一種即刻交聯(lián)技術(shù)用于制備大孔三維納米纖維支架的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用即刻交聯(lián)技術(shù)結(jié)合靜電紡絲技術(shù)制備三維納米支架的方法，本發(fā)明得到的支架具有三維立體的結(jié)構(gòu)，厚度為0.05-10mm，結(jié)構(gòu)蓬松，纖維間空隙為0-30μm，孔隙大小可調(diào)，本發(fā)明操作簡便、所涉及的即刻交聯(lián)的方法解決了機(jī)械和加工性能稍差的天然生物分子進(jìn)行靜電紡絲后再交聯(lián)所產(chǎn)生的纖維溶解、結(jié)構(gòu)破壞的問題，可以獲得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、三維立體、疏松多孔的納米纖維支架，為組織再生修復(fù)中提供運(yùn)載細(xì)胞、細(xì)胞因子及藥物的平臺(tái)。
【專利說明】一種即刻交聯(lián)技術(shù)用于制備大孔三維納米纖維支架
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植入性醫(yī)療器械領(lǐng)域，具體涉及一種即刻交聯(lián)技術(shù)用于制備大孔三維納米纖維支架。
【背景技術(shù)】
[0002]疾病和創(chuàng)傷常引起組織器官的損傷和功能障礙，是威脅人類健康和生命的危險(xiǎn)因素之一。目前，對(duì)于缺損修復(fù)首選自體組織或器官移植，但這種方法供區(qū)有限。而同種異體組織器官又存在免疫排斥，異種的某些組織也被用來修復(fù)，例如骨，但存在感染的危險(xiǎn)。在此基礎(chǔ)上，組織工程學(xué)發(fā)展起來了，這是一門致力于尋找修復(fù)、維持和改進(jìn)組織的生物替代物的學(xué)科。它的三要素包括種子細(xì)胞、組織工程支架和生長因子。其中，支架是組織工程化組織最基本的構(gòu)架。它相當(dāng)于細(xì)胞外基質(zhì)的作用，所以，最理想的支架是能模擬細(xì)胞外環(huán)境的，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長和定向分化。細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原、非膠原糖蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖、彈性蛋白組成。膠原和彈性蛋白為結(jié)構(gòu)蛋白，決定不同組織細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的特異性，他們大多以納米纖維的形式存在。
[0003]目前，得到納米纖維的方法主要有相分離、自組裝和靜電紡絲，在這些方法中，運(yùn)用靜電紡絲的方法，可以得到IOnm到微米級(jí)的纖維絲，和其他方法比較，它具有操作簡便、效率高、可用的原材料廣泛，纖維和支架性能可調(diào)、可制作有序性結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)(K.Jayaraman, et al., Recent advances in polymer nanofibers, Journal ofNanoscience and Nanotechnology4(2004)52 - 65.X
[0004]在靜電紡絲過程中，高壓電源在噴射裝置及收集裝置之間形成一個(gè)高壓電場，噴射裝置可將高分子溶液推出形成液滴或液線，液滴和液線在其尖端形成泰勒錐，在合適的高壓電場的作用下形成突破液體表面張力形成射流，向著具有相反電勢的收集裝置運(yùn)動(dòng)。在運(yùn)動(dòng)過程中，溶劑揮 發(fā)，形成高分子納米線。堆積的納米線形成膜，在發(fā)射和收集裝置間形成不導(dǎo)電屏障，消弱了高壓電場，到一定程度時(shí)，溶液中的分子不能克服表面張力形成射流，而出現(xiàn)火花和滴液現(xiàn)象，纖維膜便不再增厚。同時(shí)，因?yàn)樾碌竭_(dá)的纖維不斷擠壓已經(jīng)沉積的纖維，使得最后形成的纖維膜非常致密，越是堆積的多，越致密。這些都限制了對(duì)于其在組織工程中的運(yùn)用。因而靜電紡絲支架存在的最大的問題是孔徑不夠，通常不超過 IOum,限制了細(xì)胞的擴(kuò)散(Carletti, E., A.Motta, et al.(2011).Scaffoldsfor Tissue Engineering and3D Cell Culture.3D Cell Culture.J.ff.Haycock, HumanaPress.695:17-39.)。另外，傳統(tǒng)靜電紡絲支架難以形成三維結(jié)構(gòu)，即使增設(shè)增強(qiáng)電場裝置，也最多能形成厚度不超過5mm的纖維團(tuán)，而這樣做的代價(jià)是增大操作難度，進(jìn)一步增加了纖維團(tuán)的密度。
[0005]近幾年來靜電紡絲支架研究非常多，很多都是研究如何解決這幾個(gè)問題。目前研究者們主要通過光刻蝕法、浙濾法、超聲法和微-納米纖維復(fù)合法等來挺高孔徑。但這些方法有些破壞了纖維原有結(jié)構(gòu)，有些使得材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)不均一，甚至引入較粗的微米纖維。而研究發(fā)現(xiàn)，納米纖維較微米纖維更有利于細(xì)胞的生長(Shabani I, Haddad1-Asl V, Seyedjafari E.et al.1mproved infiltration of stemcells on electrospunnanofibers[J].Biochemical and Biophysical ResearchCommunications, 2009, 382 (I): 129—133.)。另外一些研究者用改變接收裝置的方法來提高孔徑，力求在不破壞靜電紡絲纖維結(jié)構(gòu)的前提下提高孔徑。Blakeney等將接收裝置改成一個(gè)插著不銹鋼針的泡沫空心半球，在不銹鋼針之間得到了一種集中的、低密度、不受擠壓的棉花團(tuán)樣靜電紡絲支架。對(duì)這種材料進(jìn)行物理性能測試及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這種方法得到的纖維支架和傳統(tǒng)方法比較，孔徑和厚度都有所提高。但我們使用這種方法制作天然材料支架時(shí)發(fā)現(xiàn)，支架剛剛紡好時(shí)是蓬松而且較厚的，但在進(jìn)行交聯(lián)處理時(shí)，發(fā)生了孔隙坍塌，材料收縮(Blakeney, B.A.，A.Tambralli, et al.(2011) ,Cell infiltration and growthin a low density, uncompressed three-dimensional electrospunnanofibrous scaffold."Biomaterials32(6):1583-1590.)。
[0006]SeemaAgarwal等介紹了一種反應(yīng)靜電紡絲的方法,透明質(zhì)酸在被噴出前發(fā)生交聯(lián)，靜電紡絲完畢后，得到的纖維可不用再進(jìn)行交聯(lián)處理(Agarwal, S.，J.H.Wendorff, etal.(2009)."Progress in the Field of Electrospinning for Tissue EngineeringApplications."Advanced Materials21 (32-33):3343-3351.)。這種即刻交聯(lián)可發(fā)生在靜電紡絲前，也可發(fā)生在靜電紡絲時(shí)。Xu等就是通過加入光交聯(lián)劑，紫外照射噴射中的絲，在沉積前發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)(Xu, X.，J.-F.Zhang, et al.(2010)."Fabrication of Cross-LinkedPolyethyleneimine Microfibers by Reactive Electrospinning with In SituPhoto-Cross-Linking by UV Radiation.^Biomacromoleculesll (9):2283-2289.)。若將可得到蓬松結(jié)構(gòu)的收集裝置加上反應(yīng)靜電紡絲的方法，即可避免后期交聯(lián)導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)坍塌，但是這種方法所用技術(shù)較為復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或技術(shù)需求，本發(fā)明的目的是提供一種利用即刻交聯(lián)技術(shù)結(jié)合靜電紡絲技術(shù)制備大孔三維納米支架的方法，本發(fā)明操作簡便、所涉及的即刻交聯(lián)的方法解決了機(jī)械和加工性能 稍差的天然生物分子進(jìn)行靜電紡絲后再交聯(lián)所產(chǎn)生的纖維溶解、結(jié)構(gòu)破壞的問題，可以獲得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、三維立體、疏松多孔的納米纖維支架。為組織再生修復(fù)中提供運(yùn)載細(xì)胞、細(xì)胞因子及藥物的平臺(tái)。
[0008]本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:
[0009]一種制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于:步驟如下:
[0010](I)將生物大分子材料溶于有機(jī)溶劑中，配制成質(zhì)量濃度為6-20%的靜電紡絲溶液，其中生物大分子為絲素蛋白和/或殼聚糖；
[0011](2)將上步所得的靜電紡絲溶液進(jìn)行靜電紡絲，然后在甲醇和/或乙醇溶液中收集，得到大孔三維納米纖維粗品；
[0012](3)對(duì)上步所得粗品進(jìn)行中和、清洗，除去樣品中殘留的有機(jī)溶劑，干燥得到大孔三維納米纖維支架。
[0013]所述步驟I中有機(jī)溶劑為三氟乙酸、二氯甲烷、六氟異丙醇的一種或幾種的混合物。
[0014]所述步驟I中絲素蛋白與殼聚糖可按任意比例混合。[0015]所述步驟2中靜電紡絲的電壓為16-30kv，給液速度為0.0005-0.003mm/s，收集距離為 7_15cm。
[0016]所述步驟2中甲醇和/或乙醇溶液中還可包括交聯(lián)劑。
[0017]所述交聯(lián)劑為京尼平和/或戊二醛，其中京尼平在甲醇和/或乙醇溶液中的濃度為0.l-10mg/ml，戊二醛在甲醇和/或乙醇溶液中的濃度為0.25-2.5w/v%，或者兩者之間在上訴濃度范圍內(nèi)按任意比例混合的混合物。
[0018]所述步驟2中靜電紡絲溶液中的絲素蛋白和/或殼聚糖與甲醇和/或乙醇溶液的比例為 Ig:300-1500ml。
[0019]所述步驟2中收集方法可以是:在現(xiàn)有靜電紡絲裝置的噴射裝置下方放置不導(dǎo)電容器，容器中盛有配置好的具有交聯(lián)效應(yīng)的乙醇和/或甲醇溶液。不導(dǎo)電容器放在導(dǎo)電平臺(tái)上。通過這種收集方法，可得到無序取向性的大孔三維納米纖維支架。
[0020]所述步驟2中收集還可以方法是:在配置好的具有交聯(lián)效應(yīng)的乙醇和/或甲醇溶液的氛圍下用滾筒收集法收集樣品；所述滾筒收集法中滾筒筒體水平放置，滾筒體積的1/3-1/2浸沒在乙醇中。通過這種收集方法，可得到有序取向性的大孔三維納米纖維支架。
[0021]本發(fā)明主要以運(yùn)用廣泛、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的靜電紡絲技術(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)靜電紡絲制作組織工程支架過程中產(chǎn)生的問題進(jìn)行改進(jìn)。
[0022]最基本的靜電紡絲裝置包括:高壓電源、噴射裝置及收集裝置，高壓電源在噴射裝置及收集裝置之間形成一個(gè)高壓電場，噴射裝置可將高分子溶液推出形成液滴或液線，液滴和液線在其尖端形成泰勒錐，在合適的高壓電場的作用下形成突破液體表面張力形成射流，向著具有相反電勢的收集裝置運(yùn)動(dòng)。在運(yùn)動(dòng)過程中，溶劑揮發(fā)，形成高分子納米線。
[0023]這些納米線經(jīng)過各種巧妙的收集裝置可獲得組織工程所需的蓬松立體纖維團(tuán)。但當(dāng)使用組織工程中常用的生物大分子制作蓬松立體纖維團(tuán)后，對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)處理時(shí)，其結(jié)構(gòu)沒法維持。例如本發(fā)明選用的殼聚糖及絲素蛋白，在靜電紡絲所用溶液中時(shí)主要以不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)存在，分子和分子間結(jié)合力量很弱，對(duì)于絲素蛋白來說主要存在無規(guī)卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)兩種不穩(wěn)定構(gòu)象。靜電紡絲是個(gè)物理力學(xué)的作用的過程，噴出的射流中，分子和分子相互纏繞形成纖維，所以纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)不牢固。交聯(lián)是讓分子內(nèi)部和分子間形成穩(wěn)定的結(jié)合，如醇溶液可將絲素蛋白中的無規(guī)卷曲和α_螺旋結(jié)構(gòu)變成穩(wěn)定的β_折疊結(jié)構(gòu)，戊二醛、京尼平可通過化學(xué)反應(yīng)使殼聚糖與殼聚糖之間、絲素蛋白與絲素蛋白之間以及殼聚糖與絲素蛋白之間形成穩(wěn)定而牢固的化學(xué)結(jié)合，使其在組織工程的運(yùn)用中保持一定的穩(wěn)定性。但對(duì)蓬松立體的纖維進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，纖維內(nèi)部分子的緊密結(jié)合，導(dǎo)致了孔隙及支架整體的收縮。而靜電紡絲中的即刻交聯(lián)是避免這種現(xiàn)象的一種方法。
[0024]絲素蛋白及殼聚糖作為組織工程常用原材料，具有來源廣、生物相容性好、機(jī)械加工性能佳的優(yōu)勢，絲素蛋白在醇溶液中可發(fā)生物理交聯(lián)。京尼平及戊二醛是常用生物材料交聯(lián)劑，具有低毒的特性。絲素蛋白和殼聚糖都可被上述兩種交聯(lián)劑交聯(lián)。
[0025]在殼聚糖和/或絲素蛋白的納米纖維浸入到具有交聯(lián)作用的甲醇和/或乙醇溶液之中后，納米纖維中的大分子會(huì)在液體的作用下即刻交聯(lián)，使得納米纖維中的大分子變成穩(wěn)定的空間構(gòu)象。
[0026]例外，在利用靜電紡絲取得有序取向性的納米纖維時(shí)，為了取得更有序的纖維，通常需要提高滾筒速度來提高牽拉力，達(dá)到拉得更直的目的，但對(duì)于很多生物大分子來說，交聯(lián)變成更穩(wěn)定牢固的結(jié)構(gòu)之前，其機(jī)械性能通常非常差。對(duì)于傳統(tǒng)的靜電紡絲，滾筒收集的纖維常常由未交聯(lián)的分子形成，當(dāng)速度提高到一定的時(shí)候，這些纖維很容易被拉斷。而把滾筒置于具有交聯(lián)作用的甲醇和/或乙醇溶液之中后，落在其中的纖維即刻被交聯(lián)，纖維內(nèi)部分子形成穩(wěn)定牢固的結(jié)合，纖維的機(jī)械性能提高，一定范圍內(nèi)，即使提高轉(zhuǎn)速提高滾筒對(duì)其的牽拉力量，也不容易被拉斷。同時(shí)，因?yàn)榇既芤旱拇嬖?，使得這種方法收集的有序纖維變得蓬松，纖維的厚度也因此提高，最終形成的納米纖維支架不但有序而且具有穩(wěn)定的大孔三維結(jié)構(gòu)。
[0027]綜上所述，本領(lǐng)域中存在著提供簡易的即刻交聯(lián)技術(shù)以獲得大孔三維納米纖維支架用于組織工程領(lǐng)域的技術(shù)需求。
[0028]本方法收集得到的纖維支架特點(diǎn)是纖維直徑在IOnm到10 μ m之間，可以是有取向性的纖維也可以是無取向性的纖維。在紡絲浸入具有交聯(lián)作用的甲醇和/或乙醇溶液的同時(shí)被即刻交聯(lián)，最終形成的支架具有三維立體的結(jié)構(gòu)，厚度為0.05-10mm，結(jié)構(gòu)蓬松，纖維間空隙為0-30 μ m,平均孔隙大小可調(diào)，經(jīng)過漂洗干燥處理后，結(jié)構(gòu)基本能維持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為實(shí)施例1制備大孔三維無序納米纖維支架的過程示意圖；
[0030]圖2為使用液體浴即刻交聯(lián)技術(shù)制備的再生絲素蛋白支架的傅立葉紅外光譜圖；
[0031]圖3為實(shí)施例2使用滾筒收集法制備大孔三維有序取向性納米纖維支架的過程示意圖；
[0032]1-靜電紡絲設(shè)備，2-裝有甲醇和/或乙醇的器皿，3-滾筒。
【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施實(shí)例一:
[0034]1、將蠶繭剪成Icm2的小塊，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的碳酸鈉溶液500mL煮沸1.5小時(shí)，用去離子水清洗干凈，再在500mL去離子水中煮沸0.5h，用去離子水洗凈后烘干。往處理后的蠶絲中加入約60mL氯化鈣/水/乙醇三相溶液(三種物質(zhì)的摩爾比為1/8/2)，在70°C水浴攪拌I小時(shí)使得蠶絲完全溶解，再對(duì)所得的溶液透析48小時(shí)。透析完畢后的溶液在8000r/min的條件下離心30min后過濾，過濾得到的溶液進(jìn)行液氮冷凍后干燥48小時(shí)，最后得到再生絲素蛋白。
[0035]2、將2g再生絲素蛋白溶解在Sg質(zhì)量比為3:7的二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中，配制再生絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的靜電紡絲所用溶液。
[0036]通過靜電紡絲設(shè)備進(jìn)行靜電紡絲，利用液體浴收集法進(jìn)行收集。如圖1所示，此實(shí)例中的液體浴收集方法可以得到無取向性的納米纖維支架粗品。
[0037]本實(shí)例所述液體浴收集法的實(shí)現(xiàn)方式是將600ml乙醇加入直徑為20cm，高3cm的底部鋪有導(dǎo)電錫箔紙的玻璃皿，使得再生絲素蛋白與乙醇的比例為lg:300ml，乙醇的低表面張力特性可以使得靜電紡絲所產(chǎn)生的紡絲可以浸入乙醇當(dāng)中，在進(jìn)入乙醇的同時(shí)乙醇可以即刻轉(zhuǎn)變再生絲素蛋白的構(gòu)象以進(jìn)行即刻交聯(lián)，使得蠶絲蛋白所構(gòu)成的紡絲變成穩(wěn)定的狀態(tài)，如2所示，采用液體浴即 刻交聯(lián)技術(shù)所制備的再生絲素蛋白支架的紅外光譜圖顯示，再生絲素蛋白的構(gòu)象已經(jīng)是可以穩(wěn)定存在的β-折疊結(jié)構(gòu)。[0038]同時(shí)調(diào)節(jié)靜電紡絲使用電壓為16kv、給液速度為0.0005mm/s、收集距離為7cm。在上述條件下進(jìn)行不同時(shí)間的靜電紡絲，可以收集不同厚度的樣品。
[0039]3、取下粗品，放入7%的氨水溶液中浸泡30min，再用去離子水漂洗3_6遍，最后進(jìn)行冷凍干燥。
[0040]4、將無取向性納米纖維支架用紫外光、75%乙醇或環(huán)氧乙烷消毒。培養(yǎng)基浸泡后接種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、IPS細(xì)胞、胰細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，進(jìn)行誘導(dǎo)、培養(yǎng)數(shù)周。將長有細(xì)胞的支架植入胰臟、肝臟、椎間盤、關(guān)節(jié)軟骨等處。
[0041]實(shí)施例二
[0042]1、將蠶繭剪成Icm2的小塊，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的碳酸鈉溶液500mL煮沸1.5小時(shí)，用去離子水清洗干凈，再在500mL去離子水中煮沸0.5h，用去離子水洗凈后烘干。往處理后的蠶絲中加入約60mL氯化鈣/水/乙醇三相溶液(三種物質(zhì)的摩爾比為1/8/2)，在70°C水浴攪拌I小時(shí)使得蠶絲完全溶解，再對(duì)所得的溶液透析48小時(shí)。透析完畢后的溶液在8000r/min的條件下離心30min后過濾，過濾得到的溶液進(jìn)行液氮冷凍后干燥48小時(shí)，最后得到再生絲素蛋白。
[0043]2、將0.5g再生絲素蛋白及0.5g殼聚糖混合溶解在9g質(zhì)量比為3:7的二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中，配制混合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的靜電紡絲所用溶液。
[0044]通過靜電紡絲設(shè)備進(jìn)行靜電紡絲，利用液體浴收集法進(jìn)行收集。如圖1所示，此實(shí)例中的液體浴收集方法可以得到無取向性的納米纖維支架粗品。
[0045]其具體操作方法是:將直徑20cm，高3cm的玻璃皿盛300ml甲醇和300ml乙醇，加入京尼平使其濃度為0.lmg/ml,最終絲素蛋白殼聚糖混合物和混合醇溶液的比例為lg:600ml，在培養(yǎng)皿底部鋪一層錫紙；混合醇溶液的低表面張力特性可以使得靜電紡絲所產(chǎn)生的絲素蛋白殼聚糖混合絲浸入當(dāng)中，在進(jìn)入溶液的同時(shí)即刻交聯(lián)，使得絲素蛋白本身構(gòu)象改變成穩(wěn)定的β_折疊， 同時(shí)蠶絲蛋白與絲素蛋白、殼聚糖與殼聚糖、以及絲素蛋白與殼聚糖之間形成穩(wěn)固的化學(xué)結(jié)合。
[0046]同時(shí)調(diào)節(jié)靜電紡絲使用電壓為16kv、給液速度為0.0005mm/s、收集距離為7cm。在上述條件下進(jìn)行不同時(shí)間的靜電紡絲，可以收集不同厚度的樣品。
[0047]3、取下粗品，放入7%的氨水溶液中浸泡30min，再用去離子水漂洗3_6遍，最后進(jìn)行冷凍干燥。
[0048]4、將無取向性納米纖維支架用紫外光、75%乙醇或環(huán)氧乙烷消毒。培養(yǎng)基浸泡后接種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、IPS細(xì)胞、胰細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，進(jìn)行誘導(dǎo)、培養(yǎng)數(shù)周。將長有細(xì)胞的支架植入胰臟、肝臟、椎間盤、關(guān)節(jié)軟骨等處。
[0049]實(shí)施例三
[0050]1、將蠶繭剪成Icm2的小塊，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的碳酸鈉溶液500mL煮沸1.5小時(shí)，用去離子水清洗干凈，再在500mL去離子水中煮沸0.5h，用去離子水洗凈后烘干。往處理后的蠶絲中加入約60mL氯化鈣/水/乙醇三相溶液(三種物質(zhì)的摩爾比為1/8/2)，在70°C水浴攪拌I小時(shí)使得蠶絲完全溶解，再對(duì)所得的溶液透析48小時(shí)。透析完畢后的溶液在8000r/min的條件下離心30min后過濾，過濾得到的溶液進(jìn)行液氮冷凍后干燥48小時(shí)，最后得到再生絲素蛋白。
[0051]2、將0.75g再生絲素蛋白及0.25g殼聚糖混合溶解在9g質(zhì)量比為3:7的二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中，配制混合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的靜電紡絲所用溶液。
[0052]通過靜電紡絲設(shè)備進(jìn)行靜電紡絲，利用液體浴收集法進(jìn)行收集。如圖1所示，此實(shí)例中的液體浴收集方法可以得到無取向性的納米纖維支架粗品。
[0053]其具體操作方法是:將直徑20cm，高3cm的玻璃皿盛300ml甲醇和600ml乙醇，加入戊二醛使其濃度為2.5w/v%，最終絲素蛋白殼聚糖混合物和混合醇溶液的比例為lg:900ml，在培養(yǎng)皿底部鋪一層錫紙；混合醇溶液的低表面張力特性可以使得靜電紡絲所產(chǎn)生的絲素蛋白殼聚糖混合絲浸入當(dāng)中，在進(jìn)入溶液的同時(shí)即刻交聯(lián)，使得絲素蛋白本身構(gòu)象改變成穩(wěn)定的β_折疊，同時(shí)蠶絲蛋白與絲素蛋白、殼聚糖與殼聚糖、以及絲素蛋白與殼聚糖之間形成穩(wěn)固的化學(xué)結(jié)合。
[0054]同時(shí)調(diào)節(jié)靜電紡絲使用電壓為25kv、給液速度為0.0Olmm/s、收集距離為10cm。在上述條件下進(jìn)行不同時(shí)間的靜電紡絲，可以收集不同厚度的樣品。
[0055]3、取下粗品，放入7%的氨水溶液中浸泡30min，再用去離子水漂洗3_6遍，最后進(jìn)行冷凍干燥。
[0056]4、將無取向性納米纖維支架用紫外光、75%乙醇或環(huán)氧乙烷消毒。培養(yǎng)基浸泡后接種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、IPS細(xì)胞、胰細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，進(jìn)行誘導(dǎo)、培養(yǎng)數(shù)周。將長有細(xì)胞的支架植入胰臟、肝臟、椎間盤、關(guān)節(jié)軟骨等處。
[0057]實(shí)施例四
[0058]1、將蠶繭剪成Icm2的小塊，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的碳酸鈉溶液500mL煮沸1.5小時(shí)，用去離子水清洗干凈，再在500mL去離子水中煮沸0.5h，用去離子水洗凈后烘干。往處理后的蠶絲中加入約60mL氯化鈣/水/乙醇三相溶液(三種物質(zhì)的摩爾比為1/8/2)，在70°C水浴攪拌I小時(shí)使得蠶絲完全溶解，再對(duì)所得的溶液透析48小時(shí)。透析完畢后的溶液在8000r/min的條件下離 心30min后過濾，過濾得到的溶液進(jìn)行液氮冷凍后干燥48小時(shí)，最后得到再生絲素蛋白。
[0059]2、將0.3g再生絲素蛋白及0.3g殼聚糖混合溶解在9.4g六氟異丙醇溶劑中，配制混合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的靜電紡絲所用溶液。
[0060]3、通過靜電紡絲設(shè)備進(jìn)行靜電紡絲，利用液體浴滾筒收集法進(jìn)行收集。如圖3所示，此實(shí)例中的液體浴滾筒收集方法可以得到有取向性的納米纖維支架粗品。
[0061]其中液體浴滾筒收集法的具體操作方法是:將直徑20cm，高2cm的玻璃皿盛600ml乙醇，加入京尼平使其濃度為10mg/ml,最終絲素蛋白殼聚糖混合物和乙醇溶液的比例為lg: 1000ml，在玻璃皿底部鋪一層錫紙；所用滾筒是直徑為3cm，高5cm的滾筒，其表面包裹一層錫箔紙，利用馬達(dá)旋轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)滾筒旋轉(zhuǎn)。將滾筒放置于培養(yǎng)皿中，滾筒的浸沒體積為1/2。混合醇溶液的低表面張力特性可以使得靜電紡絲所產(chǎn)生的絲素蛋白殼聚糖混合絲浸入當(dāng)中，在進(jìn)入溶液的同時(shí)即刻交聯(lián)，使得絲素蛋白本身構(gòu)象改變成穩(wěn)定的β_折疊，同時(shí)蠶絲蛋白與絲素蛋白、殼聚糖與殼聚糖、以及絲素蛋白與殼聚糖之間形成穩(wěn)固的化學(xué)結(jié)合。
[0062]調(diào)節(jié)電壓為25kv、給液速度為0.001mm/s、收集距離為IOcm,滾筒在液體浴中以20Hz的頻率轉(zhuǎn)動(dòng)。在上述條件下進(jìn)行不同時(shí)間的靜電紡絲，可以在滾筒上收集不同厚度的粗品。
[0063]4、取下粗品，用去離子水漂洗3-6遍，最后進(jìn)行冷凍干燥。
[0064]5、將有取向性 納米纖維支架用紫外光、75%乙醇或環(huán)氧乙烷消毒。培養(yǎng)基浸泡后接種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、IPS細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞、肌細(xì)胞等，進(jìn)行誘導(dǎo)、培養(yǎng)數(shù)周。將長有細(xì)胞的支架植入骨、神經(jīng)、肌腱、牙周膜、肌肉等缺損處。
[0065]實(shí)施例五
[0066]1、將蠶繭剪成Icm2的小塊，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的碳酸鈉溶液500mL煮沸1.5小時(shí)，用去離子水清洗干凈，再在500mL去離子水中煮沸0.5h，用去離子水洗凈后烘干。往處理后的蠶絲中加入約60mL氯化鈣/水/乙醇三相溶液(三種物質(zhì)的摩爾比為1/8/2)，在70°C水浴攪拌I小時(shí)使得蠶絲完全溶解，再對(duì)所得的溶液透析48小時(shí)。透析完畢后的溶液在8000r/min的條件下離心30min后過濾，過濾得到的溶液進(jìn)行液氮冷凍后干燥48小時(shí)，最后得到再生絲素蛋白。
[0067]2、將0.2g再生絲素蛋白及0.4g殼聚糖混合溶解在9.4g六氟異丙醇溶劑中，配制混合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的靜電紡絲所用溶液。
[0068]3、通過靜電紡絲設(shè)備進(jìn)行靜電紡絲，利用液體浴滾筒收集法進(jìn)行收集。如圖3所示，此實(shí)例中的液體浴滾筒收集方法可以得到有取向性的納米纖維支架粗品。
[0069]其中液體浴滾筒收集法的具體操作方法是:將直徑20cm，高3cm的玻璃皿盛900ml甲醇，加入戊二醛使其濃度為0.25w/v%，最終絲素蛋白殼聚糖混合物和甲醇溶液的比例為lg: 1500ml，在玻璃皿底部鋪一層錫紙；所用滾筒是直徑為3cm，高5cm的滾筒，其表面包裹一層錫箔紙，利用馬達(dá)旋轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)滾筒旋轉(zhuǎn)。將滾筒放置于盛滿乙醇的玻璃皿中，滾筒的浸沒體積為1/2。
[0070]調(diào)節(jié)電壓為30kv、給液速度為0.003mm/s、收集距離為15cm,滾筒在液體浴中以20Hz的頻率轉(zhuǎn)動(dòng)。在上述條件下進(jìn)行不同時(shí)間的靜電紡絲，可以在滾筒上收集不同厚度的粗品?；旌洗既芤旱牡捅砻鎻埩μ匦钥梢允沟渺o電紡絲所產(chǎn)生的絲素蛋白殼聚糖混合絲浸入當(dāng)中，在進(jìn)入溶液的同時(shí)即刻交聯(lián)，使得絲素蛋白本身構(gòu)象改變成穩(wěn)定的β_折疊，同時(shí)蠶絲蛋白與絲素蛋白、殼聚 糖與殼聚糖、以及絲素蛋白與殼聚糖之間形成穩(wěn)固的化學(xué)結(jié)合。
[0071]4、取下粗品，用去離子水漂洗3-6遍，最后進(jìn)行冷凍干燥。
[0072]5、將有取向性納米纖維支架用紫外光、75%乙醇或環(huán)氧乙烷消毒。培養(yǎng)基浸泡后接種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、IPS細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞、肌細(xì)胞等，進(jìn)行誘導(dǎo)、培養(yǎng)數(shù)周。將長有細(xì)胞的支架植入骨、神經(jīng)、肌腱、牙周膜、肌肉等缺損處。
[0073]實(shí)施例六
[0074]1、將0.6g殼聚糖溶解在六氟異丙醇溶劑中，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的靜電紡絲所用溶液。
[0075]2、通過靜電紡絲設(shè)備進(jìn)行靜電紡絲，利用液體浴滾筒收集法進(jìn)行收集。如圖3所示，此實(shí)例中的液體浴滾筒收集方法可以得到有取向性的納米纖維支架粗品。
[0076]其中液體浴滾筒收集法的具體操作方法是:將京尼平加入450ml乙醇，配置成2mg/ml的京尼平乙醇溶液，將戊二醛加入450ml甲醇，配置成2w/v%的戊二醛醇溶液，將二者混合到直徑20cm，高3cm的玻璃皿中，最終殼聚糖和混合醇溶液的比例為lg:1500ml，在玻璃皿底部鋪一層錫紙；所用滾筒是直徑為3cm，高5cm的滾筒，其表面包裹一層錫箔紙，利用馬達(dá)旋轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)滾筒旋轉(zhuǎn)。將滾筒放置于盛有900ml京尼平和戊二醛混合醇溶液的玻璃皿中，滾筒的浸沒體積為1/2?；旌洗既芤旱牡捅砻鎻埩μ匦钥梢允沟渺o電紡絲所產(chǎn)生的殼聚糖纖維浸入當(dāng)中，在進(jìn)入溶液的同 時(shí)即刻交聯(lián)，使得殼聚糖與殼聚糖分子之間形成穩(wěn)固的化學(xué)結(jié)合。
[0077]調(diào)節(jié)電壓為30kv、給液速度為0.003mm/s、收集距離為15cm,滾筒在液體浴中以20Hz的頻率轉(zhuǎn)動(dòng)。在上述條件下進(jìn)行不同時(shí)間的靜電紡絲，可以在滾筒上收集不同厚度的粗品。
[0078]3、取下粗品，用去離子水漂洗3-6遍，最后進(jìn)行冷凍干燥。
[0079]4、將有取向性納米纖維支架用紫外光、75%乙醇或環(huán)氧乙烷消毒。培養(yǎng)基浸泡后接種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、IPS細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞、肌細(xì)胞等，進(jìn)行誘導(dǎo)、培養(yǎng)數(shù)周。將長有細(xì)胞的支架植入骨、神經(jīng)、肌腱、牙周膜、肌肉等缺損處。
[0080]本實(shí)施例中使用的 靜電紡絲設(shè)備為現(xiàn)有技術(shù)。
【權(quán)利要求】
1.一種制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于:步驟如下: (1)將生物大分子材料溶于有機(jī)溶劑中，配制成質(zhì)量濃度為6-20%的靜電紡絲溶液，其中生物大分子為絲素蛋白和/或殼聚糖； (2)將上步所得的靜電紡絲溶液進(jìn)行靜電紡絲，然后在甲醇和/或乙醇溶液中收集，得到大孔三維納米纖維粗品； (3)對(duì)上步所得粗品進(jìn)行中和、清洗，除去樣品中殘留的有機(jī)溶劑，干燥得到大孔三維納米纖維支架。
2.如權(quán)利要求1所述的制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于:所述步驟I中有機(jī)溶劑為三氟乙酸、二氯甲烷、六氟異丙醇的一種或幾種的混合物。
3.如權(quán)利要求1所述的制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于:所述步驟2中靜電紡絲的電壓為16_30kv，給液速度為0.0005-0.003 mm/s，收集距離為7_15cm。
4.如權(quán)利要求1所述的制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于:所述步驟2中甲醇和/或乙醇溶液中還包括交聯(lián)劑。
5.如權(quán)利要求4所述的制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于: 所述交聯(lián)劑為京尼平和/或戊二醛，其中京尼平在甲醇和/或乙醇溶液中的濃度為0.l-10mg/ml，戊二醛在甲醇和/或乙醇溶液中的濃度為0.25-2.5w/v%，或者兩者之間在上述濃度范圍內(nèi)按任意比例混合的混合物。
6.如權(quán)利要求1所述的制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于:所述步驟(2)中靜電紡絲溶液中的絲素蛋白和/`或殼聚糖與甲醇和/或乙醇溶液的比例為Ig:300-1500ml。
【文檔編號(hào)】D01D5/00GK103861145SQ201410085109
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】王家偉, 丁慧芬 申請人:武漢大學(xué)