專利名稱：一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址的實驗?zāi)M方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址的實驗?zāi)M方法。
背景技術(shù)：
冠狀動脈搭橋術(shù)是挽救心臟病患者生命的有效方法之一，雖然血管成形術(shù)(Angioplasty)和血管支架(Stent)具有更小的手術(shù)創(chuàng)傷，但這兩種方法一般只適用于冠 狀動脈僅有一處狹窄的情況，對于連續(xù)的多處狹窄，仍需采用動脈搭橋術(shù)來旁通狹窄的冠 狀動脈。過去的幾年里，大量的動脈移植管被植入心臟患者體內(nèi)來恢復(fù)病變或受損動脈的 血液流動。這種手術(shù)使用人造或天然的血管來實現(xiàn)旁通嚴(yán)重狹窄(75%面積減小)的動脈。 在冠狀動脈的搭橋手術(shù)中，一般采用患者自體的靜脈血管作為移植管，將移植管前端縫合 到升主動脈而下端縫合到冠狀動脈狹窄的下游。通過血流動力學(xué)數(shù)值計算與模擬流場實驗發(fā)現(xiàn)，這種手術(shù)的26%會在手術(shù)后的一 年內(nèi)失效，而動脈縫合處的細(xì)胞增生和血栓形成是手術(shù)失效的主要原因。為了弄清血管組 織細(xì)胞增生的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，人們對大量不同的移植管模型進(jìn)行了研究。臨床觀察表明， 動脈移植管手術(shù)中易發(fā)生血管組織細(xì)胞增生的地方有四個部位縫合前端(toe)，縫合后 端(heel)，縫合線(sutureline)及縫合區(qū)對面底部(floor)。血管組織細(xì)胞的增生與局部 血流動力學(xué)因素密切相關(guān)，而血管內(nèi)的局部血流動力學(xué)狀態(tài)主要依賴于動脈血管的幾何形 狀。對于動脈移植管而言，移植管與動脈縫合的結(jié)構(gòu)形狀是影響移植管長期有效性的重要 因素。對于動脈吻合術(shù)的結(jié)構(gòu)形狀，一些研究者研究了移植管與冠狀動脈的縫合角度對縫 合區(qū)局部血流動力學(xué)的影響。研究發(fā)現(xiàn)小的縫合角度優(yōu)于大的縫合角度，因為較小的縫合 角度，可以避免在縫合區(qū)產(chǎn)生較大范圍的回流，從而減少血管組織細(xì)胞的增生；也有人研究 了不同狹窄程度對縫合區(qū)及其下游的流場和血流動力學(xué)參數(shù)的影響。這種研究一般以兩個 相同或不同直徑的圓直管來代替移植管和冠狀動脈，而用兩管之間不同的流量分配來代替 冠狀動脈的不同狹窄程度。事實上，動脈搭橋術(shù)后，移植管中的血液流量有一個逐漸增加的 過程。在多數(shù)情況下，術(shù)后幾個星期狹窄的冠狀動脈會完全阻塞。但在最初的幾個星期里， 狹窄的冠狀動脈內(nèi)有部分血流通過，來自狹窄處的受限射流與來自移植管的血流在縫合區(qū) 附近相互作用，形成復(fù)雜的流場，這對縫合區(qū)血管組織細(xì)胞增生的始發(fā)位置及術(shù)后移植管 的再阻塞會有重要影響。所以為了準(zhǔn)確考量這種影響，必須考慮冠狀動脈狹窄的真實存在， 而不能簡單地以直管中的不同流量來代表不同的狹窄程度。張瑩等人的椎基動脈開窗畸形 處動脈瘤的血流動力學(xué)數(shù)值模擬分析研究，研究了包含動脈狹窄的移植管的血流動力學(xué)， 但他們考慮的移植管和冠狀動脈是具有相同直徑的圓直管。實際的冠脈搭橋手術(shù)中，移植 管一般是自體靜脈，其直徑往往大于冠狀動脈的直徑，所以在手術(shù)縫合時，移植管必須由圓 變形為橢圓來適應(yīng)較小直徑的冠狀動脈。中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報，23. 4. 2004采用有限元法、數(shù)值研究具有狹窄的冠狀動脈 移植管內(nèi)的血流動力學(xué)，并考慮移植管的這種變形。計算結(jié)果表明，在縫合前端下游，存在 一個低切應(yīng)力、高切應(yīng)力梯度的區(qū)域，在吻合區(qū)底部存在一個高切應(yīng)力、高切應(yīng)力梯度的區(qū)域。這兩個區(qū)域都是血管組織細(xì)胞增生并造成移植管術(shù)后再阻塞的危險部位。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明目的在于提供一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址 的實驗?zāi)M方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址的實驗?zāi)M 方法，所述方法包括下述步驟(a)制作不同構(gòu)型的吻合模型；(b)將分離獲得的人血管組織細(xì)胞在含10%胎牛血清(GIBCO)的DMEM中，環(huán)境為37°C,5% CO2的大氣下培養(yǎng)至融合，然后消化制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞以5.0X105細(xì)胞/cm2的 密度培養(yǎng)在預(yù)先涂布有纖連蛋白(FN;50yg/ml ；Roche,Germany)的載玻片上，細(xì)胞載玻片 置于6孔板中靜置培養(yǎng)6小時，備用，將載有培養(yǎng)好的血管組織細(xì)胞的載玻片固定在吻合模 型的吻合口區(qū)；(c)將整個吻合模型連接于閉合循環(huán)的灌流系統(tǒng)中，灌流系統(tǒng)由蠕動泵驅(qū)使，模擬 人體的血液流動進(jìn)行力學(xué)加載實驗；(d)將細(xì)胞載玻片取出在熒光顯微鏡成像以及用電子掃描顯微鏡掃描。所述吻合模型為有機(jī)玻璃板上雕刻出的呈30°夾角的兩通道構(gòu)成。所述吻合模型的主動脈和移植管的內(nèi)徑分別為6毫米和9毫米。所述灌流系統(tǒng)的培養(yǎng)液為含有自由血清的DMEM，其實驗環(huán)境為溫度保持在 37°C，灌流系統(tǒng)內(nèi)為含有5% CO2的大氣。所述吻合模型根據(jù)狹窄度Y值以及移植管的后端到狹窄區(qū)域中心之間的距離D 來制作，我們選擇Y值為70%、80%、90%和95%，0值為1厘米、2厘米和3厘米。所述細(xì)胞載玻片裝在吻合模型中之前，先將模型放置在紫外燈下照射2小時殺 菌，然后可密封保存，72小時內(nèi)使用。所述熒光顯微鏡成像的步驟為(a)取出力學(xué)加載后的細(xì)胞玻片，以PBS反復(fù)沖洗三遍，用4%的多聚甲醛于4°C固 定15min，再以PBS沖洗三遍；(b)然后加入F-actin和DNA熒光抗體，于37°C濕盒內(nèi)避光孵育30min ；(c)再以PBS沖洗3次，每次5min，洗掉多余熒光抗體，10%緩沖甘油封片；(d)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架分布情況。所述電子掃描顯微鏡掃描步驟為(a)對細(xì)胞載玻片施加力學(xué)加載后，室溫下，取出加載裝置內(nèi)的細(xì)胞玻片，PBS洗3 次；(b)2. 5%戊二醛固定，50% 100%的乙醇梯度脫水，CO2臨界點干燥，噴金；(c)掃描電鏡掃描分析。本發(fā)明的有益效果是實驗證明，在狹窄區(qū)的近端放置移植管可以最大限度的保 護(hù)流體形態(tài)。然而，在狹窄區(qū)的遠(yuǎn)端放置移植管，在主動脈的狹窄區(qū)將造成一個廣泛而相對 滯流的低剪切應(yīng)力區(qū)域，低剪切應(yīng)力引起血管組織細(xì)胞的肌動蛋白細(xì)胞骨架解聚；移植管 和術(shù)后穿過狹窄區(qū)的殘留流體引起的競爭流，在低度狹窄(Y小于80%)，殘留流體保持了一個很大的速度等級，因而對吻合口處的流動模式產(chǎn)生很大的干擾；競爭流動產(chǎn)生振蕩的 剪切應(yīng)力，最終將會加速血管組織細(xì)胞增生，從而促進(jìn)損傷處血管動脈粥樣硬化的進(jìn)程；當(dāng) 處于嚴(yán)重的狹窄的情形時(Y大于80%)，研究表明可以通過將移植管放置在宿主動脈的 近端來改善，盡量靠近蔽塞或者是狹窄區(qū)以便保護(hù)主近端動脈；相反，當(dāng)處于輕度狹窄的情 形時(Y小于80%)，研究表明將移植管放置在越遠(yuǎn)端將會對移植管產(chǎn)生明顯的保護(hù)效應(yīng)， 因為它可以避免流體競爭。


圖1為本發(fā)明的閉合循環(huán)的灌流系統(tǒng)；圖2為本發(fā)明的吻合模型的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為D為3厘米時吻合模型的速度分布圖；圖4為D為3厘米時吻合模型的速度分布圖的局部放大圖；圖5為D為2厘米時吻合模型的速度分布圖；圖6為D為2厘米時吻合模型的速度分布圖的局部放大圖；圖7為D為1厘米時吻合模型的速度分布圖；圖8為D為1厘米時吻合模型的速度分布圖的局部放大圖；圖9為D為3厘米時吻合模型的壁面剪切應(yīng)力分布圖；圖10為D為3厘米時吻合模型的壁面剪切應(yīng)力分布圖的局部放大圖；圖11為D為2厘米時吻合模型的壁面剪切應(yīng)力分布圖；圖12為D為2厘米時吻合模型的壁面剪切應(yīng)力分布圖的局部放大圖；圖13為D為1厘米時吻合模型的壁面剪切應(yīng)力分布圖；圖14為D為1厘米時吻合模型的壁面剪切應(yīng)力分布圖的局部放大圖；圖15為γ為70%時吻合模型的速度以分布圖；圖16為γ為70%時吻合模型的壁面剪切應(yīng)力分布圖；圖17為γ為80%時吻合模型的速度分布圖；圖18為γ為80%時吻合模型的壁面剪切應(yīng)力分布圖；圖19為γ為95%時吻合模型的速度分布圖；圖20為γ為95%時吻合模型的壁面剪切應(yīng)力分布圖；圖21靜態(tài)下人血管組織細(xì)胞的熒光顯像；圖22為暴露于壁面剪切應(yīng)力(2Pa) 2小時后人血管組織細(xì)胞的熒光顯像；圖23靜態(tài)下人血管組織細(xì)胞的掃描電鏡掃描圖片；圖24暴露于壁面剪切應(yīng)力(2Pa)2小時后的人血管組織細(xì)胞的掃描電鏡掃描圖片。
具體實施例方式1.閉合循環(huán)的灌流系統(tǒng)閉合循環(huán)的灌流系統(tǒng)，包括儲液罐1以及與其相連的蠕動泵2，還包括緩沖槽3、第 一閥門4、吻合模型6、第二閥門5以及壓力罐8，所述緩沖槽3側(cè)壁上部和下部分別設(shè)置有 一個溢出口，所述緩沖槽3通過管道與蠕動泵2連接，所述緩沖槽3上端的溢出口通過管道與儲液罐1相連，下端的溢出口通過管道依次連接第一閥門4、吻合模型6、第二閥門5和壓力罐8，所述第一閥門4和第二閥門5之間還連接有壓力計7，所述壓力罐8的出水管通過 管道接入儲液罐1。參見圖1，位于儲液罐1中的流體由蠕動泵2壓入有一個溢出口的緩沖槽3中，為 了保持模型中的持續(xù)的固定的壓力，再此處過量的流體流回儲液罐1中，流體流過吻合模 型6和壓力罐8然后流回儲液罐1中，第一閥門4和第二閥門5用于控制各自的入口流量 以及防止倒流，當(dāng)在做細(xì)胞力學(xué)加載實驗的時候，將載有血管組織細(xì)胞的蓋玻片9固定在 吻合模型6的吻合口區(qū)域。2.吻合模型的制作如圖2所示，吻合模型為有機(jī)玻璃板上雕刻出的呈30°夾角的兩通道構(gòu)成?！爸鲃?脈”和“移植管"的內(nèi)徑分別為為6mm和9mm，硅密封環(huán)和幾個不銹鋼螺絲用于防止液體從 有機(jī)玻璃模型的水槽溢出。在我們的研究中，狹窄程度Y根據(jù)正常的主動脈和狹窄區(qū)域橫截面面積比來計 算，Y通常選擇70%、80%、90%和95%。運用依照面積比例Y切割出來的兩個半圓形的 硅膠板，狹窄區(qū)域?qū)⒛芎茌p松的在主動脈的近端定位，我們用D表示移植管的后端與狹窄 區(qū)域中心之間的距離，考慮到外科手術(shù)，D為1-3厘米是比較普遍的選擇，因此我們的吻合 模型設(shè)定D為1厘米、2厘米和3厘米。數(shù)值模擬實驗采用有限體積法，在商業(yè)CFD軟件FLUENT (Fluent Inc.，USA)中完 成。該軟件涉及的核心計算程序包括(1)使用前處理軟件包Gambit構(gòu)建幾何模型，(2)對 計算區(qū)域進(jìn)行網(wǎng)格劃分，(3)指定速度和流量邊界條件，(4)指定流體屬性，和(5)求解法 則。數(shù)值模擬實驗?zāi)Ｐ偷膸缀纬叽缗c有機(jī)玻璃吻合模型嚴(yán)格一致。計算區(qū)域網(wǎng)格的 劃分除了必要的楔形元以外，主要是結(jié)構(gòu)化的六面體元。網(wǎng)格劃分后所有模型均不少于 65，936個單元。使用Flimet的求解法則對控制方程進(jìn)行后續(xù)求解。因為控制方程為非線性的，所 以在結(jié)果收斂之前需要完成幾次迭代循環(huán)?？刂品匠淌褂冒腚[式的簡單算法求解。時間步 長采用全隱格式。使用二階迎風(fēng)格式來提高計算結(jié)果的精度。當(dāng)兩次連續(xù)迭代計算的殘 差低于設(shè)定的收斂標(biāo)準(zhǔn)IO3時，計算結(jié)果被認(rèn)為是收斂的。依據(jù)宿主動脈寬度和血液粘度 0. 0035kg HT1iT1,可得流動雷諾數(shù)為230。流動邊界條件設(shè)置入、出口壓力條件分別與宿主 動脈的入、出口壓力值相同。壁面采用非滑移邊界條件。4.人血管組織細(xì)胞培養(yǎng)將分離獲得的人血管組織細(xì)胞在含10 %胎牛血清(GIBCO)的 Dulbecco'smodified Eagle's medium(DMEM)中，環(huán)境 37°C、5% CO2 下培養(yǎng)至融合，然后消 化制備細(xì)胞懸液。細(xì)胞形態(tài)的研究，細(xì)胞以5. 0 X IO5細(xì)胞/cm2的密度培養(yǎng)在預(yù)先涂布有纖 連蛋白(FN;50yg/ml ；Roche, Germany)的載玻片上，細(xì)胞載玻片置于6孔板中靜置培養(yǎng)6 小時，備用。細(xì)胞載玻片裝在吻合模型中之前，先將模型放置在紫外燈下照射2小時殺菌， 然后可密封保存，72小時內(nèi)使用。5.力學(xué)加載實驗為了研究我們吻合模型中的力學(xué)加載對細(xì)胞的影響，應(yīng)用的是如圖1所示的閉環(huán)的灌流系統(tǒng)，對所培養(yǎng)在上述載玻片上的人血管組織細(xì)胞施加力學(xué)刺激。載有培養(yǎng)細(xì)胞的載玻片被以60°的角度固定在實驗系統(tǒng)的吻合處。吻合模型整體載入含有血清的DMEM培 養(yǎng)液的閉環(huán)灌流系統(tǒng)中。灌流系統(tǒng)由蠕動泵驅(qū)使，環(huán)境為含有5% C02/95%的大氣并且溫 度保持在37 °C。6.熒光顯微鏡顯像如前所述，取出力學(xué)加載后的細(xì)胞玻片，以PBS反復(fù)沖洗三遍，用4%的多聚甲醛 于4°C固定15min，再以PBS沖洗三遍，然后加入F-actin和DNA熒光抗體，于37°C濕盒內(nèi)避 光孵育30min，再以PBS沖洗3次，每次5min，洗掉多余熒光抗體，10%緩沖甘油封片，Leica 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架分布情況。7.電子掃描顯微鏡掃描如前所述，對細(xì)胞載玻片施加力學(xué)加載后，室溫下，取出加載裝置內(nèi)的細(xì)胞爬片， PBS洗3次后，2. 5 %戊二醛固定，50 % 100 %的乙醇梯度脫水，CO2臨界點干燥，噴金，日立 S-450型掃描電鏡掃描分析。8.結(jié)果1)我們設(shè)定D分別為1厘米、2厘米、3厘米，如圖3_圖8所示，在相同的邊界條件 下，得出當(dāng)逆行的流體流過狹窄區(qū)域的時候與術(shù)后的殘留流體相互作用，導(dǎo)致了大面積的 滯流。而滯流區(qū)的長短直接取決于距離D，D值越大滯流區(qū)越長。殘留流體在流過狹窄區(qū)時 對主動脈管壁產(chǎn)生不同的壁面剪切應(yīng)力，最后與移植管內(nèi)流體在吻合處匯合。2)圖9-圖14顯示了壁面剪切應(yīng)力也有與圖3類似的曲線。從放大的壁面剪切應(yīng) 力曲線，我們觀察到最高壁面剪切應(yīng)力出現(xiàn)在吻合前端和狹窄區(qū)的中心。從狹窄區(qū)的中心 到滯流區(qū)附近急劇下降，這意味著壁面剪切應(yīng)力在狹窄管壁上呈現(xiàn)出很大的梯度。我們設(shè)定狹窄度分別為70%、80%、90%、95%制定吻合模型，從圖15-圖20中我 們發(fā)現(xiàn)當(dāng)狹窄程度增加的時候殘留流體也變得越來越細(xì)。然而，殘留流體依然與移植流競 爭。這種流體的競爭對管口以及吻合處的遠(yuǎn)端是有害的，圖15-圖20還顯示外部的速度峰 值在整個的數(shù)值模型中有相同的值，但是壁面剪切應(yīng)力峰值就完全不一樣。越是狹窄，狹 窄管壁就擁有較高的壁面剪切應(yīng)力。在95%狹窄度的狹窄中心，壁面剪切應(yīng)力的峰值達(dá)到 12Pa。3)壁面剪切應(yīng)力對細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架的影響為了探討本裝置中不同壁面剪切應(yīng)力對細(xì)胞骨架蛋白網(wǎng)絡(luò)的影響，細(xì)胞 暴露于低壁面剪切應(yīng)力(2Pa)環(huán)境2小時，然后固定并由綠色熒光染料B0DIPFL phallacidin(B-607,Modecular probes Inc. ,USA)將肌動蛋白骨架染成綠色，使用 DNA 熒 光抗體(D-1306，Modecular probes Inc.，USA)將細(xì)胞核染成藍(lán)色，以便觀察纖維型肌動蛋 白和雙鏈DNA。靜態(tài)未加載力學(xué)時，如圖21所示，細(xì)胞的偽足擴(kuò)展開來，細(xì)胞顯現(xiàn)出典型的 鵝卵石形態(tài)，張力纖維非常的充足，細(xì)胞核呈現(xiàn)出橢圓形；細(xì)胞施加壁面剪切應(yīng)力后，如圖 22所示，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)整的圓形，隨著絲狀肌動蛋白的減少，張力纖維收縮在一起。表 明壁面剪切應(yīng)力導(dǎo)致了肌動蛋白細(xì)胞骨架的解聚。圖23顯示了靜態(tài)培養(yǎng)以及力學(xué)加載2小時后的細(xì)胞掃描電子顯微照片。靜態(tài)培 養(yǎng)的細(xì)胞受到壁面剪切應(yīng)力作用2小時后，其伸長的偽足逐漸收縮，如圖24所示，細(xì)胞邊緣 偽足向細(xì)胞核中心方向縮小。
9.結(jié)論在狹窄區(qū)的近端放置移植管可以最大限度的保護(hù)流體形態(tài)。然而，在狹窄區(qū)的遠(yuǎn) 端放置移植管，在主動脈的狹窄區(qū)將導(dǎo)致一個廣泛相對滯流的區(qū)域和低的壁面剪切應(yīng)力， 在一定流動條件下，滯流區(qū)會產(chǎn)生雙漩渦，這將導(dǎo)致流動不穩(wěn)定以及渦流擴(kuò)散，這些地方會 促進(jìn)血栓的形成，最終導(dǎo)致主動脈逆流區(qū)的阻塞。壁血栓的增長會導(dǎo)致粥樣硬化斑塊的生 長。我們知道血小板和凝血因子一旦被吻合前端高的壁面剪切應(yīng)力激活，將會被捕集到回 流區(qū)，由于滯流時間加長，激活的這些凝血物質(zhì)與相鄰-管壁受損的細(xì)胞壁相互作用進(jìn)一 步富集而加重血管阻塞。血小板的沉積又最容易導(dǎo)致滯流區(qū)域的出現(xiàn)。移植管內(nèi)的流體和術(shù)后穿過狹窄區(qū)的殘留流體形成競爭流。在低度狹窄(Y小于 80% )，殘留流體保持了一個很大的速度等級，因此他對吻合處的流動模式產(chǎn)生很大的干 擾。競爭流動導(dǎo)致一個振蕩的壁面剪切應(yīng)力，最終將會加速動脈粥樣硬化的發(fā)展。臨床研 究顯示低度狹窄的移植術(shù)失敗的風(fēng)險更大，他們研究表明內(nèi)乳動脈移植在越遠(yuǎn)側(cè)，對于動 脈移植將會產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，因為它可以阻止流體競爭。術(shù)后，狹窄處的管壁突然得到很大的空間以及短暫的壁面剪切應(yīng)力的一個梯度， 這種壁面剪切應(yīng)力的振蕩能戲劇性的隨著狹窄度的變化而改變。振蕩的強(qiáng)度和動脈壁上壁 面剪切應(yīng)力的分布主要由主動脈的狹窄性影響。振蕩的壁面剪切應(yīng)力的特性是在心臟收縮 和心臟舒張時應(yīng)力的方向以及量值都有顯著變化。振蕩的壁面剪切應(yīng)力在很短的距離上會 經(jīng)歷顯著的空間的變化，尤其是在狹窄的區(qū)域以及幾何形狀不規(guī)則的區(qū)域，導(dǎo)致很高的空 間梯度。我們設(shè)計的吻合模型和灌注系統(tǒng)可以控制機(jī)械因素，簡化了細(xì)胞對機(jī)械力的反應(yīng) 的研究。我們調(diào)整進(jìn)口壓力和出口壓力以便模擬冠狀動脈旁路移植術(shù)中壁面剪切應(yīng)力水 平。此外，在細(xì)胞實驗中，采用層流壁面剪切應(yīng)力刺激細(xì)胞。這個模型的好處就在于可以精 確的控制細(xì)胞加載的壁面剪切應(yīng)力的強(qiáng)度。另外，它簡化了實驗設(shè)備，降低了實驗的可變 性。通過以上結(jié)果我們得出當(dāng)處于嚴(yán)重的狹窄的情 形時(Y大于80% )，研究表明 可以通過將移植管放置在宿主動脈的近端來改善，盡量靠近蔽塞或者是狹窄區(qū)以便保護(hù)主 近端動脈。相反，當(dāng)處于輕度狹窄的情形時(Y小于80%)，研究表明將移植管放置在越遠(yuǎn) 端，將會對移植管產(chǎn)生明顯的保護(hù)效應(yīng)，因為它可以避免流體競爭。
權(quán)利要求
一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址的實驗?zāi)M方法，所述方法包括下述步驟(a)制作不同構(gòu)型的吻合模型；(b)將分離獲得的人血管組織細(xì)胞在含10％胎牛血清(GIBCO)的DMEM中，環(huán)境為37℃、5％CO2的大氣下培養(yǎng)至融合，然后消化制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞以5.0×105細(xì)胞/cm2的密度培養(yǎng)在預(yù)先涂布有纖連蛋白(FN；50μg/ml；Roche，Germany)的載玻片上，細(xì)胞載玻片置于6孔板中靜置培養(yǎng)6小時，備用，將載有培養(yǎng)好的血管組織細(xì)胞的載玻片固定在吻合模型的吻合口區(qū)；(c)將整個吻合模型連接于閉合循環(huán)的灌流系統(tǒng)中，灌流系統(tǒng)由蠕動泵驅(qū)使，模擬人體的血液流動進(jìn)行力學(xué)加載實驗；(d)將細(xì)胞載玻片取出用熒光顯微鏡成像以及用電子掃描顯微鏡掃描。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址的實驗?zāi)M方法，其 特征在于所述吻合模型由有機(jī)玻璃板上雕刻出的呈30°夾角的兩通道構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址的實驗?zāi)M方法，其 特征在于所述吻合模型的主動脈和移植管的內(nèi)徑分別為6毫米和9毫米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址的實驗?zāi)M方法，其 特征在于所述吻合模型根據(jù)狹窄度Y值以及移植管的后端到狹窄區(qū)域中心之間的距離D 來制作，我們選擇Y值為70%、80%、90%和95%，0值為1厘米、2厘米和3厘米。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址的實驗?zāi)M方法， 其特征在于所述灌流系統(tǒng)的培養(yǎng)液為含有自由血清的DMEM，其實驗環(huán)境為溫度保持在 37°C，灌流系統(tǒng)內(nèi)為含有5% C02的大氣。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址的實驗?zāi)M方法，其 特征在于所述細(xì)胞載玻片裝在吻合模型中之前，先將吻合模型放置在紫外燈下照射2小 時殺菌，然后密封保存，72小時內(nèi)使用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址的實驗?zāi)M方法，所 述熒光顯微鏡成像的步驟為(a)取出力學(xué)加載后的細(xì)胞玻片，以PBS反復(fù)沖洗三遍，用4%的多聚甲醛于4°C固定 15min，再以PBS沖洗三遍；(b)然后加入F-actin和DNA熒光抗體，于37°C濕盒內(nèi)避光孵育30min；；(c)再以PBS沖洗3次，每次5min，洗掉多余熒光抗體，10%緩沖甘油封片；(d)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架分布情況。
8.如權(quán)利要求1所述的一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址的實驗?zāi)M方法，所述 電子掃描顯微鏡掃描步驟為(a)對細(xì)胞載玻片施加力學(xué)加載后，室溫下，取出加載裝置內(nèi)的細(xì)胞玻片，PBS洗3次；(b)2.5%戊二醛固定，50% 100%的乙醇梯度脫水，C02臨界點干燥，噴金；(c)掃描電鏡掃描分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種冠狀動脈旁路移植吻合術(shù)術(shù)前選址的實驗?zāi)M方法，制作不同構(gòu)型的吻合模型；將分離獲得的人血管組織細(xì)胞在含10％胎牛血清(GIBCO)的DMEM中，環(huán)境為37℃、5％CO2的大氣下培養(yǎng)至融合，然后消化制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)在載玻片上，細(xì)胞載玻片置于6孔板中靜置培養(yǎng)6小時，備用，將載有培養(yǎng)好的血管組織細(xì)胞的載玻片固定在吻合模型的吻合口區(qū)；將整個吻合模型連接于閉合循環(huán)的灌流系統(tǒng)中，灌流系統(tǒng)由蠕動泵驅(qū)使，模擬人體的血液流動進(jìn)行力學(xué)加載實驗，將細(xì)胞載玻片取出用熒光顯微鏡成像以及用電子掃描顯微鏡掃描。
文檔編號G09B23/28GK101828967SQ20101017476
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者吳江, 張本貴, 楊剛, 肖正華, 郭應(yīng)強(qiáng) 申請人:郭應(yīng)強(qiáng)