本發(fā)明涉及顯微鏡，具體地，涉及用于生物學(xué)物質(zhì)(包括細(xì)胞和微生物)的三維層析成像的顯微鏡。本發(fā)明還可以更一般性地用于非生物學(xué)透明材料的三維層析成像的領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

能夠?qū)ι飳W(xué)細(xì)胞及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維成像的顯微鏡一般基于數(shù)字層析成像技術(shù)，并且往往基于標(biāo)記染料的使用，以增強(qiáng)細(xì)胞的成分之間的強(qiáng)度對(duì)比度。但是，標(biāo)記染料可能影響所要觀察的物質(zhì)(尤其是在活細(xì)胞的情況下)，而且也會(huì)致使過(guò)程更加復(fù)雜。在國(guó)際專利申請(qǐng)pct/ib2011/051306中描述了基于3d折射率計(jì)算的無(wú)標(biāo)記非侵入式顯微鏡檢查方法。但是，對(duì)非常小的對(duì)象計(jì)算具有內(nèi)部結(jié)構(gòu)的足夠細(xì)節(jié)的基于折射率的圖像所需的圖像數(shù)據(jù)的捕獲需要非常精確的顯微鏡。常規(guī)顯微鏡的精確度依賴于透鏡的質(zhì)量以及在顯微鏡的各種部件的組裝中的非常低的制造公差。這導(dǎo)致顯微鏡成本高昂。此外，為了具有高數(shù)值孔徑以增加捕獲數(shù)據(jù)的分辨率，針對(duì)所要觀察的樣本的可用工作距離和空間是非常有限的。這使得制備樣品或樣本以通過(guò)顯微鏡進(jìn)行查看變得復(fù)雜，并且限制了可以被觀察的樣本的類型以及可以呈現(xiàn)樣本的形式。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種實(shí)施和使用起來(lái)容易并且經(jīng)濟(jì)的顯微鏡。

提供一種準(zhǔn)確并給出高分辨率還生產(chǎn)起來(lái)經(jīng)濟(jì)的顯微鏡將是有利的。

提供一種簡(jiǎn)化所要觀察的生物學(xué)樣本的制備的顯微鏡是有利的。

提供一種可以與各種標(biāo)準(zhǔn)或者常見(jiàn)形式的生物學(xué)樣本容器(包括用于活細(xì)胞的培養(yǎng)皿)一起使用的顯微鏡是有利的。

提供一種簡(jiǎn)化所要觀察的生物學(xué)樣本的制備的顯微鏡是有利的。

提供一種可靠的顯微鏡是有利的。

提供一種多用途的顯微鏡是有利的。

文中公開(kāi)了一種顯微鏡，其包括：產(chǎn)生至少部分準(zhǔn)直的光束的光源；包括被配置為將光束分成參考波束和樣本照明波束的分束器的光束引導(dǎo)系統(tǒng)；被配置為接納所要觀察的樣本的樣本觀察區(qū)；被配置為在樣本照明波束通過(guò)樣本觀察區(qū)之后使參考波束和樣本照明波束重新聚合的波束重聚器；以及被配置為捕獲波束重聚器的下游的光束的至少相位和強(qiáng)度值的光感測(cè)系統(tǒng)。在實(shí)施例中，光源可以被配置為生成相干或部分相干準(zhǔn)直光束，具體地，激光束，例如，二極管激光束。在一種變型中，光源可以生成非相干光，例如，白光，其例如借助于光學(xué)透鏡得到準(zhǔn)直。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，光束引導(dǎo)系統(tǒng)包括指引參考波束和樣本照明波束沿著其相應(yīng)的光路的方向改變反射鏡，其中，方向改變反射鏡中的至少一個(gè)是可由顯微鏡的電子控制系統(tǒng)控制的可樞轉(zhuǎn)操作的反射鏡。該控制系統(tǒng)被配置為生成反射鏡角度控制信號(hào)，以自動(dòng)控制所述至少一個(gè)可樞轉(zhuǎn)操作方向改變反射鏡的角度，該反射鏡角度控制信號(hào)至少部分地基于由光感測(cè)系統(tǒng)借助于該控制系統(tǒng)的反饋環(huán)接收到的光束的信號(hào)。

在一個(gè)實(shí)施例中，控制信號(hào)可以基于由光感測(cè)系統(tǒng)測(cè)得的光束的相位和強(qiáng)度值兩者。

有利地，顯微鏡可以容易地在制造或運(yùn)輸之后以規(guī)律的間隔或者在每次使用之前，通過(guò)對(duì)在樣本照明波束路徑和/或在參考波束路徑中的方向改變反射鏡中的一個(gè)或多個(gè)的角度進(jìn)行電子控制來(lái)進(jìn)行校準(zhǔn)。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，該樣本照明裝置包括：反射鏡系統(tǒng)，被配置為指引樣本照明波束相對(duì)于光軸處于非零照明角度(非正視照明)；以及旋轉(zhuǎn)波束機(jī)構(gòu)，被配置為使成一定角度的樣本照明波束圍繞光軸旋轉(zhuǎn)至少360°(2π弧度)。

根據(jù)本發(fā)明的旋轉(zhuǎn)具有預(yù)定照明角度的樣本照明波束與常規(guī)解決方案相比尤其是有利的，因?yàn)樗试S在相比于基于透鏡的解決方案具有低成本的布置中以大的照明角度照明微小對(duì)象，其中該照明角度主要由顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑限定。實(shí)際上，與透鏡或者折射或衍射元件形成對(duì)照的是，旋轉(zhuǎn)波束不改變波束形狀，因而，與本發(fā)明所提供的解決方案形成對(duì)照的是，透鏡或者折射或衍射元件需要以極高的質(zhì)量進(jìn)行制造以減少波束整形，從而增加了生產(chǎn)成本。此外，旋轉(zhuǎn)波束允許對(duì)于樣本的大的工作空間，因而提供了可以位于樣本保持器上并由顯微鏡查看的樣本的在大小方面的通用性，同時(shí)顯著減少顯微鏡的制造成本以及對(duì)沿光路的光學(xué)元件的質(zhì)量的敏感性。

根據(jù)本申請(qǐng)的第三方面，顯微鏡進(jìn)一步包括被配置為調(diào)整參考波束的相對(duì)于樣本照明波束的光程長(zhǎng)度的光程差(opd)調(diào)整裝置，opd調(diào)整裝置包括第一光偏離元件和第二光偏離元件，它們每個(gè)都安裝在樞轉(zhuǎn)支座上，該樞轉(zhuǎn)支座被配置為變化第一光偏離元件相對(duì)于第二光偏離元件的角度，由此光偏離元件的傾斜角度至少影響光程差。

因而，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)光程差的連續(xù)、準(zhǔn)確的調(diào)整。此外，如有需要，可以進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)整。

在一個(gè)實(shí)施例中，樣本照明裝置的反射鏡系統(tǒng)安裝在旋轉(zhuǎn)支座上，并且旋轉(zhuǎn)波束機(jī)構(gòu)由旋轉(zhuǎn)支座和用于旋轉(zhuǎn)該支座的馬達(dá)驅(qū)動(dòng)裝置形成。

在一個(gè)實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)波束機(jī)構(gòu)包括旋轉(zhuǎn)可傾斜操作反射鏡，從而將樣本照明波束指引到樣本照明裝置的反射鏡系統(tǒng)上，其中反射鏡系統(tǒng)安裝在固定支座上。

在一個(gè)有利實(shí)施例中，可樞轉(zhuǎn)操作的反射鏡是微機(jī)電(mems)類型部件。

在一個(gè)有利實(shí)施例中，可樞轉(zhuǎn)操作的反射鏡基本上位于樣本之上，與顯微鏡物鏡的光軸對(duì)齊。

在一個(gè)有利實(shí)施例中，方向改變反射鏡至少包括布置在分束器的下游的樣本照明波束的光路中的第一方向改變反射鏡和第二方向改變反射鏡，兩反射鏡均可樞轉(zhuǎn)的操作，從而對(duì)光程誤差進(jìn)行校正，或者改變樣本照明角度。

在一個(gè)有利實(shí)施例中，顯微鏡還包括被配置為接收來(lái)自光感測(cè)系統(tǒng)的多個(gè)圖像幀數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，所述多個(gè)圖像幀是針對(duì)樣本照明波束圍繞顯微鏡物鏡光軸的至少360°旋轉(zhuǎn)生成的。

在一個(gè)有利實(shí)施例中，由光感測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)每360°捕獲的幀的數(shù)量大于10，優(yōu)選地大于20，更優(yōu)選地大于30。

在一個(gè)有利實(shí)施例中，圖像幀數(shù)據(jù)通過(guò)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行重構(gòu)，或者由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)供應(yīng)給外部計(jì)算系統(tǒng)，以處理成微小對(duì)象的三維圖像。

在有利實(shí)施例中，顯微鏡被配置為通過(guò)確定樣本照明波束在穿過(guò)微小對(duì)象之后的相位偏移而基于該微小對(duì)象的折射率分布生成該微小對(duì)象的三維圖像。

本文還公開(kāi)了一種控制顯微鏡的方法，該顯微鏡包括：產(chǎn)生光束的光源；包括分束器的光束引導(dǎo)系統(tǒng)，其中分束器被配置為將光束分成穿過(guò)光束引導(dǎo)系統(tǒng)的參考波束和樣本照明波束，至少一個(gè)是可樞轉(zhuǎn)操作的方向改變反射鏡(tm1、tm2、tm3、tm4)指引參考波束和樣本照明波束，從而引導(dǎo)參考波束和樣本波束沿著其相應(yīng)的光路；被配置為在樣本照明波束的路徑中接納所要觀察的樣本的樣本觀察區(qū)；被配置為在樣本照明波束穿過(guò)樣本觀察區(qū)之后使參考波束和樣本照明波束重新聚合的波束重聚器；被配置為取得波束重聚器的下游的光束的至少相位和強(qiáng)度值的光感測(cè)系統(tǒng)；以及電子控制系統(tǒng)，所述方法的特征在于：

-通過(guò)控制系統(tǒng)中的反饋環(huán)接收來(lái)自光感測(cè)系統(tǒng)的由光束生成的信號(hào)，

-在控制系統(tǒng)中生成反射鏡角度控制信號(hào)，該反射鏡角度控制信號(hào)至少部分地基于從光感測(cè)系統(tǒng)接收的所述信號(hào)；以及

-將反射鏡角度控制信號(hào)傳送至所述至少一個(gè)可樞轉(zhuǎn)操作方向改變反射鏡，以控制可樞轉(zhuǎn)操作方向改變反射鏡的角度。

在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括相對(duì)于樣本旋轉(zhuǎn)樣本波束。

在一個(gè)實(shí)施例中，所生成的反射鏡角度控制信號(hào)是動(dòng)態(tài)的。

在一個(gè)實(shí)施例中，反射鏡角度控制信號(hào)是依據(jù)樣本波束相對(duì)于樣本的旋轉(zhuǎn)角度動(dòng)態(tài)生成的。

在一個(gè)實(shí)施例中，所生成的反射鏡角度控制信號(hào)是靜態(tài)的。

在一個(gè)實(shí)施例中，反射鏡角度控制信號(hào)所基于的、從光感測(cè)系統(tǒng)接收并且由光束生成的信號(hào)包括通過(guò)光感測(cè)系統(tǒng)接收的光束的強(qiáng)度、相干性、干涉條紋(fringe)頻率和相位中的任何一個(gè)或多個(gè)。

在一個(gè)實(shí)施例中，該方法還包括在顯微鏡的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中接收來(lái)自光感測(cè)系統(tǒng)的多個(gè)圖像幀數(shù)據(jù)，所述多個(gè)圖像幀是針對(duì)樣本照明波束圍繞顯微鏡物鏡光軸的至少360°旋轉(zhuǎn)生成的。

在一個(gè)實(shí)施例中，由光感測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)每360°捕獲的幀的數(shù)量大于10。

在一個(gè)實(shí)施例中，圖像幀數(shù)據(jù)通過(guò)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行重構(gòu)，或者由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)供應(yīng)給計(jì)算系統(tǒng)，以處理成微小對(duì)象的三維圖像。

在一個(gè)實(shí)施例中，圖像幀數(shù)據(jù)被數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)一步利用，或者由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)供應(yīng)給計(jì)算系統(tǒng)，用于估算樣本的光學(xué)特性，以改善微小對(duì)象的三維圖像。

在一個(gè)實(shí)施例中，該方法還包括通過(guò)確定樣本照明波束在穿過(guò)微小對(duì)象之后的相位偏移而基于該微小對(duì)象的各個(gè)截面的折射率生成該微小部分的三維圖像。

本文還公開(kāi)了一種控制顯微鏡的方法，該方法的特征在于通過(guò)顯微鏡的控制系統(tǒng)動(dòng)態(tài)調(diào)整參考波束的光程長(zhǎng)度(opl)，從而使參考波束和樣本波束之間的光程差(opd)保持低于光源的相干長(zhǎng)度，該方法包括下述步驟：

a)將旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)定位于第一位置上，

b)將被配置為指引參考波束的所述至少一個(gè)可樞轉(zhuǎn)操作方向改變反射鏡(tm3，tm4)定位于第一位置，

c)在樣本波束被關(guān)掉時(shí)，測(cè)量通過(guò)光感測(cè)系統(tǒng)捕獲的參考波束信號(hào)的位置，

d)打開(kāi)樣本波束，并測(cè)量通過(guò)光感測(cè)系統(tǒng)捕獲的信號(hào)的干涉條紋對(duì)比度，

e)使所述至少一個(gè)可樞轉(zhuǎn)操作方向改變反射鏡(tm3，tm4)的位置改變一個(gè)增量，

f)重復(fù)步驟c)到e)直到增量之和對(duì)應(yīng)于可樞轉(zhuǎn)操作方向改變反射鏡(tm3，tm4)的預(yù)定義工作范圍，

g)比較針對(duì)每個(gè)增量獲得的干涉條紋對(duì)比度測(cè)量結(jié)果，并將可樞轉(zhuǎn)操作方向改變反射鏡(tm3，tm4)的針對(duì)具有最高值的干涉條紋對(duì)比度測(cè)量結(jié)果的位置連同旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)的位置存儲(chǔ)到控制系統(tǒng)的存儲(chǔ)器的查找表格(lut)中；

h)使旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)一個(gè)小的增量，并重復(fù)步驟b)到g)直到旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)完成了360°旋轉(zhuǎn)。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明的其他目的和有利特征將從權(quán)利要求、詳細(xì)說(shuō)明和附圖中變得清楚，其中：

圖1a是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的去除了一部分外殼的顯微鏡的透視圖；

圖1b是貫穿圖1a的顯微鏡的橫截面視圖；

圖1c是基于馬赫-曾德(mach-zehnder)方案的、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的顯微鏡的配置的簡(jiǎn)化示意圖；

圖1d是根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例的顯微鏡的橫截面視圖；

圖1e是圖1d的顯微鏡的橫截面透視圖；

圖2a是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的顯微鏡的配置的簡(jiǎn)化示意圖；

圖2b是與圖2a類似的示意圖，其例示了諸如制造公差、磨損、振動(dòng)或受熱的各種缺陷對(duì)光路的影響；

圖2c和2d是顯微鏡的一部分的配置的示意圖，例示了在顯微鏡的旋轉(zhuǎn)掃描臂的一個(gè)循環(huán)(revolution)期間機(jī)械缺陷在光程長(zhǎng)度上的影響，其中圖2c示出沒(méi)有缺陷的掃描頭，圖2c示出具有機(jī)械缺陷(錯(cuò)位)的掃描頭；

圖3a和3b是在根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡的樣本保持器上根據(jù)第一和第二變型的樣本的局部視圖；

圖4a是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的顯微鏡的基于透射原理的光程差(opd)調(diào)整裝置的視圖；

圖4b是圖4a的光路裝置的簡(jiǎn)化示意圖，其例示了opd走離校正，圖4c是與圖4b變型類似的視圖，其例示了opd補(bǔ)償；

圖4d是opd裝置的透明(例如，玻璃)厚板的詳細(xì)示意性視圖，其示出在詳細(xì)描述中討論的各種角度和尺寸；

圖4e是示出了光程長(zhǎng)度變化與圖4a的opd裝置的透明厚板的取向角度的關(guān)系的曲線圖；

圖4f到4g是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的透射型opd裝置的示意例示，其示出了理想同步(圖4f)、非理想同步(圖4g)以及借助于可傾斜反射鏡對(duì)非理想同步的校正(圖4h)；

圖4i是例示了用于調(diào)整圖4a的opd裝置的控制過(guò)程中的步驟的簡(jiǎn)圖。

圖5a是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的包括基于反射原理的opd裝置的顯微鏡的配置的簡(jiǎn)化示意圖；

圖5b、圖5c和圖5d是圖5a的實(shí)施例的opd裝置的變型的簡(jiǎn)化示意圖；

圖5e是例示了用于調(diào)整圖5a的opd裝置的控制過(guò)程中的步驟的簡(jiǎn)圖；

圖5f是例示了用于動(dòng)態(tài)調(diào)整圖5a的opd裝置的控制過(guò)程中的步驟的簡(jiǎn)圖；

圖5g是例示了依據(jù)掃描頭位置的opd系統(tǒng)的光程長(zhǎng)度(opl)差的圖，其允許確定最優(yōu)位置；

圖6a和6b是例示了所要觀察的樣本的傾斜照明的簡(jiǎn)化示意性視圖，圖6a例示了在其中浸入樣本的液體的高度(δh)的變化的影響，圖6b例示了照明角度(α)的變化的影響；

圖6c是例示了所要捕獲的樣本的傾斜照明的簡(jiǎn)化示意性視圖，該傾斜照明具有校正在其中浸入樣本的液體的高度的變化的影響的手段；

圖7a、圖7b、圖7c和圖7d是以根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡的不同變型為根據(jù)的相對(duì)于樣本旋轉(zhuǎn)照明波束系統(tǒng)的簡(jiǎn)化示意性例示；

圖8是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的用于顯微鏡中使用的具有可調(diào)整傾斜角度的基于mems的反射鏡的簡(jiǎn)化透視圖；

圖9是例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的顯微鏡的校準(zhǔn)過(guò)程(p1)的步驟的流程圖，其中，對(duì)樣本照明波束路徑中的可傾斜反射鏡的角度進(jìn)行調(diào)整；

圖10a和圖10b是例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的用于顯微鏡的基于樣本的自動(dòng)相位校正的反饋環(huán)控制過(guò)程(p2)的步驟的流程圖；

圖11是例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的顯微鏡的校準(zhǔn)過(guò)程(p5)的步驟的流程圖，其中，對(duì)參考波束路徑和樣本照明波束路徑中的可傾斜反射鏡的角度進(jìn)行調(diào)整；

圖12是例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的顯微鏡的質(zhì)量評(píng)估過(guò)程(p6)的步驟的流程圖，其中，對(duì)參考波束路徑中的可傾斜反射鏡的角度進(jìn)行調(diào)整；

圖13是例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的顯微鏡的誤差分析過(guò)程(p7)的步驟的流程圖；

圖14a是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的通過(guò)顯微鏡的光感測(cè)系統(tǒng)捕獲的全息圖的強(qiáng)度圖案的傅里葉變換的示意性例示；

圖14b是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的顯微鏡的可傾斜反射鏡的不同層級(jí)的反饋控制的示意性例示；

圖15a是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的通過(guò)顯微鏡的光感測(cè)系統(tǒng)捕獲的不同階的像差的例示圖，所述像差用于通過(guò)光感測(cè)系統(tǒng)接收的波束的幅度和相位分析；

圖15b和15c是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的通過(guò)顯微鏡的光感測(cè)系統(tǒng)捕獲的不同階的像差所生成的信號(hào)的圖形表示；

圖16a是處于具有兩種不同折射率n1、n2的物質(zhì)之間的界面處的樣本照明波束的幾何角度和長(zhǎng)度的例示，其用于例示浸沒(méi)在具有高度h的液體中的樣本；

圖16b是測(cè)得的波束信號(hào)的強(qiáng)度和散焦角度(δα)之間的關(guān)系的例示；

圖16c是用以確定相位校正(φ)的樣本照明波束的散焦角度(δα)與樣本液體的高度之間的關(guān)系的例示；

圖17a是樣本照明波束路徑的用于例示角度和尺寸的示意圖，圖17b是變化角度和尺寸的結(jié)果的表格，用于例示制造公差、振動(dòng)或熱效應(yīng)對(duì)補(bǔ)償公差所需要的樣本照明波束路徑中的一個(gè)或多個(gè)可傾斜反射鏡的角度的影響。

圖18是例示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的顯微鏡的操作中的各種過(guò)程p1到p7的全面實(shí)施的流程圖。

具體實(shí)施方式

參考附圖，具體從圖1a開(kāi)始到圖2b，顯微鏡2的示例性實(shí)施例包括光源4(具體地，相干光源，諸如，激光束裝置)、光束引導(dǎo)系統(tǒng)6、光感測(cè)系統(tǒng)8、(具體用于處理所生成的圖像數(shù)據(jù)的)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)10、電子控制系統(tǒng)15以及一般收容和支撐顯微鏡2的各種部件的外殼和支座結(jié)構(gòu)12。

顯微鏡2能夠?qū)Πɑ罴?xì)胞在內(nèi)的生物學(xué)細(xì)胞和微生物進(jìn)行三維成像?？梢酝ㄟ^(guò)使用國(guó)際專利申請(qǐng)pct/ib2011/051306中描述的技術(shù)來(lái)生成細(xì)胞和其他的生物學(xué)微細(xì)物質(zhì)樣本的圖像，該專利申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文。

外殼和支座結(jié)構(gòu)12包括樣本觀察區(qū)，樣本觀察區(qū)包括被配置為保持具有各種標(biāo)準(zhǔn)和非標(biāo)準(zhǔn)形式的生物學(xué)樣本的樣本保持器18。樣本保持器具有位置調(diào)整機(jī)構(gòu)，該位置調(diào)整機(jī)構(gòu)允許三維地移動(dòng)樣本的位置，具體地允許高度調(diào)整以及樣本照明光束所橫越的平面中的調(diào)整。顯微鏡的位置調(diào)整機(jī)構(gòu)本身是公知的，其允許相對(duì)于在樣本之下(透射)或者之上(反射)的顯微鏡物鏡位置來(lái)調(diào)整所要觀察的樣本的位置。

在一種變型(未示出)中，樣本觀察區(qū)可以具有導(dǎo)管，導(dǎo)管具有延伸通過(guò)樣本照明波束所橫越的區(qū)的透明截面，樣本觀察區(qū)被配置為觀察在封閉導(dǎo)管中的由液體流動(dòng)供應(yīng)到照明波束路徑的樣品材料。

參考圖3a和3b，可以在封閉容納系統(tǒng)3a中或者在開(kāi)口皿(opendish)3b(諸如陪替氏培養(yǎng)皿)中提供生物學(xué)樣本。例如，可以根據(jù)以下非限制性示例來(lái)提供生物學(xué)樣本。作為對(duì)任何類型的樣本的一般性要求，緩沖介質(zhì)5不應(yīng)散射入射光。例如，可以使用諸如磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)或者4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)的透明液體。為了保持細(xì)胞存活3到4小時(shí)，具有pbs(具有例如葡萄糖)(例如，25mmol)和hepes(例如，10mmol))的樣本工作良好。對(duì)于靜態(tài)實(shí)驗(yàn)而言，使用多聚甲醛(pfa)固定的細(xì)胞可供使用幾個(gè)星期。可以通過(guò)通常為170微米厚的蓋玻片進(jìn)行觀察(大部分顯微鏡物鏡針對(duì)這樣的蓋玻片進(jìn)行了優(yōu)化)，并且由于這種物鏡的有限工作距離的原因，細(xì)胞應(yīng)當(dāng)被固定在優(yōu)選距離細(xì)胞沒(méi)有遠(yuǎn)超過(guò)30微米的蓋玻片上。光學(xué)表面應(yīng)當(dāng)盡可能潔凈，并且細(xì)胞保持器應(yīng)當(dāng)被仔細(xì)清理，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)至少兩次，使得盡可能少的死細(xì)胞或者任何種類的殘留物漂浮在固定介質(zhì)(mountingmedium)中。在圖3a的示例中，緩沖介質(zhì)5被密封在腔室中，以避免液體干燥或滲漏。例如，以膠帶隔離件(例如，來(lái)自于gracebio-labsss1x9-securesealimaging，其內(nèi)徑為9mm，厚度為0.12mm)的形式的密封件7被安裝在蓋玻片9和基座11之間。

對(duì)于在具有透明基座的標(biāo)準(zhǔn)陪替氏培養(yǎng)皿3b中提供的活細(xì)胞而言，可以通過(guò)將陪替氏培養(yǎng)皿的基座定位成挨著顯微鏡物鏡37或者非?？拷@微鏡物鏡37而直接觀察細(xì)胞。只要培養(yǎng)皿的底部表面被覆蓋，其中細(xì)胞被定位成挨著該底部表面，并且該底部表面形成了觀察平面13，那么液體的量就不重要。

細(xì)胞的匯合(confluency)優(yōu)選大于20％，以確保容易對(duì)細(xì)胞定位，以供觀察。

在示例性實(shí)施例中，相干光源4可以是激光束發(fā)生器，例如，其類型為處于520納米波長(zhǎng)的二極管激光束。也可以使用具有其他波長(zhǎng)的激光束，需要注意的是波長(zhǎng)越短，可能的分辨率就越高。

具體地，光感測(cè)系統(tǒng)8可以是具有圖像傳感器的照相機(jī)，其中圖像傳感器被配置為讀取穿過(guò)樣本后被接收到的光束，并將檢測(cè)到的光信號(hào)傳送至數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)10。照相機(jī)可以是具有ccd、cmos或者其他類型的光傳感器的已知類型的照相機(jī)，其中光傳感器能夠拾取所接收到的光束的波長(zhǎng)、相位和強(qiáng)度，并將該信息傳送至數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)10。

光束引導(dǎo)系統(tǒng)6被配置為將相干光束劃分成兩個(gè)波束，即，參考波束7a和樣本照明波束7b，它們遵循不同路徑，分別為參考波束光路22和樣本波束光路20。光束引導(dǎo)系統(tǒng)包括分束器14，其接收來(lái)自相干光源4的相關(guān)波束7，并將其分成兩個(gè)波束7a、7b。分束器本身是公知器件，無(wú)需在這里對(duì)其做進(jìn)一步解釋。

在樣本照明波束7b穿過(guò)了樣本1之后，并且在被光感測(cè)系統(tǒng)8捕獲之前，樣本照明波束7b和參考波束7a通過(guò)波束重聚器16得以重新聚合?？梢耘c分束器具有相同的構(gòu)造但是按照相反的模式工作的波束重聚器本身也是公知的，無(wú)需在這里對(duì)其做進(jìn)一步描述。將相干光束7分成沿著兩條路徑(其中一條穿過(guò)樣本)允許測(cè)量樣本照明波束7b相對(duì)于參考波束7a的相移，該相移依賴于樣本物質(zhì)的被樣本照明波束7b穿過(guò)的截面的折射率。

參考波束光路系統(tǒng)22包括用以將參考波束7a重定向并引導(dǎo)成沿著其路徑的方向改變反射鏡30，以及光程差(opd)調(diào)整裝置32。

參考圖4a到圖4c，根據(jù)所示實(shí)施例的opd調(diào)整裝置32是基于透射原理的，并且包括安裝在樞轉(zhuǎn)支座46上的第一光偏離元件42和安裝在第二樞轉(zhuǎn)支座48上的第二光偏離元件44。光偏離元件42、44由折射率大于空氣的透明材料(例如，玻璃厚板)制成，被配置為使穿過(guò)它的參考光束按照某種方式發(fā)生彎曲，從而允許對(duì)參考波束的光程長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整。該透明材料可以由玻璃或聚合物或者其他透明固體制成，并且可以僅僅具有平板或厚片的形狀，或者可以具有彎曲的或者非平行的外表面。樞轉(zhuǎn)支座46、48包括樞轉(zhuǎn)軸p1、p2，并且可以通過(guò)互嚙齒50機(jī)械耦合到一起，從而使得樞轉(zhuǎn)支座同時(shí)并按照相反的角方向w1、w2旋轉(zhuǎn)。因而，安裝在樞轉(zhuǎn)支座上的光偏離元件42、44同時(shí)并以相反的角方向樞轉(zhuǎn)，以調(diào)整波束7a的光程的長(zhǎng)度。第一和第二光偏離元件42、44之間的角度ω越大，參考波束7a的光程越長(zhǎng)。有利地，樞轉(zhuǎn)支座46、48可以是使用mems制造技術(shù)由半導(dǎo)電襯底制出的微機(jī)械加工零件，樞轉(zhuǎn)支座的旋轉(zhuǎn)受到在半導(dǎo)體的一部分中流動(dòng)的感應(yīng)電流的控制。

在有利的實(shí)施例中，光偏離元件48中的至少一個(gè)可以被可旋轉(zhuǎn)地安裝到其樞轉(zhuǎn)支座上，從而相對(duì)于另一個(gè)光偏離元件具有角度ω1的附加獨(dú)立旋轉(zhuǎn)，該光偏離元件48中的至少一個(gè)被配置為允許對(duì)由于錯(cuò)位、制造公差等造成的光路錯(cuò)位(走離)進(jìn)行調(diào)整。

在可替代的實(shí)施例中，第一樞轉(zhuǎn)支座和第二樞轉(zhuǎn)支座可以被獨(dú)立控制，并且沒(méi)有被直接機(jī)械耦合，從而允許光程長(zhǎng)度和光路走離兩者的調(diào)整。

在一種變型中，如圖4c中示意性例示的，參考波束路徑系統(tǒng)20的方向改變反射鏡30中的至少一些是可樞轉(zhuǎn)的或者是傾斜可調(diào)整的，以調(diào)整光程長(zhǎng)度和/或光路錯(cuò)位(走離)。

參考圖4d和4e，進(jìn)一步描述根據(jù)上述實(shí)施例的opd補(bǔ)償系統(tǒng)的原理。已知，可以使用玻璃厚板將波束橫向偏移，并附帶地增加光程長(zhǎng)度。但是，該橫向偏移可以有利地通過(guò)使用兩個(gè)玻璃厚板而受到補(bǔ)償，其中，將一個(gè)玻璃厚板順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，并將另一個(gè)玻璃厚板逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)，從而在使opd兩倍大的同時(shí)使橫向偏移受到補(bǔ)償。

參考圖4d到圖4f，橫向偏移(c'd)和opd(即，opd＝(bc'-bc))可以被如下表示：

為了補(bǔ)償波束的橫向偏移，使另一玻璃厚板以相反角度傾斜：偏移受到補(bǔ)償，并且同時(shí)opd被加倍，如圖4f所例示的。圖4f示出了對(duì)于每個(gè)10mm厚，具有ri1.5并且可傾斜0°到60°的兩個(gè)厚板的根據(jù)以上計(jì)算的opd補(bǔ)償結(jié)果。

根據(jù)該實(shí)施例的opd調(diào)整裝置可以被實(shí)施到顯微鏡中，以使光路適應(yīng)于兩個(gè)反射鏡30之間的樣本厚度，如圖4g所示。由于命令誤差、玻璃厚板厚度e的差異或者僅僅是支撐結(jié)構(gòu)12中的部件的組裝中的寬松公差的原因，出射的參考波束7a將被橫向偏移，如圖4h所示。對(duì)于透鏡和照相機(jī)之間的300mm的距離以及對(duì)于該透鏡的20mm的焦距而言，如果容許傳感器上的視場(chǎng)的十分之一的可能偏移，例如，大約500μm的偏移，則這意味著第二反射鏡上大約40μm的最大可容許橫向偏移。如果我們?nèi)菰S這樣的最大橫向偏移，則兩個(gè)厚板42、44應(yīng)當(dāng)以具有最大差異為0.25°的角度傾斜，或者厚板的厚度的差異不應(yīng)超過(guò)100μm。為了避免對(duì)玻璃厚板的機(jī)械驅(qū)動(dòng)或尺寸施加嚴(yán)苛的公差，用由控制系統(tǒng)15的微控制器所控制的可傾斜反射鏡tm3、tm4替換反射鏡30是有利的，參考圖4i。

可以參考圖4j和4h對(duì)整個(gè)opd補(bǔ)償裝置的命令過(guò)程進(jìn)行如下描述。

-樣本1被放置在樣本觀察區(qū)17中，并準(zhǔn)備好接受探查；

-玻璃厚板42、44被放置在中立位置(在圖4h中，θ＝90°)。

-控制可傾斜反射鏡tm3、tm4(例如，mems反射鏡)，以最佳地均勻傳感器上的強(qiáng)度。為了易于搜索，可以將樣本照明波束7b從顯微鏡物鏡37的孔徑中偏轉(zhuǎn)出來(lái)。

-根據(jù)在傅里葉域中與dc分量能量相比的載波峰值能量的計(jì)算來(lái)評(píng)價(jià)干涉條紋對(duì)比度。

-opd掃描開(kāi)始于使玻璃厚板42、44沿某個(gè)方向傾斜某個(gè)小角度。

-對(duì)于角度的每個(gè)增量(厚板可以通過(guò)具有恰當(dāng)?shù)凝X輪減速比(gearreductionratio)的步進(jìn)馬達(dá)來(lái)驅(qū)動(dòng))，通過(guò)pid算法使激光光點(diǎn)保持在光傳感器上居中。

-適當(dāng)?shù)刂囟ㄏ驑颖菊彰鞑ㄊ?b，并且評(píng)估干涉條紋對(duì)比度；

-一旦完成掃描，厚板42、44被適當(dāng)?shù)厝∠虺傻玫阶罡吒缮鏃l紋對(duì)比度的位置。

-可傾斜反射鏡tm3、tm4的位置被細(xì)調(diào)。

-顯微鏡準(zhǔn)備好對(duì)樣本1進(jìn)行最優(yōu)測(cè)量。

在一種變型中，為了加快以上描述的迭代搜索，從過(guò)程p1獲得的光學(xué)厚度(用在過(guò)程p2中)可以被用于定義厚板角度的接近期望的最優(yōu)位置的起始點(diǎn)：得到最高干涉條紋對(duì)比度的結(jié)果的厚板傾斜角度直接依賴于過(guò)程p1中估算出的樣本的光學(xué)厚度。

參考圖5a到圖5d，根據(jù)所例示的實(shí)施例的opd調(diào)整裝置32是基于反射原理，并且包括第一方向改變反射鏡30a、第二方向改變反射鏡30b和第三方向改變反射鏡30c。第一和第三方向改變反射鏡30a、30c中的至少一個(gè)是可傾斜的，而沿參考波束的光路位于第一和第三反射鏡之間的第二方向改變反射鏡30b則是可平移的。第二反射鏡30b的平移改變光程的長(zhǎng)度，旋轉(zhuǎn)可傾斜的第一和第三反射鏡30a、30c，以校正依據(jù)第二反射鏡30b的位移的參考波束的方向。

在圖5b的變型中，第二反射鏡安裝在支座(未示出)上，該支座被配置為沿著偏斜于與第二反射鏡反射平面正交的方向的方向來(lái)移動(dòng)第二反射鏡(又稱為角平分線位移)，其中第一和第三反射鏡30a、30b都是可傾斜的，從而針對(duì)參考光束的角度上的變化進(jìn)行調(diào)整。在圖5c的變型中，第二反射鏡安裝到支座(未示出)上，該支座被配置為與第二反射鏡反射平面正交地移動(dòng)第二反射鏡，其中第一和第三反射鏡30a、30b都是可傾斜的，從而針對(duì)參考光束的角度上的變化進(jìn)行調(diào)整。在圖5d的變型中，第二反射鏡安裝在支座(未示出)上，該支座被配置為沿平行于被反射出第二反射鏡的參考波束的方向移動(dòng)第二反射鏡(又稱為內(nèi)切圓位移)，其中第一反射鏡30a是可傾斜的，以針對(duì)參考光束的角度上的變化進(jìn)行調(diào)整，并且第二和/或第三反射鏡是任選可傾斜的。

與透射型opd實(shí)施例相比，反射型opd實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)在于使得光學(xué)表面的誤差引起的影響(諸如強(qiáng)度變化或像散)最小化，以及使用在mems傾斜反射鏡運(yùn)動(dòng)中可容易地獲得的自由度。過(guò)程p4基本上與過(guò)程p3等同，只是利用反射鏡平移替換了厚板旋轉(zhuǎn)。

主要參考圖1a到2b，樣本波束光路系統(tǒng)20還包括方向改變反射鏡26，以引導(dǎo)樣本照明波束沿著其選定的路徑。樣本波束光路系統(tǒng)還包括樣本照明裝置28，該裝置包括反射鏡系統(tǒng)34和旋轉(zhuǎn)機(jī)構(gòu)36。反射鏡系統(tǒng)34包括被配置為將樣本照明波束7b以相對(duì)于顯微鏡物鏡37的軸a的預(yù)定角度α朝樣本1指引的第一反射鏡54和第二反射鏡56。

在實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)機(jī)構(gòu)36包括馬達(dá)驅(qū)動(dòng)裝置38和旋轉(zhuǎn)支座40，反射鏡系統(tǒng)34被安裝在旋轉(zhuǎn)支座40中。在本示例性實(shí)施例中，驅(qū)動(dòng)裝置38經(jīng)由包括皮帶39的傳動(dòng)設(shè)備耦接至旋轉(zhuǎn)支座，但是可以使用很多其他傳動(dòng)設(shè)備系統(tǒng)(例如，齒輪系統(tǒng))將驅(qū)動(dòng)設(shè)備耦接至旋轉(zhuǎn)支座，或者通過(guò)磁感應(yīng)耦接。

旋轉(zhuǎn)支座40包括中空的或者管狀的軸58，軸58被配置為允許樣本照明光束從其穿過(guò)，旋轉(zhuǎn)支座40還包括在其中安裝第一和第二反射鏡54、56的反射鏡支座體60。旋轉(zhuǎn)支座，具體地，中空軸58，經(jīng)由軸承59被安裝至外殼支撐結(jié)構(gòu)12。

第一反射鏡54將被投射通過(guò)中空軸的光束重定向到第二反射鏡56上，第二反射鏡以照明角度α將該光束重定向到位于樣本保持器18上的樣本1上。第一和第二反射鏡可以以固定關(guān)系布置在反射鏡支座體60內(nèi)。在其他變型中，第一反射鏡或者第二反射鏡或者兩者可以是可樞轉(zhuǎn)調(diào)整的。可樞轉(zhuǎn)調(diào)整的第一和/或第二反射鏡可用于將照明角度調(diào)整到選定的照明角度，和/或針對(duì)由于制造公差造成的或者由于運(yùn)輸和操作期間或使用中的失調(diào)造成的錯(cuò)位進(jìn)行調(diào)整。也可以通過(guò)調(diào)整樣本波束光路系統(tǒng)20的方向改變反射鏡26a、26b的角度來(lái)調(diào)整照明角度。角度可調(diào)整的反射鏡26a、26b可以是如圖8所例示的具有由半導(dǎo)體材料形成的以mems加工反射鏡的形式的微機(jī)械加工零件(如本領(lǐng)域中本身已知的)，以形成具有可電調(diào)整的傾斜角度的反射鏡。因而，角度可電調(diào)整的反射鏡允許對(duì)制造公差進(jìn)行補(bǔ)償，從而校準(zhǔn)該裝置，并且允許根據(jù)需要將照明角度動(dòng)態(tài)地或者靜態(tài)地調(diào)整至選定值。因而，有可能在制造之后并且每次使用之前對(duì)顯微鏡進(jìn)行自動(dòng)校準(zhǔn)，以校正使波束7b'偏離選定路徑7b的任何錯(cuò)位、制造公差、熱效應(yīng)和磨損，如圖2b中最佳地例示的。

樣本照明路徑系統(tǒng)中的角度可調(diào)整反射鏡還可以有利地實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本的折射特性的靜態(tài)或動(dòng)態(tài)調(diào)整。例如，可以對(duì)在其內(nèi)浸入樣本的液體的高度增量h的改變(參考圖5a到5c)進(jìn)行校正。隨著光束圍繞顯微鏡物鏡光軸a旋轉(zhuǎn)通過(guò)360°，可以應(yīng)用動(dòng)態(tài)校正，從而對(duì)在其中浸入樣本的液體介質(zhì)的相對(duì)于光束的路徑的不均勻的厚度進(jìn)行補(bǔ)償。這種不均勻厚度可以是由于樣本容器的非水平安裝造成的，或者可以是由于表面張力造成的液體的彎液面的存在造成的。

用于在來(lái)自光感測(cè)系統(tǒng)8的反饋信號(hào)的基礎(chǔ)上自動(dòng)控制反射鏡26a、26b的傾斜角的閉環(huán)調(diào)節(jié)系統(tǒng)可以被結(jié)合到顯微鏡的控制系統(tǒng)15的電子控制電路中。電子控制電路還可以控制旋轉(zhuǎn)波束機(jī)構(gòu)36和光源4。

在圖1b中例示的實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)支座允許在圖像捕獲期間使樣本照明波束在保持固定的照明角度α的同時(shí)旋轉(zhuǎn)360°。在旋轉(zhuǎn)反射鏡系統(tǒng)34期間，可以通過(guò)照相機(jī)捕獲選定數(shù)量的圖像幀，例如，在20個(gè)至200個(gè)的范圍內(nèi)的圖像幀，例如，大約100個(gè)圖像幀，每個(gè)圖像幀表示正被觀察的微小對(duì)象的不同視角。每幀表示一個(gè)二維圖像截面，該二維圖像截面表示正被觀察的樣本的平面截面中的折射率分布。可以編譯該二維部分，從而重構(gòu)出所觀察的微小對(duì)象的三維的基于折射率的圖像。如圖1b例示的實(shí)施例所關(guān)心的，依賴于旋轉(zhuǎn)支座40的旋轉(zhuǎn)速度的波束旋轉(zhuǎn)速度可以依據(jù)光感測(cè)系統(tǒng)8的幀捕獲頻率而調(diào)整。

根據(jù)本發(fā)明的具有預(yù)定照明角度α的旋轉(zhuǎn)的樣本照明波束相對(duì)于基于透鏡的常規(guī)解決方案尤其有利，因?yàn)樗试S以顯微鏡物鏡37的數(shù)值孔徑(na)所允許的盡量大的大照明角度α來(lái)照明微小對(duì)象。這在可以位于樣本保持器上并被顯微鏡查看的樣本的大小方面提供了大得多的靈活性，同時(shí)顯著減少了顯微鏡的制造成本和對(duì)沿著光路的光學(xué)元件的質(zhì)量的敏感性。此外，旋轉(zhuǎn)反射鏡系統(tǒng)不改變波束形狀，這與透鏡或者折射或衍射元件形成了對(duì)照，透鏡或者折射或衍射元件因而需要以極高的質(zhì)量來(lái)制造以減少波束整形。后者顯著增加了生產(chǎn)成本，與本發(fā)明提供的解決方案形成了對(duì)照。在本發(fā)明中，可以改變照明角度α，如果反射鏡以固定的關(guān)系在旋轉(zhuǎn)支座40中，則通過(guò)替換旋轉(zhuǎn)支座40來(lái)改變照明角度α，或者通過(guò)在旋轉(zhuǎn)支座中具有可旋轉(zhuǎn)的第一反射鏡54和/或第二反射鏡56來(lái)改變照明角度α，由此照明角度的極限由顯微鏡透鏡的數(shù)值孔徑確定。例如，對(duì)于0.8的數(shù)值孔徑而言，照明角度可以為55°，以及利用數(shù)值孔徑1.3，照明角度可以高達(dá)64°。該角度越高，靈敏度就越大，因而二維相位圖像以及因而由二維相位圖像重構(gòu)的三維相位圖像的分辨率就越大。

樣本照明波束的光路中的傾斜可調(diào)整反射鏡尤其有利，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S針對(duì)裝置壽命期間的錯(cuò)位、制造公差、磨損進(jìn)行調(diào)整，還允許針對(duì)各種變化，諸如在其中浸入所要觀察的物質(zhì)的液體的高度的變化，進(jìn)行靜態(tài)或者動(dòng)態(tài)的校正。

本發(fā)明的另一個(gè)尤其有利的特征是光程差(opd)調(diào)整裝置32，其具有傾斜可調(diào)整的透射或反射光偏離元件42、44、30a、30b、30c，這些元件允許對(duì)光程差進(jìn)行自動(dòng)且連續(xù)的校準(zhǔn)或調(diào)整，并且還允許在不必改變這些元件的情況下對(duì)opd走離進(jìn)行校正。在常規(guī)裝置中，依據(jù)光路的調(diào)整，具有不同厚度的一系列的透明圓片位于參考波束路徑中，然而，這不允許連續(xù)且精細(xì)的調(diào)整，也不允許對(duì)opd走離進(jìn)行校正。

參考圖7a到圖7c，首先從圖7a開(kāi)始，在第一變型中，旋轉(zhuǎn)波束機(jī)構(gòu)36包括具有第一反射鏡54和第二反射鏡56的反射鏡系統(tǒng)34，旋轉(zhuǎn)波束機(jī)構(gòu)36安裝在支座40中，支座40可旋轉(zhuǎn)地安裝在外殼支座12上，并且圍繞顯微鏡物鏡光軸a旋轉(zhuǎn)通過(guò)360°，以執(zhí)行對(duì)樣本1的圖像捕獲。第二方向改變反射鏡26b根據(jù)一種變型可以是可調(diào)整的，或者可以是固定的，其中，在可調(diào)整的變型中，可以變化波束的照明的角度α，以改變照明角度，或者保持固定的照明角并且對(duì)任何錯(cuò)位或失調(diào)進(jìn)行校正。在圖7b的第二變型中，樣本照明裝置的反射鏡系統(tǒng)34是固定的，第一反射鏡54基本上具有中央錐(centralcone)的形式，其將波束7b重定向至第二反射鏡56，也基本上形成了外錐形環(huán)(outerconicalring)。通過(guò)樣本波束光路系統(tǒng)20的第二方向改變反射鏡26b執(zhí)行波束旋轉(zhuǎn)，該反射鏡執(zhí)行連續(xù)地傾斜的圓形的移動(dòng)，以圍繞第一反射鏡54所形成的錐來(lái)旋轉(zhuǎn)照明波束，使得照明波束圍繞顯微鏡物鏡光軸a旋轉(zhuǎn)360°。這種解決方案的優(yōu)點(diǎn)在于有限的機(jī)械零件，但是與圖7a中例示的機(jī)械解決方案相比，這種解決方案對(duì)錐形反射鏡表面的曲率的準(zhǔn)確性的敏感性更大。

圖7c還例示了具有固定支座40的系統(tǒng)，其中，旋轉(zhuǎn)的照明波束通過(guò)中心可傾斜反射鏡54'致動(dòng)，該反射鏡54'執(zhí)行360°范圍的圓形的傾斜的移動(dòng)，并且將該波束朝向上方第一反射鏡56a反射，第一反射鏡56a向第二橫向反射鏡56b反射。

圖7d例示了樣本保持器18包括基座18b和在其上放置樣本的旋轉(zhuǎn)的樣本支承表面18a的實(shí)施例。因而，在該實(shí)施例中，在樣本照明波束7b保持在固定角度位置的同時(shí)，通過(guò)使樣本保持器繞著顯微鏡物鏡37的光軸a旋轉(zhuǎn)，使樣本照明波束7b相對(duì)于樣本是旋轉(zhuǎn)的。方向改變反射鏡26中的任一者或兩者可以是可樞轉(zhuǎn)操作的反射鏡tm1，例如，以mems部件的形式。

樣本照明過(guò)程p1–自動(dòng)校準(zhǔn)例程的示例：

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，顯微鏡可以有利地包括被配置為實(shí)施自動(dòng)校準(zhǔn)例程的軟件和電子控制系統(tǒng)，其中該例程的目的在于控制可傾斜(例如，mems)反射鏡26、tm1的檢測(cè)角度，以校正幾何錯(cuò)位，從而使得樣本照明波束7b在顯微鏡物鏡37的視場(chǎng)(fov)的中心射到顯微鏡物鏡37的焦平面上。這等同于使入射光光點(diǎn)在照相機(jī)8的傳感器表面上居中，相應(yīng)地在所捕獲的數(shù)字圖像上居中。從該校正可以隨著樣本旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)36的旋轉(zhuǎn)角度一起改變的意義上來(lái)講該校正是動(dòng)態(tài)的。

由于對(duì)于旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)36的每次旋轉(zhuǎn)而言，想要校正的錯(cuò)位是等同的，因而控制可傾斜反射鏡26a的信號(hào)相對(duì)于系統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)是周期性的。對(duì)于可傾斜反射鏡中的每個(gè)自由度i＝x，y而言，可以分別通過(guò)使用對(duì)應(yīng)于旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)頻率f0及其整數(shù)倍nf0的可數(shù)數(shù)量的離散傅里葉正弦和余弦系數(shù)和來(lái)描述該信號(hào)。由于該光學(xué)配置的旋轉(zhuǎn)特點(diǎn)，所以主要的傅里葉系數(shù)為dc項(xiàng)以及那些與基頻有關(guān)的項(xiàng)，和它們分別對(duì)應(yīng)角度偏差和反射鏡的與旋轉(zhuǎn)波束機(jī)構(gòu)具有相同頻率的圓形角運(yùn)動(dòng)。雖然為了完整描述所需的校正信號(hào)，更高階的項(xiàng)可能是必要的，但是在大多數(shù)情況下，只需要少量(大約10個(gè))的項(xiàng)，因而給出了一種用于存儲(chǔ)校正信息的高效存儲(chǔ)的手段，例如，可以將校正信息容易地存儲(chǔ)到在操作期間執(zhí)行實(shí)時(shí)校正的微控制器的有限存儲(chǔ)器中。

如果入射光光點(diǎn)在物鏡的視場(chǎng)(fov)中，那么可以通過(guò)對(duì)照相機(jī)圖像的四個(gè)象限中的像素值求和而定量地確定該光點(diǎn)的位置。取兩個(gè)沿對(duì)角線相對(duì)的象限的和之間的差值，則然后得到兩個(gè)值u，v，它們描述了光點(diǎn)相對(duì)于圖像中心的位置。在fov中心的光點(diǎn)將得到u＝v＝0。

值u、v可以被用作(例如針對(duì)pid控制的)反饋值。然后可以通過(guò)使樣本照明波束相對(duì)于樣本旋轉(zhuǎn)并通過(guò)使用pid以保持光點(diǎn)在照相機(jī)的數(shù)字圖像的中心而獲得校正信號(hào)軌跡。但是該過(guò)程可能導(dǎo)致下面的困難：(i)一般而言，光點(diǎn)起初不在照相機(jī)的視場(chǎng)內(nèi)，所以反饋環(huán)被破壞；以及(ii)由于pid控制的速度受到照相機(jī)幀速率的限制，所以可能需要非常大的幀速率以能夠在旋轉(zhuǎn)期間跟隨光點(diǎn)。換言之，在旋轉(zhuǎn)期間，可以發(fā)生的是，光點(diǎn)在兩個(gè)照相機(jī)幀之間徹底離開(kāi)照相機(jī)的視場(chǎng)，因而阻止pid能夠做出反應(yīng)。

為了規(guī)避這些困難，在圖8中例示的實(shí)施例中，可以實(shí)施如下文描述的兩步驟過(guò)程。在主要傅里葉系數(shù)是dc和基頻的假設(shè)下，第一步驟是獲取這些系數(shù)的近似值，從而使反饋環(huán)必須僅能夠?qū)Ρ憩F(xiàn)出低得多的幅度的較高次諧波項(xiàng)做出反應(yīng)。首先，針對(duì)旋轉(zhuǎn)波束機(jī)構(gòu)的兩個(gè)正交靜態(tài)位置θ1、θ2(圖9的流程圖中的“角度1和角度2”，下文的θ1和θ2)找到使光點(diǎn)在照相機(jī)8的視場(chǎng)中居中的可傾斜反射鏡的位置—參見(jiàn)步驟p1-1到p1-5以及p1-6到p1-10。該步驟是通過(guò)在搜索圖案中移動(dòng)可傾斜反射鏡(例如，mems反射鏡)直到光點(diǎn)進(jìn)入照相機(jī)的視場(chǎng)而完成的(步驟p1-2、p1-3以及p1-8、p1-9)。然后，pid控制被用于使光點(diǎn)在圖像中居中(步驟p1-4、p1-9)。因此獲得的反射鏡角位置可以被保存(步驟p1-5、p1-9)，并可以允許計(jì)算(步驟p1-11)對(duì)應(yīng)于角度偏差以及圓半徑和相位的dc和基頻傅里葉系數(shù)。這可以通過(guò)求解針對(duì)6個(gè)傅里葉系數(shù)a和b的6個(gè)方程完成：

這里，下標(biāo)m指示從角度1和角度2的測(cè)量獲得的x和y值，f是可傾斜反射鏡的x方向和y方向之間的靈敏度比率。

接下來(lái)，使旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)(例如，指圖1a、圖1b的實(shí)施例中例示的機(jī)械旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)的臂)連續(xù)旋轉(zhuǎn)(步驟p1-12)，并將先前確定的偏差和圓形運(yùn)動(dòng)動(dòng)態(tài)地應(yīng)用于可傾斜反射鏡tm1(步驟p1-13)。入射光光點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)的主要部分因而被減去，則殘余運(yùn)動(dòng)慢到足以被反饋環(huán)(即pid控制)跟隨(步驟p1-14)。位置可以被保存(p1-15)，并且在一個(gè)完整循環(huán)之后，反饋環(huán)的輸出信號(hào)的傅里葉變換(p1-17)可以然后被加(p1-18)到先前獲得的傅里葉系數(shù)(即，dc值和基頻值)上，從而得到完整的校正譜。

如有必要(p1-16)，可以執(zhí)行第二次迭代，現(xiàn)在將所獲得的所有傅里葉系數(shù)在旋轉(zhuǎn)期間應(yīng)用于反射鏡tm1(例如，mems反射鏡)，并使用電子控制系統(tǒng)的反饋環(huán)來(lái)再次使殘余的光點(diǎn)運(yùn)動(dòng)最小化。這在改變旋轉(zhuǎn)頻率時(shí)可以是有用的，因?yàn)閙ems反射鏡的響應(yīng)一般來(lái)說(shuō)是依賴頻率的，因此系數(shù)可以與旋轉(zhuǎn)波束的角速度一起改變。

樣本相位校正過(guò)程p2–用于基于樣本的且自動(dòng)的相位校正的可傾斜反射鏡的反饋環(huán)控制的示例。

該例程的目標(biāo)在于找到用于訪問(wèn)一定范圍的查找表格(lut)的參數(shù)，該查找表格用于對(duì)獲取的圖像的相位平坦度上的系統(tǒng)誤差進(jìn)行數(shù)值校正。照到樣本上的激光樣本照明波束可能稍微沒(méi)有準(zhǔn)直。這可能是由于準(zhǔn)直光學(xué)器件的錯(cuò)位造成的，但也是由于高斯波束的衍射受限發(fā)散造成的。當(dāng)改變?cè)摬ㄊ仨毿羞M(jìn)通過(guò)的樣本的光學(xué)厚度時(shí)，以散焦像差的形式修改顯微鏡物鏡的視場(chǎng)(fov)中的相前的曲率。已經(jīng)觀察到，該散焦像差依賴于旋轉(zhuǎn)照明臂的方位角度θ和樣本的光學(xué)厚度nh，其中，n是樣本介質(zhì)的折射率。由于像差不在不同的樣本之間改變，因而可以在給出θ和nh的情況下使用預(yù)定的lut來(lái)數(shù)值地校正散焦效應(yīng)。

可以從校準(zhǔn)過(guò)程p1的結(jié)果推導(dǎo)出樣本的光學(xué)厚度nh?？梢宰⒁獾?，可以執(zhí)行過(guò)程p1以補(bǔ)償樣本照明波束相對(duì)顯微鏡物鏡的視場(chǎng)(fov)的依賴于樣本厚度h1、h2(參見(jiàn)圖16d)的走離。

由于位于旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)的上游的傾斜反射鏡tm1是靜態(tài)安裝的，所以旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)38的旋轉(zhuǎn)將使得通過(guò)可傾斜反射鏡tm1進(jìn)行的校正是動(dòng)態(tài)的。但是，主要分量是對(duì)應(yīng)于圓柱坐標(biāo)中的恒定角度偏轉(zhuǎn)(以上的α′)的圓形校正。在過(guò)程p1中，通過(guò)第一階傅里葉系數(shù)和來(lái)描述該圓形運(yùn)動(dòng)，該運(yùn)動(dòng)的半徑通過(guò)下式給出

半徑r正比于角度α′上的偏移。由于斯涅耳定律的原因，在nh和α′之間不存在線性關(guān)系，因而在nh和r之間不存在線性關(guān)系。但是，如果使用查找表格(lut)來(lái)表征校正參數(shù)對(duì)nh的依賴性，則可以通過(guò)lut本身來(lái)補(bǔ)償任何非線性，只要在創(chuàng)建lut期間考慮了該非線性即可。在該情況下，lut參數(shù)可以通過(guò)半徑r直接定義。

該過(guò)程步驟可以被如下列舉：

p2-1在執(zhí)行了校準(zhǔn)過(guò)程p1之后，如以上所述的由第一階傅里葉系數(shù)和計(jì)算r。

p2-2更新將從其提取校正系數(shù)的對(duì)應(yīng)lut索引。

當(dāng)散焦校正被分開(kāi)地應(yīng)用于每個(gè)獲取的全息圖時(shí)，例如利用角度位置傳感器或者使用全息圖的載波頻率來(lái)在運(yùn)行時(shí)間中確定對(duì)應(yīng)的lut參數(shù)θ。

在一種變型中，以上過(guò)程是通過(guò)使用較低諧波(即，dc傅里葉分量)和較高諧波來(lái)執(zhí)行的，用于進(jìn)行走離補(bǔ)償，從而允許檢測(cè)出不均勻的樣本厚度(例如，發(fā)生了傾斜的包含液體的培養(yǎng)皿或者彎曲表面)。在這種情況下，以上的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性被破壞，并且lut參數(shù)r本身依賴于旋轉(zhuǎn)角：

在一種變型中，光學(xué)厚度nh由在p3/p4中執(zhí)行的光程長(zhǎng)度補(bǔ)償確定。其中，由樣本厚度nh引起的光程差通過(guò)移動(dòng)元件來(lái)補(bǔ)償。移動(dòng)元件的位置可以被反過(guò)來(lái)用于推導(dǎo)nh。與以上類似地，nh非線性地依賴于移動(dòng)元件位置，但是可以通過(guò)恰當(dāng)校準(zhǔn)的lut對(duì)該非線性進(jìn)行補(bǔ)償。反之亦然，通過(guò)過(guò)程p2推導(dǎo)出的nh的估值可以在p3/p4中被用于對(duì)該移動(dòng)元件定位。

參考波束校正過(guò)程p5–示例

該例程的目標(biāo)在于找到對(duì)于傾斜反射鏡tm2的最優(yōu)設(shè)置，從而使得所觀察到的全息干涉條紋具有使經(jīng)解調(diào)的相位圖像的信噪比(snr)得到優(yōu)化的頻率。在顯微鏡中，全息干涉條紋是通過(guò)在光感測(cè)系統(tǒng)8(例如，照相機(jī))上疊加兩個(gè)光束(即，對(duì)象光束和參考光束)而創(chuàng)建的。假設(shè)兩個(gè)光束是具有波矢和的平面波，那么照相機(jī)上的強(qiáng)度可以被寫(xiě)作：

其中并且zc是照相機(jī)的z位置。在兩個(gè)波束都表現(xiàn)出球面曲率時(shí)，半徑在兩種情況下是相同的，并且可以在疊加期間被減去。因而實(shí)際上可以通過(guò)單個(gè)波矢描述參考波束的方向。類似地，對(duì)象波束包括它已經(jīng)穿過(guò)的對(duì)象所調(diào)制的主要分量對(duì)象波束的載波頻率跟隨旋轉(zhuǎn)入射照明的方向，其平面內(nèi)分量描述了原點(diǎn)附近的圓，如圖14a中的虛線圓所描述的。箭頭表示參考波束的平面內(nèi)波矢。通過(guò)-1階圓和+1階圓示出了方程(1)中描述的強(qiáng)度圖案的傅里葉變換：通過(guò)靠近原點(diǎn)的黑點(diǎn)顯示常數(shù)項(xiàng)，以及第二和第三被加數(shù)分別是被稱為“+1階”和“-1階”的圓。為了準(zhǔn)確地處理該全息圖，所疊加的波的強(qiáng)度圖案的譜(即，以上的-1階和+1階圓，稱為載波頻率)必須與通過(guò)黑色中心點(diǎn)描述的常數(shù)項(xiàng)在空間上分開(kāi)。此外，整個(gè)圓應(yīng)當(dāng)在譜的單個(gè)象限中，從而加速處理，因?yàn)閮H單個(gè)象限是必須要注重的。

在參考波中引入傾斜對(duì)應(yīng)于將其表達(dá)式乘以線性相位函數(shù)，其方向通過(guò)矢量kr定義。因而經(jīng)傾斜的參考波變?yōu)閞t＝re-i(kr·x)，其中，x＝(ex,ey,ez)是笛卡爾坐標(biāo)系的單位矢量：

可以識(shí)別出，干涉項(xiàng)與在sfd中對(duì)應(yīng)不同調(diào)制的各種相位因數(shù)相乘。如果考慮沿平行于調(diào)制方向的軸ωx的調(diào)制頻率，則傾斜角度θ將引起對(duì)應(yīng)于下式的調(diào)制頻率

另一方面，探測(cè)器在x方向上具有對(duì)應(yīng)于ω＝1/δx的頻率的采樣能力，其中，δx是照相機(jī)的像素大小。因而，通過(guò)考慮奈奎斯特定理，能夠由探測(cè)器求解(resolve)的最大角度為

根據(jù)該方程，對(duì)于λ＝520nm的主激光線以及ccd照相機(jī)的標(biāo)準(zhǔn)像素大小(δx＝5μm)而言，最大可用角度為υ≤4o且α(2)≤2o。為了實(shí)現(xiàn)衍射波矢的測(cè)量，可以考慮在第一近似中將角度限于該值的一半，并且將載波頻率放到象限的中心處，因而得到α(2)≤1°。假設(shè)最大帶通偏移為帶通/8，因而512px/8＝64px，那么最大偏移導(dǎo)致δα(2)≤0.25°。

鑒于從可傾斜反射鏡tm2到光探測(cè)器8的最大距離為300mm，那么最大偏移導(dǎo)致δα(2)≤0.25°，使得橫向?qū)嶋H空間位移為tan(0.25°)*300mm＝1.3mm。因而，對(duì)于典型的傳感器大小1024*0.005mm＝5.12mm而言，6.4mm的波束大小應(yīng)當(dāng)足夠使載波頻率適應(yīng)僅α(2)而不損失實(shí)際空間“diameter_ref＝fov+最大位移”中的強(qiáng)度。

強(qiáng)度圖案的譜的位置依賴于對(duì)象波束7b和參考波束7a兩者的方向。由于顯微鏡物鏡37的與照相機(jī)8有關(guān)的幾何結(jié)構(gòu)是固定的，所以不能容易地調(diào)整對(duì)象波束的方向。但是，能夠通過(guò)使用可傾斜反射鏡，例如，tm2，調(diào)整參考波束的方向。用于找到對(duì)于可傾斜反射鏡tm2的最優(yōu)位置的過(guò)程可以如下：

p2-1首先運(yùn)行校準(zhǔn)過(guò)程p1和p3/p4，以確保存在可在光探測(cè)器8上觀察到的干涉條紋。

p2-2借助于旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)36(例如，在圖1b中例示的實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)支座臂40)使對(duì)象波束7b旋轉(zhuǎn)，以將對(duì)象波束的波矢的kx分量最小化。

p2-3計(jì)算光探測(cè)器(照相機(jī))8上的強(qiáng)度圖案的2dfft，并且由+1階計(jì)算載波頻率

p2-4將kc，x與預(yù)定義最小值kmin進(jìn)行比較。如果kc，x＞kmin，那么前進(jìn)至步驟p5-6。

p2-5增加傾斜反射鏡tm2，從而使參考波束7a更加陡峭地落在照相機(jī)8的x軸上。返回至步驟p5-3。

p2-6計(jì)算照相機(jī)上的強(qiáng)度圖案的2dfft，并且由+1階計(jì)算載波頻率

p2-7將kc，y與預(yù)定義最小值kmin進(jìn)行比較。如果kc，y＞kmin，那么前進(jìn)至步驟p5-10。

p2-8增加傾斜反射鏡tm2，從而使參考波束更加陡峭地落在照相機(jī)的y軸上。返回至步驟p5-7。

p2-9通過(guò)將在對(duì)象波束路徑中(位于樣本1的上游)的反射鏡tm1完全向一側(cè)傾斜而使得僅參考波束7a落到光探測(cè)器8上，使得對(duì)象波束7b消隱。

p2-10通過(guò)計(jì)算像素的在照相機(jī)感興趣區(qū)域(roi)中受到照明的部分而計(jì)算參考波束的填充因子ff。

p2-11將ff與預(yù)定義值ffmin進(jìn)行比較。如果ff≥ffmin，那么前進(jìn)至步驟p5-14。

p2-12將roi從未受照明的像素的平均位置移開(kāi)。返回至步驟p5-11。

p2-13使對(duì)象波束可傾斜反射鏡tm1返回至其默認(rèn)位置，從而在光探測(cè)器上看到對(duì)象波束。

p2-14連續(xù)地旋轉(zhuǎn)對(duì)象波束(例如，通過(guò)旋轉(zhuǎn)支座臂40)。

p2-15獲取多個(gè)全息圖，并計(jì)算它們的載波頻率的重心作為用于解調(diào)的帶通濾波器的中心。

質(zhì)量評(píng)估過(guò)程p6–參考圖12的示例

該例程的目標(biāo)在于通過(guò)提取光學(xué)波束的一些特征而對(duì)測(cè)量的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，當(dāng)沒(méi)有樣本存在于視場(chǎng)中時(shí)，特征為強(qiáng)度平均值波度和粗糙度。該過(guò)程的目標(biāo)在于給予i)關(guān)于波束強(qiáng)度分布的信息(可以用于診斷問(wèn)題)以及ii)留到過(guò)程p2之后才能確定的針對(duì)a_n^m的lut，其中，n≥2并且m≥1。如果樣本1被插入到對(duì)象波束7b的路徑，那么必須應(yīng)用照亮(lightened)過(guò)程來(lái)確保樣本基本上在特設(shè)的(ad-hoc)形狀中，從而允許進(jìn)行適當(dāng)?shù)?d測(cè)量。

依賴于所觀察到的樣本的類型、固定介質(zhì)的性質(zhì)以及光學(xué)表面的清潔度狀態(tài)，強(qiáng)度分布會(huì)或多或少地變動(dòng)。此外，即使在波束均勻性滿足了一定質(zhì)量要求時(shí)，由于光路中的殘留輕微錯(cuò)位的原因，每個(gè)全息圖的相位有可能不是理想化平坦的。為了實(shí)現(xiàn)最佳質(zhì)量的層析成像測(cè)量，一旦補(bǔ)償了第一階像差(即，活塞(piston)、傾斜和散焦)，就可以對(duì)更高階的像差進(jìn)行量化和數(shù)值補(bǔ)償，如過(guò)程p3或p4中所描述的。

在裝置的該校準(zhǔn)階段中，已經(jīng)執(zhí)行了過(guò)程p1、p2、p3/p4和p5?，F(xiàn)在我們可以確保整個(gè)視場(chǎng)沒(méi)有可以作為對(duì)象和/或參考波束的強(qiáng)度分布的不均勻性而出現(xiàn)的缺陷?？商娲?，如圖18所述，可以在應(yīng)用p1、p3/p4和p5之后在空的fov上執(zhí)行p6，從而得到針對(duì)唯一歸因于顯微鏡的光學(xué)特性的參數(shù)a_n^m的lut。隨后的過(guò)程p2用于對(duì)歸因于樣本引起的光學(xué)特性的a_2^0進(jìn)行更新。

因而，這里的方法是首先在參考波束7a光路內(nèi)使用傾斜反射鏡tm2來(lái)相對(duì)于光探測(cè)器8遮蔽參考波束。然后，對(duì)象波束7b可以被表征。在通過(guò)傾斜反射鏡tm1遮蔽住對(duì)象波束時(shí)，可以針對(duì)參考波束執(zhí)行相同的過(guò)程。如果在該點(diǎn)處檢測(cè)到的誤差，則可以啟動(dòng)過(guò)程p7，否則可以執(zhí)行層析成像獲取，意味著獲取和分析一系列的全息圖。

一旦波束均勻性滿足了某些預(yù)定義的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，則記錄和分析一系列的全息圖，如先前描述的那樣。根據(jù)在相對(duì)于樣本1旋轉(zhuǎn)對(duì)象波束的循環(huán)期間取得每個(gè)全息圖，再次在平坦度和粗糙度方面對(duì)由光探測(cè)器取得的波束信號(hào)的相位進(jìn)行計(jì)算和表征。對(duì)于每個(gè)旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)角度而言，可以計(jì)算對(duì)zernicke多項(xiàng)式r_n^m的最小平方擬合，以產(chǎn)生a_n^m參數(shù)的值的查找表格(lut)。根據(jù)該lut，能夠取得針對(duì)旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)的每個(gè)取向的平坦相位，并能夠?qū)崿F(xiàn)層析成像重建(仍然是空視場(chǎng)的)。此外，該方法傾向于根據(jù)該3d測(cè)量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)表征，可以再次在平坦度和粗糙度方面將其與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。

誤差分析過(guò)程p7–參考圖13的示例

在出現(xiàn)誤差時(shí)，啟動(dòng)該過(guò)程以解決問(wèn)題或者盡可能多的診斷問(wèn)題從而將有用信息以日志文件的形式傳送至計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)(這里稱為云)。如果在幾個(gè)測(cè)試?yán)讨螅b置仍然沒(méi)有適當(dāng)?shù)毓ぷ?，那么可能需要維修。

這里，我們只考慮以上描述的從p1到p6的例程中的故障。該誤差例程p7描述了系統(tǒng)如何能夠自我診斷問(wèn)題并且解決問(wèn)題或者向用戶給出用于解決問(wèn)題的基本且精確的指令?？紤]兩種類型的問(wèn)題：i)與樣本有關(guān)聯(lián)的問(wèn)題，或者是樣本的性質(zhì)(吸收、厚度)，或者是樣本浸入其中的介質(zhì)的性質(zhì)(擴(kuò)散或者表現(xiàn)出漂浮碎片)，或者ii)與光學(xué)器件有關(guān)聯(lián)的問(wèn)題，例如，由于灰塵或錯(cuò)位。

在檢測(cè)到阻止執(zhí)行適當(dāng)?shù)膶游龀上駵y(cè)量或者只是阻止完成過(guò)程p1到p6中的一個(gè)的誤差時(shí)，方法如下。在第一步驟中，裝置連接至云，以上傳包含元數(shù)據(jù)的日志文件。第二步驟是通過(guò)使可傾斜反射鏡tm1發(fā)生樞轉(zhuǎn)而執(zhí)行對(duì)象波束7b的2d的盲全局搜索。該搜索被說(shuō)成是盲搜索，是因?yàn)槲唇o出任何具體的約束來(lái)限制在tm1的可能傾斜角度范圍內(nèi)的搜索圖案。該過(guò)程或者在顯微鏡開(kāi)啟期間發(fā)生(例如，在無(wú)樣本1的情況下)，或者在已經(jīng)將樣本插入樣本觀察區(qū)17中之后發(fā)生。

稍后，可以對(duì)參考波束可傾斜反射鏡tm2到tm4進(jìn)行受約束的全局搜索，而約束則是由依據(jù)tm2的可移動(dòng)元件或角度范圍的tm3和tm4的平行取向給出的。該步驟的目標(biāo)在于識(shí)別未被先前的步驟解決的問(wèn)題是否實(shí)際上來(lái)自于參考光路。該搜索在這里是受約束的，因?yàn)楦鞣瓷溏R的運(yùn)動(dòng)根據(jù)設(shè)計(jì)是按照線性定律發(fā)生聯(lián)系的。它還允許減少搜索的復(fù)雜度，從而加快搜索。

在執(zhí)行完這兩次全局搜索之后，可以完成過(guò)程p6，以評(píng)估測(cè)量的質(zhì)量。從那里開(kāi)始，問(wèn)題或者得到了解決，或者需要進(jìn)一步分析，該分析是然后針對(duì)旋轉(zhuǎn)光引導(dǎo)系統(tǒng)的不同取向來(lái)執(zhí)行的?？梢詫?duì)依賴于樣本照明的一系列全息圖實(shí)施單獨(dú)的且計(jì)算密集型的分析。其目標(biāo)在于明確該問(wèn)題是否具有取向依賴性。

于是，能夠推導(dǎo)出該問(wèn)題來(lái)自于光學(xué)器件還是樣本，并且可以給用戶導(dǎo)向性指令。如果質(zhì)量還是不令人滿意，那么可以遠(yuǎn)程訪問(wèn)該裝置，以進(jìn)行更高級(jí)的分析。如果在該過(guò)程之后問(wèn)題仍然存在，那么該裝置將需要特別注意。

圖18例示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的顯微鏡的操作中各種過(guò)程p1到p7的全面實(shí)施的示例。

在下文說(shuō)明在上述過(guò)程p1到p7的每一個(gè)中由光感測(cè)系統(tǒng)捕獲的各全息圖的幅度和相位分析?？梢园凑昭笫[皮模型查看不同層級(jí)的反饋，該模型的外表面描述了最易訪問(wèn)的層級(jí)，而最里面的核心是最不易訪問(wèn)的層級(jí)。訪問(wèn)每一層級(jí)首先要求所有外側(cè)的反饋層級(jí)的成功對(duì)準(zhǔn)。具體地，可以通過(guò)使用如圖14b中示出的具有強(qiáng)度、相干性、干涉條紋頻率和相位的相繼層級(jí)的洋蔥皮模型來(lái)描述反饋控制的不同層級(jí)。每個(gè)反饋層級(jí)可以在所呈現(xiàn)的校準(zhǔn)過(guò)程中的一個(gè)或多個(gè)中被訪問(wèn)，并且不僅表示對(duì)于校準(zhǔn)質(zhì)量的監(jiān)視器，還表示在向內(nèi)前進(jìn)之前必須優(yōu)化的參數(shù)：必須成功地校準(zhǔn)所有的外層才能評(píng)估下一個(gè)層。最內(nèi)層，成像相位，是被最后用于顯微鏡中對(duì)生物學(xué)樣本成像的值。第一層，強(qiáng)度，是調(diào)整起來(lái)最不復(fù)雜的參數(shù)，因?yàn)樗恍枰渌麉?shù)的對(duì)準(zhǔn)。如果對(duì)象波束和參考波束干凈利落地通過(guò)波束路徑內(nèi)的所有光學(xué)元件的通光孔徑，則該波束的強(qiáng)度得到優(yōu)化。起初，必須僅一次就找到適當(dāng)?shù)膶?duì)準(zhǔn)，但是在其他反饋參數(shù)的對(duì)準(zhǔn)期間，每次修改配置，就必須調(diào)整強(qiáng)度。強(qiáng)度對(duì)準(zhǔn)的一個(gè)特別情況是校準(zhǔn)過(guò)程p1，因?yàn)樗枰_定動(dòng)態(tài)的校正，該動(dòng)態(tài)的校正要確保在樣本照明波束的旋轉(zhuǎn)期間對(duì)象波束的強(qiáng)度最大值保持在顯微鏡物鏡的fov中居中。該強(qiáng)度層還可以提供有關(guān)樣本和系統(tǒng)配置的信息。例如，在過(guò)程p1中獲得的系數(shù)可以給出對(duì)樣本的光學(xué)厚度的估算，如在p2中被使用的。而且，在反射鏡tm4既可傾斜，又可平移的實(shí)施例中，參考波束路徑中的可傾斜反射鏡tm3的使光穿過(guò)可傾斜反射鏡tm4的通光孔徑的角度能夠給出可平移反射鏡tm4的位置的近似。

如果對(duì)象波束和參考波束的光程長(zhǎng)度比光源的相干長(zhǎng)度短，那么第二層，相干性，得到優(yōu)化。這等同于對(duì)象波束和參考波束之間的固定相位關(guān)系，并且是觀察干涉條紋所需要的。顯然，為了獲得干涉條紋，對(duì)象波束和參考波束兩者的強(qiáng)度必須得到適當(dāng)優(yōu)化，即，必須成功對(duì)準(zhǔn)外層。反過(guò)來(lái)，在對(duì)光程長(zhǎng)度優(yōu)化之后，應(yīng)當(dāng)對(duì)強(qiáng)度對(duì)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)。除了提供對(duì)于干涉的必備條件之外，用于最優(yōu)相干性的配置也是對(duì)于對(duì)象波束路徑中的樣本的光學(xué)厚度的測(cè)量。

第三層，干涉條紋頻率，由入射到光感測(cè)系統(tǒng)上的參考波束和對(duì)象波束的相對(duì)角度定義。與強(qiáng)度形成對(duì)照的是，該層受到波束路徑中的光學(xué)元件被穿過(guò)的角度的影響。如果干涉條紋頻率大到足以使得圍繞所觀察的全息圖階(hologramorder)的通帶中的經(jīng)調(diào)制的圖像信息不與0階區(qū)域重疊，則該層將得到優(yōu)化。如果干涉條紋方向使得，對(duì)于旋轉(zhuǎn)樣本照明波束相對(duì)于樣本的所有旋轉(zhuǎn)位置而言，對(duì)應(yīng)譜內(nèi)的載波頻率峰均處于同一象限內(nèi)，從而加快了處理，則干涉條紋頻率得到進(jìn)一步優(yōu)化。在修改該層之后，必須對(duì)強(qiáng)度以及也有可能的相干性的適當(dāng)對(duì)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

干涉條紋頻率，即，全息圖的傅里葉變換中的載波峰值的位置，可以在運(yùn)行時(shí)間中(即，在獲取期間)，用于提取有用信息。例如，峰的最大值限定了對(duì)于解調(diào)必須使用的頻率。在使樣本照明波束相對(duì)于樣本轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，峰相對(duì)于其旋轉(zhuǎn)的重心的位置可以被用于計(jì)算旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)相對(duì)于樣本的角位置，以用于基于查找表(lut)的相位校正。

最內(nèi)層，經(jīng)解調(diào)的圖像的相位，可以用于重建樣本1的圖像。該值是通過(guò)獲取全息圖，向其譜中的先前確定的通帶應(yīng)用濾波器以及成功解調(diào)載波頻率而獲得的?？梢钥闯?，在評(píng)估相位之前必須優(yōu)化所有外層。鑒于空的樣本包含介質(zhì)但不包含生物學(xué)對(duì)象，如果所得到的圖像的相位具有最佳平坦度，則參數(shù)得到優(yōu)化。該相位平坦度可能因?yàn)榇巫顑?yōu)校正的顯微鏡物鏡而降低質(zhì)量，也因顯微鏡中的不正確放置的光學(xué)元件而降低質(zhì)量，諸如：

i.使非準(zhǔn)直波束穿過(guò)平的窗口。

ii.使波束斜著(即不平行于透鏡的光軸)通過(guò)透鏡。

可以使用優(yōu)化例程來(lái)最小化上述像差，尤其是ii號(hào)像差，以控制在光學(xué)元件上的波束位置和入射角度。如果提供了無(wú)樣本參考，則可以數(shù)值地校正殘余相位誤差。

參考圖15，下文說(shuō)明對(duì)于自動(dòng)校準(zhǔn)步驟的相位校正。通過(guò)控制可傾斜反射鏡執(zhí)行用于光學(xué)厚度估算的對(duì)象掃描反饋。它允許基于樣本且自動(dòng)化的相位校正，意味著無(wú)背景識(shí)別的獨(dú)立于用戶的校正，該校正能夠處理高細(xì)胞匯合。

可以描述在成像過(guò)程期間引入的有關(guān)從對(duì)象到圖像的相位轉(zhuǎn)移的光學(xué)像差。假設(shè)通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)的相位偏差來(lái)修改對(duì)象的相位因此，光場(chǎng)能夠被寫(xiě)成

這里，索引i表示圖像，o表示對(duì)象，以及s表示光學(xué)系統(tǒng)。如果以形式的像差是已知的，那么可以得到校正相位因子利用校正相位因子能夠重建未失真的對(duì)象場(chǎng)：

可以在被稱為zernike多項(xiàng)式m＝-n...n的一系列多項(xiàng)式中將相位偏差展開(kāi)。這些多項(xiàng)式在圖15a中描繪。相應(yīng)地，利用校正因子能夠被減少成一組參數(shù)為了在測(cè)量之后對(duì)像差進(jìn)行數(shù)值校正，必須確定參數(shù)

對(duì)于空的樣本，即沒(méi)有生物學(xué)樣本浸入在其中的介質(zhì)(例如，液體)而言，是恒定的，因而例如通過(guò)全息顯微鏡測(cè)得的相位描述了純像差。對(duì)呈現(xiàn)的像差的分析指示其相應(yīng)的來(lái)源。z1像差，即傾斜，僅依賴于照明的取向θ和α，并且它們的幅值可以根據(jù)每個(gè)全息圖中的載波頻率直接確定。大部分更高階的像差(m≥2)是成像系統(tǒng)特有的，而與樣本無(wú)關(guān)，因而可以在沒(méi)有樣本的情況下表征這些像差，其對(duì)應(yīng)的校正參數(shù)被存儲(chǔ)在參考表格中。特別情況是散焦像差其由系統(tǒng)定義的分量和依賴于樣本厚度nh和照明方向的分量構(gòu)成。因而，對(duì)應(yīng)的校正參數(shù)必須與針對(duì)nh和θ的附加參數(shù)一起存儲(chǔ)到參考表格中。

可以直接從全息圖的傅里葉變換(特定頻域，sfd)或者通過(guò)在實(shí)際空間中最小平方擬合到經(jīng)濾波以僅包含非零階的全息圖頻率的相位(或者通過(guò)兩種方法的組合)來(lái)確定針對(duì)每個(gè)獲取的全息圖的傾斜(z1像差，a_1^(±1)因子)。校正因子正比于全息圖的載波峰值的位置，相應(yīng)地，正比于通過(guò)最小平方擬合的平面的斜率。

載波頻率(相應(yīng)地，sfd中的峰值位置)可以被用于確定旋轉(zhuǎn)波束機(jī)構(gòu)相對(duì)于樣本的角度位置θ。這里，在旋轉(zhuǎn)波束機(jī)構(gòu)的完整旋轉(zhuǎn)期間，載波峰值的位置必須是相對(duì)于由載波峰值描述的圓的重心來(lái)確定的。在給定三個(gè)載波峰值的情況下，可以容易地找到該中心：重心是連接三個(gè)峰值位置的線段的中垂線的交點(diǎn)。在給定旋轉(zhuǎn)波束機(jī)構(gòu)的位置θ的情況下，可以通過(guò)將θ(和樣本厚度)插入到查找表格中而獲得剩余的校正因子a_n^m。該查找表格先前根據(jù)關(guān)于透明、均勻的樣本所做的校準(zhǔn)測(cè)量(諸如在過(guò)程p6中)來(lái)填充。對(duì)于各種樣本介質(zhì)厚度nh和旋轉(zhuǎn)波束機(jī)構(gòu)角度θ而言，未經(jīng)校正的相位得到測(cè)量，以及對(duì)zernicke多項(xiàng)式r_n^m的最小平方擬合得到查找表格值。

參考圖15b和15c，例示了在不同樣本條件下像散和散焦的典型測(cè)量結(jié)果，該典型測(cè)量結(jié)果由作為時(shí)間(在旋轉(zhuǎn)期間)的函數(shù)的更高階展開(kāi)表示。在圖15b中，通過(guò)蓋玻片提供樣本，對(duì)于蓋玻片而言，散焦僅是旋轉(zhuǎn)的函數(shù)，散焦的偏差的幅值是由光學(xué)厚度確定的，像散在時(shí)間上為常數(shù)但依賴于旋轉(zhuǎn)。在圖15c中，樣本在陪替氏培養(yǎng)皿中，由此散焦是旋轉(zhuǎn)和蒸發(fā)(隨時(shí)間而改變)的函數(shù)，散焦的偏差的幅值由樣本的光學(xué)厚度和可能的彎液面確定，像散在時(shí)間上為常數(shù)但依賴于旋轉(zhuǎn)。

這些測(cè)量結(jié)果告訴我們散焦的平均幅值隨著樣本的光學(xué)厚度而變化。因此，通過(guò)變化樣本照明路徑中的可傾斜反射鏡的角度而掃描的目標(biāo)是確定樣本的光學(xué)厚度，并借助這些手段確定散焦的幅值。在水溶液的情況下，彎液面可能引入附加的散焦。為了得到最佳的散焦估算，例如散焦的theta依賴性(校準(zhǔn)期間)的測(cè)量結(jié)果(尤其)可以用作彎液面估算。

參考圖16a-16c，說(shuō)明以上提及的前因子的估算。在變化可傾斜反射鏡的角度的掃描中，由光感測(cè)系統(tǒng)的光傳感器(例如，照相機(jī))捕獲的光束信號(hào)的測(cè)量結(jié)果提供下面的信息：如果入射光的角度α使得光束直接落入視場(chǎng)中，則在視場(chǎng)中心，即(x＝0)處的強(qiáng)度將示出最大值。這是圖16a中針對(duì)實(shí)線顯示的情況。對(duì)于樣本的變化的光學(xué)厚度厚度nh而言，該最大值將偏移到不同的α，如圖16b中所顯示的。角度α和光學(xué)厚度之間的關(guān)系可以使用費(fèi)馬定理給出，并且涉及使針對(duì)給定幾何結(jié)構(gòu)的光學(xué)路徑ψ最小化：

這里，(x0，y0)是從可傾斜反射鏡反射出去的波束的位置，(x1，y1)是進(jìn)入樣本介質(zhì)的波束的位置。因而可以得到α和光學(xué)厚度nh之間的非線性關(guān)系，但是對(duì)于光學(xué)厚度相較于到反射鏡的距離小的情況而言，響應(yīng)接近于線性，如圖16c中針對(duì)顯微鏡中的典型值所示出的。

通過(guò)使用可傾斜反射鏡而減少機(jī)械上的公差并且補(bǔ)償熱擴(kuò)散的示例：

參考圖17a，其表示了樣本照明波束旋轉(zhuǎn)頭架構(gòu)的例示，以探查以下討論的機(jī)械公差的影響。改變參數(shù)包括：

-alpha：中心反射鏡54相對(duì)于光軸a的角度。

-beta：旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)28相對(duì)于結(jié)構(gòu)的角度。

-theta：外圍反射鏡56相對(duì)于在中立位置上的光軸的角度。

-d：中心反射鏡54在其法線方向上的位置。

-d'：兩個(gè)反射鏡54、56之間的距離。

-d"：臂相較于空心軸58的水平位置。

所選擇的標(biāo)準(zhǔn)將處于mems反射鏡26b補(bǔ)償角的一定公差(可以例如是0.1°)以內(nèi)，該公差對(duì)應(yīng)于其法線方向關(guān)于其機(jī)械樞轉(zhuǎn)軸的靜態(tài)誤差。

研究了誤差的不同組合，并且在圖17b的表格中示出了結(jié)果。例如，被作為目標(biāo)的公差可以是：

-d/d'和d"：0.1mm(不是非常關(guān)鍵)

-alpha/beta/theta：0.025°，其對(duì)應(yīng)于0.0055mm的幾何公差。

如前所述，還可以借助于至少部分地基于通過(guò)光感測(cè)系統(tǒng)捕獲的光束信號(hào)的反饋環(huán)，對(duì)opd系統(tǒng)的可傾斜透射或反射元件進(jìn)行控制，以調(diào)整和校正參考波束的路徑。

更一般地，本發(fā)明的一個(gè)重要方面是借助于電子控制系統(tǒng)，使用來(lái)自通過(guò)光感測(cè)系統(tǒng)捕獲的波束信號(hào)的反饋來(lái)通過(guò)控制系統(tǒng)自動(dòng)控制一個(gè)或多個(gè)傾斜的可調(diào)整反射鏡的角度，以便對(duì)樣本照明波束或參考波束或樣本照明波束及參考波束兩者的不希望出現(xiàn)的偏離進(jìn)行校正，或者以便創(chuàng)建想要的偏離(例如，以便控制opd)。樣本照明路徑中的偏離可能是由于制造公差、顯微鏡在其使用壽命內(nèi)的部件的磨損、熱膨脹效應(yīng)或者樣本介質(zhì)中的變化(諸如，液體高度、彎液面曲率、非水平液體表面以及其他因素的變化)造成的。參考波束的偏離也可能是由于制造公差、顯微鏡在其使用壽命內(nèi)的部件的磨損以及熱膨脹效應(yīng)造成的，以及還有由于用于控制光程差的期望的偏離造成的。通過(guò)讀取通過(guò)光感測(cè)系統(tǒng)捕獲的波束信號(hào)而控制在樣本照明波束或者參考波束中的這些偏離，有利地提供了利用極小的設(shè)置以簡(jiǎn)單、容易、實(shí)惠的方式獲得高質(zhì)量圖像的自動(dòng)化方式。

動(dòng)態(tài)opd過(guò)程p8–參考圖5f、5g以及2c、2d的示例

由于在機(jī)械上的缺陷或者僅僅瑕疵的原因，當(dāng)旋轉(zhuǎn)掃描臂在全息圖的獲取期間正在完成360°旋轉(zhuǎn)時(shí)，樣本波束的光程長(zhǎng)度(opl)可能發(fā)生變化。如果這些缺陷導(dǎo)致了限于激光的相干長(zhǎng)度的一小部分的opl變化，則關(guān)于圖4h-4i描述的過(guò)程可以用于實(shí)現(xiàn)針對(duì)掃描臂的任何取向(參見(jiàn)圖2c和圖2d)的最優(yōu)干涉條紋對(duì)比度。

但是，該缺陷可以導(dǎo)致光程長(zhǎng)度的變化超過(guò)相干長(zhǎng)度，從而在臂的某個(gè)取向上極大地減少，或者甚至消除干涉條紋對(duì)比度，那么使得在這些位置上的相位計(jì)算失去意義。

為了對(duì)此進(jìn)行補(bǔ)償，并找到如圖5g中例示的最小opl，通過(guò)顯微鏡的控制系統(tǒng)對(duì)opl進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)整，以保持參考波束和樣本波束之間的opd遠(yuǎn)低于激光源的相干長(zhǎng)度并確保沿旋轉(zhuǎn)掃描過(guò)程的最佳干涉條紋對(duì)比度。

用于定義可以與旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)36同步地應(yīng)用于opd系統(tǒng)32的參數(shù)的方法包括以下步驟：

a)將樣本放置到樣本保持器上，

b)使旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)位于第一位置，

c)使被配置為指引參考波束的所述至少一個(gè)可樞轉(zhuǎn)操作方向改變反射鏡(tm3、tm4)位于第一位置，

d)在樣本波束被關(guān)掉時(shí)，測(cè)量通過(guò)光感測(cè)系統(tǒng)捕獲的參考波束信號(hào)的位置，

e)打開(kāi)樣本波束，并測(cè)量通過(guò)光感測(cè)系統(tǒng)捕獲的信號(hào)的干涉條紋對(duì)比度，

f)使所述至少一個(gè)可樞轉(zhuǎn)操作方向改變反射鏡(tm3、tm4)的位置改變一個(gè)增量，

g)重復(fù)步驟d)到f)直到增量之和對(duì)應(yīng)于可樞轉(zhuǎn)操作方向改變反射鏡(tm3、tm4)的預(yù)定義的工作范圍，

h)比較針對(duì)每個(gè)增量獲得的干涉條紋對(duì)比度測(cè)量結(jié)果，并將可樞轉(zhuǎn)操作方向改變反射鏡(tm3、tm4)的針對(duì)具有最高值的干涉條紋對(duì)比度測(cè)量結(jié)果的位置連同旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)的位置存儲(chǔ)到控制系統(tǒng)的存儲(chǔ)器的查找表格(lut)中；

j)使旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)一個(gè)小的增量，并重復(fù)步驟c)到h)直到旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)完成了360°旋轉(zhuǎn)。

因而，可以創(chuàng)建用于提供參數(shù)的查找表格(lut)，能夠應(yīng)用該參數(shù)來(lái)與旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)36同步地動(dòng)態(tài)地控制opd系統(tǒng)32。

作為示例，在圖5f的實(shí)施例中例示了該過(guò)程，該過(guò)程包括下面的步驟：

一旦樣本放置在xy臺(tái)上(步驟p8-1)，就將旋轉(zhuǎn)臂40放置于其停放位置(步驟8-2)。

之后，啟動(dòng)(步驟p8-3)過(guò)程p4(在圖5e中例示)，從而找到導(dǎo)致最大干涉條紋對(duì)比度的該臂位置的最優(yōu)opd位置。

保存針對(duì)該臂位置的opd系統(tǒng)參數(shù)(步驟p8-4)。

然后，使掃描臂旋轉(zhuǎn)一個(gè)小的增量(步驟p8-5)，并且然后再次啟動(dòng)過(guò)程p4。再次存儲(chǔ)參數(shù)。

重復(fù)先前的步驟p8-3到p8-5直到臂返回到其停放位置。

因此創(chuàng)建了查找表格(lut)(步驟p8-6)，從而收集必須與旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)36同步地應(yīng)用于opd系統(tǒng)32的參數(shù)。

附圖標(biāo)記列表

顯微鏡2

(相干)光源4(激光器)

參考波束7a

樣本照明波束7b(本文也稱為對(duì)象波束)

光束引導(dǎo)系統(tǒng)6

分束器14

樣本波束光路20

方向改變反射鏡26,26a,26b

可傾斜反射鏡tm1(mems)

樣本照明裝置28

反射鏡系統(tǒng)34

第一反射鏡54

第二反射鏡56

旋轉(zhuǎn)波束系統(tǒng)36

驅(qū)動(dòng)裝置38

傳動(dòng)裝置39(皮帶)

支座40(旋轉(zhuǎn)臂——圖1a、圖1b、圖1d、

圖7a的實(shí)施例，/固定的——圖7b、圖7c的實(shí)施例)

可操作的反射鏡

中空軸58

軸承59

反射鏡支座體60

被配置為旋轉(zhuǎn)的樞轉(zhuǎn)波束

顯微鏡物鏡37

參考波束光路22

方向改變反射鏡30

可傾斜反射鏡tm2、tm3、tm4(例如，mems反射鏡)

反射鏡表面61

樞轉(zhuǎn)軸63

光程差(opd)調(diào)整裝置32

第一光偏離元件42

第二光偏離元件44

樞轉(zhuǎn)支座46、48

樞轉(zhuǎn)軸49、51

齒50

透鏡65(本文也稱為場(chǎng)鏡)

波束重聚器16

光感測(cè)系統(tǒng)8(探測(cè)器、照相機(jī))

圖像數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)10

外殼/支承結(jié)構(gòu)12

樣本觀察區(qū)17

樣本保持器18

高度調(diào)整機(jī)構(gòu)

樣本光

控制系統(tǒng)15

反射鏡(例如，mems反射鏡)傾斜角控制

反射鏡旋轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)控制

源控制

照相機(jī)控制

樣本1

封閉容納系統(tǒng)3a

基座11

蓋玻片9

觀察平面13

密封件7

開(kāi)口皿3b

緩沖介質(zhì)5