一種造紙用漂白復(fù)合酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種造紙用漂白復(fù)合酶及其制備方法，以耐高溫堿性木聚糖酶為主要原料，科學(xué)復(fù)配嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物、漆酶及其介質(zhì)、葡聚糖酶、EDTA、保護(hù)劑、激活劑、甘露糖酶、脂肪酶、單寧酶、果膠酶、白度穩(wěn)定劑、非離子表面活性劑、抗氧化劑等，在完全保留紙漿纖維素的同時(shí)，最大限度地溶出木質(zhì)素并將其降解，制備了一種酶系全、漂白效果好、易保存、儲存穩(wěn)定性好的造紙用漂白復(fù)合酶酶，對闊葉木、針葉木和蘆葦黃漿可顯著提高紙漿產(chǎn)量和質(zhì)量，白度分別提高10.94％、11.97％和11.10％；返黃值分別降低39.84％、37.31％和24.32％；可節(jié)約常規(guī)化學(xué)用品量50-60％；最終達(dá)到降低成本和保護(hù)環(huán)境的目的。
【專利說明】一種造紙用漂白復(fù)合酶及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及造紙用復(fù)合酶，具體涉及一種造紙用漂白復(fù)合酶及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在工業(yè)生產(chǎn)中，制漿過程是在堿性的條件下，用高溫蒸煮的方法除去木質(zhì)素，為使 溶解制漿纖維素純度達(dá)到98%，這就需要大量的氫氧化鈉處理紙漿，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污 染，為此許多學(xué)者轉(zhuǎn)而嘗試生物處理制漿，而用于制漿漂白的木聚糖酶應(yīng)是耐熱和耐堿的。 馮建良等（Kimura et al. 2000)用木聚糖酶預(yù)處理麥草與常規(guī)化學(xué)法制漿進(jìn)行了比較試 驗(yàn)，木聚糖酶預(yù)處理提高了原料的脫木素程度，還可以降低制漿的卡伯值。木聚糖酶在輔 助漂白方面有較廣泛而深入的研宄，且取得了很大成果。研宄發(fā)現(xiàn)，無論是針葉木漿、闊葉 木漿或是竹漿、草漿，木聚糖酶均可以降解紙漿中殘余的木質(zhì)素，提高了白度（AL BALAA et al, 2006 ;Meek and Lipman, 1922)。用于紙衆(zhòng)漂白的木聚糖酶必須具有耐高溫特點(diǎn)，Khasin 等得到了一個(gè)來源于堿性菌株Bacillus sterarothermophilus T26木聚糖酶，該木聚糖酶 在pH 9.0及65°C時(shí)對紙漿有最好的漂白效果（Khasin et al，1993)，很多木聚糖酶不具備 這樣的特點(diǎn)，限制了商業(yè)化應(yīng)用。全世界每年產(chǎn)生的廢紙數(shù)量是驚人的，廢紙回收后再利用 工作就變得尤為重要了，可以使在資源重復(fù)利用的同時(shí)也保護(hù)了環(huán)境。1991年，由韓國學(xué)者 首次報(bào)道了應(yīng)用木聚糖酶能將油墨從新聞廢紙漿中脫除。此后，人們開始研宄利用木聚糖 酶進(jìn)行廢紙脫墨，以減輕或消除化學(xué)脫墨帶來的環(huán)境污染（曹軍衛(wèi)等，2004)。
[0003] 目前，以無元素氯和全無氯漂白工藝為代表的紙漿綠色清潔漂白已經(jīng)成為世界各 國造紙業(yè)紙漿漂白發(fā)展的必然趨勢，木聚糖酶酶法助漂新工藝已在歐洲和北美洲的30余 家大型紙廠得到應(yīng)用，成為生物技術(shù)在造紙工業(yè)應(yīng)用最成功的一例。其中加拿大有約10% 的硫酸鹽法紙漿廠采用了該項(xiàng)新工藝。丹麥諾維信公司和美國山道斯化學(xué)公司等多家酶制 劑廠商，紛紛推出了專門用于制漿處理的木聚糖酶和纖維素酶新產(chǎn)品，但到目前為止，工業(yè) 上應(yīng)用于紙漿漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最適反應(yīng)溫度大多在50°C左右，眾所周 知，紙漿蒸煮和漂白基本都是在高溫和強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行的，使得現(xiàn)有的低溫酸性木聚糖 酶產(chǎn)品在此領(lǐng)域的應(yīng)用受到極大的限制。
[0004] 但是，由于木聚糖酶處理工藝是通過降解除去紙漿表面再沉積的半纖維素等方式 來幫助化學(xué)漂劑漂白的，木聚糖酶只能起到助漂的作用，不能真正替代化學(xué)漂劑。因此，生 物預(yù)漂白并不能完全替代化學(xué)漂白，能減少污染卻不能最終消除污染，要從根本上消除有 氯漂白液的污染，需最終實(shí)現(xiàn)生物漂白，即完全采用生物手段除去紙漿中殘留的木質(zhì)素，因 為木質(zhì)素的存在是紙漿返黃的根本原因，化學(xué)漂白可直接作用木質(zhì)素而破壞紙漿中的發(fā)色 基團(tuán)。木素酶可直接作用于木質(zhì)素，對木質(zhì)素進(jìn)行降解，主要為白腐菌分泌的木素過氧化物 酶、錳過氧化物酶、漆酶和纖維二糖脫氫酶等，近幾年研宄的熱點(diǎn)主要集中在漆酶的生物漂 白上，漆酶是一種多銅氧化酶，也稱多酚氧化酶，主要氧化含酚的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單位，但天然 木材木質(zhì)素只有少于20%的含酚結(jié)構(gòu)單位，另通常真菌漆酶分子量較大（約為70000Da)難 以穿入木頭中作用木質(zhì)素分子，要想充分發(fā)揮其酶活性，必須添加漆酶介質(zhì)，通常為紫尿 酸（VA)和1-羥基苯并三氮唑（HBT)，視不同漂白工藝而選用，并且漆酶的產(chǎn)量較小、穩(wěn)定性 較差。
[0005] 中國專利CN 102978986 A公開了一種生物酶法制備紙漿的方法，所述生物酶制備 液中生物酶組分的質(zhì)量百分比含量為：纖維素酶20%，半纖維素酶10%，木素降解酶10%， 淀粉酶20%，脂肪酶5%，果膠酶和漆酶20% ;其中的纖維素酶會降解紙漿中的有效成分纖 維素，不易控制，嚴(yán)重影響成紙的物理機(jī)械性能，同時(shí)，上述生物酶適用于制漿工藝，而非漂 白工藝，并且，單一使用漆酶，其酶活力很難發(fā)揮，不能很好作用于木質(zhì)素，紙漿返黃可能性 增大。中國專利CN 103555701 A公開了一種紙漿漂白用復(fù)合酶液的生產(chǎn)方法，其特征是將 各組份酶經(jīng)稱量、復(fù)配罐混合配制、防腐、檢驗(yàn)、包裝后存放于5°C庫房中，所述各組份酶為 堿性果膠酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和木質(zhì)素酶；上述復(fù)合酶液酶種類和特性單一、木質(zhì)素 酶活力低且沒有公開木質(zhì)素酶的具體種類，工業(yè)化難于實(shí)現(xiàn)，還是不能從根本上徹底消除 木質(zhì)素，漂白效果仍不理想，并且不易保存、儲存穩(wěn)定性差，商品化應(yīng)用受限。
[0006] 綜上，制備一種酶系全、漂白效果好、易保存、儲存穩(wěn)定性好的紙漿漂白酶具有廣 闊的市場前景和巨大的市場潛在價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有紙漿漂白酶的缺陷，以耐高溫堿性木聚糖酶 為主要原料，科學(xué)復(fù)配嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物、漆酶及其介質(zhì)、葡聚糖酶、EDTA、保護(hù)劑、激活 劑、甘露糖酶、脂肪酶、單寧酶、果膠酶、白度穩(wěn)定劑、非離子表面活性劑、抗氧化劑等，制備 一種酶系全、漂白效果好、易保存、儲存穩(wěn)定性好的紙漿漂白酶，在完全保留紙漿纖維素的 同時(shí)，最大限度地溶出木質(zhì)素并將其降解，從根本上降低紙漿中木質(zhì)素含量，增強(qiáng)脫木素效 果，同時(shí)適度復(fù)配白度穩(wěn)定劑，可彌補(bǔ)生物漂白的不足，力爭達(dá)到永久漂白，防止紙漿返黃， 提高成紙的產(chǎn)量和質(zhì)量，以推進(jìn)生物漂白在造紙工業(yè)的應(yīng)用進(jìn)程，最終達(dá)到降低成本和保 護(hù)環(huán)境的目的。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 一種造紙用漂白復(fù)合酶，由以下重量份數(shù)的原料制備：
[0010] 堿性木聚糖酶25-35份，嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物15-25份，漆酶12-18份，葡聚糖酶 5-8份，1-羥基苯并三氮唑3-8份，EDTA 3-8份，保護(hù)劑4-7份，激活劑4-7份，甘露糖酶4-6 份，脂肪酶3-5份，單寧酶3-5份，果膠酶3-5份，白度穩(wěn)定劑2-5份，非離子表面活性劑2-4 份，抗氧化劑1 _3份。
[0011] 所述堿性木聚糖酶和嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物是由產(chǎn)耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽 孢桿菌（Bacillus thermophilus) 701 (保藏編號為CCTCC M 2013537)為出發(fā)菌株，并通過 優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝而制備；
[0012] 所述堿性木聚糖酶耐高溫、耐堿性強(qiáng)、作用條件寬泛、不具有纖維素酶活性，更加 適合紙漿的生物漂白和化學(xué)助漂；
[0013] 所述耐高溫堿性木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)如下：
[0014] (1)溫度：該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，適用溫度范圍為40-75°C，最適反應(yīng)溫度65°C， 在75 °C酶活完全穩(wěn)定；
[0015] (2) pH :該酶適用反應(yīng)pH值范圍為5. 0-11. 0,在pH值為11. 0時(shí)酶活完全穩(wěn)定，最 適反應(yīng)pH值為10. O ;
[0016] (3)酶活性：發(fā)酵液堿性木聚糖酶酶比活力較高，為350-420IU/ml ;
[0017] (4)熱穩(wěn)定性：該酶在70°C條件下保存Ih后仍能保持80 %以上酶活，75°C條件下 保存Ih后保持70%以上酶活；
[0018] (5)存儲穩(wěn)定性：該酶在室溫下保存12個(gè)月后酶活損失小于3. 0%。
[0019] 優(yōu)選地，所述耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法如下：將保存完好的嗜熱芽孢桿 菌CCTCC M 2013537的斜面菌種經(jīng)活化和逐級擴(kuò)大培養(yǎng)（包括一、二、三級種子培養(yǎng)以及 一級種子罐培養(yǎng)）得到種子液，以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度37-45°C，攪拌速度 200-700rpm，通風(fēng)量（V/V)l:l-3,培養(yǎng)時(shí)間25-30h ;然后以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至 15-20°C，恒溫培養(yǎng)10_12h ;繼續(xù)以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至8-10°C，此時(shí)，將一級種 子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)7-12h ;最后以1-2°C /h升溫速率緩慢 升溫至15-20°C，恒溫培養(yǎng)10_12h ;繼續(xù)以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至37-45°C，恒溫培 養(yǎng)20-30h ;發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶，所述調(diào)配過程加 入濃縮酶液總重量0. 5-5%中草藥粉劑；
[0020] 所述斜面培養(yǎng)基組成為：牛肉膏3-10g，氯化鈉5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖 2_5g，瓊脂 15-20g，中草藥粉劑 5-10g，蒸餾水 lOOOmL，pH 值 5-11，121°C滅菌 20min ;
[0021] 所述中草藥粉劑的制備方法如下：以重量份數(shù)計(jì)，稱取黃芪20-30份，黨參10-18 份，柴胡10-15份，黃芩10-15份，魚腥草8-12份，當(dāng)歸8-10份；分別將上述中草藥粉碎至 粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C?90°C 保持2?4h，然后降溫至45-60 °C，加入混合酶進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5. 5-6. 8,酶解 2_4h，最后添加混合物料0. 5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C?78°C保持 3?4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；
[0022] 所述混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ;
[0023] 所述混合酶的重量份數(shù)組成為：內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份，夕卜β -葡聚糖酶10-20 份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份， β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份， 葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；
[0024] 所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為I :1-1. 5 ;
[0025] 所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為：
[0026] 酵母粉0. 3-0. 5%，葡萄糖1-1. 5%，蛋白胨0. 3-0. 5%，牛肉膏0. 5-0. 8%，磷酸氫 二鉀0.8-1. 5%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸鈣0. 1%，氯化鎂0.2%，檸檬酸 鈉0· 1-0. 3%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值5-11，121-123°C滅菌30-40min ;
[0027] 所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為：
[0028] 麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0. 8%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1-3%，蛋白 胨0. 1-0. 5%，玉米漿0. 1-0. 5%，磷酸氫二鉀0.8-1. 5%，硫酸鎂0.05-0. 1%，檸檬酸 鈉0. 1-0. 5%，樺木木聚糖0. 1-0. 8%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值5-11，121-123°C滅菌 3〇-40min ；
[0029] 所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7. 0xl08-8. OxlO8個(gè)/ml ;
[0030] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆餅粉15-25g，中草 藥粉劑30-50g，海藻糖30-40g，樺木木聚糖5-15g，酵母粉4-8g，玉米漿l-5g，硫酸銨l-3g， 磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，梓檬酸鈉 l-5g，消泡劑0. 1-lg,純凈水lOOOmL，pH值 5-11，121°C 滅菌 20min ;
[0031] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)配方法為：按比例準(zhǔn)確稱取原料，將原料中的純凈水、玉 米粉、豆餅粉投入配料罐中，調(diào)節(jié)pH值5-11，加入中溫淀粉酶（3u/g玉米粉）與高溫淀 粉酶（30u/g玉米粉），同時(shí)邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然后緩慢升溫至90°C 保溫15-30min進(jìn)行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調(diào)初始pH5-ll，121-123°C滅菌 30_40min 備用。
[0032] 所述嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物含有較強(qiáng)的生物活性，在生物漂白過程中通過發(fā)酵一方 面可產(chǎn)生耐高溫堿性木聚糖酶，為體系持續(xù)提供，另一方面是通過發(fā)酵的動(dòng)態(tài)反應(yīng)可使嗜 熱芽孢桿菌均勻、充分地分散到紙漿纖維素、半纖維素和木質(zhì)素間質(zhì)，充分柔化纖維素和降 解半纖維素（木聚糖、葡聚糖、甘露糖等），使復(fù)合酶的其它成分（如漆酶、介質(zhì)等酶制劑、螯 合劑、保護(hù)劑、激活劑、白度穩(wěn)定劑等）均勻、充分地滲透到紙漿植物細(xì)胞間質(zhì)，充分發(fā)揮組 份的作用，以提高紙漿收得率和質(zhì)量，縮短漂白時(shí)間，并去除雜質(zhì)和增強(qiáng)生物漂白效果；
[0033] 優(yōu)選地，所述嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法為上述制備堿性木聚糖酶的發(fā)酵液 經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥、低溫粉碎而得到的；
[0034] 所述嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物活菌含量為7Χ101(ι-9 Χ101(^Ρυ/^。
[0035] 所述1-羥基苯并三氮唑可激活大分子漆酶的活力，形成強(qiáng)氧化作用的復(fù)合介體， 提高漆酶的酶解效力，充分發(fā)揮漆酶對木質(zhì)素的降解作用，從根本上消除木質(zhì)素，防止紙漿 返黃。
[0036] 所述EDTA可螯合紙漿中大部分過渡金屬離子（銅離子、二價(jià)鐵離子、三價(jià)鐵離子、 二價(jià)錳離子、二價(jià)鎳離子等）和微量重金屬，以排除其對生物酶酶活力的抑制和消除作用， 使酶組份充分、有效地發(fā)揮作用；
[0037] 所述白度穩(wěn)定劑具有漂白和穩(wěn)定白度的雙重作用，既可有效提高紙漿白度，又可 防止紙漿返黃，并且不會受紙漿中氧氣和過渡金屬離子（銅離子、二價(jià)鐵離子、三價(jià)鐵離 子、二價(jià)錳離子、二價(jià)鎳離子等）的影響，白度穩(wěn)定劑的使用可有效彌補(bǔ)生物漂白后殘留木 質(zhì)素引起的紙漿返黃；
[0038] 所述白度穩(wěn)定劑為硫醇、硫醚、三羥甲基磷酸（ΤΗΡ)、四羥甲基磷酸鹽（THPC)、三 羥甲基磷酸的雙磷衍生物（BBHPE)中的一種或幾種以任意比例均勻混合；
[0039] 優(yōu)選地，所述白度穩(wěn)定劑為三羥甲基磷酸的雙磷衍生物（BBHPE);
[0040] 所述非離子表面活性劑在酶漂白過程中可促進(jìn)復(fù)合酶組份滲透，充分游離木質(zhì) 素、半纖維素、果膠、單寧、脂肪、等底物，促進(jìn)和延長各組份酶與底物的作用時(shí)間，使紙漿中 的有害成分充分降解，提高紙漿纖維的柔滑性和漂白均勻度；
[0041] 優(yōu)選地，所述非離子表面活性劑為環(huán)保型非離子表面活性劑，容易生物降解，無殘 留，對人體、生物及環(huán)境無任何毒副作用；
[0042] 更優(yōu)選地，所述非離子表面活性劑的質(zhì)量組份為：烷基多苷（APG) 30-40份，烷基 葡萄糖酰胺（AGA) 15-20份，N-十二烷基乙二胺三乙酸鈉（ED3A) 10-15份，異構(gòu)醇醚羧酸鹽 AEC-110710-15份，月桂酰胺醚羧酸鹽（LAEC) 8-10份，平平加 c-1253-5份，JFC 3-5份；上 述原料均為市購固體粉狀商品。
[0043] 所述激活劑是由如下質(zhì)量組份的無機(jī)鹽均勻混合而成：硫酸鈉10-15份，氯化鋅 6-8份，氯化儀5_8份，氯化1? 3_5份。
[0044] 所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成：海藻糖30-50份，靈芝多糖12-18份， NaCl 10-15 份，（NH4)2S045-9 份，半胱氨酸 3-5 份。
[0045] 所述抗氧化劑為葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物中的任一一種或幾 種組合；
[0046] 優(yōu)選地，所述抗氧化劑為葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物按質(zhì)量比 3-5:1-3:1-2均勻混合；
[0047] 所述葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物均為市購商品
[0048] 上述造紙用漂白復(fù)合酶的制備方法，包括如下步驟：
[0049] 首先將所述保護(hù)劑、激活劑分別超微粉碎，均勻混合，隨后立即依次加入非離子表 面活性劑、嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物均勻混合20-30min，然后依次加入堿性木聚糖酶、漆酶、葡 聚糖酶、甘露糖酶、脂肪酶、單寧酶、果膠酶均勻混合，最后依次加入1-羥基苯并三氮唑、 EDTA、白度穩(wěn)定劑、抗氧化劑，混合均勻后密封包裝即得造紙用漂白復(fù)合酶。
[0050] 本發(fā)明另一目的是所述造紙用漂白復(fù)合酶在造紙生物漂白工藝中的應(yīng)用。
[0051] 使用方法：
[0052] 1.復(fù)合酶在黃漿氯化前或氯化后或堿化后加入被漂黃漿中；
[0053] 2.復(fù)合酶作用條件：適應(yīng)pH值5-11，最適pH值7-9,適應(yīng)溫度40-70°C，最適反應(yīng) 溫度 45-55 °C ;
[0054] 3.使用方法：1)將復(fù)合酶與50°C水按質(zhì)量比1:10均勻混合，調(diào)整pH值為7-9,活 化20-30min，通過計(jì)量泵加入被漂黃漿中，使其與黃漿混合均勻進(jìn)行酶解反應(yīng)；
[0055] 2)復(fù)合酶的添加量占絕干黃漿質(zhì)量的0. 05-0. 3 % ;
[0056] 3)黃漿的濃度為5-15 % ;
[0057] 4)酶解時(shí)間35-60min，酶解完成后，其化學(xué)漂白按常規(guī)工藝步驟進(jìn)行，各步驟化 學(xué)品用量為常規(guī)用量的40-50 %。
[0058] 所述的黃漿為造紙?jiān)辖?jīng)備料、制漿、洗滌、篩選后制成的黃漿；
[0059] 所述的黃漿為木漿或非木漿中的一種或組合；
[0060] 所述的非木漿由原料麥草或稻草或蘆葦或蔗渣制備；
[0061] 所述復(fù)合酶在氯化前加入時(shí)，復(fù)合酶的添加量占絕干黃漿質(zhì)量的0. 15-0. 3 % ;復(fù) 合酶在氯化后加入時(shí)，復(fù)合酶的添加量占絕干黃漿質(zhì)量的〇. 1-0. 15 % ;復(fù)合酶在堿化后加 入時(shí)，復(fù)合酶的添加量占絕干黃漿質(zhì)量的〇. 05-0. 1 %。
[0062] 有益效果：
[0063] 本發(fā)明造紙用漂白復(fù)合酶以耐高溫堿性木聚糖酶為主要原料，科學(xué)復(fù)配嗜熱芽孢 桿菌培養(yǎng)物、漆酶及其介質(zhì)、葡聚糖酶、EDTA、保護(hù)劑、激活劑、甘露糖酶、脂肪酶、單寧酶、果 膠酶、白度穩(wěn)定劑、非離子表面活性劑、抗氧化劑等，制備一種酶系全、漂白效果好、易保存、 儲存穩(wěn)定性好的紙漿漂白酶，在完全保留紙漿纖維素的同時(shí)，最大限度地溶出木質(zhì)素并將 其降解，從根本上降低紙漿中木質(zhì)素含量，增強(qiáng)脫木素效果，同時(shí)適度復(fù)配白度穩(wěn)定劑，可 彌補(bǔ)生物漂白的不足，以達(dá)到永久漂白，防止紙漿返黃，提高成紙的產(chǎn)量和質(zhì)量，與市售紙 漿漂白專用酶相比，本發(fā)明造紙用漂白復(fù)合酶對闊葉木、針葉木和蘆葦黃漿可顯著提高紙 漿產(chǎn)量和質(zhì)量：得率分別提高8. 94%、8. 80%和10. 05%; α -纖維素含量分別提高8. 58%、 9. 49%和16. 41% ;白度分別提高10. 94%、11. 97%和11. 10% ;返黃值分別降低39. 84%、 37. 31 %和24. 32% ;粘度分別降低1. 20 %、1. 18 %和1. 43% ;灰分分別降低25 %、26 %和 28%，可節(jié)約常規(guī)化學(xué)用品量50-60% ;從而推進(jìn)生物漂白在造紙工業(yè)的應(yīng)用進(jìn)程，最終達(dá) 到降低成本和保護(hù)環(huán)境的目的，其有益效果是復(fù)合酶各組份協(xié)同作用的綜合體現(xiàn)，具體表 現(xiàn)在：
[0064] 1.本發(fā)明的堿性木聚糖酶耐高溫、耐堿性強(qiáng)、作用條件寬泛、不具有纖維素酶活 性，更加適合紙漿的生物漂白和化學(xué)助漂。
[0065] 2.本發(fā)明的嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物含有較強(qiáng)的生物活性，在生物漂白過程中通過發(fā) 酵一方面可產(chǎn)生耐高溫堿性木聚糖酶，為體系持續(xù)提供，另一方面是通過發(fā)酵的動(dòng)態(tài)反應(yīng) 可使嗜熱芽孢桿菌均勻、充分地分散到紙漿纖維素、半纖維素和木質(zhì)素間質(zhì)，充分柔化纖維 素和降解半纖維素（木聚糖、葡聚糖、甘露糖等），使復(fù)合酶的其它成分（如漆酶、介質(zhì)等酶 制劑、螯合劑、保護(hù)劑、激活劑、白度穩(wěn)定劑等）均勾、充分地滲透到紙漿植物細(xì)胞間質(zhì)，充 分發(fā)揮組份的作用，以提高紙漿收得率和質(zhì)量，縮短漂白時(shí)間，并去除雜質(zhì)和增強(qiáng)生物漂白 效果。
[0066] 3.本發(fā)明將漆酶及其介質(zhì)1-羥基苯并三氮唑科學(xué)復(fù)配，形成強(qiáng)氧化作用的復(fù)合 介體，提高漆酶的酶解效力，充分、有效地實(shí)現(xiàn)漆酶對木質(zhì)素的降解作用，從根本上消除木 質(zhì)素，防止紙漿返黃。
[0067] 4.本發(fā)明使用EDTA可螯合紙漿中大部分過渡金屬離子（銅離子、二價(jià)鐵離子、三 價(jià)鐵離子、二價(jià)錳離子、二價(jià)鎳離子等）和微量重金屬，以排除其對生物酶酶活力的抑制和 消除作用，使酶組份充分、有效地發(fā)揮作用。
[0068] 5.本發(fā)明白度穩(wěn)定劑具有漂白和穩(wěn)定白度的雙重作用，既可有效提高紙漿白度， 又可防止紙漿返黃，并且不會受紙漿中氧氣和過渡金屬離子（銅離子、二價(jià)鐵離子、三價(jià)鐵 離子、二價(jià)錳離子、二價(jià)鎳離子等）的影響，白度穩(wěn)定劑的使用可有效彌補(bǔ)生物漂白后殘留 木質(zhì)素引起的紙漿返黃。
[0069] 6.本發(fā)明非離子表面活性劑主要科學(xué)復(fù)配了環(huán)保型性能優(yōu)越的非離子表面活性 劑，容易生物降解，無殘留，對人體、生物及環(huán)境無任何毒副作用；可在酶漂白過程中可促進(jìn) 復(fù)合酶組份滲透，充分游離木質(zhì)素、半纖維素、果膠、單寧、脂肪、等底物，促進(jìn)和延長各組份 酶與底物的作用時(shí)間，使紙漿中的有害成分充分降解，提紙漿纖維的柔滑性和漂白均勻度。
[0070] 7.本發(fā)明造紙用漂白復(fù)合酶抗氧化劑的科學(xué)復(fù)配，可有效防止復(fù)合酶酶分子結(jié)構(gòu) 氧化而造成酶活性損失，提高酶活力穩(wěn)定性。在〇°C和40°C條件下儲存12個(gè)月，復(fù)合酶中 單酶酶活損失分別為〇. 41 %和0. 56%，比對比例分別降低18. 0 %和65%，有效防止在包 裝、儲存、運(yùn)輸、使用等環(huán)節(jié)因環(huán)境改變、操作方法不當(dāng)而造成酶的失活，尤其可防止高溫造 成的酶失活。
[0071] 8.本發(fā)明造紙用漂白復(fù)合酶中保護(hù)劑的科學(xué)復(fù)配，有效減緩了復(fù)合酶制劑的回 潮；同時(shí)可增強(qiáng)復(fù)合酶的耐凍、耐熱性能，保持相同的酶活力，其耐熱溫度可提高20_30°C， 耐冷凍溫度可降低10-15攝氏度，有效防止了復(fù)合酶在運(yùn)輸、保存和使用過程中酶活力的 損失，延長了復(fù)合酶的保質(zhì)期，達(dá)到同樣的酶活力，比同類產(chǎn)品保質(zhì)期可延長2-3年。
[0072] 9.本發(fā)明造紙用漂白復(fù)合酶添加無機(jī)鹽作為激活劑，創(chuàng)造了酶催化作用的最佳條 件，充分發(fā)揮了植物酶和微生物酶的活力，提高了復(fù)合酶作用效力。

【具體實(shí)施方式】
[0073] 下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0074] 實(shí)施例1原料制備
[0075] 1.堿性木聚糖酶的制備：包括如下步驟
[0076] (1)菌種活化
[0077] 將保存完好的嗜熱芽孢桿菌CCTCC M 2013537的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基， 45°C培養(yǎng)36h進(jìn)行菌種活化，如此活化3次；
[0078] 所述斜面培養(yǎng)基組成為：牛肉膏10g，氯化鈉12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g，瓊脂 20g，中草藥粉劑10g，蒸餾水1000mL，pH值10,121°C滅菌20min ;
[0079] 所述中草藥粉劑的制備方法如下：
[0080] 以重量份數(shù)計(jì)，稱取黃芪25份，黨參15份，柴胡12份，黃芩12份，魚腥草10份， 當(dāng)歸9份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍 重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至55°C，加入混合物料總重量8%的混合酶進(jìn)行 酶解，用乳酸調(diào)節(jié)PH值為6,酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙 醇和丙醇的質(zhì)量比例為I : 1. 5,控制溫度至70°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲 得中草藥粉劑；
[0081] 所述混合酶的重量份數(shù)組成為：內(nèi)β-葡聚糖酶15份，外β-葡聚糖酶15份， β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份， 中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶 8份；
[0082] (2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0083] ①一級種子培養(yǎng)：將步驟（1)活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基 裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度43°C，培養(yǎng)時(shí)間15h ;
[0084] ②二級種子培養(yǎng)：將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中， 培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0085] ③三級種子培養(yǎng)：將二級種子以10%接種量接入5000暈升三級種子搖瓶中，培養(yǎng) 基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度43°C，培養(yǎng)時(shí)間15h ;
[0086] ④一級種子罐培養(yǎng)：將三級種子以10 %接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度45°C，攪拌速度400rpm，通風(fēng)量（V/V) 1:2,罐壓0. 05Mpa， 培養(yǎng)時(shí)間20h ;
[0087] 所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為：
[0088] 酵母粉0. 5%，葡萄糖1. 5%，蛋白胨0. 5%，牛肉膏0. 8%，磷酸氫二鉀1. 5%，中草 藥粉劑2 %，海藻糖3 %，硫酸鈣0. 1 %，氯化鎂0. 2 %，檸檬酸鈉0. 3 %，不足部分純凈水補(bǔ) 足，pH 值 10,123°C滅菌 40min ;
[0089] 所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為：
[0090] 麥芽糊精15%，酵母粉0. 8%，中草藥粉劑2%，海藻糖3%，蛋白胨0. 5%，玉米漿 0. 5 %，磷酸氫二鉀1. 5 %，硫酸鎂0. 1 %，檸檬酸鈉0. 5 %，樺木木聚糖0. 8 %，不足部分純凈 水補(bǔ)足，pH值10,123°C滅菌40min ;
[0091] 所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為8. OxlO8個(gè)/ml ;
[0092] (3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0093] 將步驟（2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度45°C，攪拌速 度700rpm，通風(fēng)量（V/V) 1:3,培養(yǎng)時(shí)間30h ;然后以2°C /h降溫速率緩慢降溫至20°C，恒溫 培養(yǎng)12h ;繼續(xù)以2°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，此時(shí)，將步驟（2)中一級種子罐發(fā)酵液 以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)12h ;最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至20°C，恒 溫培養(yǎng)12h ;繼續(xù)以2°C /h升溫速率緩慢升溫至45°C，恒溫培養(yǎng)30h ;
[0094] 溶解氧控制：通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量，控制溶解氧30% ;
[0095] pH控制：通過補(bǔ)氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在10 ;
[0096] 補(bǔ)料控制：當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時(shí)，開始添加補(bǔ)料培養(yǎng) 基，補(bǔ)料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ;
[0097] 放罐標(biāo)準(zhǔn)：80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢；
[0098] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：麥芽糊精150g，玉米粉60g，豆餅粉25g，中草藥粉劑50g， 海藻糖40g，酵母粉8g，玉米漿5g，硫酸銨3g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉5g， 樺木木聚糖15,消泡劑lg，純凈水lOOOmL，pH值10,121°C滅菌20min ;
[0099] 所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為：麥芽糊精20-30 %，玉米粉10-20 %，豆粉15-25 %， 中草藥粉劑5-10%，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值5-11，121-123°C滅菌30-40min ;
[0100] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)配方法為：
[0101] 按比例準(zhǔn)確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調(diào)節(jié)PH 值10,加入中溫淀粉酶（3u/g玉米粉）與高溫淀粉酶（30u/g玉米粉），同時(shí)邊攪拌邊升溫 至70°C保溫30min，然后緩慢升溫至90°C保溫30min進(jìn)行液化，最后加入其它原料，攪拌均 勾，調(diào)初始pH值10,123°C滅菌40min備用。
[0102] (4)發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶；
[0103] 所述調(diào)配過程不添加任何防腐劑，加入濃縮酶液總重量5%中草藥粉劑。
[0104] 2.嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備：所述嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法為上述 1中制備堿性木聚糖酶的發(fā)酵液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥、低溫粉碎而制得，其活菌含量為 9xl010CFU/g〇
[0105] 實(shí)施例2耐高溫堿性木聚糖酶酶活力的測定（3, 5-二硝基水楊酸比色法，簡稱 DNS 法）
[0106] 1.試劑和溶液
[0107] I. 1所用水除特別要求外，均為符合GB/6682-1992規(guī)定的三級水，化學(xué)藥品除 特別要求外，均為分析純。
[0108] 1.2 DNS 試劑
[0109] 稱取3, 5-二硝基水楊酸IOg加入500ml水中，分多次加入氫氧化鈉16g，攪拌 溶解（溫度< 45°C )，再分多次加入酒石酸鉀鈉300g，攪拌至全溶，冷卻后用水定容至 1000ml。室溫下棕色瓶儲存暗處放置，一周后使用（如有沉淀過濾后使用）。
[0110] 1. 3 0· lmol/L，pH5. 0醋酸一醋酸鈉緩沖液
[0111] 吸取冰醋酸I. 8ml，加適量水，加醋酸鈉5. 78g，溶解，定容至1000ml，調(diào)節(jié)PH至 5. 00 ±0.01后使用。室溫下存放2個(gè)月有效。
[0112] L 4 0· 1 %即lmg/ml木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液
[0113] 無水木糖于80°C烘至恒重，稱取0. IOOOg于燒杯中，加適量水溶解，轉(zhuǎn)入容量瓶 中并定容至l〇〇ml。
[0114] 1.5 1.0%木聚糖溶液
[0115] 稱取木聚糖I. OOg于燒杯中，用2ml 0. 5mol/L氫氧化鈉潤濕成糊狀，加40ml緩沖 液，于60?70°C水浴中加熱溶解，冷涼后用0. 5mol/L醋酸（約2ml)調(diào)pH5. 0,轉(zhuǎn)入容量瓶 中，加緩沖液（4. 3)定容至100ml。如果冰箱中放置時(shí)間長了出現(xiàn)沉淀，使用前應(yīng)在熱水浴 中熱溶。
[0116] 1.6木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0117] 吸取lmg/ml木糖溶液0, 0· 2,0· 4,0· 6,0· 8,1. Oml于試管中，補(bǔ)水至2ml，加 DNS試 劑3ml，混合后于沸水中煮IOmin,冷卻后定容至15ml，于分光光度計(jì)540nm波長下測吸光 度（A)。以吸光度為縱坐標(biāo)，木糖量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，三次重復(fù)試驗(yàn)的均值用最小 二乘法擬合一元線性方程y = ax + b，求出吸光度與木糖量的關(guān)系。
[0118] 2.待測酶樣品的處理
[0119] 直接吸取酶液做適當(dāng)稀釋，使測定光吸收值在0. 25 - 0. 4范圍內(nèi)。
[0120] 3.酶活力測定
[0121] 取15ml具塞刻度試管按下面的反應(yīng)順序進(jìn)行操作，在反應(yīng)過程中，從加入底 物（吸取前搖勻）（1. 5)開始，向每支試管中加入試劑的時(shí)間間隔要絕對一致，50°C水解 IOmin.
[0122] 反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量見表1 :
[0123] 表1反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量
[0124]

【權(quán)利要求】
1. 一種造紙用漂白復(fù)合酶，由以下重量份數(shù)的原料制備：堿性木聚糖酶25-35份，嗜熱 芽孢桿菌培養(yǎng)物15-25份，漆酶12-18份，葡聚糖酶5-8份，1-羥基苯并三氮唑3-8份，EDTA 3-8份，保護(hù)劑4-7份，激活劑4-7份，甘露糖酶4-6份，脂肪酶3-5份，單寧酶3-5份，果膠 酶3-5份，白度穩(wěn)定劑2-5份，非離子表面活性劑2-4份，抗氧化劑1-3份； 所述堿性木聚糖酶和嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物均由產(chǎn)耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿 菌CCTCC M 2013537為出發(fā)菌株，并通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝而制備； 所述激活劑是由如下質(zhì)量組份的無機(jī)鹽均勻混合而成：硫酸鈉10-15份，氯化鋅6-8 份，氯化鎂5-8份，氯化1? 3-5份； 所述保護(hù)劑由以下重量份數(shù)的原料組成：海藻糖30-50份，靈芝多糖12-18份，NaCl 10-15 份，（NH4)2S045-9 份，半胱氨酸 3-5 份。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種造紙用漂白復(fù)合酶，其特征在于，所述耐高溫堿性木聚糖 酶的制備方法如下：將保存完好的嗜熱芽孢桿菌CCTCC M 2013537的斜面菌種經(jīng)活化和 一、二、三級種子培養(yǎng)以及一級種子罐培養(yǎng)得到種子液，以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫 度37-45°C，攪拌速度200-700rpm，通風(fēng)量（V/V)l:l-3,培養(yǎng)時(shí)間25-30h;然后以1-2°C / h降溫速率緩慢降溫至15-20°C，恒溫培養(yǎng)10_12h ;繼續(xù)以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至 8-10°C，此時(shí)，將一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)7-12h ;最后以 1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至15-20°C，恒溫培養(yǎng)10_12h ;繼續(xù)以1-2°C /h升溫速率緩慢 升溫至37-45°C，恒溫培養(yǎng)20-30h ;發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得耐高溫堿性木 聚糖酶。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種造紙用漂白復(fù)合酶，其特征在于，所述嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng) 物活菌含量為TxKT-gxK^CFU/g。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種造紙用漂白復(fù)合酶，其特征在于，所述白度穩(wěn)定劑為硫醇、 硫醚、三羥甲基磷酸、四羥甲基磷酸鹽、三羥甲基磷酸的雙磷衍生物中的一種或幾種以任意 比例均勻混合。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種造紙用漂白復(fù)合酶，其特征在于，所述非離子表面活性劑 為環(huán)保型非離子表面活性劑。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種造紙用漂白復(fù)合酶，其特征在于，所述抗氧化劑為葡萄籽 原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物中的任一一種或幾種組合。
7. 如權(quán)利要求1-6任一所述的一種造紙用漂白復(fù)合酶的制備方法，其特征在于，包括 如下步驟：首先將所述保護(hù)劑、激活劑分別超微粉碎，均勻混合，隨后立即依次加入非離子 表面活性劑、嗜熱芽孢桿菌培養(yǎng)物均勻混合20-30min，然后依次加入堿性木聚糖酶、漆酶、 葡聚糖酶、甘露糖酶、脂肪酶、單寧酶、果膠酶均勻混合，最后依次加入1-羥基苯并三氮唑、 EDTA、白度穩(wěn)定劑、抗氧化劑，混合均勻后密封包裝即得造紙用漂白復(fù)合酶。
8. 如權(quán)利要求7所述的一種造紙用漂白復(fù)合酶的制備方法，其特征在于，所述白度穩(wěn) 定劑為三羥甲基磷酸的雙磷衍生物。
9. 如權(quán)利要求7所述的一種造紙用漂白復(fù)合酶的制備方法，其特征在于，所述非離子 表面活性劑的質(zhì)量組份為：烷基多苷30-40份，烷基葡萄糖酰胺15-20份，N-十二烷基乙二 胺三乙酸鈉10-15份，異構(gòu)醇醚羧酸鹽AEC-1107 10-15份，月桂酰胺醚羧酸鹽8-10份，平 平加 c-1253-5 份，JFC 3-5 份。
10.如權(quán)利要求7所述的一種造紙用漂白復(fù)合酶的制備方法，其特征在于，所述抗氧化 劑為葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物按質(zhì)量比3-5:1-3:1-2均勻混合。
【文檔編號】D21C9/10GK104499336SQ201410713795
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月30日
【發(fā)明者】邵素英 申請人:邵素英