專利名稱：：包含高濃度的生物活性分子的組合物及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含高濃度的諸如質(zhì)粒的生物活性分子的大批組合物(bulkcomposition)以及制備這樣的組合物的工藝。
背景技術(shù)：
：在細胞中產(chǎn)生并從細胞分離的生物活性分子存在許多用途。通過引用在此并入的美國公布序列號20050014245公開了用于生物材料制備的設(shè)備和方法。生物活性分子包括蛋白和核酸分子。在活細胞中制備這樣的分子提供了相對可選擇的制備方法的許多優(yōu)勢，但當從細胞中提取生物活性分子時出現(xiàn)了分離和純化問題。在細胞中存在多種組分，這阻礙實現(xiàn)感興趣的生物活性分子的高產(chǎn)率，也表示可能的不希望的污染物進入最終產(chǎn)品。由于非病毒性基因療法和DNA疫苗領(lǐng)域的出現(xiàn)，質(zhì)粒制備是感興趣的領(lǐng)域。質(zhì)粒是大的并且復(fù)雜的高分子，除非斷裂，其保持超螺旋DNA結(jié)構(gòu)。與其使用合成方法，在多種情況下，在生物系統(tǒng)中制備它們并隨后從那些系統(tǒng)中分離并純化它們是更具有成本效益的。質(zhì)粒的生物制備通常采取使包含感興趣的質(zhì)粒的大腸桿菌(Escherichiacoli)("E.coli")發(fā)酵的方式。細胞溶胞和隨后的用于制備用于純化的工藝流的處理步驟是在任何質(zhì)粒工藝中最困難、復(fù)雜和重要的步驟。在該過程中，對于每次質(zhì)粒制備的運行定義產(chǎn)率和質(zhì)量。對最佳方法的探求已經(jīng)成為獲得商業(yè)能力可接受的工藝的障礙，所述最佳方法是連續(xù)的、可縮放的并且產(chǎn)生可以不管質(zhì)粒尺寸以高濃度配制的高質(zhì)量產(chǎn)品。使用堿和洗滌劑溶解細菌以純化質(zhì)粒是常用的技術(shù)。令人遺憾地，該方法對于大規(guī)模制備(或放大生產(chǎn))呈現(xiàn)出顯著的挑戰(zhàn)。首先，含有溶胞溶液的懸浮細胞的完全混合在小規(guī)模下通過簡單地使包含該細胞的容器渦旋或顛倒而容易操控。然而，這在其中體積可以在幾十升或幾百升范圍內(nèi)的大規(guī)模下是不現(xiàn)實的。用于混合大體積液體的常用技術(shù)，例如葉輪混合，是有問題的，因為當某些細胞在最初的混合后開始溶解時，它們釋放顯著增加溶液粘度的基因組DNA。這種粘度上的增加顯著妨礙了進一步混合。另一挑戰(zhàn)在于，在加入堿性溶胞溶液后在高PH下過多的孵育可導(dǎo)致質(zhì)粒的永久變性，使其不適于大部分隨后的用途，特別是用于治療目的的用途。此外，眾所周知，在該步驟的混合應(yīng)當是完全的但足夠溫和的(即，低剪切)以防止大量來自絮狀沉淀的物質(zhì)進入含質(zhì)粒的溶液。大量的宿主基因組DNA和內(nèi)毒素存在于絮狀沉淀中并且如果它們與質(zhì)?；旌希鼈冊陔S后的純化期間可能難以從質(zhì)粒中分離。因此，質(zhì)粒的大規(guī)模制備以某種方式使大量細胞暴露于溶胞溶液、使其混合并中和溶胞產(chǎn)物以最優(yōu)化質(zhì)粒產(chǎn)率、最小化質(zhì)粒降解和最大化除去其他細胞成分以便該物質(zhì)可被進一步純化而以相對大的體積制備高濃度、高質(zhì)量、高純度的最終產(chǎn)品。存在多種純化質(zhì)粒的現(xiàn)有方法；然而，這些方法不適于大規(guī)模制備。實驗室規(guī)模的純化技術(shù)不能簡單地放大用于涉及大規(guī)模質(zhì)粒制備的體積。大規(guī)模制備需要產(chǎn)率和分子完整性的最優(yōu)化而同時使污染物的去除和質(zhì)粒濃度最大化。在制備大量高濃度的質(zhì)粒DNA中，存在將質(zhì)粒維持為超螺旋形式和開環(huán)松弛形式的問題。儲存條件通常需要高鹽，并且即使在鹽存在下，隨時間的分子降解仍然是個問題。許多現(xiàn)有的純化方法依賴于使用潛在地危險的、毒性的、誘變的或污染的物質(zhì)和/或昂貴的物質(zhì)或設(shè)備，這又是對于大規(guī)模制備所不期望的。某些現(xiàn)有的純化方法利用酶的使用以消化蛋白用于最終的消除，而這樣的酶對于大規(guī)模生產(chǎn)是昂貴的并且可造成生物污染的危險。存在對諸如質(zhì)粒的感興趣的生物活性分子的大規(guī)模制備方法的需求，其中最終產(chǎn)品可以具有成本效益的方式制備，所述具有成本效益的方式例如最少的設(shè)備和/或最少的工藝步驟、高產(chǎn)率、高濃度和最少降解并且不存在雜質(zhì)、污染物和不希望的物質(zhì)。存在對具有高濃度和最少降解及存在最少雜質(zhì)、污染物和不希望的物質(zhì)的大量質(zhì)粒溶液的需求以及對這樣的溶液的制備方法的需求。對大量質(zhì)粒的需求大于對是低拷貝數(shù)質(zhì)粒的那些質(zhì)粒的需求，所述低拷貝數(shù)質(zhì)粒需要非常大量的細胞以得到毫克("mg")范圍和以上的質(zhì)粒量。發(fā)明概述本發(fā)明的一方面包括用于從細菌細胞中制備至少一種感興趣的生物活性分子的高純度樣品的大規(guī)模工藝。所述大規(guī)模工藝包括以下步驟a)通過使所述大量細胞的細胞懸浮液與溶胞溶液接觸制備溶胞產(chǎn)物溶液；b)用中和溶液中和所述溶胞產(chǎn)物溶液以制備包含被中和的溶胞產(chǎn)物溶液和碎片的分散體；c)通過至少一個過濾器過濾所述分散體；d)對所述被中和的溶胞產(chǎn)物溶液進行離子交換分離以產(chǎn)生離子交換洗出液；禾口e)對所述離子交換洗出液進行疏水作用分離以產(chǎn)生疏水作用溶液。在該方面的某些實施方案中，大規(guī)模工藝還包括通過所述疏水作用溶液的超濾制備至少一種生物活性分子的溶液的步驟。本發(fā)明進一步方面包括用于從細菌細胞制備至少一種感興趣的生物活性分子的高純度樣品的大規(guī)模工藝，其包括以下步驟使細菌細胞以細胞分散體與溶胞溶液接觸以形成溶胞產(chǎn)物溶液；通過用泡罩塔混合器將中和溶液混入所述溶胞產(chǎn)物溶液而中和所述溶胞產(chǎn)物溶液以形成被中和的混合物；通過初級過濾器和二級過濾器過濾所述被中和的混合物以形成濾過的溶液；使所述濾過的溶液通過離子交換柱以形成離子交換溶液；使所述離子交換溶液通過疏水作用柱或疏水作用膜以形成疏水作用溶液；和超濾所述疏水作用溶液以形成至少一種感興趣的生物活性分子的高純度樣品；其中在從接觸步驟到使濾過的溶液通過的步驟的大規(guī)模工藝中的一個步驟向隨后的步驟的每次過渡基本上連續(xù)發(fā)生。在本發(fā)明的另一方面中，提供了組合物，其包含通過本文描述和公開的方法制備的至少一種感興趣的生物活性分子，其中至少一種感興趣的生物活性分子是DNA質(zhì)粒。在某些實施方案中，所述組合物包含在溶液中的至少一種約10mg或更多的量的DNA質(zhì)粒，其中高純度的所述質(zhì)粒是以大于約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%存在的質(zhì)粒。附圖簡述通過參考附圖，本領(lǐng)域技術(shù)人員可更好地理解本發(fā)明的多個目的和優(yōu)勢，其中圖1顯示用于以連續(xù)流工藝從細菌細胞中分離和純化感興趣的生物活性分子的一個實施方案的示意圖。圖2顯示包含來自以下實施例1的樣品的電泳凝膠的圖。第1泳道表示超螺旋質(zhì)粒標準梯帶(supercoiledplasmidladder)(Invitrogen);第2泳道細胞溶胞產(chǎn)物；第3泳道Q陰離子交換后的產(chǎn)物；第4泳道用疏水作用純化后的產(chǎn)物；和第5泳道UF后混合的最終產(chǎn)物。圖3顯示包含來自實施例3的樣品的電泳凝膠的圖。第1泳道表示超螺旋質(zhì)粒標準梯帶(Invitrogen);第2泳道表示在使用48ym褶裙式濾筒(pleatedcartridge)的初級過濾之后的溶胞產(chǎn)物；第3泳道表示在使用1ym褶裙式濾筒的二級過濾之后的濾液；第4泳道表示在使用COHCPod過濾器的三級過濾之后的濾液；第5泳道表示在經(jīng)過MustangQ陰離子交換步驟之后的洗出液產(chǎn)物級分#1;和第6泳道表示Q洗出液的第二級分。優(yōu)選實施方案的描述提供了從細胞中純化感興趣的生物活性分子的方法以便從該細胞中以高水平的純度與濃度純化感興趣的生物活性分子。優(yōu)選地，所述感興趣的生物活性分子是質(zhì)?；駾NA質(zhì)粒。所述細胞可以是包含感興趣的生物活性分子的任何細胞。在某些實施方案中，所述細胞是微生物細胞，例如諸如細菌細胞的原核細胞。在某些實施方案中，它們是大腸桿菌細胞。所述細胞可以通過諸如發(fā)酵的任何方式制備或產(chǎn)生。用于發(fā)酵細胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的?？墒褂帽景l(fā)明從細胞中提取任何感興趣的生物活性分子。在某些實施方案中，可使用本發(fā)明提取超過一種感興趣的生物活性分子。所述感興趣的生物活性分子可以是諸如核酸分子或蛋白的高分子。在某些實施方案中，所述感興趣的生物活性分子可以是質(zhì)粒?？苫Q使用的術(shù)語"質(zhì)粒"或"DNA質(zhì)粒"是指環(huán)狀DNA分子，其為能夠獨立于染色體DNA復(fù)制的、與染色體DNA分離的染色體外DNA分子。編碼序列或轉(zhuǎn)基因通常包含在DNA質(zhì)粒內(nèi)，并且在存在時，DNA質(zhì)粒被提及為表達質(zhì)?；虮磉_構(gòu)建體。編碼序列或"編碼核酸序列"可包括可操作地與調(diào)節(jié)元件連接的起始和終止信號，所述調(diào)節(jié)元件包括能夠指導(dǎo)在核酸分子所施用于的個體的細胞中表達的啟動子和多腺苷酸化信號。提及所描述的工藝時使用的術(shù)語"大規(guī)模"是指從細菌細胞或細菌細胞的懸浮液中產(chǎn)生約1克或更多量的至少一種生物活性分子(特別是DNA質(zhì)粒)的純化工藝和/或需要約1千克或更多量的細菌細胞糊(cellpaste)的溶胞的純化工藝。提及生物活性分子(特別是DNA質(zhì)粒)的純度水平時使用的術(shù)語"高純度"是指以至少大于或等于約90%;并且優(yōu)選地大于或等于約91%，大于或等于約92%，大于或等于約93%，大于或等于約94%，大于或等于約95%，大于或等于約96%，大于或等于約97%，大于或等于約98%或大于或等于約99%的水平純化來自宿主細菌細胞的分子。提及本文所述工藝時使用的術(shù)語"連續(xù)的"或"基本上連續(xù)的"是指物質(zhì)(或溶液或懸浮液)在純化工藝的每個步驟至每個隨后的步驟之間的連續(xù)流動，所述步驟起始于純化工藝的開始直到加載離子交換色譜柱的步驟。例如，隨著分散體的細菌細胞與溶胞溶液在接觸步驟中接觸以形成溶胞產(chǎn)物溶液，這樣的溶胞產(chǎn)物溶液將直接流入用中和溶液中和的下一步驟。這些在步驟之間的連續(xù)過渡消除了在純化工藝步驟之間的保持步驟或孵育步驟。術(shù)語"生物活性分子"是指包含在細菌內(nèi)的、在其功能狀態(tài)的分子或生物分子，并且在某些實施方案中，特別是指DNA質(zhì)粒。這樣的DNA質(zhì)?？杀环蛛x并用于轉(zhuǎn)染感興趣的細胞。本發(fā)明的組合物包含至少一種類型的生物活性分子。在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含超過一種類型的生物活性分子。質(zhì)粒在它們的拷貝數(shù)上變化很大，取決于它們包含的復(fù)制起點，例如，pMBl或pSC101，所述復(fù)制起點決定它們是在松弛控制下還是在嚴緊控制下；并取決于質(zhì)粒及其相關(guān)的插入序列的尺寸。諸如PUC系列及衍生質(zhì)粒的某些質(zhì)粒存在變異，這允許它們在細菌細胞內(nèi)達到很高的拷貝數(shù)?；赑BR322的質(zhì)粒通常保持在較低的拷貝數(shù)。很大的質(zhì)粒通常保持在每個細胞很低的拷貝數(shù)。本發(fā)明的某些實施方案涉及質(zhì)粒純化工藝，該質(zhì)粒純化工藝允許以具有成本效益和最少步驟的制備工藝從細胞(優(yōu)選細菌細胞)中大規(guī)模地純化質(zhì)粒以得到例如克量級的大量質(zhì)粒(目的是保持較高產(chǎn)率)。在某些實施方案中，質(zhì)粒是低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。對提供的工藝和由此制備的生物活性分子來說，低拷貝數(shù)質(zhì)粒是獲得小于或等于約300、小于或等于約100、小于或等于約50、小于或等于約20、小于或等于約10、或小于或等于約5的拷貝數(shù)的質(zhì)粒。本發(fā)明的一方面包括用于從細菌細胞中制備至少一種感興趣的生物活性分子的高純度樣品的大規(guī)模工藝。所述大規(guī)模工藝包括以下步驟a)通過使所述大量細胞的細胞懸浮液與溶胞溶液接觸制備溶胞產(chǎn)物溶液；b)用中和溶液中和所述溶胞產(chǎn)物溶液以制備包含被中和的溶胞產(chǎn)物溶液和碎片的分散體；c)通過至少一個過濾器過濾所述分散體；d)對所述被中和的溶胞產(chǎn)物溶液進行離子交換分離以產(chǎn)生離子交換洗出液；禾口e)對所述離子交換洗出液進行疏水作用分離以產(chǎn)生疏水作用溶液。在一個實施方案中，所述大規(guī)模工藝包括制備溶胞產(chǎn)物溶液步驟，該步驟包括在高剪切串聯(lián)混合器中將所述細胞懸浮液與溶胞溶液混合。在某些實施方案中，制備步驟包括在混合器中使所述細胞懸浮液與所述溶胞溶液接觸約1分鐘至約20分鐘，優(yōu)選地從約4分鐘至約8分鐘，并且更優(yōu)選地約5分鐘的持續(xù)時間。在某些實施方案中，所述中和步驟包括在泡罩混合器(bubblemixer)中將所述溶胞產(chǎn)物溶液與所述中和溶液混合。在某些實施方案中，進行疏水作用分離的步驟包括使用疏水作用柱或疏水作用膜進行疏水作用分離以形成疏水作用溶液。疏水作用分離步驟可以是感興趣的生物活性分子通過結(jié)合至疏水作用膜或柱的分離，這使雜質(zhì)能夠流過或被洗掉。在某些實施方案中，感興趣的生物活性分子可流過疏水作用柱而雜質(zhì)結(jié)合。在某些實施方案中，感興趣的生物活性分子流過疏水作用膜(或HIC膜)(本文稱為"方法I")。在某些實施方案中，感興趣的生物活性分子結(jié)合至HIC柱，例如丁基柱(butylcolumn)(本文稱為"方法II")。在某些實施方案中，可使用HIC膜和HIC柱(例如丁基柱)的組合(本文稱為"方法III")以得到大規(guī)模量的、具有高純度的感興趣的生物活性分子，例如克或更大量級的DNA質(zhì)粒。在某些實施方案中，疏水作用分離包括至少使用丁基疏水作用色譜的分離，目的是產(chǎn)生疏水作用溶液，所述疏水作用溶液是丁基疏水作用色譜溶液洗出液。在某些實施方案中，所描述的大規(guī)模工藝還可包括通過所述疏水作用溶液的超濾而制備含有至少一種生物活性分子的溶液的步驟。此外，可以進行通過所述生物活性分子的溶液的無菌過濾而制備生物活性分子的無菌溶液的步驟。在某些實施方案中，所述大規(guī)模工藝包括保持步驟，所述保持步驟需要將分散體保持一段時間以使被中和的溶胞產(chǎn)物溶液與碎片分離并然后通過至少一個過濾器過濾被中和的溶胞產(chǎn)物溶液。在某些實施方案中，所述進行離子交換分離步驟是使用陰離子交換膜而進行的。優(yōu)選地，離子交換分離步驟包括離子交換柱的使用，并優(yōu)選地使用]\4118{31^@Q柱。在某些實施方案中，所述大規(guī)模工藝包括連續(xù)過程或被稱為連續(xù)大規(guī)模工藝，其用于從細菌細胞制備高純度生物活性分子。所述方法包括從大規(guī)模工藝的一個步驟向隨后的步驟基本上連續(xù)地過渡，并且包括通過在容器中收集溶胞產(chǎn)物并使分散體通過初級過濾器而使分散體中的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液與碎片分離以產(chǎn)生最初的粗的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液。在某些實施方案中，所述工藝還包括使最初的粗的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液通過二級過濾器以產(chǎn)生隨后的粗的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液。在一個實施方案中，本發(fā)明包括用于從細菌細胞制備感興趣的生物活性分子的高純度樣品的大規(guī)模工藝，其包括以下步驟使細菌細胞以細胞分散體與溶胞溶液接觸以形成溶胞產(chǎn)物溶液；通過用泡罩塔混合器將中和溶液混入所述溶胞產(chǎn)物溶液而中和所述溶胞產(chǎn)物溶液以形成被中和的混合物；通過初級過濾器和二級過濾器過濾所述被中和的混合物以形成濾過的溶液；使所述濾過的溶液通過離子交換柱以形成離子交換溶液；使所述離子交換溶液通過疏水作用柱或疏水作用膜以形成疏水作用溶液；和超濾所述疏水作用溶液以形成感興趣的生物活性分子的高純度樣品；其中在從接觸步驟到使濾過的溶液通過的步驟的大規(guī)模工藝中的一個步驟向隨后的步驟的每次過渡基本上連續(xù)發(fā)生。在本發(fā)明的另一方面中提供了包含由本文所述的大規(guī)模工藝制備的感興趣的生物活性分子的組合物，其中所述感興趣的生物活性分子是DNA質(zhì)粒。在某些實施方案中，所述組合物包含在溶液中的約10mg或更多量的DNA質(zhì)粒，其中高純度的所述質(zhì)粒是以大于約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%存在的質(zhì)粒。權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述質(zhì)粒的濃度為約5、6、7、8、9、10、11、12或13mg/mL。某些組合物包含超螺旋質(zhì)粒水平大于約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%并且優(yōu)選地大于80%的質(zhì)粒。某些組合物包含小于或等于約10EU內(nèi)毒素每mg質(zhì)粒，并且某些實施方案，所述組合物包含小于或等于約1EU內(nèi)毒素每mg質(zhì)粒。某些實施方案小于或等于約O.1EU內(nèi)毒素每mg質(zhì)粒。在某些實施方案中，所述組合物包含含有小于或等于約1.0%RNA或小于或等于約0.4%RNA的溶液。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含含有小于或等于約1.0%蛋白、優(yōu)選小于或等于約0.20%蛋白的溶液。在某些實施方案中，所述組合物包含含有小于或等于約1X基因組DNA、優(yōu)選地小于或等于約0.01X基因組DNA的溶液。包括許多本文提供的工藝步驟的本發(fā)明實施方案的實例包括以下步驟第一步，制備并收獲感興趣的細胞；第二步，溶解細胞以將其內(nèi)容物(包括感興趣的生物活性分子)釋放至溶液；第三步，將固體細胞碎片和沉淀的細胞成分與含有至少一種感興趣的生物活性分子的流體分離；第四步，使含有感興趣的生物活性分子的溶液經(jīng)過離子交換色譜；第五步，使由離子交換色譜產(chǎn)生的部分純化的物質(zhì)經(jīng)過疏水作用色譜；第六步，使由疏水作用色譜產(chǎn)生的物質(zhì)經(jīng)過超濾和滲濾以濃縮至少一種類型的感興趣的生物活性分子并從溶液中除去過量的鹽；第七步，使?jié)饪s并脫鹽的產(chǎn)物可選擇地經(jīng)過無菌過濾以使其適于藥用，包括，例如，肌肉內(nèi)遞送、靜脈內(nèi)遞送、鼻內(nèi)遞送、心臟內(nèi)遞送、氣溶膠遞送、經(jīng)皮遞送、體內(nèi)電穿孔促進的向肌肉的遞送、體內(nèi)電穿孔促進的向皮下組織或皮內(nèi)組織的遞送以及其他已知的藥物施用的方法。本發(fā)明的某些實施方案包括本文公開的工藝步驟，所述工藝步驟包括但不限于以導(dǎo)致不受工藝保持步驟限制的生產(chǎn)規(guī)模的連續(xù)方式操作步驟組合。這樣的工藝使醫(yī)藥級生物分子能夠大規(guī)模制備，例如制備約1克或更多的質(zhì)粒。本發(fā)明的某些實施方案排除了可證明對大規(guī)模制備或藥物產(chǎn)品是有害的任何物質(zhì)或過程，包括，例如，酶的包含、熱變性、機械分離(做這樣的分離的機器)，諸如離心設(shè)備，或諸如異丙醇的有機溶劑或揮發(fā)性溶劑。感興趣的細胞可以通過例如常規(guī)的發(fā)酵和收集方式而制備或收獲。制備足量的感興趣的細胞完全是在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)的。例如，細胞可以是含有高拷貝數(shù)的感興趣的質(zhì)粒的大腸桿菌，并且可以使用分批或補料分批技術(shù)將含質(zhì)粒的細胞發(fā)酵至高密度。用于制備這樣的含質(zhì)粒的大腸桿菌細胞的方法和進行這樣的分批或補料分批發(fā)酵的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。細胞可以通過諸如離心或過濾的常規(guī)方式收獲以形成細胞糊。這樣的收獲方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，收獲的細胞或細胞糊可以立即處理，或者以冷凍狀態(tài)或冷藏狀態(tài)貯存用于以后處理?？墒褂萌馨芤簩⑹斋@的細胞溶解以將其內(nèi)容物(包括感興趣的生物活性分子)釋放至溶液。通常，在溶解細胞前，細胞糊可用于制備含有感興趣的生物活性分子的細胞懸浮液。細胞可懸浮于任何合適的溶液中。在懸浮溶液中含有細胞的懸浮液可保持在罐中或其他貯存容器中?？墒褂脙蓚€容器，其中第二容器可用于再懸浮額外量的細胞，而第一容器用于溶胞過程。在某些實施方案中，所述懸浮溶液可包含中等濃度的緩沖液、中等濃度的螯合劑或兩者。在某些實施方案中，所述懸浮溶液可包含約25mMTris-鹽酸鹽("Tris-HCl")和約10mM乙二胺四乙酸二鈉("N^EDTA")，pH約為8。在某些實施方案中，所述細胞懸浮液可通過將已知重量的細胞糊懸浮于已知重量的懸浮緩沖液中而制備。例如，l份細胞糊可再懸浮于約4-10份緩沖液中，在某些實施方案中，使用約6-8份緩沖液。在某些實施方案中，所得細胞懸浮液的光密度可以是約50-800De。。單位。在某些實施方案中，其可以是約60-700D6。。單位。溶胞溶液優(yōu)選地包含一種或多種溶胞劑(lysisagent)，例如堿、酸、酶、有機溶劑、洗滌劑或其混合物。然而，動物衍生酶或有機溶劑的使用不是優(yōu)選的，因為它們對藥物產(chǎn)品的制備是有害的。在某些實施方案中，溶胞溶液包含堿、洗滌劑或其混合物。合適的堿包括，但不限于，氫氧化鈉或氫氧化鉀。洗滌劑可以是非離子的、陽離子的或陰離子的。合適的洗滌劑包括，但不限于十二烷基硫酸鈉("SDS")、三硝基甲苯(Triton)、吐溫或聚氧丙烯型試劑(基于氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物)。對合適的堿或洗滌劑的選擇完全在本領(lǐng)域的普通技術(shù)范圍內(nèi)。在某些實施方案中，溶胞溶液可包含氫氧化鈉("NaOH")和SDS。在某些實施方案中，NaOH的濃度可以是約0.1N至約0.3N，并且在某些實施方案中是約0.2N。在某些實施方案中，SDS的濃度可以是約0.1%至約5%，并且在某些實施方案中，是約1%。在某些實施方案中，溶胞溶液可以保持在罐中或其他貯存容器中?？梢院喜⒓毎麘腋∫汉腿馨芤阂匀芙饧毎a(chǎn)生溶胞產(chǎn)物溶液。在某些實施方案中，它們被合并、混合并保持為混合物，持續(xù)足以促進高水平的細胞溶解并釋放生物物質(zhì)的時間，從而形成溶胞產(chǎn)物溶液。在某些實施方案中，細胞懸浮液和溶胞溶液被保持在分離的罐中并使用一個或多個泵從這樣的罐中取出?？墒褂?Y"形連接器使細胞懸浮液和溶胞溶液互相接觸。在某些實施方案中，等體積的細胞懸浮液和溶胞溶液可以使用雙頭泵以相等的流速被泵送。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，如果需要，不同體積的細胞懸浮液和溶胞溶液可以使用單獨的泵以不同的速率被泵送。在某些實施方案中，細胞懸浮液和溶胞溶液通過雙頭泵以約0.3L/min至約2L/min同時被泵送，并且接觸過的流體以約0.6L/min至約4L/min的速率離開"Y"形連接器。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，這些流速可容易地增加或減少，并且管道尺寸可容易地增加或減少，以滿足任何處理量需求。在離開"Y"形連接器以后，接觸過的細胞懸浮液和溶胞溶液可通過高剪切的串聯(lián)混合器。該混合器可以是以流通模式(與分批模式相對)提供快速、高剪切混合的任何設(shè)備。在某些實施方案中，該混合器是轉(zhuǎn)子/定子混合器或乳化器。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，多種這樣的高剪切串聯(lián)混合器是商業(yè)可得的。任何這樣的混合器的使用完全在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，該混合器是配備標準乳化器篩網(wǎng)(standardEmulsorscreen)(SilversonMachines,Inc.EastLongmeadow，MA)禾口串聯(lián)組件的SilversonL4R轉(zhuǎn)子/定子混合器。轉(zhuǎn)子可以諸如以下的速率運轉(zhuǎn)從約500rpm至約900rpm、500-600rpm、從約500rpm至約700rpm、從約500rpm至約800rpm、從約600rpm至約700rpm、從約600rpm至約800rpm、從約600rpm至約900rpm、從約700rpm至約800rpm或從約700rpm至約900rpm。這樣的混合器適于處理從約0.3L/min至約2L/min的細胞懸浮液。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，可以替換更大規(guī)模的混合器用于處理明顯更大體積的細胞懸浮液。這樣的替換將由本領(lǐng)域技術(shù)人員僅僅用普通試驗而容易地實現(xiàn)。使用高剪切的串聯(lián)混合器促進了細胞懸浮液和溶胞溶液的完全的且快速的混合，使細胞與溶胞劑緊密接觸以獲得有效的溶胞。此外，混合器能夠容易地適應(yīng)不同的流體流速并提供用于不同流速的變速混合的靈活性。離開高剪切的串聯(lián)混合器的物質(zhì)然后可通過保持盤管。該盤管可簡單地包括長度足以提供流體以確定的時間通過該盤管的管道。該盤管的功能是提供細胞與溶胞劑之間足夠的接觸時間以保證基本上完全的溶胞。同時，該盤管保證接觸時間不是太長以至于具有負面結(jié)果。在某些實施方案中，例如細胞是含質(zhì)粒的細胞并且溶胞溶液包含堿的實施方案，期望保證在堿中的暴露持續(xù)得足夠長以獲得基本上完全的細胞溶胞以及蛋白、基因組DNA和其他細胞成分基本上完全的變性。然而，還期望在堿中的暴露不太長以至于導(dǎo)致大量永久變性的質(zhì)粒。盤管可以是一個完整的管道或被分割為2-10個管道以允許流體流速的靈活性。保持盤管使該接觸時間能夠被控制。在某些實施方案中，該接觸時間可以是從約2分鐘至約10分鐘。在某些實施方案中，該接觸時間可以是從約2分鐘至約9分鐘、從約2分鐘至約8分鐘、從約2分鐘至約7分鐘、從約2分鐘至約6分鐘、從約3分鐘至約10分鐘、從約3分鐘至約9分鐘、從約3分鐘至約8分鐘、從約3分鐘至約7分鐘、從約3分鐘至約6分鐘、從約4分鐘至約10分鐘、從約4分鐘至約9分鐘、從約4分鐘至約8分鐘、從約4分鐘至約7分鐘、從約4分鐘至約6分鐘、從約5分鐘至約10分鐘、從約5分鐘至約9分鐘、從約5分鐘至約8分鐘、從約5分鐘至約7分鐘或從約5分鐘至約6分鐘。優(yōu)選地，接觸時間是從約4分鐘至約8分鐘或從約4分鐘至約6分鐘。在某些實施方案中，接觸時間是約5分鐘。在某些實施方案中，保持盤管的長度和直徑是這樣的當溶解的細胞以所期望的速率流過時獲得了所期望的暴露時間。在某些實施方案中，保持盤管可以具有從約10英尺的長度至約150英尺的長度、從約25英尺的長度至約100英尺的長度或從約40英尺的長度至約60英尺的長度。在某些實施方案中，保持盤管具有約50英尺的長度，并且在某些實施方案中，保持盤管具有約100英尺的長度。保持盤管可具有從約0.5英寸至約2英寸的內(nèi)徑，并且在某些實施方案中為0.625英寸。還在某些實施方案中，溶解的細胞可以以下的速率離開高剪切的串聯(lián)混合器并通過保持盤管從約100mL/min至約10L/min、從約200mL/min至約8L/min、從約300mL/min至約6L/min、從約400mL/min至約4L/min、從約400mL/min至約2L/min或從約600mL/min至約1.2L/min。優(yōu)選地，經(jīng)過保持盤管的速率是從約0.6L/min至約10L/min。在某些優(yōu)選的實施方案中，通過保持盤管的速率是約600mL/min并且在某些實施方案中，其為約1200mL/min。當生物活性分子的制備被放大時，盤管長度和直徑的調(diào)整可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員實現(xiàn)以適應(yīng)或適合較大流速。從保持盤管收集溶胞產(chǎn)物溶液。溶胞產(chǎn)物溶液通過將其與中和溶液(還稱為中和沉淀溶液)合并而被中和，以制備含有被中和的溶胞產(chǎn)物溶液和碎片的分散體。然后可保持所得分散體以促進被中和的溶胞產(chǎn)物溶液與碎片分離。在某些實施方案中，包含溶解的細胞的溶胞產(chǎn)物溶液可通過將其與中和溶液在中和室中混合而被中和。溶胞產(chǎn)物溶液的這種中和可通過在中和室中混合而促進。在某些實施方案中，這種中和可在后面接著在泡罩塔混合器中泡罩混合(bubblemixing)。優(yōu)選地，中和與泡罩混合在泡罩塔混合器中一起發(fā)生。在某些實施方案中，離開保持盤管的溶胞產(chǎn)物溶液可進入泡罩塔混合器中而同時，泵可將中和/沉淀溶液從另一個罐中遞送至泡罩塔混合器中。在某些實例中，還同時地，來自另一個罐的壓縮氣體可鼓泡進入泡罩塔混合器的底部。在某些實施方案中，溶胞產(chǎn)物溶液可從一側(cè)進入塔的底部，而中和/沉淀溶液可從相對側(cè)進入底部。壓縮氣體可經(jīng)過燒結(jié)的鼓泡器被鼓泡進入，所述燒結(jié)的鼓泡器設(shè)計為基本上均勻地沿塔的橫截面遞送氣泡。包含溶解的細胞的溶胞產(chǎn)物溶液和中和溶液垂直向上流過塔并且經(jīng)過頂部附近的一側(cè)上的出料口離開。經(jīng)過垂直的液體柱的氣泡通道用于混合溶胞產(chǎn)物溶液和中和/沉淀溶液。由上升的氣泡提供的混合是完全但溫和和低剪切的。當中和/沉淀溶液與溶胞產(chǎn)物溶液的溶解的細胞混合時，細胞成分從溶液中沉淀。可在泡罩塔混合器的頂部提供通氣管以排出過量的氣體。在某些實施方案中，溶胞產(chǎn)物溶液包含用堿、洗滌劑或其混合物溶解的含質(zhì)粒的細胞，并且中和/沉淀溶液中和堿并沉淀諸如蛋白、膜、內(nèi)毒素和基因組DNA的宿主細胞成分。在某些實施方案中，所述堿可以是NaOH，所述洗滌劑可以是SDS并且所述中和/沉淀溶液可包含乙酸鉀、乙酸銨或其混合物。在某些實施方案中，所述中和/沉淀溶液可包含含有約1M乙酸鉀和從約3M至約7M的乙酸銨的未緩沖的溶液。使用這樣的中和/沉淀溶液制備出pH從約7至約8的懸浮液，所述懸浮液優(yōu)選為酸性pH，因為酸性條件可導(dǎo)致DNA的脫嘌呤。在某些實施方案中，中和/沉淀溶液可以從約2t:至約『C的冷凍的形式提供。泡罩塔混合器提供低剪切形式的混合并因此避免了基因組DNA和內(nèi)毒素向被中和的溶胞產(chǎn)物溶液中的過度釋放。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠確定經(jīng)過泡罩塔混合器的流動氣體的合適的速率?？墒褂眉s2標準升每分鐘至約20標準升每分鐘("slpm")的氣體流速。可使用任何合適的氣體，包括但不限于，空氣、氮氣、氬氣和二氧化碳。氣體可以是過濾的壓縮空氣。溶胞產(chǎn)物溶液和中和溶液的合并導(dǎo)致包含被中和的溶胞產(chǎn)物溶液和碎片的分散體的產(chǎn)生。被中和的溶胞產(chǎn)物溶液可收集在罐中或其他貯存容器中。在某些實施方案中，容器被冷凍至5t:-l(TC。用于在容器中保持被中和的溶胞產(chǎn)物的時間不是強制性的，并且可以從小于1小時、從約1小時至約12小時、從約12小時至約15小時或大于15小時變化。在某些實施方案中，使用的時間為約12小時，而某些實例包括約15小時的時間，而在其他實例中，該時間為"過夜"(定義為大于約15小時)。在一個實施方案中，使用充分的保持期以獲得細胞碎片與被中和的溶胞產(chǎn)物溶液的基本上完全的分離，結(jié)果獲得有利于隨后的凈化過程的具有有限固體顆粒的粗溶胞產(chǎn)物。然而，該工藝規(guī)模受限于粗溶胞產(chǎn)物保持罐并且工藝時間被該保持期拉長。為了獲得低產(chǎn)率質(zhì)粒產(chǎn)物的大規(guī)模純化，被中和的溶胞產(chǎn)物的保持期可被減少至低于1小時。在某些實施方案中，被中和的溶胞產(chǎn)物溶液可在其產(chǎn)生的同時被處理，因此在容器中的保持時間是可以忽略的。在某些實施方案中，在將溶胞產(chǎn)物收集于容器中的從約5分鐘至約60分鐘時段后，溶胞產(chǎn)物溶液通過以下的過程同時被處理。溶胞產(chǎn)物保持時間的減少或消除還排除了容器的處理容量限制，因為溶胞產(chǎn)物在其產(chǎn)生時立即被處理。被中和的溶胞產(chǎn)物溶液可用任何固液分離方法凈化，例如袋過濾、筒過濾(cartridgefiltration)、分批離心、連續(xù)離心。完全除去溶液中的顆粒是所期望的以避免在以下的純化過程中膜或柱的阻塞。同時，溶胞產(chǎn)物可不經(jīng)過過多的剪切，所述過多的剪切將撕碎基因組DNA并造成基因組DNA、撕碎的基因組DNA、內(nèi)毒素和其他污染物釋放至含質(zhì)粒的溶液中。分批過濾可用于處理小體積的溶胞產(chǎn)物，但在大規(guī)模中不實用。連續(xù)離心也是不適合的，因為沉淀可經(jīng)過高剪切壓力并釋放高水平的污染物至溶液。在某些實施方案中，可使用采用不同級別過濾介質(zhì)的一系列的過濾。初級過濾可用于除去大部分微米尺寸范圍的大的細胞絮凝物，而連續(xù)的二級過濾保留了剩余的細顆粒。當隨后過程需要嚴格的澄清度并且二級過濾不夠時可進行可選擇的三級過濾。在某些實施方案中，可以使用袋過濾器和筒過濾器，因為它們的高納污能力和對溶液最小的干擾。過濾器的袋或筒可以是任何尺寸、形狀、孔徑率(poresizerating)、構(gòu)型和介質(zhì)類型。過濾介質(zhì)優(yōu)選由醫(yī)藥級或符合食品與藥品管理局(FDA)要求的材料制成。過濾器材料還優(yōu)選不帶電或?qū)Ξa(chǎn)物具有有限的結(jié)合。過濾器材料的粒徑限值可以從約0.liim至約幾百微米變化，條件是其大于目標產(chǎn)物的尺寸以便產(chǎn)物不被過濾介質(zhì)保留。袋過濾器和筒過濾介質(zhì)可以是單層的、多層的、褶裙式的或多褶裙式的。在某些實施方案中，可并聯(lián)使用具有近似孔徑率的兩個或多個過濾器以適應(yīng)大規(guī)模工藝。在溶胞產(chǎn)物溶液中的大部分固體顆粒，包括細胞壁和細胞膜成分、沉淀、基因組DNA、蛋白、脂質(zhì)、脂多糖及其他污染物，將通過過濾除去。然而，當初級過濾不足以提供所期望的澄清度時，可隨后設(shè)置具有減少的孔徑或較高的保留率的二級過濾。在某些實施方案中，可并聯(lián)設(shè)置兩個或多個二級過濾器以適應(yīng)大規(guī)模工藝。多個過濾器的使用在大規(guī)模工藝中可能是需要的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，可容易地改變諸如使用的過濾器數(shù)以及它們的粒徑限值的細節(jié)。在某些實施方案中，可在沉降罐中收集和保持分散體以使碎片沉淀或漂浮。因此，在某些實施方案中，分散體可作為粗的細胞溶胞產(chǎn)物與來自泡罩塔混合器的沉淀的宿主細胞成分的漿料而收集，并且可被保持在沉降罐中以使碎片沉淀或漂浮。分散體可以被保持(例如在沉降罐中保持)足以獲得組成碎片的沉淀的宿主細胞成分與被中和的溶胞產(chǎn)物溶液基本上完全分離的時間。沉淀的組分可在泡罩塔混合器引入的夾入氣泡的幫助下上升至分散體的表面。在某些實施方案中，分散體可保持在沉降罐中約6小時至約24小時，在某些實施方案中，從約12小時至約18小時。在某些實施方案中，分散體可在保持期間被冷凍至小于約15t:，在某些實施方案中為從約2t:至約8°C，以幫助RNA或其他雜質(zhì)的沉淀。在某些實施方案中，分散體可在保持期間溫和地混合，例如通過以很低的rpm、優(yōu)選地從約15rpm至約25rpm運轉(zhuǎn)的葉輪式混合器。在某些實施方案中，可將真空施加于保持分散體的諸如沉降罐的容器。這有助于將沉淀的成分帶到液體表面。此外，這壓緊了漂浮的絮狀沉淀/碎片，有助于其隨后的去除并且還允許更大百分比的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液在以后的步驟中被回收。此外，這除去了溶液中夾雜的空氣，所述空氣可能污染以后的色譜法步驟。在某些實施方案中，施加的真空可以從約15英寸HG至約30英寸Hg(in*Hg)，在某些實施方案中，從約20英寸Hg至約30英寸Hg，并且在某些實施方案中，從約25英寸Hg至約30英寸Hg。在某些實施方案中，真空可在整個該保持期間保持。可使用真空泵或任何其他可用的真空設(shè)備或可用的負壓設(shè)備而施加真空。在某些實施方案中，在開始固液分離前，施加于罐的任何真空被小心地釋放。然后使用泵從罐中收集粗的細胞溶胞產(chǎn)物，即被中和的溶胞產(chǎn)物溶液，并使其通過深層過濾器和最后的過濾器，然后在保持罐中收集。在某些實施方案中，沉降罐安裝了觀察窗，允許操作者觀察液面位置和壓緊的沉淀的宿主細胞成分。從罐中泵送物質(zhì)被視覺監(jiān)測，并且在沉淀的宿主細胞成分進入管線之前停止。這防止了后面的過濾器的阻塞。不需要袋過濾(或筒過濾)或離心。此外，碎片的干擾由此最小化諸如基因組DNA或內(nèi)毒素成分向被中和的溶胞產(chǎn)物溶液中的釋放。在被中和的溶胞產(chǎn)物溶液從沉降罐被泵送后，其通過一個或多個過濾器以除去細顆粒。在某些實施方案中，可串聯(lián)使用約1個至約3個過濾器，第一過濾器除去較大的顆粒，并且隨后的過濾器連續(xù)除去較小的顆粒。在某些實施方案中，可串聯(lián)使用2個過濾器。在某些實施方案中，第一過濾器是預(yù)過濾深層過濾器，其粒徑限值為從約5iim至約15iim、優(yōu)選地從約7.5ym至約12ym或更優(yōu)選地從約9ym至約11ym。在某些實施方案中，預(yù)過濾深層過濾器具有約lOym的粒徑限值。第二過濾器優(yōu)選地是膜過濾器，其截留為從約0.01iim至約0.25iim或優(yōu)選地從約0.05ym至約0.15ym。在某些實施方案中，膜過濾器具有約O.liim的截留。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，可以容易地改變諸如使用的過濾器數(shù)以及它們的粒徑限值的細節(jié)。大量的過濾器是可從不同供應(yīng)商商業(yè)獲得的。一種具體的類型是720系列褶裙式筒過濾器(CPIfilters,Houston,TX)，其表現(xiàn)出大的納污能力和優(yōu)良的處理容量。高效率的多層過濾袋，例如300系列和500系列(KnightCorporation，Houston,TX)，已顯示出對細顆粒的相當大的保留。具有達12層介質(zhì)的漸進密度設(shè)計的PR0GAFTM過濾袋(EatonFiltration,Cleveland,0H)在具有多種尺寸的顆粒的去除中可提供高效率。在某些實施方案中，褶裙式筒過濾接著是多層或褶裙式筒過濾的組合可對在被中和的溶胞產(chǎn)物溶液中的顆粒的凈化提供最佳性能。筒過濾器或袋過濾器優(yōu)選裝配在過濾器殼或過濾器容器中，以簡化操作和較高的處理容量。容器材料可以是304或316型不銹鋼或碳鋼，而具有聚氯乙烯(PVC)、氯化的聚氯乙烯(CPVC)、聚酯塑料(PPL)或聚偏氟乙烯(PVDF)結(jié)構(gòu)的選擇的全塑料殼對于超高純或腐蝕性的應(yīng)用是有利的。過濾器容器可以是定制的或從若干生產(chǎn)商容易地可得的。例如，EatonFiltration(Cleveland,OH)提供了對設(shè)計為滿足任何要求的應(yīng)用的殼/容器的寬泛的選擇，例如T0PLINE、SIDELINE、DU0LINE、M0DULINE、P0LYLINE、FL0WLINE、ECOLINE、MAXILINE系列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠確定過濾器殼的結(jié)構(gòu)和特征以適應(yīng)處理要求?？蛇x擇地，在二級過濾后可提供另外的深層過濾器或膜過濾器。過濾器優(yōu)選具體從約O.liim至約0.2iim的截留以進一步除去被中和的溶胞產(chǎn)物溶液中的細顆粒。筒過濾器，例如來自Meissner(Camarillo，CA)的VangardPP和AlphaPP、來自Millipore(Billerica，MA)的Clarigard、來自Pall(EastHills,NY)的HP禾PPreFlow，可預(yù)期為一次性的或具有殼輔助的。然而，大部分的這些筒過濾器受其處理容量限制，尤其是在一次性形式中。優(yōu)選的是使用可提供可升級形式以適應(yīng)大規(guī)模應(yīng)用的一次性組件。Millipore(Billerica，MA)已開發(fā)出高效一次性深層過濾器系統(tǒng)，Millistak+Pod，用于在實驗室或生產(chǎn)規(guī)模中的應(yīng)用。在pod過濾器(podfilter)中的過濾介質(zhì)主要由精選級別的(selectgrade)纖維素纖維和硅藻土組成，并且被證明具有大的納污能力和優(yōu)良的保留能力。輔有不銹的支持物的pod形式的疊片式設(shè)計實現(xiàn)了在小空間中的大面積過濾。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定pod過濾器的介質(zhì)級別和膜面積以滿足特定操作需要。因此，包含感興趣的生物活性分子的、凈化的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液能夠經(jīng)過離子交換色譜，包括基于柱色譜的或基于膜的。優(yōu)選的，可使用基于膜的方法，例如陰離子交換膜色譜。例如，被中和的溶胞產(chǎn)物溶液可應(yīng)用于離子交換膜。根據(jù)某些實施方案，感興趣的生物活性分子可與膜接觸，由此，感興趣的生物活性分子可與膜結(jié)合而雜質(zhì)從膜流過或從膜被洗掉，從而將雜質(zhì)與感興趣的生物活性分子分離。可選擇地，感興趣的生物活性分子可流過膜，而雜質(zhì)被保留。在某些實施方案中，感興趣的生物活性分子與膜結(jié)合，并且在洗滌除去弱結(jié)合的雜質(zhì)后，從膜洗脫感興趣的生物活性分子?？赏ㄟ^使鹽溶液流過膜而實現(xiàn)洗脫。鹽溶液具有足以克服感興趣的生物活性分子與膜的結(jié)合的強度、濃度或電導(dǎo)率。因此，感興趣的生物活性分子在離子交換洗出液中被回收。雖然任何離子交換膜可以是合適的，但在某些實施方案中，可使用包含季胺基團的陰離子交換膜、諸如強陰離子交換膜。這樣的膜的實例包括，但不限于MustangQ(PallCorporation,EastHills，NY)、SartobindQ(Sartorius，Edgewood，NY)禾口InterceptQ(MilliporeCorporate,Billerica，MA)。在某些實施方案中，含質(zhì)粒的細胞被溶解和中和以產(chǎn)生可通過陰離子交換膜純化而處理的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液，所述陰離子交換膜純化包括使用PallMustangQ柱(PallCorporation,EastHills，NY)的純化。在某些實施方案中，通過用適量凈化水的稀釋可將被中和的溶胞產(chǎn)物溶液的電導(dǎo)率調(diào)整為約小于95mS/cm或約85mS/cm。電導(dǎo)率在某些實施方案中可調(diào)整為從約80mS/cm至約85mS/cm?？蓪⒌扔谌馨a(chǎn)物體積的約1.5倍的凈化水用于稀釋以獲得所需電導(dǎo)率?？赏ㄟ^將合適的鹽溶液流過Mustang⑧Q柱而對其進行調(diào)整。在某些實施方案中，所述溶液可包含從約0.5M氯化鈉至約1.0M氯化鈉("NaCl")并且在某些其他實施方案中為0.67MNaCl。平衡溶液還可包含緩沖劑、螯合劑或其組合。在某些實施方案中，除了0.67MNaCl以外，該平衡溶液/洗液可包含10mMTris-HCl、lmMNa2EDTA，pH為8。在某些實施方案中，平衡溶液/洗液可經(jīng)所述柱以約800mL/min至約1500mL/min被泵送。稀釋的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液可在某些實施方案中以小于約4800mL/min、在某些實施方案中以從約2000mL/min至約20，000mL/min被泵送至所述柱上。裝載的柱可采用優(yōu)選為從約800mL/min至約1500mL/min的流速的平衡溶液/洗液洗滌。在某些實施方案中，洗滌可持續(xù)到流出液在260nm(A，)的吸光度回到大約基線處。質(zhì)?？刹捎冒?MNaCl、10mMTris-HCl、lmMNa2EDTA且pH為8的溶液洗脫。在某些實施方案中，洗脫是以以下流速進行的從約500mL/min至約9000mL/min、從約500mL/min至約8000mL/min、從約500mL/min至約7000mL/min、從約500mL/min至約6000mL/min、從約500mL/min至約5000mL/min、從約500mL/min至約4000mL/min、從約500mL/min至約3000mL/min、從約500mL/min至約2000mL/min、從約600mL/min至約5000mL/min、從約600mL/min至約4000mL/min、從約600mL/min至約3000mL/min、從約600mL/min至約2000mL/min或從約600mL/min至約1500mL/min。在某些實施方案中，洗脫持續(xù)到洗出液的A26?；氐酱蠹s基線處。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，通過使用大的膜面積可容易地增加流速并且可僅僅使用普通試驗而改變列出的特定鹽溶液的濃度以使特定生物分子的產(chǎn)率和純度最大化。收集的洗出液是離子交換洗出液并且用于隨后的通過疏水作用步驟的純化。從離子交換膜回收的離子交換洗出液經(jīng)過由疏水作用色譜(本文中，"HIC")的純化。在某些實施方案中，感興趣的生物活性分子可結(jié)合至HIC膜或柱，而雜質(zhì)流過或被洗掉。在某些實施方案中，感興趣的生物活性分子可流過而雜質(zhì)結(jié)合。在某些實施方案中，感興趣的生物活性分子流過HIC膜(本文稱為"方法I")。在某些實施方案中，感興趣的生物活性分子結(jié)合至HIC柱，例如丁基柱(本文稱為"方法II")。在某些實施方案中，可使用HIC膜和HIC柱(例如丁基柱)的組合(本文稱為"方法III")以得到大規(guī)模量的、具有高純度的感興趣的生物活性分子。離子交換洗出液可在流至疏水作用膜之前被調(diào)整。通常，所述調(diào)整由添加所期望量的所期望的鹽組成。在某些實施方案中，可按需要以適于提供產(chǎn)物或雜質(zhì)的結(jié)合的量使用硫酸銨。通常，在方法III中，在裝載至丁基柱之前，對于HIC濾液可不必調(diào)整。在某些實施方案中，離子交換洗出液通過使用PallMustangQ柱的陰離子交換色譜產(chǎn)生并通過疏水作用進一步純化。在某些實施方案中，可使用諸如具有SuporPES過濾器的PallKleenpakNova囊(PallCorporation,EastHills，NY)。所述柱可通過將含有濃縮硫酸銨的平衡溶液/洗液流過該柱而被調(diào)整。在某些實施方案中，所述平衡溶液/洗液包含從約1M硫酸銨至約3M硫酸銨并且在某些實施方案中包含2.4M硫酸銨和10mMTris-HCl，pH為8。在某些實施方案中，所述平衡溶液/洗液的電導(dǎo)率為從約240mS/cm至約260mS/cm。在某些實施方案中，所述平衡溶液/洗液的電導(dǎo)率為從約240mS/cm至約300mS/cm，在某些實施方案中，所述平衡溶液/洗液為從約250mS/cm至約270mS/cm，并且在某些實施方案中，所述平衡溶液/洗液為從約245mS/cm至約255mS/cm。在某些實施方案中，使用的HIC柱可以是用樹脂Toyopearl丁基樹脂650M(TosohBioscienceLLC，Montgomeryville，PA)填充的柱。在某些實施方案中，所述柱可用含有約1.5M硫酸銨至約3.OM硫酸銨的溶液平衡。在某些實施方案中，所述柱可與含有2.5M硫酸銨和10mMTris-HCl的溶液平衡。疏水作用膜可以是任何這樣的膜，其主要基于疏水作用結(jié)合感興趣的生物活性分子或雜質(zhì)。HIC膜的實例包括，但是限于Pallsupor聚醚砜("PES")過濾器、PVDF過濾器、GEPES囊式過濾器和具有低蛋白結(jié)合和寬化學(xué)相容性的類似的親水膜。典型的HIC樹脂包括，但不限于丁基、己基、苯基、辛基、丙基、新戊基、羥基丙基、節(jié)基、甲基及其衍生物。在某些實施方案中，所述離子交換洗出液可通過用3M或4.1M硫酸銨將其稀釋而被調(diào)整以得到從約240mS/cm至約290mS/cm并且在某些實施方案中為從約245mS/cm至約255mS/cm的電導(dǎo)率。當使用HIC方法I時，稀釋的離子交換洗出液可以在某些實施方案中為從約100mL/min至約200mL/min的流速流過調(diào)整的HIC柱。流過物(flow-through)可被收集用于隨后的超濾/滲濾?？蛇x擇地，HIC柱可用水洗滌，并且回收洗液以分析從產(chǎn)物中除去的污染物。當使用方法II時，稀釋的離子交換洗出液可以10-20床體積/分鐘(BV/min)的流速被裝載至柱。感興趣的生物活性分子可被洗滌，例如用1.0M硫酸銨至約2.5M硫酸銨，直至吸光度回到基線處，然后用例如0.5M至2.OM硫酸銨洗脫。雜質(zhì)可用無菌的注射用水(WFI)剝離以便柱可被再生而重復(fù)使用。方法III使用如方法I描述的HIC膜，然后是如方法II描述的HIC柱。對于方法1、方法II或方法III的選擇取決于產(chǎn)物性質(zhì)和質(zhì)量要求，這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。使用任何HIC方法，均產(chǎn)生包含感興趣的生物活性物質(zhì)的HIC洗出液。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，通過使用大的膜面積或柱直徑可容易地增加流速，并且可僅僅使用普通試驗而改變列出的特定鹽溶液的濃度以使特定生物分子的產(chǎn)率和純度最大化。可選擇地，存在于HIC洗出液中的感興趣的生物活性物質(zhì)可進一步純化。在某些實施方案中，HIC洗出液可經(jīng)過超濾/滲濾以濃縮感興趣的生物活性物質(zhì)、除去過量的鹽，并且如果需要，改變稀釋液的組成。用于進行超濾/滲濾的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在某些實施方案中，使用切向流過濾。在某些實施方案中，使用分批方法。超濾膜/滲濾膜可基于名義截留分子量("NMWCO")而選擇以便將感興趣的生物活性物質(zhì)保留在截留物中，而允許諸如鹽的低分子量物質(zhì)通過進入濾過液。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于感興趣的產(chǎn)物的尺寸和特性結(jié)合僅普通的試驗而選擇這樣的膜。在某些實施方案中，例如當感興趣的生物活性物質(zhì)是質(zhì)粒時的某些實施方案，可使用PallCentramate裝置(PallCorporation，EastHills，NY)或MilliporePelliconXL裝置(MilliporeCorporate，Billerica，MA)或具有類似特征的裝置進行超濾/滲濾，并且使用的膜可以是PallOmega懸掛篩膜盒(suspendedscreenmembranecassette)(PallCorporation,EastHills，NY)或Millipore中等篩膜盒(mediumscreenmembranecassette)(MilliporeCorporate,Billerica，MA)或本領(lǐng)域中公知的NMWC0為100kD或50kD的類似的盒。在某些實施方案中，質(zhì)?？蓾饪s為至少約2.5mg/mL，在某些實施方案中為至少約5.Omg/mL，在某些實施方案中為至少約10.0mg/mL，而在其他實施方案中，濃度為至少12.5mg/mL，并且在其他實施方案中，濃度為至少約15mg/mL或更多。在某些實施方案中，濃縮的質(zhì)粒溶液的電導(dǎo)率為小于約50mS/cm。如果需要無菌的產(chǎn)物，在來自超濾/滲濾的截留物中回收的、濃縮的、脫鹽的感興趣的生物活性物質(zhì)可經(jīng)過無菌過濾。用于無菌過濾的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可選擇任何這樣的方法。所得物質(zhì)由基本上純化的生物活性產(chǎn)物組成。該產(chǎn)物可用于多種用途，包括，但不限于，藥學(xué)應(yīng)用、獸醫(yī)應(yīng)用或農(nóng)業(yè)應(yīng)用。因此，該方法提供了基本上純化的生物活性分子的大批制備。這些分子可以是質(zhì)粒。在某些實施方案中，它們可以是基本上不含基因組DNA、RNA、蛋白和內(nèi)毒素的質(zhì)粒。16在某些實施方案中，例如生物活性分子是質(zhì)粒的實施方案，優(yōu)選地，無菌過濾可使用具有O.22iim截留的Pa11AcroPak200過濾器(PallCorporation，EastHills，NY)而進行。由提供的工藝產(chǎn)生的質(zhì)粒DNA已顯示出高純度和極低的污染。在某些實施方案中，質(zhì)粒DNA的高純度是以以下的水平存在的質(zhì)粒DNA:大于或等于90X、大于或等于91%、大于或等于92%、大于或等于93%、大于或等于94%、大于或等于95%、大于或等于96%、大于或等于97%、大于或等于98%或大于或等于99%。很顯然地，純度可由低水平的污染物而表征，包括低水平的RNA、基因組DNA、內(nèi)毒素和蛋白。在某些實施方案中，質(zhì)粒DNA可以是以下的量約10mg或更多、20mg或更多、30mg或更多、100mg或更多、200mg或更多、300mg或更多、500g或更多、lg或更多、10g或更多、20g或更多、30g或更多、100g或更多、200g或更多、300g或更多、lkg或更多或2kg或更多。在某些實施方案中，質(zhì)粒DNA的濃度可以是lmg/mL或更多。圖1顯示制備工藝的一個實施方案的示意圖。實施方案顯示一種連續(xù)過程，所述連續(xù)過程用于采集給定的細胞樣品并經(jīng)歷相同的純化工藝步驟，所述純化工藝步驟起始于開始(包括溶胞和中和步驟)直至樣品的連續(xù)流中的分離步驟(即，離子交換色譜的開始)。細胞在包含于細胞懸浮罐101的重懸液中重懸。溶胞溶液包含在溶胞溶液罐102中。分別用泵104或泵105將細胞懸浮液和溶胞溶液泵送至"Y"形連接器的兩個入口。離開"Y"形連接器的溶液通過高剪切的串聯(lián)混合器107混合。離開混合器107的溶胞產(chǎn)物溶液通過保持盤管108，保持期為4-6分鐘。離開保持盤管的溶胞溶液/細胞混合物進入泡罩塔混合器109而同時泵106將中和/沉淀(NP)溶液從另一個罐(NP溶液罐103)遞送至泡罩塔混合器。同時，將來自壓縮氣體罐110的壓縮氣體進料至位于泡罩塔混合器109的底部的鼓泡器。在容器111中收集被中和的溶胞產(chǎn)物溶液。在容器111中收集溶胞產(chǎn)物1-60分鐘的時段后，通過后面的工藝同時處理溶胞產(chǎn)物溶液。用于初級過濾的泵112將粗溶胞產(chǎn)物溶液遞送經(jīng)過初級過濾器113。初級濾過的溶液在過濾器113之后經(jīng)泵114被同時泵送至二級過濾器115。經(jīng)過泵116，由115產(chǎn)生的濾過的溶液經(jīng)第三過濾器117而被過濾。用于凈化的溶胞產(chǎn)物的泵118將流從用于溶胞產(chǎn)物的容器119驅(qū)動至混合器121，所述流與來自水罐120的水混合?；旌喜⑶蚁♂尩娜芤涸谟糜谙♂尩娜馨a(chǎn)物的容器122中收集。稀釋的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液被泵送至預(yù)調(diào)整的MustangQ柱124，這由泵123完成。在某些實施方案中，本文提供的工藝的產(chǎn)物是純化的、濃縮的、脫鹽的、無菌濾過的質(zhì)粒，能夠基本上不含諸如蛋白、基因組DNA、RNA和內(nèi)毒素的雜質(zhì)。本文提供了低水平的這些雜質(zhì)或污染物，優(yōu)選基本上沒有的量，最優(yōu)選的水平為無法檢測量的這樣的雜質(zhì)或污染物。在某些實施方案中，在由提供的制備方法制備的生物活性分子(優(yōu)選質(zhì)粒)的溶液中，由BCA(二辛可寧酸)蛋白測定法(PierceBiotechnology,Inc.，Rockford，IL)測定的殘留蛋白可以小于或等于約1%(按重量計)、小于或等于0.9%、小于或等于0.8%、小于或等于0.7%、小于或等于0.6%、小于或等于0.5%、小于或等于0.4%、小于或等于0.3%、小于或等于0.2%或小于或等于約0.1%。在某些實施方案中，殘留蛋白為小于或等于0.2%并且更優(yōu)選地，小于或等于0.1%。在某些實施方案中，在由提供的制備方法制備的生物活性分子(優(yōu)選質(zhì)粒)的溶液中，殘留內(nèi)毒素可以小于約100內(nèi)毒素單位每毫克質(zhì)粒(EU/mg)、小于約或等于約20EU/mg、小于約或等于約10EU/mg、小于或等于約1.0EU/mg、小于或等于約0.9EU/mg、小于或等于約0.8EU/mg、小于或等于約0.7EU/mg、小于或等于約0.6EU/mg、小于或等于約0.5EU/mg、小于或等于約0.4EU/mg、小于或等于約0.3EU/mg、小于或等于約0.2EU/mg、或小于或等于約0.lEU/mg。優(yōu)選地，在某些實施方案中，內(nèi)毒素水平為小于或等于約0.2EU/mg，并且更優(yōu)選地，小于或等于約0.lEU/mg。在某些實施方案中，在由提供的制備方法制備的生物活性分子(優(yōu)選質(zhì)粒)的溶液中，由疏水作用HPLC測定的殘留RNA可以小于或等于約5%(按重量計)、小于或等于約1%、小于或等于0.9%、小于或等于0.8%、小于或等于0.7%、小于或等于0.6%、小于或等于0.5%、小于或等于0.4%、小于或等于0.3%、小于或等于0.2%或小于或等于約0.1%。優(yōu)選地，在某些實施方案中，RNA的量為小于或等于約0.5%，并且更優(yōu)選地，小于或等于0.4%。在某些實施方案中，在由提供的制備方法制備的生物活性分子(優(yōu)選質(zhì)粒)的溶液中，由qPCR測定的殘留基因組DNA可以小于或等于約5%(按重量計)、小于或等于約1%、小于或等于0.9%、小于或等于0.8%、小于或等于0.7%、小于或等于0.6%、小于或等于0.5%、小于或等于0.4%、小于或等于0.3%、小于或等于0.2%、小于或等于約0.1%、小于或等于約0.01%、小于或等于約0.001%、小于或等于約0.0001%、小于或等于約0.00001%或小于或等于約0.000001%。優(yōu)選地，在某些實施方案中，基因組DNA的量為小于或等于約0.1%，并且更優(yōu)選地小于約0.001%，并且最優(yōu)選地小于或等于約0.000001%。通過本文提供的方法可制備出大量高收率且高濃度的質(zhì)粒DNA。通過提供的工藝制備的質(zhì)粒DNA包括高純度的質(zhì)粒DNA溶液。在某些實施方案中，質(zhì)粒DNA的高純度為大于或等于約90%、大于或等于約91%、大于或等于約92%、大于或等于約93%、大于或等于約94%、大于或等于約95%、5mg/mL或更高、6mg/mL或更高、7mg/mL或更高、8mg/mL或更高、9mg/mL或更高、10mg/mL或更高、llmg/mL或更高、12mg/mL或更高、13mg/mL或更高、14mg/mL或更高、15mg/mL或更高。在某些實施方案中，質(zhì)粒DNA的濃度可以是從約5mg/mL至約15mg/mL、從約5mg/mL至約14mg/mL、從約5mg/mL至約13mg/mL、從約5mg/mL至約12mg/mL、從約5mg/mL至約11mg/mL、從約5mg/mL至約10mg/mL、從約5mg/mL至約9mg/mL、從約5mg/mL至約8mg/mL，f農(nóng)度可以是從約6mg/mL至約15mg/mL、從約6mg/mL至約14mg/mL、從約6mg/mL至約13mg/mL、從約6mg/mL至約12mg/mL、從約6mg/mL至約11mg/mL、從約6mg/mL至約10mg/mL、從約6mg/mL至約9mg/mL、從約6mg/mL至約8mg/mL，f農(nóng)度可以是從約7mg/mL至約15mg/mL、從約7mg/mL至約14mg/mL、從約7mg/mL至約13mg/mL、從約7mg/mL至約12mg/mL、從約7mg/mL至約11mg/mL、從約7mg/mL至約10mg/mL、從約7mg/mL至約9mg/mL、從約8mg/mL至約15mg/mL、從約8mg/mL至約14mg/mL、從約8mg/mL至約13mg/mL、從約8mg/mL至約12mg/mL、從約8mg/mL至約llmg/mL、從約8mg/mL至約10mg/mL、從約9mg/mL至約15mg/mL、從約9mg/mL至約14mg/mL、從約9mg/mL至約13mg/mL、從約9mg/mL至約12mg/mL、從約9mg/mL至約11mg/mL、從約10mg/mL至約15mg/mL、從約10mg/mL至約14mg/mL、從約10mg/mL至約13mg/mL、從約10mg/mL至約12mg/mL、從約11mg/mL至約15mg/mL、從約11mg/mL至約14mg/mL、從約11mg/mL至約13mg/mL、從約12mg/mL至約15mg/mL、從約12mg/mL至約14mg/mL或從約13mg/mL至約15mg/mL。在某些實施方案中，質(zhì)粒DNA可以是如大于約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%的超螺旋質(zhì)粒并且優(yōu)選地大于80%超螺旋質(zhì)粒的超螺旋百分比所提出的這樣的濃度。在某50-75%、50-70%、50-65%、50-60%、60-90%、60-80%、60-75%、60-70%、65-90%、65-80%、65-75%、65-70%、70-90%、70-80%、70-75%、80-90%、85-90%、90-95%或更高的超螺旋百分比所提出的這樣的濃度。在某些實施方案中，質(zhì)粒DNA可以是如90%或更高、95%或更高、或98%或更高的超螺旋與松弛(開環(huán)非降解的)百分比所提出的這樣的濃度。在某些實施方案中，質(zhì)粒DNA可以是如以下所提出的這樣的濃度在儲存2年或更長后剩余物基本上為松弛的(開環(huán)非降解的)質(zhì)粒的50%或更高的超螺旋百分比、在儲存2年或更長后剩余物基本上為松弛的(開環(huán)非降解的)質(zhì)粒的60%或更高的超螺旋百分比、在儲存2年或更長后剩余物基本上為松弛的(開環(huán)非降解的)質(zhì)粒的65%或更高的超螺旋百分比、在儲存2年或更長后剩余物基本上為松弛的(開環(huán)非降解的)質(zhì)粒的85%或更高的超螺旋百分比，其中所述儲存是在水的凝固點以下。在某些實施方案中，質(zhì)粒DNA可以是如以下所提出的這樣的濃度在儲存2年或更長后90%或更高、95%或更高、98%或更高的超螺旋與松弛的(開環(huán)非降解的)百分比，其中所述儲存是在水的凝固點以下。如此處描述的這樣的質(zhì)粒制備可以制成本文描述的工藝的產(chǎn)物。實施例在以下實施例中進一步說明本發(fā)明，其中份和百分比是按重量計并且度是攝氏度，除非另外說明。應(yīng)當理解，這些實施例雖然指示了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但其僅作為示例而給出。從以上的討論和這些實施例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的基本特征，并且在不背離其精神和范圍的情況下，能夠?qū)Ρ景l(fā)明做出多種改變和更改以使其適應(yīng)多種用途和條件。因此，除了本文呈現(xiàn)和描述的那些更改以外，從先前的描述中，本發(fā)明的多種更改將對本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。這樣的更改還意圖落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實施例1將含有質(zhì)粒A的大腸桿菌("E.coli")的細胞發(fā)酵為高密度，在通過離心分離收獲時的細胞光密度("0D6。。")為72。質(zhì)粒A具有6549bp的尺寸。質(zhì)粒通常以250拷貝/細胞的低拷貝數(shù)復(fù)制。將細胞濕重("WCW")為約3.lkg的細胞糊懸浮于由25mMTris-鹽酸鹽("Tris-HCl"，J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)、10mM依地酸二鈉("Na2EDTA"，F(xiàn)isherScientific,FairLawn，NJ)組成的、pH8的重懸緩沖液至約21.5L的最終體積。將該細胞懸浮液以300mL/min泵送至"Y"形連接器的一側(cè)。同時，將由0.2N氫氧化鈉("NaOH"，J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)、1%十二烷基硫酸鈉("SDS"，J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)組成的溶胞溶液以300mL/min泵送至"Y"形連接器的另一側(cè)。離開"Y"形連接器的合并的流體立即通過配備標準乳化器篩網(wǎng)(SilversonMachines,Inc.EastLongmeadow，MA)和串聯(lián)組件的SilversonModelL4R轉(zhuǎn)子/定子混合器。該混合器以800rpm的轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速運轉(zhuǎn)。離開轉(zhuǎn)子/定子混合器的流體通過50-英尺、0.625英寸(內(nèi)徑)的保持盤管。以約600mL/min的總流速，經(jīng)過保持盤管的通過時間為約5分鐘以允許完全的細胞溶胞。將離開保持盤管的細胞溶胞產(chǎn)物(溶胞產(chǎn)物溶液)通入泡罩塔混合器。同時，將由1M乙酸鉀(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)、7M乙酸銨(EMDChemicals，Inc.，Bibbstown，NJ)組成的冷的(約4°C)中和/沉淀溶液以600mL/min獨立地泵送至泡罩塔混合器。溶胞產(chǎn)物溶液和中和/沉淀溶液垂直流上混合柱并流過靠近頂部的出口。當該溶液通過混合柱時，將壓縮空氣以約3.0slpm的速率經(jīng)過燒結(jié)的鼓泡器引入該柱的底部，所述燒結(jié)的鼓泡器設(shè)計為提供貫穿該混合的橫斷面的持續(xù)的小氣泡流。過量的空氣經(jīng)該柱的頂部排出。當溶胞產(chǎn)物溶液和中和/沉淀溶液通過該柱時，它們通過上升氣泡的溫和湍流而不斷地混合。這可以通過由SDS鉀、變性的細胞蛋白、結(jié)合的脂質(zhì)和細胞壁成分以及相關(guān)的基因組DNA組成的白色絮狀沉淀(碎片組分)形成來證明。在沉降容器中收集離開泡罩塔混合器的被中和的沉淀的溶胞產(chǎn)物(被中和的溶胞產(chǎn)物溶液和碎片的懸浮液)。以連續(xù)方式運行該工藝直到全部的細胞糊懸浮液被溶解、被中和及被沉淀并且在沉降罐中收集。全部的溶液體積為21.5L細胞懸浮液加5L洗滌重懸罐的重懸緩沖液、26.5L溶胞溶液和53L中和溶液，總體積為約106L。在收集后，通過觀察窗觀察沉降罐中的物質(zhì)?？梢钥吹叫鯛畛恋碓诒粖A入固體中的清晰可見的氣泡的幫助下上升至液體表面。將約28英寸Hg的真空施加于沉降罐，導(dǎo)致對漂浮的沉淀的顯著并且可見的壓緊。在室溫下，將該物質(zhì)在沉降罐中真空保持約16小時。然后緩慢地對真空放氣以避免破壞壓緊的沉淀。將含質(zhì)粒的液體(被中和的溶胞產(chǎn)物溶液)從罐中經(jīng)底部的清潔設(shè)備(sanitaryfitting)而小心泵送。持續(xù)監(jiān)測罐中液體和沉淀的水平，并且及時停止泵送以確保沉淀不離開罐。經(jīng)過lOiim深層過濾，接著是O.liim最終過濾。由于過濾器的阻塞，一部分被中和的溶胞產(chǎn)物溶液在過濾期間損失了。結(jié)果，獲得了約69L澄清的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液。然后用約93L凈化水稀釋被中和的溶胞產(chǎn)物溶液，獲得162L的總體積和約97mS/cm的電導(dǎo)率，為用陰離子交換進一步處理做準備。估計在濾過的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液中的質(zhì)粒濃度為約17yg/mL，相當于約1170mg全部質(zhì)粒。通過陰離子交換進一步純化澄清的、稀釋的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液。用4L在pH8的lXTris-EDTA("TE")緩沖液中的0.67M氯化鈉("NaCl"，J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)來平衡260mL床體積的PallMustangQ柱，所述1XTris-EDTA緩沖液主要由10mMTris-HCl(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)禾口lmMEDTA(FisherScientific,FairLawn，NJ)組成。以1.2L/min的流速將體積為162L的稀釋的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液泵送至Q柱上。監(jiān)測并使用長條紙記錄儀記錄柱流出液在260nm處的紫外("UV")吸收。在裝載后，用1.2L/min的平衡緩沖液洗滌柱直至流出液的A26。接近基線。然后用以1.2L/min泵送的、含有1MNaCl(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)的1XTE緩沖液將質(zhì)粒從柱中洗脫。A260回到基線時洗脫終止。全部洗出液的體積為約4.8L并且包含共約915mg基于A，的DNA。Q陰離子交換的產(chǎn)率為約78%。在該步驟中的流過和洗滌中將包含蛋白、大部分RNA、基因組DNA和內(nèi)毒素的污染物除去。經(jīng)過丁基柱的方法II，通過疏水作用進一步純化Q流出液。用290mL床體積("BV，，)的Toyopearl丁基樹月旨650M(TosohBioscienceLLC，Montgomeryville，PA)填充K5/15Amersham(Piscataway，NJ)柱。將24L體積的3M硫酸銨(EMDChemicals,Inc.，Gibbstown，NJ)在裝載前與4.8LQ流出物混合。用2L以43mL/min泵送的2.5M硫酸銨(EMDChemicals,Inc.，Gibbstown，NJ)平衡該柱。將調(diào)整的Q流出液以43mL/min裝載至丁基柱，隨后用5L2.5M硫酸銨(EMDChemicals,Inc.，Gibbstown,NJ)以43mL/min洗滌，并且產(chǎn)物用1.5L1.8M硫酸銨(EMDChemicals,Inc.，Gibbstown,NJ)以43mL/min洗脫。該柱用無菌的注射用水("WFI"，BaxterHealthcare,Deerfield，IL)剝離以除去包含RNA和內(nèi)毒素的結(jié)合的污染物，并且被再生而重復(fù)使用。流出液獲得約870mg質(zhì)粒，產(chǎn)率為95X，而質(zhì)粒的超螺旋百分比從Q之后的66%富集至丁基柱步驟后的大于80%。[OO96]使用PallCentramate盒支持物，通過超濾/滲濾("UF/DF")將來自丁基HIC的流出液濃縮并脫鹽，所述PallCentramate盒支持物配備了面積為l平方英尺且名義截留分子量為50kDa的一個PallOmega懸掛篩膜盒(PallCorporation,EastHills，NY)。回收了體積為41.2mL的大批截留物，其含有的DNA濃度為9.026mg/mL(基于A26。)。用于UF/DF設(shè)備(UF/DFrig)的WFI的第一次洗滌得到46.9mL，濃度為1.6mg/mL。WFI的第二次洗滌得到65.8mL，濃度為0.268mg/mL。在UF后合并的回收DNA為約476mg，收率為55%。獲得的質(zhì)粒的最終超螺旋百分比在UF后為大于87%。來自實施例1的樣品通過在圖2中顯示的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。在所有樣品泳道中(第2-5泳道)均存在三個主要的帶，而最低的帶是超螺旋形式的目標質(zhì)粒A(6.5kb)。第1泳道表示超螺旋質(zhì)粒標準梯帶(Invitrogen)。第2泳道表示含有6.5kb質(zhì)粒產(chǎn)物的細胞溶胞產(chǎn)物，而大量RNA也存在于該樣品中。第3泳道表示Q陰離子交換后的產(chǎn)物，其顯示質(zhì)粒被濃縮，具有較少的RNA。第4泳道顯示用疏水作用純化后的產(chǎn)物，并且第5泳道表示UF后混合的最終產(chǎn)物。在溶胞產(chǎn)物中的污染物RNA被除去并且所期望的超螺旋質(zhì)粒的純度基本上從60%增加至>85%。實施例2將包含質(zhì)粒B的3140克量的大腸桿菌細胞重懸于重懸緩沖液至最終體積18.8L，該重懸緩沖液是由pH為8的25mMTris-HCl(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)和10mMNa2EDTA組成的。質(zhì)粒B具有4.7kb的尺寸。重懸的細胞通過SilversonModelL4R轉(zhuǎn)子/定子混合器、以300mL/min的相等流速與由0.2NNaOH(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)和1%SDS(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)組成的溶胞溶液混合，所述SilversonModelL4R轉(zhuǎn)子/定子混合器以800rpm的轉(zhuǎn)子速度運行。在進入泡罩塔以與預(yù)冷卻的(4°C_5°C)中和/沉淀(NP)溶液混合之前，來自混合器的溶胞產(chǎn)物流出液在保持盤管中維持5分鐘的保持時間。將含有1M乙酸鉀(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和3M乙酸銨(EMDChemicals,Inc.，Bibbstown，NJ)的NP溶液以600mL/min進料至泡罩塔混合器，同時，以3-5slpm的流速從鼓泡器底部將壓縮空氣引入。被中和的細胞溶胞產(chǎn)物首先通過懸掛在泡罩塔出口下面的200-400iim的編織網(wǎng)袋接收。大的細胞絮狀物保留在袋中，而含有質(zhì)粒DNA和減少的細胞碎片的粗溶胞產(chǎn)物溶液在預(yù)冷卻的(5°C)沉降罐中收集。同時，以2L/min的流速將產(chǎn)生的粗溶胞產(chǎn)物泵送至裝配在ECOLINE過濾器容器(EatonFiltration,Iselin，NewJersey)中的48iim褶裙式筒過濾器(CPIfilters，Houston,TX)。初級濾過的溶胞產(chǎn)物在容器中收集，回收的總體積為75L。然后進行二級過濾。以2L/min的流速將初級濾過的溶胞產(chǎn)物泵送至裝配在ECOLINE過濾器容器(EatonFiltration,Iselin，NewJersey)中的523多層的袋過濾器(KnightCorporation,Barrington，IL)。回收的溶液在容器中收集，回收的總體積為65L。最后，使用MillistakPod—次性的深層過濾器系統(tǒng)(Millipore，Bellerica，MA)進行深層過濾。過濾介質(zhì)具有0.2-2.5iim的孔徑分布。膜面積為0.11m2的Pod過濾器用于以0.5L/min的流速凈化二級濾過的溶胞產(chǎn)物。獲得60L體積的最終凈化的溶胞產(chǎn)物，其呈現(xiàn)出NTU值低于2的高澄清度。在過濾的每個階段中，溶胞產(chǎn)物樣品中的質(zhì)粒純度和形式是難區(qū)分的。實施例3將含有質(zhì)粒C的大腸桿菌細胞發(fā)酵為高細胞密度，并通過離心收獲。從400L發(fā)酵的工作體積中回收細胞濕重為24.4kg的細胞。將細胞用由pH為8的25mMTris-HCl(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)禾口10mMNa2EDTA(MallinckrodtBaker，Phillipsburg，NJ)組成的171L重懸緩沖液重懸3小時的時段。通過Silverson高剪切混合器以600ml/min的相同流速將重懸的細胞與新鮮的溶胞溶液混合，并且保持約5min，由保持環(huán)路(holdingloop)完成。將由1M乙酸鉀(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和3M乙酸銨(EMDChemicals，Inc.，Bibbstown，NJ)組成的中和/沉淀溶液以1.2L/min的流速泵送至泡罩混合器以與溶解的細胞混合。以5-6slpm的氣體流速進料的壓縮空氣作為混合力(mixingforce)和將被中和的溶胞產(chǎn)物運輸至收集罐。約5小時的時段用于溶胞過程。離開泡罩混合設(shè)備的被中和的細胞被轉(zhuǎn)移至收集罐并經(jīng)過以下的連續(xù)過濾。被中和的粗溶胞產(chǎn)物在其形成時用三個連續(xù)的過濾來處理并且這些凈化過程與溶胞過程同時進行。最初的過濾是通過將含有細胞絮狀物的粗溶胞產(chǎn)物以2.4L/min的流速泵送至配備48iim褶裙式筒過濾器(CPIfilters,Houston,TX)的T0PLINE過濾器容器(EatonFiltration,Iselin，NewJersey)中而進行。使用初級過濾以除去大部分的諸如細胞絮狀物的大顆粒，并且褶裙式的膜提供更大的過濾面積，從而提供了比單層或多層結(jié)構(gòu)更高的流速和更大的處理容量。使用4個褶裙式筒以處理體積為680L的含有細胞絮狀物的被中和的粗溶胞產(chǎn)物，而回收的初級濾過的溶胞產(chǎn)物估計為600L。將離開48iim褶裙式筒過濾器的溶液以2.4L/min的流速直接泵送至配備1Pm多層筒過濾器(CPIfilters,Houston,TX)的二級EC0LINE過濾器容器(EatonFiltration,Iselin，NewJersey)。該步驟除去在二級濾過的溶胞產(chǎn)物中的范圍在1Pm與50m之間的小顆粒的大部分。隨后的MustangQ具有等于0.2ym的孔徑，并因此通過具有0.2ym或更小的絕對孔徑的過濾器進行三級深層過濾。深層過濾器Millitak+Pod過濾器系統(tǒng)能夠獲得大的處理體積和對細顆粒的高保留。裝配在不銹鋼Pod支持物中的MillistakC0HC過濾器(Millipore，Bellerica，MA)用于將溶胞產(chǎn)物的濁度降低至2比濁法濁度單位(NTU)。膜面積為1.lm2的C0HC過濾器處理400L體積的二級濾過的溶胞產(chǎn)物。在容器中收集離開Millistak過濾器的濾過的溶胞產(chǎn)物。將來自該容器的一部分溶液以2.2L/min的流速泵送至"Y"形連接器以與水混合，所述水以0.7L/min的流速被泵送至相同的"Y"形連接器。該混合物流入導(dǎo)入另一保持罐的Kenics串聯(lián)混合器。在保持罐中如此稀釋的溶胞產(chǎn)物的電導(dǎo)率為90-95mS/cm的范圍。將體積為400L的稀釋的溶胞產(chǎn)物裝載至10英寸的MustangQ(Pall，EastHills，NY)中，所述MustangQ具有260ml的床體積。在200L的Q負載之前使Q囊飽和。在Q流出液中回收約3g的質(zhì)粒DNA。Q產(chǎn)物的超螺旋百分比在80%_90%之間，并且Q洗出液中的RNA含量不能被凝膠分析所檢測到。來自實施例3的樣品通過在圖3中顯示的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。在每一泳道中的最高強度的帶表示超螺旋(SC)形式的質(zhì)粒，其以80-90%的百分比存在。第l泳道表示超螺旋質(zhì)粒標準梯帶。第2泳道表示在使用48m褶裙式筒的初級過濾后的溶胞產(chǎn)物，并顯示高的RNA含量。第3泳道表示在使用1ym褶裙式筒的二級過濾后的濾液，并且也顯示高的RNA含量。第4泳道表示在使用C0HCPod過濾器的三級過濾后的濾液，并且顯示減少的RNA比例。第5泳道表示在經(jīng)過MustangQ陰離子交換步驟后的流出液產(chǎn)物級分#1，其呈現(xiàn)出有限的RNA的高純度。第6泳道表示Q流出液的二級級分，與流出液#1具有類似的純度。實施例4將細胞濕重為25kg的含有質(zhì)粒C的大腸桿菌細胞在由pH為8的25mMTris-HCl(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)和10mMNa2EDTA組成的105L重懸緩沖液中重懸3小時的總時間。質(zhì)粒C具有3.5kb的尺寸。將重懸的細胞以1500ml/min的流速泵送至SilversonModelL4R轉(zhuǎn)子/定子混合器，同時，將由0.2NNaOH(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和1%SDS(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)組成的溶胞溶液以1500ml/min的流速遞送至相同的混合器。使含有溶解的細胞的混合物通過內(nèi)徑(ID)為l英寸且長度為100英尺的保持盤管。對于溶胞產(chǎn)物從進入混合器直至離開保持盤管的大約的保留時間為5分鐘。然后溶解的細胞進入泡罩塔與預(yù)冷卻的(4°C_5°C)中和/沉淀(NP)溶液接觸。將含有1M乙酸鉀(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)和3M乙酸銨(EMDChemicals,Inc.，Bibbstown，NJ)的NP溶液以3000mL/min進料至泡罩塔混合器。同時，從鼓泡器底部以6-10slpm的流速將壓縮空氣引入以作為混合力并促進被中和的溶液進入導(dǎo)入粗溶胞產(chǎn)物罐的轉(zhuǎn)移管。在收集粗溶胞產(chǎn)物20分鐘時段后，將溶液從粗溶胞產(chǎn)物罐的底部以6L/min的流速泵送至配備48iim褶裙式筒過濾器(CPIfilters,Houston,TX)的TOPLINE過濾器容器(EatonFiltration,Iselin，NewJersey)。同時，將來自初級過濾器容器的濾液以6L/min的流速泵送至配備liim褶裙式筒過濾器(CPIfilters,Houston,TX)的二級TOPLINE過濾器容器(EatonFiltration,Iselin，NewJersey)。初級過濾除去了99X的大于48iim的顆粒，并且五個10英寸的筒過濾器凈化了總體積為700L的粗溶胞產(chǎn)物。使用三個10英寸的1ym筒過濾器使完成二級過濾能夠除去99%大于1iim的顆粒。借助于泵，以5_6L/min的流速將來自二級容器的濾液收集在凈化的溶胞產(chǎn)物罐中。使用配備不銹鋼中試規(guī)模的Pod支持物的Millitak+C0HCPod過濾器(Millipore，Bellerica，MA)的三級過濾器系統(tǒng)以獲得高澄清度用于隨后的MustangQ純化。將來自凈化的溶胞產(chǎn)物罐的溶液以6L/min的流速泵送至pod過濾器。在入口壓力達到10psi之前，膜面積為2.2m2的C0HC過濾器處理了650L體積的二級濾過的溶胞產(chǎn)物。在濾過的溶胞產(chǎn)物容器中收集經(jīng)過三級Pod過濾器的濾液。將濾過的溶胞產(chǎn)物在裝載至MustangeQ之前遞送至"Y"形連接器并經(jīng)Kenics串聯(lián)混合器以0.3-0.4V水/V溶胞產(chǎn)物的比例與水混合。以5L/min的流速泵送溶胞產(chǎn)物，而水以1.75-2L/min的流速進料。在稀釋的溶胞產(chǎn)物罐中收集該混合物。在保持罐中如此稀釋的溶胞產(chǎn)物的電導(dǎo)率為90-95mS/cm的范圍。將體積約為800L的稀釋的溶胞產(chǎn)物裝載至具有5000ml床體積的MustangQXT5000(Pall，EastHills,NY)。在Q流出液中回收約25g的質(zhì)粒DNA?；厥盏腝流出液顯示高百分比的超螺旋形式和有限水平的污染。實施例5下表I表示使用采用質(zhì)粒A(—種低拷貝質(zhì)粒)的方法II制備的14個質(zhì)粒制劑以及其中檢測的某些純度參數(shù)。用于制備的方案是以上實施例3中討論的方案。質(zhì)粒樣品的分析質(zhì)粒C具有3.5kb的尺寸(如實施例3和實施例4)。質(zhì)粒D1-D3范圍從4.4_4.7kb，除了表達基因外具有類似的結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒El-E2具有3.8kb的尺寸，除了表達基因外具有類似的結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒F具有2.5kb的尺寸。表I<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>權(quán)利要求一種從細菌細胞制備至少一種感興趣的生物活性分子的高純度樣品的大規(guī)模工藝，其包括以下步驟a)通過使所述大量細胞的細胞懸浮液與溶胞溶液接觸而制備溶胞產(chǎn)物溶液；b)用中和溶液中和所述溶胞產(chǎn)物溶液以制備包含被中和的溶胞產(chǎn)物溶液和碎片的分散體；c)通過至少一個過濾器過濾所述分散體；d)對所述被中和的溶胞產(chǎn)物溶液進行離子交換分離以產(chǎn)生離子交換洗出液；和e)對所述離子交換洗出液進行疏水作用分離以產(chǎn)生疏水作用溶液。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中步驟a)包括在高剪切的串聯(lián)混合器中使所述細胞懸浮液與溶胞溶液混合。3.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的方法，其中步驟b)包括在泡罩混合器中將所述溶胞產(chǎn)物溶液與所述中和溶液混合。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一項所述的方法，其中步驟e)包括使用疏水作用柱或疏水作用膜進行疏水作用分離以形成疏水作用溶液。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其還包括以下步驟；f)通過所述疏水作用溶液的超濾來制備生物活性分子的溶液。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其還包括以下步驟g)通過所述生物活性分子的溶液的無菌過濾來制備至少一種生物活性分子的無菌溶液。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其還包括將所述分散體保持一段時間以使所述被中和的溶胞產(chǎn)物溶液與所述碎片分離并且通過至少一個過濾器過濾所述被中和的溶胞產(chǎn)物溶液。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中制備步驟包括在混合器中使所述細胞懸浮液與所述溶胞溶液接觸約1分鐘至約20分鐘的持續(xù)時間。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述持續(xù)時間為從約4分鐘至約8分鐘。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述持續(xù)時間為約5分鐘。11.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述生物活性分子是質(zhì)粒。12.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述離子交換是陰離子交換膜。13.根據(jù)權(quán)利要求1_8、11或12中任一項所述的方法，其中步驟e)包括進行疏水作用分離，包括丁基疏水作用色譜，以制備疏水作用溶液，即丁基疏水作用色譜溶液流出液。14.根據(jù)權(quán)利要求l-8、或11-13中任一項所述的方法，其中所述方法包括從一個步驟基本上連續(xù)地過渡到隨后的步驟，并且包括通過將所述溶胞產(chǎn)物收集在容器中并將所述分散體通過初級過濾器而使所述分散體中的所述被中和的溶胞產(chǎn)物溶液與所述碎片分離以制備最初的粗的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其還包括使所述最初的粗的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液通過二級過濾器以產(chǎn)生隨后的粗的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液。16.—種從細菌細胞制備至少一種感興趣的生物活性分子的高純度樣品的大規(guī)模工藝，其包括以下步驟使所述細菌細胞以細胞分散體與溶胞溶液接觸以形成溶胞產(chǎn)物溶液；通過用泡罩塔混合器將中和溶液混入所述溶胞產(chǎn)物溶液而中和所述溶胞產(chǎn)物溶液以形成被中和的混合物；通過初級過濾器和二級過濾器過濾所述被中和的混合物以形成濾過的溶液；使所述濾過的溶液通過離子交換柱以形成離子交換溶液；使所述離子交換溶液通過疏水作用柱或疏水作用膜以形成疏水作用溶液；禾口超濾所述疏水作用溶液以形成至少一種感興趣的生物活性分子的高純度樣品；其中在從接觸步驟到使濾過的溶液通過的步驟的大規(guī)模工藝中的一個步驟向隨后步驟的每次過渡基本上連續(xù)發(fā)生。17.—種組合物，其包含由權(quán)利要求1所述的方法制備的至少一種感興趣的生物活性分子，其中至少一種感興趣的生物活性分子是DNA質(zhì)粒。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述組合物包含在溶液中的約10mg或更多量的DNA質(zhì)粒，其中高純度的所述質(zhì)粒是以大于約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%存在的質(zhì)粒。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述質(zhì)粒的純度為大于約99%。20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的組合物，其中所述溶液中的質(zhì)粒濃度為約5、6、7、8、`9、10、11、12或13mg/mL。21.根據(jù)權(quán)利要求18-21中任一項所述的組合物，其中所述質(zhì)粒包含大于約50%的超螺旋質(zhì)粒。22.根據(jù)權(quán)利要求18-21中任一項所述的組合物，其中所述質(zhì)粒包含大于約80%的超螺旋質(zhì)粒。23.根據(jù)權(quán)利要求18-22中任一項所述的組合物，其中所述溶液包含小于或等于約10EU內(nèi)毒素每mg質(zhì)粒。24.根據(jù)權(quán)利要求18-22中任一項所述的組合物，其中所述溶液包含小于或等于約1EU內(nèi)毒素每mg質(zhì)粒。25.根據(jù)權(quán)利要求18`0.1EU內(nèi)毒素每mg質(zhì)粒。26.根據(jù)權(quán)利要求18`1.0%RNA。27.根據(jù)權(quán)利要求18`0.4%RNA。28.根據(jù)權(quán)利要求18`1.0%蛋白。29.根據(jù)權(quán)利要求18`0.20%蛋白。30.根據(jù)權(quán)利要求18-29中任一項所述的組合物，其中所述溶液包含小于或等于約1%基因組DNA。31.根據(jù)權(quán)利要求18-29中任一項所述的組合物，其中所述溶液包含小于或等于約`0.01X基因組DNA。-22中任一項所述的組合物，其中所述溶液包含小于或等于約-25中任一項所述的組合物，其中所述溶液包含小于或等于約-25中任一項所述的組合物，其中所述溶液包含小于或等于約-25中任一項所述的組合物，其中所述溶液包含小于或等于約-27中任一項所述的組合物，其中所述溶液包含小于或等于約全文摘要公開了用于從細菌細胞制備具有感興趣的生物活性分子的高純度樣品的大規(guī)模工藝。該方法包括以下步驟通過使所述大量細胞的細胞懸浮液與溶胞溶液接觸制備溶胞產(chǎn)物溶液；用中和溶液中和所述溶胞產(chǎn)物溶液以制備包含被中和的溶胞產(chǎn)物溶液和碎片的分散體；通過至少一個過濾器過濾所述分散體；對所述被中和的溶胞產(chǎn)物溶液進行離子交換分離以產(chǎn)生離子交換洗出液；和對所述離子交換洗出液進行疏水作用分離以產(chǎn)生疏水作用溶液。此外，提供了包含通過公開的大規(guī)模工藝制備的大量質(zhì)粒DNA的組合物。文檔編號G02B6/293GK101702938SQ200880016945公開日2010年5月5日申請日期2008年5月23日優(yōu)先權(quán)日2007年5月23日發(fā)明者H·赫貝爾,R·德拉吉亞-阿克利,蔡穎申請人:Vgx藥品公司