專利名稱：具有氧化還原酶活性的多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有氧化還原酶活性的多肽和包含編碼該多肽的基因的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及2, 5-呋喃ニ羧酸(2, 5-Furan-dicarboxylic acid,FDCA)的生產(chǎn)。本發(fā)明還包括適用于生產(chǎn)這些多肽的、用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述細(xì)胞也可以被用于將羥甲基糠醛(HMF)生物轉(zhuǎn)化成FDCA。
背景技術(shù)：
2，5-呋喃ニ羧酸(FDCA)具有在聚酯如PET的生產(chǎn)中成為對苯ニ酸酯的基 于生物的替代物的巨大潛能。因此和由于其他原因，F(xiàn)DCA在關(guān)于Top Value-Added Chemicalsfrom Biomass的DOE報(bào)告中被鑒定為前12種最優(yōu)選化學(xué)品之一(Top Value-AddedChemicals from Biomass, Volume I-Results of screening for potential Candidatesfrom Sugars and Synthesis gas, Department of Energy (USA), 2004)。該化合物可通過5-羥甲基糠醛(HMF)的氧化獲得，所述HMF可通過在酸條件下加熱己糖來生產(chǎn)。DOE報(bào)告在第27頁公開了 FDCA的ー些可能的應(yīng)用。這些應(yīng)用包括作為用于生產(chǎn)琥珀酸、2，5-雙(氨甲基)-四氫呋喃、2，5- ニ羥甲基-四氫呋喃、2，5- ニ羥甲基呋喃和2，5-呋喃ニ甲醛的底物的作用。盡管通過C6糖的化學(xué)氧化脫水進(jìn)行的FDCA生產(chǎn)和FDCA的用途是公知的并且設(shè)置了第26頁表13中所指出的技術(shù)障礙，但是對生物轉(zhuǎn)化一可能的酶促轉(zhuǎn)化一而言，狀況是未知的。W02009/023174中給出了用于酶促制備FDCA的方法。在所述公開中，用氯過氧化還原酶(chloroperoxidoreductase)氧化輕甲基糠醒物類，并且被過氧化氫氧化的產(chǎn)物在羥甲基糠醛(特別是甲酰呋喃羧酸或FFCA)的Cl位置處具有羧酸基團(tuán)。結(jié)果例如展示于圖I中。在另ー實(shí)施方案中，HMF在存在氧化底物時(shí)與氧化還原酶接觸，從而將HMF氧化成至少ニ甲?；秽蚣柞；秽人嶂?。W02009/023174中已知的方法的缺點(diǎn)在于，反應(yīng)需要過氧化氫,并且形成的產(chǎn)物是FDCA與兩種污染性副產(chǎn)物羥甲基呋喃羧酸(HmFCA)和甲?；秽人?FFCA)的混合物。因此，從HMF到FDCA的產(chǎn)率被降低，并且需要額外的回收步驟獲得基本純化形式的FDCA。在數(shù)據(jù)庫EBI,Uniprot B2T4R9中鑒定了ー個(gè)577個(gè)氨基酸的序列，所述序列由作為“Burkholderia phytofirmans PsJN的染色體I的完整序列”中葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶的同源性推斷而來。在數(shù)據(jù)庫EBI,Uniprot B2JSZ0中鑒定了ー個(gè)576個(gè)氨基酸的序列，所述序列由作為“ Burkho lderi a phymatum STM815的質(zhì)粒I的完整序列”中葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶的同源性推斷而來。在Deurzen, M.P.J. et al, J. Carbohydrate Chemistry 16 (3),299-309(1997)中公開了氯過氧化物酶-催化的5-羥甲基糠醛的氧化。所述反應(yīng)以針對呋喃_2，5-ニ甲醛(furan-2, 5-dicarboxaldehyde, FDC) 60-74%的選擇性進(jìn)行。副產(chǎn)物是5_輕甲基_2_呋喃羧酸(HFCA)和5-甲?；秽?2-羧酸(FFCA)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個(gè)目的是提供能夠使用分子氧進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的氧化還原酶。另ー個(gè)目的是提供具有廣闊反應(yīng)譜的氧化還原酶。另ー個(gè)目的是提供具有高區(qū)域特異性(regiospecificity)的氧化還原酶。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供用于生產(chǎn)FDCA的方法,其中可以避免大量的副產(chǎn)物。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供用于生產(chǎn)5-羥甲基-2-呋喃羧酸(HMF酸)的方法，其中能夠避免大量副產(chǎn)物。一個(gè)或多個(gè)這些目的根據(jù)本發(fā)明被實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明提供了編碼具有氧化還原酶活性的多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸典型地編碼具有氧化還原酶活性、特別是HmfH氧化還原酶活性的多肽。因此，根據(jù)本發(fā)明提供了具有氧化還原酶活性的多肽或其變體多肽，所述多肽包含SEQ ID NO 3中公開的氨基酸序列或由SEQ ID NO 4的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述變體多肽與SEQ ID NO :3的序列具有45%或更多的序列同一性。
這些氧化還原酶多肽提供了生產(chǎn)有附加價(jià)值的化合物FDCA的化學(xué)氧化途徑的酶促替代方式，允許溫和的反應(yīng)條件(30°C，pH 7)井生產(chǎn)更少的廢物。所述氧化還原酶是真正的氧化酶(true oxidase),即氧化反應(yīng)僅需要分子氧,省略了用于再生昂貴的輔因子的需求。所述酶提供廣泛的反應(yīng)特異性和區(qū)域特異性，將醇和醛基團(tuán)均最終氧化成羧酸，而無論這些基團(tuán)位于呋喃主鏈的C2或C5位。根據(jù)本發(fā)明還提供了并入本發(fā)明多核苷酸序列的載體,例如表達(dá)載體,和包含根據(jù)本發(fā)明的多肽、多核苷酸或載體的細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于制備具有氧化還原酶活性的多肽的方法和能夠通過所述方法獲得的多肽，所述方法包括在允許所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞，并任選地回收所表達(dá)的多肽。本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案涉及使用強(qiáng)效的全細(xì)胞生物催化劑由富含(富集)果糖的進(jìn)料流生產(chǎn)FDCA的集成方法。


圖I :由HmfH氧化還原酶催化的氧化的反應(yīng)流程。圖2 :HmfH表達(dá)載體pJT’hmfH的質(zhì)粒圖譜。Ptac’，tac啟動(dòng)子；rep,編碼pR01600復(fù)制蛋白的基因；gmR,慶大霉素抗性基因；bla, β-內(nèi)酰胺酶；pR01600_ori,P. putida的復(fù)制起點(diǎn)；pUC ori, E. coli的復(fù)制起點(diǎn)。圖3 :被鑒定為潛在的糠醛和/或HMF利用者的C. basilensis HMFH(A)和其他物種(B)中糠醛和HMF代謝基因的遺傳構(gòu)成的圖示。圖4 :在R putida S12 pJT’ hmfH的粗制細(xì)胞提取物中由HMF形成FDCA、HMF-醇(H-oh)和 HMF-酸(H-酸)。圖5 :在P. putida_pJT’ hmfH的分批進(jìn)料培養(yǎng)物中形成HMF酸和FDCA。左側(cè)的箭頭指出HMF進(jìn)料的起點(diǎn)；右側(cè)箭頭指出對進(jìn)料添加甘油。圖6.在P. putida_pJT’hmfH的分批進(jìn)料培養(yǎng)物中形成HMF和FDCA。箭頭指出合并的HMF和甘油進(jìn)料的起點(diǎn)。圖7a :實(shí)施例VIII的分批進(jìn)料發(fā)酵中，HMF酸、FDCA和生物質(zhì)的濃度。7b :實(shí)施例VIII的分批進(jìn)料發(fā)酵中甘油和HMF的進(jìn)料速率。序列表概述SEQ ID NO : I 公開了引物 FN23 的 DNA 序列5 ’ -CGGAATTCCACATGACAAGGGGAGACCG-3’。加有下劃線的序列指出EcoRI限制性位點(diǎn)；SEQ ID NO : 2 公開了引物 FN24 的 DNA 序列；5，-CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG-3’。加有下劃線的序列指出EcoRI限制性位點(diǎn)；SEQ ID NO 3公開了 HmfH的氨基酸序列；SEQ ID NO 4公開了 hmfH的編碼序列。發(fā)明詳述在本說明書和附帯的權(quán)利要求書中，詞語“包含”和“包括”及其變體如“包含，，("comprises" , " comprising")、“包括，，("includes" and" including")應(yīng) 被解釋為開放式的。也就是說，在上下文允許時(shí)，這些詞語g在傳達(dá)可能包括未明確指出的其它元素或整體。冠詞“ー個(gè)”(“a”和“ an”)在本文中被用于表示一個(gè)或多于ー個(gè)(即ー個(gè)或至少ー個(gè))所述冠詞的語法客體。例如，“ー個(gè)元件”可表示一個(gè)元件或多于ー個(gè)元件。廣泛的反應(yīng)譜在本文中表示氧化還原酶能夠作為催化劑作用于許多不同的底物，例如HMF、HMF酸、HMF醇、糠醛、糠醇。區(qū)域特異性表示其僅氧化特定的C-原子。氧化還原酶多肽根據(jù)本發(fā)明的具有氧化還原酶活性的多肽包含SEQ ID NO :3中公開的氨基酸序列或SEQ ID NO 4的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，或其與SEQ ID NO 3中公開的序列具有至少45%的序列同一性的多肽變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與SEQ ID NO :4中所示核苷酸序列至少66%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更同源的基本同源的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，變體蛋白質(zhì)包含與SEQ ID N0:3中所示氨基酸序列至少45%、50%、55%、60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或更同源的基本同源的氨基酸序列。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是包括以下的多核苷酸(a) SEQ ID NO :4中公開的核苷酸序列；(b)與屬于SEQ ID NO :4的反向互補(bǔ)體的多核苷酸選擇性雜交的核苷酸序列；(c)與SEQ ID NO :4的核苷酸序列具有至少66%或更大序列同一'丨生的核苷酸序列；(d)如(a)、(b)或(c)中定義的核苷酸序列的片段，所述片段長度為至少約100個(gè)核苷酸；(e)由于遺傳密碼子而成為(a)、(b)、(c)或(d)任一中定義的序列的簡并物的序列；(f)屬于(a)、(b)、(C)、(d)或(e)中定義的核苷酸序列的反向互補(bǔ)體或編碼多肽的核苷酸序列；還涉及相關(guān)多肽。一個(gè)實(shí)施方案是包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體，其中GC含量可以是56%或更高，58%或更高，或58-65%。另ー個(gè)實(shí)施方案是并入多核苷酸序列或核酸構(gòu)建體的載體。術(shù)語“同源性”、“序列同一性”等等在本文可互換使用。就本發(fā)明的目的而言，在本文中定義為了測定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列共享的序列同一性程度，就最適比較的目的排列所述序列(例如為了與第二氨基酸或核酸序列最適比對，可以向第一氨基酸或核酸序列的序列中引入缺ロ)。這類排列可以在被比較的序列的全長上進(jìn)行?；蛘撸帕锌稍诟痰拈L度上進(jìn)行，例如在約20個(gè)、約50個(gè)、約100或更多個(gè)核酸/堿基或氨基酸上進(jìn)行。然后比較相應(yīng)的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粭l序列中的ー個(gè)位置被與第二序列中相應(yīng)位置上相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則所述分子在該位置上是相同的。序列之間共享的同一性程度典型地被表述為所述兩條序列之間的同一性百分比，并且是所述序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)(即％同一性=相同位置數(shù)/位置總數(shù)(即重疊位置)xlOO)。優(yōu)選地，被比較的兩條序列具有相同或基本相同的長度。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白下述事實(shí)可獲得若干種不同的計(jì)算機(jī)程序以測定兩條序列之間的同源性。例如，可以使用數(shù)學(xué)算法完成兩個(gè)序列之間的同一性百分比測定和序列比較。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用Needleman and Wunsch(J. Mol. Biol. (48)444-453 (1970))算法，使用 Blossom 62 矩陣或 PAM250 矩陣和 16、14、12、10、8、6 或 4 的缺ロ權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重測定兩條氨基酸序列之間的同一性百分比，所述算法已經(jīng)被整合進(jìn)GCG軟件包內(nèi)的GAP程序中(可得自http: //www. accelrys. com/products/ “)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道這些不同的參數(shù)會(huì)產(chǎn)生輕微差異的結(jié)果，但是使用不同的算法時(shí)兩條序列的整體同一性百分比不會(huì)被顯著改變。在另一實(shí)施方案中，使用Accelrys GCG軟件包(可得自http://www. accelrys.com/products/gcg/)中的 GAP 程序，使用 NWSgapdna. CMP 矩陣和 40、50、60、70 或 80 的缺ロ權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重測定兩條核苷酸序列之間的同一性百分比。在另ー實(shí)施方案中，使用 E. Meyers and W.Miller 算法(CABI0S，4 :11-17 (1989))，使用 PAM120 權(quán)重殘表、12的缺ロ長度罰分和4的缺ロ罰分測定兩條氨基酸或核苷酸序列的同一性百分比，所述算法已被整合進(jìn)ALIGN程序(2. O版)中(可得自http: / / veRa. !Rh. cnrs. fr/bin/aliRn-Ruess. crij。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列還可以被用作“查詢序列”，針對公開數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，以例如鑒定其它家族成員或相關(guān)序列。這類搜索可以使用Altschul，et al. (1990)J. Mol. Biol. 215 :403-10 的 BLASTN、BLASTP和 BLASTx程序(2. O 版)進(jìn)行。可以使用 BLASTN程序(評分=100，詞長=12)在核苷酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的氧化還原酶核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肂LASTx程序(評分=50，詞長=3)進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的氧化還原酶蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了就比較的目的獲得帶有缺ロ的比對，可以利用如Altschul et al.，(1997) Nucleic AcidsRes. 25(17) :3389-3402 中所述的Gapped BLAST。使用 BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例如BLASTx和BLASTn)的默認(rèn)參數(shù)。見http://www. ncbi. nlm. nih. rov/上的 National Center for Biotechnology Information 王頁。在本文中使用時(shí)，術(shù)語“選擇性雜交”("selectively hybridizing "、“hybridizes selectively”)和類似的術(shù)語_在描述用于雜交和洗漆的下述條件,在所述條件下彼此至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、更優(yōu)選地至少85%、進(jìn)一步更優(yōu)選地至少90%、優(yōu)選地至少95%、更優(yōu)選地至少98%或更優(yōu)選地至少99%彼此同源的核苷酸序列典型地保持為彼此雜交。也就是說，這類雜交序列可共享至少45%、至少50%、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、更優(yōu)選地至少85 %、進(jìn)ー步更優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95 %、更優(yōu)選地至少98 %或更優(yōu)選地至少99 %的序列同一性。這類雜交條件的一個(gè)優(yōu)選的非限制性例子是于約45°C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后于約50°C、優(yōu)選地約55°C、優(yōu)選地約60°C和進(jìn)ー步更優(yōu)選地約65°C下，在IX SSC,O. 1% SDS中洗滌一次或多次。高度嚴(yán)格條件包括例如于約68°C下在5x SSC/5x Denhardt' s溶液/L 0% SDS中雜交并于室溫下在O. 2x SSC/0. 1% SDS中洗滌?；蛘?，洗滌可以在42°C進(jìn)行。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對于嚴(yán)格和高度嚴(yán)格的雜交條件而言應(yīng)用何種條件。涉及這類條件的其它指示在該領(lǐng)域能夠容易地獲得，例如在Sambrook et al. , 1989, MolecularCloning, A Laboratory Manual, Cola Spring Harbor Press, N. Y.；和 Ausubel etal. (eds. ),1995,Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley & Sons,N. Y.)中。當(dāng)然，僅與多聚A序列(例如mRNA的3’末端多聚(A)束)或互補(bǔ)的T (或U)序 列段雜交的多核苷酸不應(yīng)被包括在被用干與本發(fā)明的核酸部分特異雜交的本發(fā)明多核苷酸內(nèi)，因?yàn)檫@類多核苷酸會(huì)與含有多聚(A)序列段或其互補(bǔ)體的任何核酸分子(例如實(shí)際上任何雙鏈的cDNA克隆)雜交?？梢砸冤`種典型的途徑，來篩選從其它生物(例如細(xì)菌，特別是來自Trichomaceae 科、例如來自 Burkholderia 屬的微生物，例如 Burkholderia phytofirmans)構(gòu)建的基因文庫。例如，可以通過Southern印跡分析，針對同源的氧化還原酶多核苷酸篩選Burkholderia菌株。檢測到根據(jù)本發(fā)明的同源DNA限制性片段后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技木，由來自適當(dāng)菌株的具有相同大小的染色體片段構(gòu)建基因文庫?；蛘?，如果微生物是真核生物，則可以通過Northern雜交鑒定氧化還原酶HmfH的mRNA轉(zhuǎn)錄本,并且在鑒定轉(zhuǎn)錄本后，可以使用分離自真核微生物的總RNA制備cDNA文庫。可以例如通過進(jìn)行PCR來分離同源的基因序列，所述PCR使用以本文所述核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的兩個(gè)簡并寡核苷酸引物池。用于反應(yīng)的模板可以是來自己知或懷疑表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的菌株的總?cè)旧wDNA0可以對PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆和測序，以確保被擴(kuò)增的序列代表了新的氧化還原酶核酸序列的序列或其功能等同物。或者,用于反應(yīng)的模板可以是通過反轉(zhuǎn)錄mRNA獲得的cDNA,所述mRNA從已知或懷疑表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的菌株中制備。可以對PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆和測序，以確保被擴(kuò)增的序列代表了新的氧化還原酶核酸序列的序列或其功能等同物。然后可以通過多種已知方法，使用PCR片段來分離全長cDNA克隆。例如，被擴(kuò)增的片段可以被標(biāo)記，并用于篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫?；蛘撸粯?biāo)記的片段可以被用于篩選基因組文庫。也可以用PCR技術(shù)來從其它生物中分離全長cDNA序列。例如，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟從合適的細(xì)胞或組織來源中分離RNA?？梢允褂脤Ρ粩U(kuò)增片段最5’端而言特異性的寡核苷酸引物，引導(dǎo)第一鏈合成，針對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后可以使用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)將得到的RNA/DNA雜交體“加尾”(例如用鳥嘌呤)，可以用RNase H消化所述雜交體，然后(例如用多聚-C引物)引物引導(dǎo)第二鏈合成。因此，被擴(kuò)增片段上游的cDNA序列可以容易地被分離。有用的克隆策略的綜述，參閱例如上文 Sambrook et al.;和上文的 Ausubel et al.。本發(fā)明的另一方面涉及包含編碼氧化還原酶蛋白質(zhì)或其功能性等同物的本發(fā)明多核苷酸的載體，包括克隆和表達(dá)載體，還涉及在例如本發(fā)明多肽發(fā)生表達(dá)的條件下，在合適的宿主細(xì)胞中培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染這類載體的方法。本文使用的術(shù)語“載體”指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接的另ー核酸的核酸分子。本發(fā)明的多核苷酸可以被摻入重組的可復(fù)制載體中，例如克隆或表達(dá)載體中。載體可被用于在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。因此在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如下制造本發(fā)明多核苷酸的方法將本發(fā)明的多核苷酸引入可復(fù)制載體中，將所述載體引入相容的宿主細(xì)胞中，并在使得所述載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。載體可以從宿主細(xì)胞中被回收。合適的宿主細(xì)胞在下文討論。其中插入本發(fā)明表達(dá)盒或多核苷酸的載體可以是能夠便利地進(jìn)行重組DNA操作 的任何載體，并且所述載體的選擇通常應(yīng)取決于要引入它的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的載體可以是自主復(fù)制載體，即顯示為染色體外實(shí)體的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒?；蛘咻d體可以是被引入宿主細(xì)胞中后被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，并與整合了它的染色體一起復(fù)制的載體?！N類型的載體是“質(zhì)?！保|(zhì)粒是指其中可以連接其它DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另ー種類型的載體是病毒載體，其中其它DNA區(qū)段可以被連接進(jìn)病毒基因組中。某些載體在它們被引入的宿主細(xì)胞中能夠自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加體哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加體哺乳動(dòng)物載體)在引入宿主細(xì)胞時(shí)被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨宿主細(xì)胞的基因組一起被復(fù)制。另外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們可操作地連接的基因的表達(dá)。這類載體在本文中被稱作“表達(dá)載體”。一般而言，重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體通常是以質(zhì)粒的形式存在的。術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”在本文中可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明g在包括這類表達(dá)載體的起等同作用的其它形式，如粘粒、病毒載體(例如復(fù)制缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)和噬菌體載體。根據(jù)本發(fā)明的載體可以體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。本發(fā)明的載體可包含兩種或更多，例如三種、四種或五種本發(fā)明的多核苷酸，例如用于過表達(dá)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體以適合核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式包含本發(fā)明的核酸，這意味著重組表達(dá)載體含有一個(gè)或多個(gè)與待表達(dá)的核酸序列可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，以要用于表達(dá)的宿主細(xì)胞為基礎(chǔ)選擇所述調(diào)節(jié)序列。在載體例如表達(dá)載體中，“可操作地連接” g在表示感興趣的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許核苷酸序列表達(dá)(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯體系中或當(dāng)載體被引入宿主細(xì)胞中時(shí)在宿主細(xì)胞中)的方式連接，即術(shù)語“可操作地連接”是指ー種連接，其中所述組分處于允許它們以其預(yù)期方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。與編碼序列“可操作地連接”的調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其它表達(dá)調(diào)節(jié)信號以下述方式放置在與所述控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)所述編碼序列的表達(dá)；或者所述調(diào)節(jié)序列被布置為使得它們與其預(yù)期目的一致地發(fā)揮功能，例如轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子處開始并通過編碼多肽的DNA序列繼續(xù)。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”或“控制序列” g在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。此類調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel ；Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)中。術(shù)語調(diào)節(jié)或控制序列包括在許多類型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達(dá)的那些序列，或僅在某宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的那些序列(例如組織特異性調(diào)節(jié)序列)。針對指定宿主細(xì)胞的載體或表達(dá)構(gòu)建體因此可包含以下元件，所述元件以相對于編碼第一發(fā)明的多肽的序列的編碼鏈從5’ -端到3’ -端的連續(xù)順序彼此可操作地連接
(i)能夠在給定的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列；(2)任選地，能夠指導(dǎo)多肽從給定的宿主細(xì)胞分泌進(jìn)培養(yǎng)基中的信號序列；(3)本發(fā)明的DNA序列，其編碼成熟和優(yōu)選地活性形式的、具有纖維ニ糖水解酶活性的多肽；和優(yōu)選地還有(4)能夠終 止編碼多肽的核苷酸序列下游轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(終止子)。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的下游可以是含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(例如終止子)的3’非翻譯區(qū)。終止子的起點(diǎn)較不關(guān)鍵。終止子可以例如對編碼多肽的DNA序列而言是天然的。然而，優(yōu)選地在酵母宿主細(xì)胞中使用酵母終止子并在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用絲狀真菌終止子。更優(yōu)選地，終止子對宿主細(xì)胞(其中要表達(dá)編碼多肽的核苷酸序列)而言是內(nèi)源的。在被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中，可存在用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建體所表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分應(yīng)當(dāng)包括位于要翻譯的多肽起點(diǎn)處的翻譯起始AUG和適當(dāng)?shù)匚挥诮Y(jié)尾處的終止密碼子。本發(fā)明多核苷酸的增強(qiáng)的表達(dá)也可以通過對異源調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子、分泌前導(dǎo)肽和/或終止子區(qū))的選擇來實(shí)現(xiàn)，所述異源調(diào)節(jié)區(qū)可發(fā)揮以下作用提高表達(dá)宿主對感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和需要時(shí)的分泌水平，和/或提供本發(fā)明多肽表達(dá)的誘導(dǎo)型控制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以以下述因素為基礎(chǔ)，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等。本發(fā)明的載體(例如表達(dá)載體)可以被引入宿主細(xì)胞中，從而生產(chǎn)由本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽(例如氧化還原酶蛋白質(zhì)、氧化還原酶蛋白質(zhì)的突變體形式，其片段、變體或功能等同物、融合蛋白等)。本發(fā)明的載體(例如重組表達(dá)載體)可以被設(shè)計(jì)為用于在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中表達(dá)氧化還原酶蛋白質(zhì)。例如，氧化還原酶蛋白質(zhì)可以在細(xì)菌細(xì)胞如E. coli、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、絲狀真菌、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。合適的宿王細(xì)胞在Goeddel,Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185,AcademicPress, San Diego, CA(1990)中進(jìn)ー步討論。適當(dāng)宿主的代表性例子在下文中描述。用于上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。如上文所公開的，術(shù)語“控制序列”或“調(diào)節(jié)序列”在本文中被定義為至少包括對多肽表達(dá)而言必需和/或有利地任何組件。任何控制序列對于編碼多肽的本發(fā)明核酸序列而言可以是天然的或外源的。此類控制序列可包括但不限于啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、最適翻譯起始序列(如Kozak，1991，J. Biol. Chem. 266 :19867-19870中所述)、分泌信號序列、原-月太序列、多聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄終止子?？刂菩蛄兄辽俚湫偷匕▎?dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的微生物是下述微生物其中引入了ー種或多種DNA片段，使得被引入的分子在生長的培養(yǎng)物中被保持、復(fù)制并分離。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化可歸因于多個(gè)或單一的染色體整合，或通過染色體外元件例如質(zhì)粒載體來實(shí)現(xiàn)。質(zhì)粒載體能夠指導(dǎo)具體DNA片段所編碼的多肽的表達(dá)。表達(dá)可以是組成型的，或由誘導(dǎo)型(或阻抑型)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)，所述啟動(dòng)子值得能夠高水平地轉(zhuǎn)錄編碼特定多肽的與功能相關(guān)的DNA片段。氧化還原酶的分離氧化還原酶或表達(dá)氧化還原酶的DNA材料可從生物中分離，優(yōu)選地從表達(dá)氧化還原酶的微生物中分離。優(yōu)選地，所述微生物能夠使用HMF，但是這不是必需的。微生物優(yōu)選地選自由5ロ！'組成的組Cupriavidus> BurkhoIderia> Bradynrizobium> Methyiobacterium ；しupriavidus basisliensis、Burkhoideria pnytofirmans> Bradyhrizobium japonicum、Methylobacterium radiotolerans、Cupriavidus basisliensis HMF14、Burkholderia phytofirmans PsJN、Bradyhrizobium japonicum USDAl10、Methylobacteriumradiotolerans JCM2831。本發(fā)明中有用的最優(yōu)選的氧化還原酶使用HMF,并且是分離自本文中Cupriavidusbasilensis HMF14的氧化還原酶,所述Cupriavidus basilensis HMF14根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約被保藏于DSMZ Cupriavidus basilensis HMF14 =DSM 22875，保藏日 2009 年 8 月 19 日，保藏人 TNO，Schoemakerstraat 97，2628VK Delft,荷蘭。因此我們分離了利用HMF的細(xì)菌Cupriavidus basilensis菌株HMF14，并鑒定了涉及HMF降解途徑的基因。所述基因之一(在本文中被定義為hmfH)編碼了 579個(gè)氨基酸、62kDa的FAD-依賴型氧化還原酶，發(fā)現(xiàn)所述酶氧化糠醇、糠醛、HMF和5-羥甲基-糠酸。這些分子中C2和C5上的醇/醛基團(tuán)被氧化，而不需要額外的編碼還原酶的核酸構(gòu)建體，盡管此類活性的存在可以是有利的(見圖I)。本發(fā)明因此提供了編碼下述多肽的多核苷酸，所述多肽例如是具有氧化還原酶(EC I. 1+EC I. 2活性)活性的酶。酶在本文中是多肽的子類。氧化反應(yīng)氧化反應(yīng)在本文中是存在本發(fā)明的氧化還原酶和ー種或多種輔酶(下文討論)時(shí)氧化劑與呋喃化合物的ー種或多種反應(yīng)。氧化反應(yīng)可包含得到產(chǎn)物的一個(gè)氧化反應(yīng)步驟(例如HMF-酸成為FDCA的氧化)?；蛘咂淇砂嘤讴`個(gè)反應(yīng)步驟，每個(gè)步驟得到ー種中間產(chǎn)物，其中最后的中間產(chǎn)物是終產(chǎn)物(例如HMF氧化成FDCA)。氧化反應(yīng)的例子在圖I中
をA屮
S ロ山O一種氧化反應(yīng)是2，5-呋喃ニ羧酸(FDCA)的生產(chǎn)，其中FDCA的一種或多種前體在存在氧化還原酶催化劑和ー種或多種輔酶時(shí)通過與氧化劑反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成FDCA，其中所述氧化還原酶催化劑包括根據(jù)本發(fā)明的多肽。FDCA的呋喃前體可選自由5-羥甲基糠醛(HMF)、2，5- ニ羥甲基呋喃(HMF醇)和5-羥甲基-2-呋喃羧酸(HMF酸)組成的組，優(yōu)選地呋喃前體是HMF。HMF可以常規(guī)方式，通過在存在酸時(shí)加熱一種或多種己糖得到。己糖可得自生物質(zhì)。氧化反應(yīng)也可以是用于生產(chǎn)5-羥甲基-2-呋喃羧酸(HMF酸)的方法，其中HMF酸的一種或多種呋喃前體通過在存在氧化還原酶催化劑和ー種或多種輔酶時(shí)與氧化劑反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成HMF酸，其中所述氧化還原酶催化劑包括本發(fā)明的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，HMF酸的呋喃前體選自5-羥甲基糠醛(HMF)和2，5-ニ羥甲基呋喃(HMF醇)的組。其他氧化方法是可能的。氧化反應(yīng)優(yōu)選地在相對溫和的溫度即10-80°C下進(jìn)行，更優(yōu)選地20-45°C下，最優(yōu)選地25-40°C左右。反應(yīng)期間的pH優(yōu)選地為pH 3到8，更優(yōu)選地在pH 7左右。使用大氣氧或純氧的反應(yīng)時(shí)間為6-18小時(shí)，優(yōu)選地所述酶在更長的時(shí)間里有反應(yīng)性。反應(yīng)器可以是任何合適的(充氣)生物反應(yīng)器。其可以分批、連續(xù)或優(yōu)選地以分批進(jìn)料的方式操作?？梢酝ㄟ^冷卻/再結(jié)晶并分離結(jié)晶的氧化產(chǎn)物(例如結(jié)晶的FDCA)，從反應(yīng)混合物中回收氧化產(chǎn)物例如FDCA、HMF酸等等。然而，其他回收方法是合適的，例如但不限于酸沉淀和溶劑萃取，如本領(lǐng)域所已知的。任選地，反應(yīng)在存在輔酶時(shí)發(fā)生。輔酶可以是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和/ 或黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和/或卩比咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinolone, PQQ)。在本發(fā)明的氧化反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)與脫氫酶活性的協(xié)同效應(yīng)，例如在下述細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源脫氫活性，氧化反應(yīng)發(fā)生在或存在于所述細(xì)胞的細(xì)胞提取物中。用于由ー種或多種單體生產(chǎn)聚合物的方法，其中單體之ー是FDCA。氧化劑根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)期間的氧化劑可以是任何氧化劑，優(yōu)選地是氧。氧的最經(jīng)濟(jì)的來源是空氣。這是有利的，因?yàn)榭諝馊菀椎匾粤愠杀镜米源髿?，無毒，并且在反應(yīng)后無需去除。或者可使用分子氧釋放系統(tǒng)。氧生成系統(tǒng)原則上可以選自本領(lǐng)域已公開的各種氧生成系統(tǒng)。例如，可以使用反應(yīng)混合物中已存在的過氧化氫酶，由過氧化氫產(chǎn)生氧。呋喃化合物呋喃化合物在本文中被理解為具有呋喃基團(tuán)的任何化合物，其可以被氧化成2，5_呋喃ニ羧酸或其前體。優(yōu)選的呋喃化合物包括羥甲基糠醛(HMF)、羥甲基呋喃羧酸(HMF酸)、2，5_ ニ羥甲基呋喃(HMF醇)。呋喃環(huán)或其任何可取代的側(cè)基可以在呋喃環(huán)中任何可用的位置上被例如OH、Cl-ClO烷基、烷基、芳基或RO-醚部分，包括環(huán)狀基團(tuán)取代。氧化還原酶的表達(dá)不管用于表達(dá)酶的精確機(jī)制如何，可以想到通過本領(lǐng)域已知的方法將編碼這些酶的基因引入另一宿主細(xì)胞中來轉(zhuǎn)移此類表達(dá)。在本文中定義的遺傳元件包括具有針對產(chǎn)物的可表達(dá)編碼序列的核酸(通常為DNA或RNA)，所述產(chǎn)物例如為蛋白質(zhì)，尤其是酶，脫輔蛋白質(zhì)或反義RNA (其表達(dá)或調(diào)控相關(guān)酶的表達(dá))。被表達(dá)的蛋白質(zhì)可發(fā)揮酶的作用，阻抑或去阻抑酶活性或控制酶的表達(dá)。編碼這些可表達(dá)序列的重組DNA可以是染色體的(通過例如同源重組整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體中)或染色體外的(例如由ー種或多種質(zhì)粒、粘?；蚰軌蜃晕覐?fù)制的其他載體載有)。應(yīng)當(dāng)理解，用于轉(zhuǎn)化根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞的重組DNA除了結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子以外，還可包含表達(dá)控制序列，包括啟動(dòng)子、阻抑子和增強(qiáng)子，它們發(fā)揮控制針對蛋白質(zhì)、脫輔蛋白質(zhì)或反義RNA的編碼序列的表達(dá)或去阻抑的作用。例如，此類控制序列可以被插入野生型宿主細(xì)胞中，以促進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中已經(jīng)編碼的選定酶的過表達(dá)，或者它們可以被用于控制染色體外編碼的酶的合成。可以通過任何手段將重組的DNA引入宿主細(xì)胞中，所述手段包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、酵母人工染色體或介導(dǎo)遺傳元件轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞中的其他載體。這些載體可包含復(fù)制起點(diǎn)，連同控制載體復(fù)制的順式作用控制元件以及載體所載有的遺傳元件?？蛇x擇標(biāo)記物可存在于載體上，以幫助鑒定其中已引入遺傳元件的宿主細(xì)胞。用于將遺傳元件引入宿主細(xì)胞中的手段(例如克隆)是技術(shù)人員公知的?？梢岳萌旧w外多拷貝質(zhì)粒載體來插入根據(jù)本發(fā)明的遺傳元件。將質(zhì)粒承載的遺傳元件引入宿主細(xì)胞涉及最初用限制性酶切割質(zhì)粒載體，之后連接質(zhì)粒和編碼根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)酶物類的遺傳元件。將連接的重組質(zhì)粒再環(huán)化之后，利用感染(例如包裝在噬菌體λ中)或質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的其他機(jī)制(例如電穿孔、顯微注射等等)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞中。適合將遺傳元件插入宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒是技術(shù)人員公知的。其他基因克隆方法包括但不限于將遺傳材料直接整合進(jìn)染色體中。這可以通過多種手段來實(shí)現(xiàn)，包括在側(cè)翼是宿主染色體的同源DNA序列的非復(fù)制型質(zhì)粒上克隆本文所述的遺傳元件；將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主后，可以通過DNA重組將遺傳元件引入染色體中。如果整合型DNA片段含有可選擇標(biāo)記物例如抗生素抗性，則能夠回收此類重組菌株。或者， 可以將遺傳元件直接引入宿主細(xì)胞的染色體中，而不使用非復(fù)制型質(zhì)粒。這可以通過合成生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的遺傳元件的DNA片段來實(shí)現(xiàn)，所述DNA片段也含有宿主染色體的同源DNA序列。此外，如果這些合成的DNA片段也含有可選擇標(biāo)記物，則遺傳元件可以被插入宿主染色體中。宿主細(xì)胞本發(fā)明的另ー實(shí)施方案是包含根據(jù)本發(fā)明的多肽、多核苷酸、核酸構(gòu)建體或載體的細(xì)胞。宿主細(xì)胞是其中可以合適地表達(dá)多肽、多核苷酸、核酸構(gòu)建體或載體的細(xì)胞。氧化還原酶可以在宿主細(xì)胞中有利地表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是任何宿主細(xì)胞。細(xì)胞可以是原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。在此類細(xì)胞中，一個(gè)或多個(gè)基因可以被缺失、敲除或完全或部分打斷，其中任選地ー個(gè)或多個(gè)基因編碼蛋白酶。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞或藻類細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、COS細(xì)胞、293細(xì)胞、PerC6細(xì)胞和雜交瘤。優(yōu)選的昆蟲細(xì)胞包括例如Sf9和SH2細(xì)胞及其衍生物。更優(yōu)選地，真核細(xì)胞是真菌細(xì)胞，即酵母細(xì)胞，例如Candida、Hansenuia、Kluyveromyces、Pichia> baccharomyces> Schizosaccharomyces 5 Yarrowia1 株° 更優(yōu)選地來自 Kluyveromyces lactis、S. cerevisiae、Hansenula polymorpha、Yarrowia lipolytica和Pichia pastoris,或絲狀真菌細(xì)胞。最優(yōu)選地,真核細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括(如 Hawksworth et al. , In, Ainsworth and Bisby ' sDictionary of The Fungi,8th edition,1995, CAB International, UniversityPress, Cambridge, UK所定義的)Eumycota和Oomycota亞門的所有絲狀形式。絲狀真菌的特征是由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復(fù)合多糖組成的菌絲壁。營養(yǎng)生長通過菌絲伸長進(jìn)行，并且碳代謝是專性需氧的。絲狀真菌菌株包括但不限于 Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Fi Iibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、MyceIiophthora、Neocal丄imastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium 和Trichoderma 的菌株。優(yōu)選的絲狀真菌細(xì)胞屬于Aspergillus、Chrysosporium、Penicillium、Taiaromyces 或 Trichoaerma ノ禹的矛中，最優(yōu)選地屬亍 Aspergillus niger、Aspergillusawamoriλ Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillus fumigatus、Talaromyces emersonii、Aspergillus oryzae、しhrysosporium lucknowense、Trichodermareesei或Penicillium chrysogenum的種。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是Aspergillus宿主細(xì)胞時(shí)，宿主細(xì)胞優(yōu)選地是CBS513. 88、CBS124. 903或其衍生物。根據(jù)另ー個(gè)實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。優(yōu)選地，原核宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。術(shù)語“細(xì)菌細(xì)胞”包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性微生物。合適的細(xì)菌可選自例5ロ Escherichia、Anabaena、CaulobacterΛ bluconobacter、RhodobacterΛ PseudomonasΛParacoccus、Bacillus、BrevibacteriumΛ CorynebacteriumΛ Rhizobium(^inorhizoDium)、Flavobacteriumλ Klebsiella、EnterobacterΛ Lactobacillus、LactococcusΛMethy lobacter ium λ Staphylococcus或Streptomyces。優(yōu)選地，細(xì)菌細(xì)胞選自由以下組成 的組B. subtilis、B. amyloiiquefaciens、B. licheniformis、B. puntis、B. megaterium、B. halodurans、B. pumilus、Gluconobacter oxydans、Caulobacter crescentusCB 15、Methylobacterium extorquens、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonaszeaxanthinifaciens、 Pseudomonas putida、 Pseudomonas putida S12、 Paracoccusdenitrificans、E. coli、C.glutamicum、Staphylococcus carnosus、Streptomyceslividans、Sinorhizobium melioti 和 Rhizobium radiobacter。絲狀真菌的若干菌株是公眾能夠容易地從大量培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)例如AmericanType Culture Col iection (ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)、 Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)和Agricultural Research Service Patent Culture Collection， Northern RegionalResearch Center (NRRL)獲得的:例如菌株 Aspergillus niger CBS 513. 88、Aspergillusoryzae ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892，P. chrysogenum CBS 455. 95，Penicillium citrinum ATCC 38065,Penici11iumchrysogenum P2， Talaromyces emersonii CBS 124.902， Acremonium chrysogenum ATCC36225 或 ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 或 ATCC 56765 或 ATCC 26921，Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense ATCC44006。也可以使用其衍生物。根據(jù)另ー個(gè)實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。優(yōu)選地，原核宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。術(shù)語“細(xì)菌細(xì)胞”包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性微生物。合適的細(xì)菌可選自例如 Escherichia、Anabaena、Caulobacter> (aluconobacter、Rhodobacter> Pseudomonas>Paracoccus、Bacillus、BreviDacterium> しorynebacterium、Rhizobium(binorhizooium)、Flavobacteriumλ Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、LactococcusΛMethy lobacter ium λ Staphylococcus 或 Streptomyces。優(yōu)選地，細(xì)菌細(xì)胞選自由以下組成的組B. subtilis、B. amyloliquifaciens、B. licheniformis、B. puntis、B. megaterium、B. haiodurans、B. pumilus、G. oxydans、 Caulobacter crescentus CB15、Methylobacterium extorquens、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonas putida、Paracoccus zeaxanthinifaciens、Paracoccus denitrif icans、E. coli、C. glutamicum、Staphylococcus carnosus、 Streptomyces lividans、 Sinorhizobium melioti 和Rhizobium radiobacter。對根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的化合物的特定用途而言，宿主細(xì)胞的選擇可以根據(jù)此類用途來進(jìn)行。例如要在食品應(yīng)用中使用根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的化合物時(shí)，宿主細(xì)胞可選自食品級生物例如Saccharomyces cerevisiae。特定的用途包括但不限于，食品、(動(dòng)物)飼料、藥物、農(nóng)業(yè)例如作物保護(hù)，和/或個(gè)人護(hù)理應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于制備具有氧化還原酶活性的多肽的方法和通過所述方法可獲得的多肽，所述方法包括在允許所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞，并任選地回收所表達(dá)的多肽。原料 天然富含果聚糖(fructan)的農(nóng)作物(例如洋姜(topinambur)或菊苣根(chicory roots))可以通過常規(guī)(組合的)水解和熱化學(xué)加工被轉(zhuǎn)化成富含HMF的原料。由果糖產(chǎn)生HMF的技術(shù)是被廣泛接受并且強(qiáng)效的。也可以利用富含葡萄糖的原料，但是HMF的熱化學(xué)形成使用果糖時(shí)進(jìn)行得更加高效。因此，可以包括額外的酶促步驟，使用葡萄糖異構(gòu)酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化成果糖。后一過程在由水解淀粉生產(chǎn)高果糖玉米糖漿(HFCS)的食品エ業(yè)中是被廣泛接受的。為了避免與食品應(yīng)用競爭，木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物會(huì)是用于生產(chǎn)HMF/FDCA的優(yōu)選的原料。生物轉(zhuǎn)化為了將HMF生物轉(zhuǎn)化成FDCA,使用表達(dá)前文所述的Cupriavidus basilensis HMF氧化還原酶的強(qiáng)效全細(xì)胞生物催化劑(游離細(xì)胞或固定的細(xì)胞)。在所述方法中全細(xì)胞生物催化劑具有由于酶催化劑的若干優(yōu)點(diǎn)=HMF氧化還原酶被保護(hù)免受高度反應(yīng)性底物的化學(xué)失活，并且宿主原生的脫氫酶能夠在由HMF產(chǎn)生(可能的)相應(yīng)一元酸的最初兩個(gè)氧化步驟中幫助HMF氧化還原酶，所述一元酸隨后被HmfH轉(zhuǎn)化成ニ酸。優(yōu)選地，可能需要額外的手段來確保輔因子再生。全細(xì)胞生物催化劑應(yīng)當(dāng)允許HMF進(jìn)料流的最小加工，即優(yōu)選地耐受低pH、高T和原料水解/熱化學(xué)轉(zhuǎn)化中產(chǎn)生的有毒化合物(其中有底物)?？紤]到對多種化學(xué)應(yīng)激源(stressor)的耐受、相對較寬的pH范圍和原生脫氫酶的存在，Pseudomonasputida S12可以滿足合適宿主生物的資格，所述原生脫氫酶幫助HMF氧化還原酶導(dǎo)致更高效的HMF到FDCA的生物轉(zhuǎn)化。作為全細(xì)胞生物催化劑的替代方式，可以通過與全細(xì)胞生物催化劑相似的方式單獨(dú)或作為酶混合物使用細(xì)胞裂解物、經(jīng)純化的酶、或經(jīng)固定的酶。產(chǎn)物和生物質(zhì)回收生物轉(zhuǎn)化后，可以通過公認(rèn)的方法將細(xì)胞從發(fā)酵液中分離并再使用?？梢酝ㄟ^酸沉淀從無細(xì)胞發(fā)酵液中回收FDCA，并在提高的溫度下重溶于合適的有機(jī)溶劑中。溶解后可以通過酸沉淀和溶劑萃取或本領(lǐng)域已知的其他純化方法，以ニ酸形式以高純度回收FDCA，如果需要的話。FDCA的用途FDCA可在聚酯的生產(chǎn)中被用作對苯ニ酸酯的替代物。其也可以被用作大量不同有價(jià)值化合物的底物。例如其是用于生產(chǎn)琥珀酸、2，5-雙(氨甲基)-四氫呋喃、2，5_ ニ羥甲基-四氫呋喃、2，5-ニ羥甲基呋喃和2，5-呋喃ニ甲醛的已知底物。FDCA可用于涂層例如醇酸樹脂和熱塑性涂層的生產(chǎn)。其也可被用作生物燃料中的ニ甲苯等同物或用作溶剤。FDCA可以被酯化，所述酯可被用作增塑劑。其可以被轉(zhuǎn)化成其ニ醇，所述ニ醇可被用于類PET聚酯和聚氨酯中。另外，其可以被轉(zhuǎn)化成其ニ胺，所述ニ胺可以被用作擴(kuò)鏈劑，并且所述ニ胺可以被轉(zhuǎn)化成ニ異氰酸酷，所述ニ異氰酸酯可用于聚氨酯的生產(chǎn)。通過根據(jù)本發(fā)明的方法，可通過生物轉(zhuǎn)化，由生物質(zhì)(包括木質(zhì)纖維素生物質(zhì))通過生物轉(zhuǎn)化制備FDCA和由FDCA制備的產(chǎn)品。
實(shí)施例一般方法菌株和質(zhì)粒于2009 年 8 月 19 日保藏于 DSMZ 的 Cupriavidus basilensis HMF14 Cupriavidus basilensis HMF14 = DSM 22875是能夠使用呋喃作為卩隹一碳源的土壤分離物。使用Pseudomonas putida S12 (ATCC 700801)作為用于表達(dá)HMF氧化還原酶的宿主。使用Escherichia coli DH5 a (Invitrogen)用于一般克隆的目的。使用源自pUCP22的E. coli-P. putida穿梭質(zhì)粒pJT’mcs(未公開)，用于在組成型tac啟動(dòng)子的控制下表達(dá) HMF氧化還原酶。為了在E. coli中復(fù)制，使用pUC復(fù)制起點(diǎn)；為了在P. putida中復(fù)制，使用pR01600復(fù)制起點(diǎn)。hmfH基因的表達(dá)由組成型tac啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。使用β -內(nèi)酰胺酶標(biāo)記物基因(bla)在E. coli中進(jìn)行抗生素選擇(氨芐西林抗性)。為了在P. putida中進(jìn)行抗生素選擇，使用慶大霉素こ酰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記物基因(gmR)。圖2中給出了 HmfH表達(dá)載體pJT’ hmfH的質(zhì)粒圖譜。Ptac’，tac啟動(dòng)子；rep,寬泛宿主范圍的復(fù)制起點(diǎn)；gmR，慶大霉素抗性基因；bla，β -內(nèi)酰胺酶；pUC ori，針對E. coli的復(fù)制起點(diǎn)。培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件使用礦物鹽培養(yǎng)基(MM)作為定義的培養(yǎng)基，麗(每升去礦物質(zhì)水)含有以下3. 888的1(2即04，1.638的似％ 04，2· Og 的(NH4)2SO4,0. Ig 的 MgCl2 ·6Η20，IOmg 的 EDTA, 2mg 的 ZnSO4 · 7H20, Img 的 CaCl2 · 2H20，5mg 的 FeSO4 · 7H20，0. 2mg 的Na2MoO4 · 2Η20，0· 2mg 的 CuSO4 · 5Η20，0· 4mg 的 CoCl2 · 6H20,和 Img 的 MnCl2 · 2H20,根據(jù)說明補(bǔ)充碳源。使用Luria發(fā)酵液(L-發(fā)酵液10g/l Bacto胰胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l NaCl)作為用于 P. putida S12 和衍生菌株、C. basilensis HMF14 和 E.coliDH5a和衍生物繁殖的完全培養(yǎng)基。用2% (w/v)瓊脂(Difco)固化固體L-發(fā)酵液。對分批進(jìn)料實(shí)驗(yàn)而言，在具有以下組成的11經(jīng)改造的礦物鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行初始批次階段3. 88g 的 K2HPO4'I. 63g ^ NaH2PO4,2. Og 的(NH4)2SO4^O. 2g 的 MgCl2 .6H20、20mg 的EDTA、4mg 的 ZnSO4 · 7H20、2mg 的 CaCl2 · 2H20、10mg 的 FeSO4 · 7H20、0. 4mg 的 Na2MoO4 · 2H20、O. 4mg 的 CuSO4 · 5Η20、0· 8mg 的 CoCl2 · 6H20、2mg 的 MnCl2 · 2H20、10mg/L 慶大霉素和 IOOmM甘油。耗盡初始甘油后，開始并控制進(jìn)料，以允許最大生長的同時(shí)保持甘油是培養(yǎng)物中的限制性底物。進(jìn)料溶液(每升)含有:368. 4g甘油和10g/L MgCl2. 6H20和12. 6g/L HMF?？股蒯槍. coli添加氨節(jié)西林(amp)至100 μ r/hiL·針對P. putida S12添加慶大霉素(gm)至Luria發(fā)酵液中30 μ g/ml,礦物鹽培養(yǎng)基中10 μ g/ml?？股刭徸許igma-Aldrich0
培養(yǎng)在30°C下培養(yǎng) P. putida 和 C. basilensis。在 37°C下培養(yǎng) E. coli。在水平搖床培養(yǎng)箱中，在Boston瓶(Alltech applied sciences BV ;Breda,荷蘭)中進(jìn)行MM上的搖瓶實(shí)驗(yàn)。在水平搖床培養(yǎng)箱中，在帶有棉塞的Erlenmeyer搖瓶中進(jìn)行L-發(fā)酵液上的搖瓶實(shí)驗(yàn)。使用BioFlollO控制器在I升發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific)中進(jìn)行分批進(jìn)料實(shí)驗(yàn)。在補(bǔ)充有40mM甘油和2mM葡萄糖的IOOml MM中，用來自過夜預(yù)培養(yǎng)物的經(jīng)洗滌的細(xì)胞起始初始的分批發(fā)酵。初始的攪拌速度被設(shè)置為200rpm,使用M+W Instruments D-5111質(zhì)量流控制器以I升/分鐘對頂空供應(yīng)空氣。用InPro型6900探針(Mettler Toledo BV ；Tiel，荷蘭)持續(xù)監(jiān)測溶解的氧張カ(DO)，并通過自動(dòng)化調(diào)節(jié)攪拌速度至最大IOOOrpm將其維持在30%的空氣飽和度。達(dá)到最大攪拌速度后，用O. 2升/分鐘流速的經(jīng)純化的氧代替空氣，并將最大攪拌速度設(shè)置為800rpm。在初始批次階段期間，通過自動(dòng)化添加25% NH4OH將PH維持在7. 0，在進(jìn)料階段期間通過自動(dòng)化添加IOmM NaOH使pH保持恒定。溫度保持在30。。。測定&分析方法使用平底96-孔微量培養(yǎng)板(Greiner)，使用Biowave細(xì)胞密度 計(jì)(WPA Ltd)或μ Quant MQX200通用微量培養(yǎng)板分光光度計(jì)(Biotek)，通過測量600nm處的光密度(OD6J，測定細(xì)菌培養(yǎng)物的細(xì)胞干重(CDW)含量。對P. putida而言，I. O的0D_對應(yīng)于 O. 56g CDff/L (Biowave)或 I. 4g CDW/L ( μ Quant)。HPLC分析:使用設(shè)定于230nm的ニ極管陣列檢測器，通過RP-HPLC(Agilent 1100系統(tǒng))分析FDCA、HMF、HMF-醇和HMF-酸。使用的柱是在25°C下操作的Zorbax Eclipse
XDB-C8(孔徑80人，表面積 180m2/g，Agilent)。以 I. 2ml/ 分鐘的流速使用 20mM KH2PO4(pH
2或pH 6)中含有1%こ腈的こ腈梯度作為洗脫液，所述こ腈梯度在3. 5分鐘內(nèi)從O提高至5%、在2. 5分鐘內(nèi)從5%提高到40%。細(xì)胞提取物的制備:使用補(bǔ)充有12mM琥珀酸鹽(C. basilensis HMF14,OD600 ^ I. 5)或20mM葡萄糖(P. putida S12, OD600 ^ 4)的MM，由50-ml晚期指數(shù)生長階段培養(yǎng)物制備表達(dá)HMF氧化還原酶的P. putida S12轉(zhuǎn)化體或野生型C. basilensis HMF14的細(xì)胞提取物。通過離心收獲培養(yǎng)物，并重懸于3ml測定緩沖液中。使用Branson超聲波儀(脈沖模式的微尖端(micro tip),輸出設(shè)定為3,工作循環(huán)百分比設(shè)定為40% ;3個(gè)超聲處理循環(huán)45s 脈沖和 15s 暫停)或 Sonics Vibra-Cell (Sonics&Materials, USA) (5mm 維形微尖端；脈沖模式設(shè)定為I分鐘(0，5s脈沖，2秒暫停)，通過超聲處理破壞細(xì)胞。超聲處理后，于4°C下通過在8228Xg離心3分鐘去除碎片。使用F1DlO凝膠過濾柱(GE healthcare)使上清液脫鹽，并用作HMF氧化還原酶測定的細(xì)胞提取物。使用Bradford試劑(Sigma-Aldrich)測量蛋白質(zhì)濃度。HMF氧化還原酶測定在表達(dá)C. basilensis HMF14 HMF氧化還原酶的P. putidaS12轉(zhuǎn)化體或野生型C. basilensis HMF14的細(xì)胞提取物中進(jìn)行HMF氧化還原酶測定。使用在hmfH基因中帶有轉(zhuǎn)座子插入的C. basilensis HMF14突變體或野生型P. putida S12作為陰性對照。在30°C下充氧的條件下，用糠醛、糠醇、HMF或HMF酸孵育細(xì)胞提取物。反應(yīng)混合物含有Iml細(xì)胞提取物、976 μ I氧飽和的MM、20 μ I 2mM黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)溶液和4 μ I O. 5Μ底物(糠醛、糠醇、HMF或HMF酸)儲液。以設(shè)定的間隔采樣，通過添加HCl至IM的終濃度，立即終止反應(yīng)。通過HPLC測定樣品中的底物和產(chǎn)物濃度。作為氧耗盡的對照，通過連續(xù)的氮?dú)饬魇狗磻?yīng)混合物的不同組分耗盡氧，并在氮?dú)庵性趲в邢鹌と挠许斂盏墓苤蟹跤嗤姆磻?yīng)混合物?；瘜W(xué)品FDCA的分析標(biāo)準(zhǔn)購自 Immunosource B. V. (Halle-Zoersel,比利時(shí))。5-輕甲基-呋喃甲酸(HMF酸)購自Matrix Scientific (Columbia SC,美國)。發(fā)現(xiàn)所述化合物被高度酷化。使用前即刻將經(jīng)酯化的HMF酸的IOmM溶液在2M H2SO4中煮兩小時(shí)，冷卻，并在添加50mM磷酸緩沖液后用NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.0。所有其他化學(xué)品購自Sigma-AldrichChemie B. V. (Zwi jndrecht，荷蘭)。分子和遺傳技術(shù)使用DNeasy組織試劑盒(QIAGEN)分離基因組DNA。用QIApr印離心小量制備試劑盒(QIAGEN)分離質(zhì)粒DNA。用QIAEXII凝膠提取試劑盒(QIAGEN)分離被瓊脂糖捕獲的DNA片段。根據(jù)制造商的說明，用Accuprime Pfx聚合酶(Invitrogen)進(jìn)行PCR反應(yīng)。用于從C. basilensis HMF14的基因組DNA擴(kuò)增HMF氧化還原酶的引物是FN23 :5，_CGGAATTCCACATGACAAGGGGAGACCG-3，(SEQ ID NO 1)和 FN24 :5’-CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG-3，(SEQ ID NO 2) 0加有下劃線的序列指出EcoRI限制性位點(diǎn)。 使用Gene Pulser電穿孔設(shè)備(BioRad)將質(zhì)粒DNA引入電感受態(tài)細(xì)胞(electrocompetent cell)中。通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定轉(zhuǎn)座子側(cè)翼的染色體DNA(Ausubel, F. M. etal.Current protocols in molecular biology (Green publishing association, NewYork ;1987))，并通過引物步移法(primer walkin)獲得完整的遺傳基因座序列。通過MWGBiotech AG(德國)進(jìn)行寡核苷酸合成和DNA測序。根據(jù) Sambrook and Russell {Sambrook, J, Russel, D. ff. Molecular cloning ；alaboratory manual (Cold spring Harbor Laboratoy Press, New York :2001)進(jìn)行其他標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技木。實(shí)施例IC. basilensis HMF14細(xì)胞提取物中的FDCA生產(chǎn)用HMF或HMF酸孵育下述C. basilensis細(xì)胞提取物時(shí)觀察FDCA的形成，所述細(xì)胞提取物來自在補(bǔ)充有12mM琥珀酸鹽和3mM HMF的匪上培養(yǎng)的晚期對數(shù)階段預(yù)培養(yǎng)物(OD600 ^ I. 5)。使用HMF作為底物吋，隨著FDCA形成觀察到HMF酸、HMF醇的迅速瞬時(shí)累積。在脫鹽的細(xì)胞提取物中，與粗制細(xì)胞提取物相比，HMF酸濃度以較低的速率降低，F(xiàn)DCA生產(chǎn)更加緩慢。因?yàn)槊擕}的細(xì)胞提取物以及粗制細(xì)胞提取物中均產(chǎn)生FDCA，所以HMF到FDCA的轉(zhuǎn)化似乎不涉及輔因子。然而，來自粗制細(xì)胞提取物的輔因子或其他低分子量組分顯示對FDCA形成具有協(xié)同作用。添加HMF酸作為底物吋，在粗制細(xì)胞提取物和脫鹽的細(xì)胞提取物中均觀察到FDCA的立即形成。還證實(shí)FDCA形成需要氧的存在，因?yàn)樵趨捬鯒l件下不生產(chǎn)FDCA。觀察了 HMF酸到FDCA的化學(xué)計(jì)量轉(zhuǎn)化。實(shí)施例II編碼HMF氧化還原酶的hmfH基因的分離和表征發(fā)現(xiàn)hmfH基因編碼屬于FAD-依賴型葡萄糖-甲醇-膽堿(GMC)氧化還原酶家族的62 317Da蛋白質(zhì)。所述酶顯示能夠?qū)MF酸氧化成呋喃ニ羧酸(FDCA)。另外，所述酶還接受HMF作為底物，所述HMF經(jīng)由HMF酸被氧化成FDCA。在非冗余的NCBI數(shù)據(jù)庫中與HmfH最高同源性發(fā)現(xiàn)是與Burkholderia phytofirmans PsJN的GMC氧化還原酶的(基因座標(biāo)簽Bphyt_2180 ;在562個(gè)氨基酸的序列段上具有68%同一性)。以C. basilensis HMF14的HMF/糠醛操縱子的序列數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，鑒定了其他潛在的HMF/糠醛降解者。針對以HMF或糠醛作為唯一碳源在礦物鹽培養(yǎng)基上的生長測試所選擇的菌株。能夠在HMF上生長的菌株具有下述hmfH直向同源物，其編碼與HmfH同一性在45%到68%之間的氧化還原酶。ー種菌株(Burkholderia xenovorans LB400)不能夠利用HMF,盡管其氧化還原酶與HmfH 44%相同。圖3給出被鑒定為潛在的糠醛和/或HMF利用者的C. basilensis HMFH(A)和其他物種(B)中糠醛和HMF代謝基因的遺傳構(gòu)成的圖示。顏色對應(yīng)于圖I中的酶活性。箭頭下的粗體數(shù)字(x/y)指出在y氨基酸序列段中與相應(yīng)的C. basilensis HMF14蛋白質(zhì)的同一性百分比(X)。在National Center for Biotechnology Information 的非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 中，通過BLASTx同源性捜索鑒定直向同源基因。在下述情況下糠醛簇的命中(hits)被定義為相關(guān)的hmfA、B、C、D和E的直向同源物存在于單個(gè)基因組中，其中hmfA直向同源物編碼與HmfA至少50 %相同的酶。使用相同的標(biāo)準(zhǔn)定義hmfF和hmfG直向同源物，其中與HmfH的40%同一性被用作hmfH直向同源物的標(biāo)準(zhǔn)。斜體數(shù)字指出所示菌株的基因組基因座標(biāo)簽。白色箭頭描述了不具有代謝功能的基因。C :使用糠醛或HMF(3mM)作為唯一碳源的礦物鹽培養(yǎng)基上所測試的菌株的生長表型概況。ND :未測定。圖中給出編碼HMF氧化還原酶的HmfH的開放讀碼框的核苷酸序列(圖4)和演繹的氨基酸序列(圖3)。實(shí)施例III在P. putida S12中克隆hmfH并表達(dá)所編碼的氧化還原酶將編碼HMF氧化還原酶的hmfH基因克隆進(jìn)表達(dá)載體pJT’ mcs中。用EcoRI (Fermentas)消化使用引物 FN23 和 FN24 在 C. basilensis HMF14 基因組 DNA 上獲得的PCR片段。將經(jīng)消化的片段連接進(jìn)經(jīng)EcoRI消化和FastAP(Fermentas)處理的pJT’mcs載體中，得到HmfH表達(dá)質(zhì)粒pJT’hmfH。通過對照消化和本領(lǐng)域中已知的核苷酸測序，驗(yàn)證hmfH插入的正確定向。使用HMF或HMF酸作為底物，通過FDCA的形成，在MM+20mM葡萄糖和10mg/l慶大霉素上生長的P. putida_pJT’ hmfH(OD600た4)的細(xì)胞提取物中證實(shí)HMF氧化還原酶的表達(dá)(表I)。表I.在P. putida_pJT’hmfH細(xì)胞提取物中由HMF或HMF酸形成FDCA。使用帶有空表達(dá)載體pJT’ mcs的P. putida S12的細(xì)胞提取物作為對照。
權(quán)利要求
1.包含SEQID NO 3中公開的氨基酸序列或SEQ ID NO 4的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的、具有氧化還原酶活性的多肽或其變體多肽，所述變體多肽與SEQ ID N0:3的序列具有45%或更高的序列同一性。
2.多核苷酸，其包括 (a)SEQ ID NO :4中公開的核苷酸序列； (b)與屬于SEQID NO :4反向互補(bǔ)體的多核苷酸選擇性雜交的核苷酸序列； (c)與SEQID NO 4的核苷酸序列具有至少66%或更高的序列同一'丨生的核苷酸序列； (d)如(a)或(b)中定義的核苷酸序列的片段，所述片段長度為至少約100個(gè)核苷酸； (e)由于遺傳密碼子而成為(a)、(b)、(c)或(d)任一中定義的序列的簡并產(chǎn)物的序列； (f)屬于(a)、(b)、(c)、⑷或(e)中定義的核苷酸序列的反向互補(bǔ)體的核苷酸序列。
3.編碼根據(jù)權(quán)利要求I所述的多肽的多核苷酸。
4.包含根據(jù)權(quán)利要求2到3中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。
5.載體，其并入有根據(jù)權(quán)利要求2到3中任一項(xiàng)所述的多核苷酸序列或根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸構(gòu)建體。
6.包含根據(jù)權(quán)利要求I所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體的細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞是選自如下的組的細(xì)菌Escherichia、Anabaena、 Caulobacter、 Gluconobacter、 Rhodobacter、 Pseudomonas、 Paracoccus、Bacillus、 Brevibacterium、 Corynebacterium、 Rhizobium(Sinorhizobium)、Flavobacterium、 Klebsiella、 Enterobacter、 Lactobacillus、 Lactococcus、Methylobacterium、 Staphylococcus 或 Streptomyces 屬； 或 B. subtilis、B. amyloliquefaciens、B. licheniformis、B. puntis、B. megaterium、B. halodurans、B. pumilus、G. oxydans、Caulobacter crescentus CB 15ΛMethylobacterium extorquens、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonas putida、Paracoccus zeaxanthinifaciens、Paracoccus denitrificans、E.coli、C. glutamicum、Staphylococcus carnosus、Streptomyces lividans、Sinorhizobium melioti 和 Rhizobium radiobacter 種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是選自由Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces 或 Yarrowia 屬； 或Kluyveromyces lactis、S. cerevis iae、Hansenula polymorpha、Yarrowia lipolytica和Pichiapastoris種組成的組的酵母細(xì)胞，或選自Aspergillus、Chrysosporium、Penicillium、Talaromyces 或 Trichoderma 屬； 或 Aspergillus niger、Aspergillusawamoriλ Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillus fumigatus、Talaromyces emersonii、Aspergillus oryzae、Chrysosporium lucknowense、Trichodermareesei或Penicillium chrysogenum種的組的絲狀真菌細(xì)胞。
9.用于制備具有氧化還原酶活性的多肽的方法，所述方法包括在允許所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求6到8中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，并任選地回收被表達(dá)的多肽。
10.能夠通過根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法獲得的多肽。
11.用于生產(chǎn)2，5_呋喃二羧酸(H)CA)的方法，其中通過在存在氧化還原酶催化劑和任選地一種或多種輔酶時(shí)與氧化劑的反應(yīng)將一種或多種FDCA的呋喃前體轉(zhuǎn)化成FDCA，其中所述氧化還原酶催化劑包含根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求10所述的多肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述FDCA的呋喃前體選自由5-羥甲基糠醛(HMF) ,2,5- 二羥甲基呋喃(HMF醇)和5-羥甲基-2-呋喃羧酸(HMF酸)組成的組，優(yōu)選地所述呋喃前體是HMF。
13.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述前體是HMF，并且HMF通過在存在酸時(shí)加熱得自一種或多種己糖，其中優(yōu)選地所述一種或多種己糖得自生物質(zhì)。
14.用于生產(chǎn)5-羥甲基-2-呋喃羧酸(HMF酸)的方法，其中通過在存在氧化還原酶催化劑和任選地一種或多種輔酶輔因子時(shí)與氧化劑反應(yīng)，將HMF酸的一種或多種呋喃前體轉(zhuǎn)化成HMF酸，其中所述氧化還原酶催化劑包括根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求12所述的多肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述HMF酸的呋喃前體選自5-羥甲基糠醛(HMF)和2，5- 二羥甲基呋喃(HMF醇)。
16.根據(jù)權(quán)利要求11或15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述輔酶是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和/或吡咯并喹啉醌(PQQ)和/或黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。
17.根據(jù)權(quán)利要求11到16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述氧化還原酶催化劑是根據(jù)權(quán)利要求6到8中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞的無細(xì)胞提取物。
18.根據(jù)權(quán)利要求11-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述氧化還原酶催化劑是全細(xì)胞生物催化劑，其為根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
19.用于從一種或多種單體生產(chǎn)聚合物的方法，其中所述單體之一是根據(jù)權(quán)利要求18所述的FDCA。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有氧化還原酶活性的多肽或其變體多肽，所述多肽包含SEQ ID NO3中公開的氨基酸序列或SEQ ID NO4的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述變體多肽與SEQ ID NO3的序列具有45％或更高的序列同一性。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)2，5-呋喃二羧酸(FDCA)或生產(chǎn)5-羥甲基-2-呋喃羧酸(HMF酸)的方法。
文檔編號C11D3/386GK102834386SQ201080039317
公開日2012年12月19日 申請日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月2日
發(fā)明者哈拉德·約翰·魯杰瑟納斯, 尼克·約翰尼斯·皮特斯·維爾克斯, 弗蘭克·沃特·庫普曼, 阿德里安努·約翰尼斯·約瑟夫·斯特拉索夫, 約翰尼斯·翰德里克·溫德·德 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司