本發(fā)明涉及土田七，具體涉及一種土田七的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，屬于植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

土田七(Stahlianthus involucratus)屬于姜科(Zingiberaceae)土田七屬(Stahlianthus)植物，產(chǎn)于廣東、廣西、云南、福建；印度和錫金也有分布。土田七植株高約15～30厘米，根莖外面棕褐色，內(nèi)面棕黃色，芳香而有辛辣味，根末端膨大成球狀；葉片披針形，葉面深綠色，葉被綠色或淡紫紅色，葉柄較長；花序從根莖抽出，10～15朵花聚生于鐘狀的總苞內(nèi)，總苞綠色；花白色，唇瓣中央具杏黃色斑，內(nèi)被長柔毛；生于海拔800～900米的林下、荒坡蔭濕處；花期5～7月；觀葉類，可作為林下地被和盆栽觀葉植物(高江云，等2006；路國會和王英強，2011)。土田七的根莖具藥用價值，能活血散瘀，消腫止痛，主治跌打損傷，風(fēng)濕骨痛(《中國植物志》第16分卷第2分冊)。

土田七可通過切分根莖進行分株的方式繁殖，但分株繁殖速度慢，且對母株的根莖也有損傷。目前，尚未見對土田七進行組織培養(yǎng)和種苗大規(guī)模生產(chǎn)的報道，因此，進行土田七的組織培養(yǎng)快速繁殖研究，對提高其種苗繁殖速度、在園藝園林上和作為藥用植物種植的推廣應(yīng)用上具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種土田七組織培養(yǎng)快速繁殖方法，可在短期內(nèi)獲得大量性狀穩(wěn)定的試管苗，能保持母株的優(yōu)良特性，具有低投入高產(chǎn)出的優(yōu)勢。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種土田七的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括以下步驟：

(a)外植體的選擇：取生長旺盛的土田七幼嫩新芽的根莖為外植體；

(b)外植體的消毒：將外植體用自來水洗凈，剪刀剪掉葉片，留根莖和距離根莖高5～7厘米的莖，進行外植體的消毒；切掉距離根莖高1～2厘米的莖留根莖，并接種根莖到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

(c)叢生芽的誘導(dǎo)：在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)直至外植體形成不定芽；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS、6‐芐氨基腺嘌呤1.0～3.0mg/L、萘乙酸0.01～0.10mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉膠9.5～10g/L；

(d)增殖繼代：將誘導(dǎo)出的不定芽切掉部分葉片后再切割，繼代培養(yǎng)于增殖培養(yǎng)基中進行不定芽的增殖；所述的增殖繼代培養(yǎng)基成分為MS、6‐芐氨基腺嘌呤3.0～8.0mg/L、萘乙酸0.1～0.20mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉膠9.5～10g/L；

(e)生根培養(yǎng)：當(dāng)繼代苗高3～5厘米時，切下接種到生根培養(yǎng)基中，所述的生根培養(yǎng)基成分為MS、萘乙酸0.1～1.0mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉膠9.5～10g/L；

(f)煉苗移栽：當(dāng)生根培養(yǎng)基上的苗高5～8厘米時，在溫室自然光照下煉苗10～15天，取出試管苗，洗凈根部培養(yǎng)基，用0.1％～0.3％的百菌清溶液浸泡30～40分鐘，移栽到由黃泥、珍珠巖和泥炭土混合的基質(zhì)中，保持通風(fēng)透氣，濕度在70‐85％，溫度在20‐32℃，自然光照條件培養(yǎng)后得到移栽苗。

為進一步實現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，步驟(a)所述的外植體為土田七(Stahlianthus involucratus)的5～20厘米高的幼嫩新芽的根莖。

優(yōu)選地，以質(zhì)量百分比濃度計，所述外植體的消毒是先用0.1％‐0.2％高錳酸鉀溶液浸泡根莖30～40分鐘，再用0.1％～0.3％的百菌清和甲基硫菌靈混合溶液，浸泡根莖40～50分鐘，接著在自來水下反復(fù)沖洗根莖30～40分鐘；晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉高4～6厘米的莖，留1～2厘米高的帶根莖的莖，用棉球蘸取70％酒精擦拭根莖及1～2厘米高的莖表面，最后用0.1％升汞溶液消毒15～20分鐘，滅菌水沖洗4～5次。

優(yōu)選地，所述百菌清和甲基硫菌靈的體積比為1：1。

優(yōu)選地，所述黃泥、珍珠巖和泥炭土的體積比為1：1：1。

優(yōu)選地，步驟(f)中如果溫度高于32℃，用風(fēng)機和水簾降溫。

優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的pH都為5.6～5.8；培養(yǎng)基滅菌條件為125℃，30分鐘。

優(yōu)選地，步驟(b)、步驟(c)、步驟(d)和步驟(e)所述培養(yǎng)溫度為25～30℃，光照強度為2000～2300lx，光照時間控制為12小時/天。

應(yīng)用本發(fā)明的外植體消毒方法，消毒成活率可達到75～85％，15～25天能在外植體上形成綠色的不定芽。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果為：

本發(fā)明只需簡單的植物組織培養(yǎng)設(shè)備就可在110～150天內(nèi)完成從外植體到試管苗形成的一個周期，大大加快了土田七的繁殖速度，經(jīng)過繼代增殖，每個繼代增殖周期對不定芽可增殖4～7倍，因此，可在短時間內(nèi)獲得大量的試管苗。本發(fā)明繁殖的土田七種苗，能保持母株的優(yōu)良特性，移栽成活率可達85％以上，具有低投入高產(chǎn)出的優(yōu)勢。

附圖說明

圖1A為實施例2的土田七母株上新長的嫩芽。

圖1B為實施例2的從土田七母株上取下的嫩芽外植體。

圖2為實施例2的外植體升汞消毒。

圖3為實施例2的土田七外植體誘導(dǎo)形成綠色不定芽。

圖4為實施例2的土田七外植體獲得的再生植株。

圖5A為實施例2的土田七試管苗移栽成活的種苗。

圖5B為實施例2的土田七二次移栽上盆栽培的種苗。

具體實施方式

為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的實施方式不限如此。

實施例1

(a)選擇外植體：取生長旺盛的土田七幼嫩新芽(5～10厘米高)的根莖為外植體；

(b)外植體的消毒：將外植體用自來水洗凈，剪刀剪掉葉片，留根莖和距離根莖高約5～7厘米的莖，以質(zhì)量百分比濃度計，先用0.1％高錳酸鉀溶液浸泡根莖30分鐘，再用0.1％的百菌清和甲基硫菌靈(1：1)混合溶液浸泡根莖40分鐘，接著在自來水下反復(fù)沖洗根莖30分鐘。晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉高約4～5厘米的莖，留約1～2厘米高的帶根莖的莖，用棉球蘸取70％酒精擦拭根莖及約1～2厘米高的莖表面，最后用0.1％升汞溶液消毒15分鐘，滅菌水沖洗4次，切掉距離根莖高約1～2厘米的莖留根莖，并接種根莖到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

(c)叢生芽的誘導(dǎo)：在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周，根莖上有綠芽形成并長出；再經(jīng)4周，新芽長出1～2片葉，高約3～5厘米。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS+6‐芐氨基腺嘌呤1.0mg/L+萘乙酸0.01mg/L+10.0％椰汁+蔗糖30g/L+卡拉膠10g/L。

(d)增殖繼代：將誘導(dǎo)出的不定芽切掉部分葉片后再切割，繼代培養(yǎng)于增殖培養(yǎng)基中進行不定芽的增殖，培養(yǎng)60天，可獲得增殖倍數(shù)為4～5的增殖叢生芽。所述的增殖繼代培養(yǎng)基成分為MS+6‐芐氨基腺嘌呤3.0mg/L+萘乙酸0.10mg/L+10.0％椰汁+蔗糖30g/L+卡拉膠9.5g/L。

(e)生根培養(yǎng)：當(dāng)繼代苗高3～5厘米時，切下接種到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約40天得到生根苗。所述的生根培養(yǎng)基成分為MS+萘乙酸0.1mg/L+10.0％椰汁+蔗糖30g/L+卡拉膠9.5g/L。

(f)煉苗移栽：當(dāng)生根培養(yǎng)基上的苗高5～8厘米時，在溫室自然光照下煉苗10天，取出試管苗，洗凈根部培養(yǎng)基，0.1％的百菌清溶液浸泡30分鐘，移栽到由黃泥、珍珠巖和泥炭土(1：1：1)等體積混合的基質(zhì)中，保持通風(fēng)透氣，濕度在70‐85％，溫度在20‐32℃，高于32℃需用風(fēng)機和水簾降溫，自然光照條件培養(yǎng)后得到移栽苗。

上述b、c、d、e四個步驟中，所用的培養(yǎng)基：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的pH為5.6～5.8，培養(yǎng)基滅菌條件為125℃，30分鐘，培養(yǎng)條件為25～30℃，光照強度2000～2300lx，光照12小時/天。

移栽苗注意通風(fēng)、澆水和遮蔭，成活率可達90％以上，移栽45天后可上盆栽培。從選擇外植體到再生試管苗約需要149天的時間。

實施例2

(a)選擇外植體：如圖1A所示，為土田七母株上長出的幼嫩新芽，取8～15厘米高的幼嫩新芽的根莖為外植體。

(b)外植體的消毒：如圖1B所示，為從土田七母株上切取下的幼嫩新芽外植體，先用自來水洗凈，剪刀剪掉葉片，留根莖和距離根莖高約5～7厘米的莖，先用0.2％高錳酸鉀溶液浸泡根莖30分鐘，再用0.2％的百菌清和甲基硫菌靈(1：1)混合溶液浸泡根莖40分鐘，接著在自來水下反復(fù)沖洗根莖40分鐘。晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉高約4～6厘米的莖，留約1～2厘米高的帶根莖的莖，用棉球蘸取70％酒精擦拭根莖及約1～2厘米高的莖表面，最后如圖2所示，用0.1％升汞溶液消毒18分鐘，滅菌水沖洗4次，切掉距離根莖高約1～2厘米的莖留根莖，并接種根莖到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

(c)叢生芽的誘導(dǎo)：在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周，如圖3所示，根莖上有綠芽形成并長出；再經(jīng)4周，新芽長出1～2片葉，高約3～5厘米。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS+6‐芐氨基腺嘌呤2.0mg/L+萘乙酸0.05mg/L+15.0％椰汁+蔗糖20g/L+卡拉膠9.5g/L。

(d)增殖繼代：將誘導(dǎo)出的不定芽切掉部分葉片后再切割，繼代培養(yǎng)于增殖培養(yǎng)基中進行不定芽的增殖，培養(yǎng)50天，可獲得增殖倍數(shù)為4～6的增殖叢生芽。增殖繼代培養(yǎng)基成分為MS+6‐芐氨基腺嘌呤5.0mg/L+萘乙酸0.20mg/L+15.0％椰汁+蔗糖20g/L+卡拉膠9.5g/L。

(e)生根培養(yǎng)：當(dāng)繼代苗高3～5厘米時，切下接種到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35天后，如圖4所示，得到生根苗。所述的生根培養(yǎng)基成分為MS+萘乙酸0.5mg/L+15.0％椰汁+蔗糖20g/L+卡拉膠9.5g/L。

(f)煉苗移栽：當(dāng)生根培養(yǎng)基上的苗高5～8厘米時，在溫室自然光照下煉苗12天，取出試管苗，洗凈根部培養(yǎng)基，0.2％的百菌清溶液浸泡30分鐘，然后如圖5A所示，移栽到由黃泥、珍珠巖和泥炭土(1：1：1)等體積混合的基質(zhì)中，保持通風(fēng)透氣，濕度在70‐85％，溫度在20‐32℃，高于32℃需用風(fēng)機和水簾降溫，自然光照條件培養(yǎng)后得到移栽苗。

上述(b)、(c)、(d)、(e)四個步驟中，所用的培養(yǎng)基：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的pH為5.6～5.8，培養(yǎng)基滅菌條件為125℃，30分鐘，培養(yǎng)條件為25～30℃，光照強度2000～2300lx，光照12小時/天。

移栽苗注意通風(fēng)、澆水和遮蔭，成活率可達85％以上，移栽45天后上盆栽培，如圖5B所示，為土田七種苗二次移栽上盆栽培的種苗。從選擇外植體到再生試管苗約需要127天的時間。

實施例3

(a)選擇外植體：取生長旺盛的土田七幼嫩新芽(10～20厘米高)的根莖為外植體；

(b)外植體的消毒：將外植體用自來水洗凈，剪刀剪掉葉片，留根莖和距離根莖高約5～7厘米的莖，先用0.1％高錳酸鉀溶液浸泡根莖40分鐘，再用0.3％的百菌清和甲基硫菌靈(1：1)混合溶液浸泡根莖50分鐘，接著在自來水下反復(fù)沖洗根莖40分鐘。晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉高約4～6厘米的莖，留約1～2厘米高的帶根莖的莖，用棉球蘸取70％酒精擦拭根莖及約1～2厘米高的莖表面，最后用0.1％升汞溶液消毒20分鐘，滅菌水沖洗5次，切掉距離根莖高約1～2厘米的莖留根莖，并接種根莖到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

(c)叢生芽的誘導(dǎo)：在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周，根莖上有綠芽形成并長出；再經(jīng)3周，新芽長出1～2片葉，高約3～5厘米。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS+6‐芐氨基腺嘌呤3.0mg/L+萘乙酸0.10mg/L+15.0％椰汁+蔗糖30g/L+卡拉膠10g/L。

(d)增殖繼代：將誘導(dǎo)出的不定芽切掉部分葉片后再切割，繼代培養(yǎng)于增殖培養(yǎng)基中進行不定芽的增殖，培養(yǎng)45天，可獲得增殖倍數(shù)為5～7的增殖叢生芽。所述的增殖繼代培養(yǎng)基成分為MS+6‐芐氨基腺嘌呤8.0mg/L+萘乙酸0.20mg/L+15.0％椰汁+蔗糖30g/L+卡拉膠10g/L。

(e)生根培養(yǎng)：當(dāng)繼代苗高3～5厘米時，切下接種到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30天得到生根苗。所述的生根培養(yǎng)基成分為MS+萘乙酸1.0mg/L+15.0％椰汁+蔗糖30g/L+卡拉膠9.5g/L。

(f)煉苗移栽：當(dāng)生根培養(yǎng)基上的苗高5～8厘米時，在溫室自然光照下煉苗15天，取出試管苗，洗凈根部培養(yǎng)基，0.3％百菌清溶液浸泡40分鐘，移栽到由黃泥、珍珠巖和泥炭土(1：1：1)等體積混合的基質(zhì)中，保持通風(fēng)透氣，濕度在70‐85％，溫度在20‐32℃，高于32℃需用風(fēng)機和水簾降溫，自然光照條件培養(yǎng)后得到移栽苗。

上述b、c、d、e四個步驟中，所用的培養(yǎng)基：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的pH為5.6～5.8，培養(yǎng)基滅菌條件為125℃，30分鐘，培養(yǎng)條件為25～30℃，光照強度2000～2300lx，光照12小時/天。

移栽苗注意通風(fēng)、澆水和遮蔭，成活率可達85％以上，移栽45天后可上盆栽培。從選擇外植體到再生試管苗約需要110天的時間。

對比例1

本對比例土田七的外植體消毒方式為：將外植體用自來水洗凈，剪刀剪掉葉片，留根莖和距離根莖高約5～7厘米的莖，在自來水下加少量洗衣粉反復(fù)沖洗根莖40分鐘。晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉高約4～6厘米的莖，留約1～2厘米高的帶根莖的莖，用棉球蘸取70％酒精擦拭根莖及約1～2厘米高的莖表面，最后用0.1％升汞溶液消毒10分鐘，滅菌水沖洗4次，切掉距離根莖高約1～2厘米的莖留根莖，并接種根莖到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。本對比例的誘導(dǎo)培養(yǎng)基與實施例3的條件都相同。接種1周左右觀察發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基100％污染。

對比例2

本對比例土田七的外植體消毒方式為：將外植體用自來水洗凈，剪刀剪掉葉片，留根莖和距離根莖高約5～7厘米的莖，在自來水下反復(fù)沖洗根莖40分鐘。晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉高約4～6厘米的莖，留約1～2厘米高的帶根莖的莖，用棉球蘸取70％酒精擦拭根莖及約1～2厘米高的莖表面，最后用0.1％升汞溶液消毒15分鐘，滅菌水沖洗5次，切掉距離根莖高約1～2厘米的莖留根莖，并接種根莖到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。本對比例的誘導(dǎo)培養(yǎng)基與實施例3的條件都相同。接種1周左右觀察發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基100％污染。

本發(fā)明實施例相對于對比例的優(yōu)點如下：由于外植體消毒方法的不同，本發(fā)明實施例大大降低了外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的污染率，從而提高了工作效率。