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通過(guò)抑制干細(xì)胞因子的生成和釋放、用于改善瘙癢、皮膚粗糙或皮膚敏感或用于增白的藥物的制作方法

文檔序號(hào):1423329閱讀:236來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):通過(guò)抑制干細(xì)胞因子的生成和釋放、用于改善瘙癢、皮膚粗糙或皮膚敏感或用于增白的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及活性成分的篩選方法,該活性成分通過(guò)抑制干細(xì)胞因子(以下稱(chēng)為“SCF”)的生成和/或釋放而顯示改善瘙癢、皮膚粗糙或皮膚敏感的效果或者皮膚增白的效果,還涉及含有這些活性成分、用于瘙癢、皮膚粗糙、皮膚敏感和/或皮膚增白的藥物。
背景技術(shù)
各種治療劑、皮膚外用制劑、化妝品等通常被用于改善瘙癢、皮膚粗糙或皮膚敏感或用于增白皮膚。作為具有改善瘙癢、皮膚粗糙或皮膚敏感效果的常用藥物或化妝品的活性成分,已使用抗炎劑或氨基酸、多糖、脂質(zhì)等,以及具有抗炎效果或者高吸濕效果的各種動(dòng)物或植物提取物,因?yàn)樗鼈兙哂袠O佳的防止皮膚瘙癢、發(fā)炎或者角質(zhì)層水分喪失的能力。作為顯示增白效果的常用藥物或化妝品的活性成分,已所用L-抗壞血酸、谷胱甘肽、曲酸、半胱氨酸、氫醌、胎盤(pán)提取物等,因?yàn)樗鼈兙哂袠O佳的抑制黑色素生成從而防止皮膚斑點(diǎn)、雀斑等的能力。然而,所有它們的效果均不太令人滿意,因此需要開(kāi)發(fā)更優(yōu)良的藥物。
已知SCF(也稱(chēng)為“kit ligand”(KL)或肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(MCF))在皮膚斑點(diǎn)區(qū)等處加速表達(dá),并且紫外照射可加速SCF的表達(dá)(L.H.Kligman等人,Photochem.Photobiol.63卷,No.2(1996)123-127頁(yè))。SCF是由角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等生成的一種蛋白。SCF的作用包括使未分化造血干細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)生殖細(xì)胞的分化、促進(jìn)肥大細(xì)胞的生長(zhǎng)和促進(jìn)色素細(xì)胞的生長(zhǎng)(“生物科學(xué)術(shù)語(yǔ)庫(kù)-細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子”,Yodosha出版社(1995),K.Miyazono和K.Sugamura編撰)。已知兩種形式的SCF膜結(jié)合形式(SCF-2)和分泌形式(SCF-1),后者在被蛋白酶剪切后自膜中釋放。在與角質(zhì)形成細(xì)胞或其它類(lèi)型細(xì)胞結(jié)合的同時(shí),SCF-2可與色素細(xì)胞上的SCF受體結(jié)合,從而激活色素細(xì)胞的生長(zhǎng),而SCF-1在其剪切部位被剪切并自細(xì)胞膜釋放,然后與色素細(xì)胞或肥大細(xì)胞的SCF受體結(jié)合,導(dǎo)致色素細(xì)胞的生長(zhǎng)激活或者肥大細(xì)胞的生長(zhǎng)激活和脫粒作用(T.Kunisade等人,J.Exp.Med.187卷,No.10,(1998)1565-1573頁(yè))。SCF的生成異常與色素細(xì)胞的異常增殖相關(guān),其導(dǎo)致黑色素的生成加速,并成為皮膚斑點(diǎn)、雀斑、皮膚變暗等的原因。其還與肥大細(xì)胞的異常增殖和異常脫粒相關(guān),導(dǎo)致化學(xué)調(diào)節(jié)劑如組胺、5-羥色胺和LTB4的釋放加速(J.Grabbe等人,Arch.Dermatol.Res.(1984)28778-84),并且成為導(dǎo)致瘙癢、皮膚粗糙、皮膚敏感和類(lèi)似狀況的原因。
由此可相信有效抑制被認(rèn)為是導(dǎo)致瘙癢、皮膚粗糙、皮膚敏感、皮膚斑點(diǎn)、雀斑等的直接原因的SCF的生成和釋放的能力將導(dǎo)致全新的更有效的用于瘙癢、皮膚粗糙、皮膚敏感和/或皮膚增白等的藥物,這在現(xiàn)有技術(shù)中并不存在。然而,在現(xiàn)有技術(shù)中,具有這種抑制SCF生成和釋放活性的物質(zhì)或植物制劑的有效篩選方法尚不為人所知。T.Kunisada等人(Supra)已使用轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了SCF對(duì)肥大細(xì)胞和色素細(xì)胞的作用。然而,由于這種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的成本高且耗時(shí),未能成為篩選廣泛多樣的植物制劑和藥物的合適方法,因此需要開(kāi)發(fā)可方便而經(jīng)濟(jì)地篩選具有抑制SCF生成和釋放活性的活性成分和植物制劑的方法。
令人驚訝的是,本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)以例如干燥的方式刺激人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞可促進(jìn)SCF的生成或釋放,結(jié)果,成功地對(duì)能夠有效抑制SCF生成和/或釋放的活性成分進(jìn)行了有效的篩選。

發(fā)明內(nèi)容
具體而言,根據(jù)本發(fā)明的第一種模式,提供了活性成分的篩選方法,該活性成分通過(guò)抑制SCF的生成和/或釋放而顯示改善瘙癢、皮膚粗糙或皮膚敏感的效果或皮膚增白效果,該方法的特征在于包括以下步驟使表達(dá)SCF的細(xì)胞與供試成分接觸,分析由細(xì)胞生成和/或釋放的SCF的量,并選擇可減少SCF生成和/或釋放量的供試成分作為活性成分,其中使表達(dá)SCF的細(xì)胞受到刺激以促進(jìn)SCF生成和/或釋放。
根據(jù)該模式的一個(gè)方面,刺激為干燥刺激、紫外照射刺激或化學(xué)刺激,優(yōu)選干燥刺激。
根據(jù)該模式的另一方面,篩選方法包括使表達(dá)SCF的細(xì)胞與供試成分接觸,隨后使細(xì)胞受到刺激,然后分析由細(xì)胞生成和/或釋放的SCF的量并選擇活性成分。
根據(jù)本發(fā)明的第二種模式,提供了抑制SCF生成和/或釋放的皮膚外用制劑,其包含一種或多種選自以下的成分玫瑰提取物玫瑰水、大葉茶(camellia sinensis)葉提取物、啤酒花提取物、山楂提取物、赤豆粉、白樺提取物、肉桂(cinnamon)提取物、丁香提取物、山金車(chē)(arnica)提取物、芍藥提取物、來(lái)檬、小球藻提取物、白花春黃菊提取物、紅茶提取物、桉樹(shù)提取物、粉狀蒼術(shù)(cang zhu)提取物、粉狀白術(shù)(bai zhu)提取物、粉狀烏龍茶提取物、芒柄花(restharrow)提取物、茜草科鉤藤(uncaria gambir)提取物、葡萄葉提取物、防風(fēng)根提取物、桑樹(shù)皮提取物、墻草(parietaria)提取物、安息香樹(shù)(benzoin)提取物、甜葉菊(stevia)提取物、柏木提取物、菖蒲提取物、大豆提取物、中國(guó)貓爪草提取物、肥皂草提取物、蜀葵提取物、otogiriso(小連翹,Hypericum erectum)提取物和蒿屬植物提取物。
根據(jù)本發(fā)明的第三種模式,提供了用于瘙癢的皮膚外用制劑,其包含抑制SCF生成和/或釋放的成分作為改善瘙癢的活性成分。
根據(jù)該模式的一個(gè)方面,改善瘙癢的活性成分是一種或多種選自以下的成分啤酒花提取物、山楂提取物、赤豆粉、丁香提取物、白花春黃菊提取物、紅茶提取物、桉樹(shù)提取物、粉狀蒼術(shù)提取物、粉狀白術(shù)提取物、粉狀烏龍茶提取物、芒柄花提取物、防風(fēng)根提取物、墻草提取物、安息香樹(shù)提取物、甜葉菊提取物、菖蒲提取物、中國(guó)貓爪草提取物、肥皂草提取物、蜀葵提取物和otogiriso(小連翹)提取物。
根據(jù)本發(fā)明的第四種模式,提供了用于預(yù)防皮膚粗糙的皮膚外用制劑,其包含抑制SCF生成和/或釋放的成分作為預(yù)防皮膚粗糙的活性成分。
根據(jù)該模式的一個(gè)方面,預(yù)防皮膚粗糙的活性成分為一種或多種選自如下的成分山楂提取物、粉狀蒼術(shù)提取物、粉狀白術(shù)提取物、芒柄花提取物、桑樹(shù)皮提取物、墻草提取物、安息香樹(shù)提取物、甜葉菊提取物、柏木提取物、菖蒲提取物、中國(guó)貓爪草提取物、肥皂草提取物和蜀葵提取物。
根據(jù)本發(fā)明的第五種模式,提供了用于皮膚敏感的皮膚外用制劑,其包含抑制SCF生成和/或釋放的成分作為改善皮膚敏感的活性成分。
根據(jù)該模式的一個(gè)方面,改善皮膚敏感的活性成分為一種或多種選自如下的成分玫瑰提取物玫瑰水、大葉茶葉提取物、啤酒花提取物、山楂提取物、赤豆粉、白樺提取物、肉桂提取物、丁香提取物、小球藻提取物、紅茶提取物、桉樹(shù)提取物、粉狀蒼術(shù)提取物、粉狀白術(shù)提取物、粉狀烏龍茶提取物、芒柄花提取物、茜草科鉤藤提取物、葡萄葉提取物、防風(fēng)根提取物、桑樹(shù)皮提取物、墻草提取物、安息香樹(shù)提取物、甜葉菊提取物、柏木提取物、菖蒲提取物、大豆提取物、中國(guó)貓爪草提取物、肥皂草提取物、蜀葵提取物、otogiriso(小連翹)提取物和蒿屬植物提取物。
根據(jù)本發(fā)明的第六種模式,提供了用于皮膚增白的皮膚外用制劑,其包含抑制SCF生成和/或釋放的成分作為皮膚增白活性成分。
根據(jù)該模式的一個(gè)方面,皮膚增白活性成分是一種或多種選自如下的成分玫瑰提取物玫瑰水、芒柄花提取物、茜草科鉤藤提取物、墻草提取物、安息香樹(shù)提取物、肥皂草提取物、小球藻提取物和桉樹(shù)提取物。
根據(jù)本發(fā)明的第七種模式,提供了改善瘙癢、皮膚粗糙或皮膚敏感或增白皮膚的方法,其包括將通過(guò)抑制SCF生成和/或釋放而顯示改善瘙癢、皮膚粗糙或皮膚敏感效果或皮膚增白效果的活性成分應(yīng)用于人或哺乳動(dòng)物的表皮。
根據(jù)本發(fā)明的第八種模式,提供了包含可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)答紫外線刺激而在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上表達(dá)SCF的成分的藥物。
根據(jù)該模式的一個(gè)方面,這些成分是一種或多種選自如下的成分玫瑰提取物玫瑰水、大葉茶葉提取物、啤酒花提取物、山楂提取物、赤豆粉、白樺提取物、肉桂提取物、丁香提取物、山金車(chē)提取物、芍藥提取物、來(lái)檬、小球藻提取物、白花春黃菊提取物、紅茶提取物、桉樹(shù)提取物、粉狀蒼術(shù)提取物、粉狀白術(shù)提取物、粉狀烏龍茶提取物、芒柄花提取物、茜草科鉤藤提取物、葡萄葉提取物、防風(fēng)根提取物、桑樹(shù)皮提取物、墻草提取物、安息香樹(shù)提取物、甜葉菊提取物、柏木提取物、菖蒲提取物、大豆提取物、中國(guó)貓爪草提取物、肥皂草提取物、蜀葵提取物、otogiriso(小連翹)提取物和蒿屬植物提取物。
根據(jù)該模式的另一個(gè)方面,這些成分是赤豆粉、山金車(chē)提取物、芒柄花提取物和安息香樹(shù)提取物。
以上提及模式的提取物通過(guò)下述方法得到并用于試驗(yàn)。
通過(guò)常用方法以水作為溶劑提取若干小時(shí),同時(shí)自室溫加熱至50℃后,得到蒿屬植物、肉桂、赤豆粉、菖蒲和甜葉菊提取物。
通過(guò)常用方法在室溫下于作為溶劑的含水乙醇(30%乙醇)中浸泡和提取一周后,得到肥皂草、山楂、丁香、蜀葵、來(lái)檬、芍藥、桉樹(shù)、安息香樹(shù)、柏木、烏龍茶、桑樹(shù)皮、大豆和茜草科鉤藤提取物。
通過(guò)常用方法在作為溶劑的水或含水乙醇(30%乙醇)中提取5小時(shí)、同時(shí)加熱(60℃)后,得到紅茶提取物。
通過(guò)常用方法在作為溶劑的80%或90%乙醇-水中在60℃下加熱提取3小時(shí)或者90℃下加熱提取2小時(shí)后,得到白樺、大葉茶葉、otogiriso、芒柄花、山金車(chē)、墻草、小球藻、玫瑰提取物玫瑰水、葡萄葉、啤酒花和白花春黃菊提取物。
附圖簡(jiǎn)介

圖1顯示各種植物提取物對(duì)受到干燥刺激的細(xì)胞中的SCF的抑制。
圖2顯示各種植物提取物對(duì)受到干燥刺激的細(xì)胞中的SCF的抑制。
圖3顯示紫外線刺激下的細(xì)胞加速表達(dá)SCF。
圖4顯示化學(xué)刺激下的細(xì)胞加速表達(dá)SCF。
圖5顯示各種植物提取物對(duì)受到紫外線刺激的細(xì)胞中的SCF的抑制。
本發(fā)明提供了篩選通過(guò)抑制SCF生成和/或釋放而顯示改善瘙癢、皮膚粗糙或皮膚敏感效果或皮膚增白效果的活性成分的方法。該篩選方法的特征在于使表達(dá)SCF的細(xì)胞與供試成分接觸,分析由細(xì)胞生成和/或釋放的SCF的量,并選擇可減少SCF生成和/或釋放量的供試成分作為活性成分,其中使表達(dá)SCF的細(xì)胞受到刺激以促進(jìn)SCF的生成和/或釋放。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)刺激,如使包括人角質(zhì)形成細(xì)胞的皮膚細(xì)胞干燥,可導(dǎo)致細(xì)胞生成和/或釋放SCF加速。因此,使細(xì)胞受到這種刺激可誘導(dǎo)SCF在這些細(xì)胞中的異常表達(dá),導(dǎo)致出現(xiàn)瘙癢、皮膚粗糙、皮膚敏感和皮膚斑點(diǎn)、雀斑等。應(yīng)用該知識(shí),本發(fā)明人借助可促進(jìn)SCF生成和/或釋放的刺激加速了SCF的表達(dá),同時(shí)允許抑制SCF生成和/或釋放的供試成分作用于細(xì)胞,從而已成功地對(duì)有效抑制SCF生成和/或釋放的活性成分進(jìn)行了有效的篩選。這種刺激包括干燥刺激以及其它類(lèi)型的應(yīng)激,如紫外照射刺激、熱刺激(加熱或冷卻)、化學(xué)刺激(例如毛喉素或茶堿)、滲透刺激和氧化刺激。
根據(jù)本發(fā)明篩選方法的細(xì)胞刺激可以在使供試成分作用于細(xì)胞之前、期間或之后進(jìn)行。優(yōu)選在使供試成分作用于細(xì)胞之后,使細(xì)胞受到刺激。
更具體而言,篩選方法可以以例如以下方式進(jìn)行(1)將生成SCF的細(xì)胞培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)液中(例如在約25至37℃、優(yōu)選在約37℃下培養(yǎng)幾小時(shí)至幾天、優(yōu)選約72小時(shí))。
(2)用合適的細(xì)胞培養(yǎng)液將供試成分稀釋至所需濃度(例如0.0001%至0.01%)。
(3)將(1)的細(xì)胞培養(yǎng)液與上述稀釋的供試成分交換并培養(yǎng)(例如在約25至37℃、優(yōu)選在約37℃下培養(yǎng)幾小時(shí)至幾天、優(yōu)選約24小時(shí))。也可任選將具有相同活性的細(xì)胞制備于不含供試成分的培養(yǎng)基中,作為對(duì)照。
(4)使已被活性成分作用的細(xì)胞受到刺激。當(dāng)刺激是干燥刺激時(shí),除去細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液并在干燥條件下進(jìn)行培養(yǎng)。也可任選制備未刺激細(xì)胞,作為對(duì)照。
(5)將培養(yǎng)基加入經(jīng)刺激的細(xì)胞中并進(jìn)行培養(yǎng)(例如在約25至37℃、優(yōu)選在約37℃下培養(yǎng)約30分鐘至4小時(shí)、優(yōu)選約2小時(shí))。
(6)收集細(xì)胞上清液,分析SCF濃度并選擇抑制SCF生成和/或釋放的成分。
抑制一定量的SCF生成和/或釋放的定義是加入供試成分使SCF的生成減少約25%,相比之下,僅加入培養(yǎng)基所得該值為100%。然而,所加入供試成分的濃度必須處于不導(dǎo)致明顯細(xì)胞毒性(例如呼吸活性減小至約75%)的范圍內(nèi)。
所使用的生成SCF的細(xì)胞可以是人或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞,并且例如它們可以是來(lái)自大鼠、小鼠、兔等的角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。它們優(yōu)選為人角質(zhì)形成細(xì)胞。
如上所述,刺激包括各種應(yīng)激如干燥刺激、紫外照射刺激、熱刺激(加熱和冷卻)、化學(xué)刺激(例如毛喉素和茶堿)、滲透刺激和氧化刺激等。對(duì)于干燥刺激,例如可如下使細(xì)胞受到干燥刺激除去培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中氣氛為約1至5%的CO2、濕度為約0到100%、溫度為25至37℃,然后放置約15分鐘至6小時(shí)、優(yōu)選約1小時(shí)。對(duì)于紫外照射刺激,例如可通過(guò)在波長(zhǎng)約290至320mm處、以10至60mJ/cm2進(jìn)行紫外照射而刺激細(xì)胞。對(duì)于熱刺激,例如可通過(guò)將細(xì)胞在氣氛為1至5%的CO2、濕度約0至100%、溫度為4至25℃或37至42℃的CO2培養(yǎng)箱中放置合適的時(shí)間如約5分鐘至6小時(shí)、優(yōu)選約1小時(shí)而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激。
本發(fā)明的篩選方法優(yōu)選在體外進(jìn)行,但也可在體內(nèi)進(jìn)行。
SCF分析根據(jù)本發(fā)明,對(duì)表達(dá)SCF的細(xì)胞生成和/或釋放的SCF的分析優(yōu)選通過(guò)定性或定量分析細(xì)胞釋放入細(xì)胞培養(yǎng)液中的SCF或存在于破裂細(xì)胞或細(xì)胞膜部分中的SCF進(jìn)行。待分析的SCF可以是從細(xì)胞膜中脫離并釋放入細(xì)胞培養(yǎng)液中的分泌形式(SCF-1),或者是包含在細(xì)胞膜部分中的膜結(jié)合形式(SCF-2)。對(duì)于SCF分析方法,可以提及各種本技術(shù)領(lǐng)域中熟知的方法,如例如免疫分析方法,包括使用酶標(biāo)記的ELISA分析法;使用放射性標(biāo)記的RIA法;免疫濁度分析方法,其中根據(jù)抗體與抗原反應(yīng)導(dǎo)致的混濁吸收的改變對(duì)抗原進(jìn)行定量;和乳膠凝聚試驗(yàn)或紅血球凝聚方法,其中根據(jù)抗原與抗體敏感化的乳膠珠或抗體敏感化的紅血球的反應(yīng)所形成凝聚的程度對(duì)抗原的量進(jìn)行分析。免疫分析系統(tǒng)可以是競(jìng)爭(zhēng)性或夾心分析系統(tǒng)。免疫分析也可以通過(guò)電泳、等電聚焦或色譜法如凝膠過(guò)濾色譜、離子交換色譜、反相色譜、高效液相色譜,或Western印跡分析而完成。根據(jù)本發(fā)明,SCF分析優(yōu)選通過(guò)ELISA完成。
上述免疫分析方法所使用的SCF特異性抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體,但尤其優(yōu)選單克隆抗體。制備單克隆抗體和多克隆抗體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
使用本發(fā)明的篩選方法,本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)以下植物制劑可減少生成SCF的細(xì)胞生成SCF玫瑰提取物玫瑰水、大葉茶葉提取物、啤酒花提取物、山楂提取物、赤豆粉、白樺提取物、肉桂提取物、丁香提取物、山金車(chē)提取物、芍藥提取物、來(lái)檬、小球藻提取物、白花春黃菊提取物、紅茶提取物、桉樹(shù)提取物、粉狀蒼術(shù)提取物、粉狀白術(shù)提取物、粉狀烏龍茶提取物、芒柄花提取物、茜草科鉤藤提取物、葡萄葉提取物、防風(fēng)根提取物、桑樹(shù)皮提取物、墻草提取物、安息香樹(shù)提取物、甜葉菊提取物、柏木提取物、菖蒲提取物、大豆提取物、中國(guó)貓爪草提取物、肥皂草提取物、蜀葵提取物、otogiriso(小連翹)提取物和蒿屬植物提取物。這些植物制劑的詳細(xì)描述可見(jiàn)于NipponHanyou Keshouhin Genryoshu,第四版(Yakuji Nippo)。
上述植物制劑提取物是通過(guò)常用方法自天然植物材料得到,對(duì)提取方法沒(méi)有限制,例如對(duì)于丁香提取物,可將10kg日本藥典中所列的丁香干燥、細(xì)分,然后在50v/v%乙醇(根據(jù)日本化妝品成分標(biāo)準(zhǔn)制備,使用無(wú)水乙醇和純化水)中浸泡24小時(shí),并擠壓分離得到提取物。
根據(jù)本發(fā)明,瘙癢、皮膚粗糙和皮膚敏感是由細(xì)胞釋放的SCF與肥大細(xì)胞的SCF受體結(jié)合所誘導(dǎo)的皮膚癥狀。瘙癢通常意義上指皮膚或頭皮發(fā)癢,可以提及例如由干燥、特應(yīng)性皮炎和老年干燥病引起的瘙癢。皮膚粗糙通常意義上指皮膚退化狀態(tài),可以提及由瘙癢誘導(dǎo)的剝落或特應(yīng)性皮炎導(dǎo)致的退化加重所致的皮膚粗糙,和干燥引起的皮膚粗糙。皮膚敏感指皮膚處于高度過(guò)敏性狀態(tài),并且表示對(duì)外部非特異性理化刺激如例如剝落、過(guò)熱、出汗、陽(yáng)光、衣物、增積物等或者對(duì)心理應(yīng)激刺激活動(dòng)過(guò)度的皮膚狀態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明的“增白效果”指的是黑色素過(guò)度生成所致的皮膚斑點(diǎn)、雀斑、皮膚發(fā)暗等的改善,所述黑色素過(guò)度生成是由于日灼、干燥和其它原因使細(xì)胞釋放的SCF與色素細(xì)胞SCF受體的結(jié)合所致。
本發(fā)明的用于瘙癢、皮膚粗糙、皮膚敏感和皮膚增白的藥物通常通過(guò)將上述抑制SCF生成/釋放的活性成分加至水性溶劑如水或乙醇中使用。對(duì)抑制SCF生成/釋放的成分的含量沒(méi)有特別限制,但是它們基于固體部分優(yōu)選為0.00001至0.01wt%,且尤其為約0.0001至0.005wt%。當(dāng)欲將本發(fā)明的藥物制備成沐浴粉時(shí),使用時(shí)通常將它們稀釋至約100至1000倍,因此,對(duì)于這類(lèi)目的,優(yōu)選將含量規(guī)定在高濃度水平。優(yōu)選低級(jí)醇作為上述水性溶劑,并且低級(jí)醇的含量可占本發(fā)明藥物的20至80wt%、優(yōu)選40至60%。
除了上述基本成分,本發(fā)明的用于瘙癢、皮膚粗糙、皮膚敏感和/或皮膚增白的藥物也可視需要和情況而定含有常用于化妝品和醫(yī)用皮膚外用制劑的成分,如其它皮膚增白劑、潤(rùn)濕劑、抗氧化劑、油性成分、紫外吸收劑、表面活性劑、增稠劑、醇、粉狀成分、色素、水性成分、水、各種皮膚營(yíng)養(yǎng)物等。
根據(jù)藥物的用途,也可以視情況而定含有金屬螯合劑如EDTA二鈉、EDTA三鈉、檸檬酸鈉、多聚磷酸鈉、偏磷酸鈉或葡萄糖酸,藥物活性劑如咖啡因、單寧、維拉帕米、氨甲環(huán)酸及其衍生物、甘草提取物、甘草黃酮(glabridin)、榅桲果熱水提取物、各種植物制劑、生育酚乙酸酯或甘草亭酸及其衍生物或鹽,其它增白劑如維生素C、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡糖苷、熊果甘(albutin)或曲酸,糖如葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖或海藻糖,以及維生素A化合物如視黃酸、視黃醇、乙酸視黃醇酯、棕櫚酸視黃醇酯等。
本發(fā)明的用于瘙癢、皮膚粗糙、皮膚敏感和皮膚增白的藥物可以根據(jù)預(yù)計(jì)用途而采取任何形式,只要它們是化妝品、藥物、準(zhǔn)藥物等外用制劑即可,實(shí)例包括通常用于皮膚外用制劑的形式,如例如化妝水、霜?jiǎng)?、乳劑、洗劑、涂敷?pack)、沐浴添加劑、軟膏劑、洗發(fā)劑、生發(fā)劑、發(fā)用液劑、洗發(fā)香波、潤(rùn)絲、刺激頭發(fā)或頭發(fā)生長(zhǎng)劑等。
實(shí)施例現(xiàn)利用以下實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1分析經(jīng)干燥刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞所釋放的SCF并篩選抑制劑使用市售可得的無(wú)血清培養(yǎng)基(Defined Keratinocyte-SFM,GibcoIndustries,Inc.)培養(yǎng)市售可得的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(新生,CryoNHEK-Neo,Sanko Junyaku Co.,Ltd.)。將細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/mL置于12孔微量培養(yǎng)板中并在約37℃培養(yǎng)約72小時(shí)至融合。
將用水或乙醇提取的圖1和2中所示的各種植物提取物溶于70%乙醇,至2%w/v。
將每種供試植物提取物加至培養(yǎng)液中,終濃度為0.005%w/v,并在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。還培養(yǎng)了僅含乙醇(EtOH)的培養(yǎng)物,作為對(duì)照。為檢查細(xì)胞活性,即為了測(cè)定供試植物提取物的細(xì)胞毒性作用,在最后2小時(shí)內(nèi)將alamarBlueTM(Biosource International)以10%加入,并測(cè)量各上清液的熒光強(qiáng)度(激發(fā)560nm,發(fā)射590nm)。
通過(guò)完全除去上清液并在CO2培養(yǎng)箱中保持1小時(shí)進(jìn)行干燥刺激。
然后加入培養(yǎng)基并在2小時(shí)后收集上清液。用市售可得的ELISA分析試劑盒(R&D Systems)對(duì)上清液中的SCF水平進(jìn)行定量。
相對(duì)于未經(jīng)干燥刺激的相同供試提取物,評(píng)價(jià)每種供試植物提取物抑制SCF水平的作用。
每種供試植物提取物的細(xì)胞毒性還通過(guò)使用alamarBlueTM的減少量作為指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
結(jié)果顯示于圖1和2。圖1(a)和2(a)顯示了加入每種植物提取物所引起的alamarBlueTM熒光強(qiáng)度的減少量,圖1(b)和2(b)顯示了自加入每種植物提取物并經(jīng)干燥刺激的細(xì)胞培養(yǎng)基中游離SCF的量中減去加入每種植物提取物但未經(jīng)干燥刺激的細(xì)胞培養(yǎng)基中游離SCF的量后所得的數(shù)值。從圖1和2的結(jié)果清晰可見(jiàn)與乙醇相比,植物提取物顯著降低了培養(yǎng)液中的SCF水平,因此可有效抑制SCF的生成和/或釋放。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2不同刺激所致的角質(zhì)形成細(xì)胞膜上SCF的表達(dá)加速將150萬(wàn)個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞置于10cm平板上并培養(yǎng)72小時(shí)后,通過(guò)以下方法之一刺激細(xì)胞(1)將培養(yǎng)基用PBS(-)替換,用UVB以20mJ/cm2照射培養(yǎng)物然后立即將PBS(-)用培養(yǎng)基替換,(2)加入毛喉素,或(3)加入茶堿。培養(yǎng)24小時(shí)后,收集細(xì)胞并將其分散于200μl 50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.8)+蛋白酶抑制劑溶液中,然后在4℃用超聲破裂器破裂細(xì)胞5次,每次30秒。4℃下以10,000g離心20分鐘后,將上清液以100,000g在4℃下進(jìn)一步離心60分鐘。將所得沉淀溶于100μl 25mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)+0.1%Triton-X100溶液中,得到膜部分的蛋白提取物。溶液的蛋白含量通過(guò)成熟的方法測(cè)量,然后分析SCF的量以得到SCF/蛋白值。
結(jié)果顯示于圖3和4。這些圖的結(jié)果清楚地表明通過(guò)紫外刺激或使用毛喉素或茶堿的化學(xué)刺激對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激,加速了SCF在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3分析經(jīng)紫外線刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞膜上所表達(dá)的SCF并篩選抑制劑將150萬(wàn)個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞置于10cm平板上并培養(yǎng)72小時(shí)后,將培養(yǎng)基用PBS(-)替換,用UVB以20mJ/cm2照射培養(yǎng)物并立即將PBS(-)用培養(yǎng)基替換。加入待篩選的植物制劑并培養(yǎng)24小時(shí)后,收集細(xì)胞,然后將其分散于200μl 50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.8)+蛋白酶抑制劑溶液中,并在4℃下用超聲破裂器破裂細(xì)胞5次,每次30秒。在4℃下以10,000g離心20分鐘后,將上清液以100,000g在4℃下進(jìn)一步離心60分鐘。將所得沉淀溶于100μl 25mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)+0.1%Triton-X100溶液中,得到膜部分的蛋白提取物。溶液的蛋白含量通過(guò)成熟的方法測(cè)量,然后分析SCF的量以得到SCF/蛋白值。將抑制劑定義為所加入供試植物制劑中那些使所述數(shù)值與僅加入溶劑相比時(shí)減少至25%或更低的植物制劑。
結(jié)果顯示于圖5。由該圖的結(jié)果清楚地顯示與僅用紫外照射處理的細(xì)胞相比,用植物提取物處理的細(xì)胞顯著地抑制了SCF的表達(dá)。
以下列出本發(fā)明的含植物提取物藥物的不同制劑。
實(shí)施例1體霜含量(份數(shù),以重量計(jì))聚甲基硅氧烷 3十甲基環(huán)戊硅氧烷 13八甲基環(huán)丁硅氧烷 12聚氧乙烯-聚甲基硅氧烷共聚物1乙醇 2異丙醇 1甘油 3雙丙甘醇 5聚乙二醇6000 5偏磷酸鈉 0.05
DL-α-生育酚2-L-抗壞血酸磷酸二酯鉀鹽0.1乙酸DL-α-生育酚酯 0.1咖啡因 0.1茴香提取物 0.1金縷梅(hamamelis)提取物 0.1人參提取物 0.1粉狀蒼術(shù)提取物 0.005L-薄荷醇適量對(duì)羥基苯甲酸酯 適量EDTA三鈉0.05二嗎啉代噠嗪0.01甲基二(三甲基甲硅烷氧基)甲硅烷基異戊基三甲氧基肉桂酸酯0.1黃色氧化鐵 適量鈦酸鈷 適量二甲基二硬脂基銨鋰蒙脫 1.5聚乙烯醇0.1羥乙基纖維素0.1純化水 補(bǔ)足三甲基甲硅烷氧基肉桂酸 2香料適量實(shí)施例2乳劑含量(份數(shù),以重量計(jì))聚甲基硅氧烷2二十二醇1木糖醇 1鯊肝醇 0.5
甘油 51,3-丁二醇7赤蘚醇 2氫化油 3角鯊?fù)?6季戊四醇四(2-乙基己酸酯) 2聚氧乙烯甘油異硬脂酸酯 1聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯 1安息香樹(shù)提取物 0.001氫氧化鉀 適量六偏磷酸鈉 0.05苯氧基乙醇 適量羧乙烯基聚合物 0.11純化水 補(bǔ)足實(shí)施例3洗劑含量(份數(shù),以重量計(jì))甘油 21,3-丁二醇4赤蘚醇 1聚氧乙烯甲基葡糖苷 1聚氧乙烯氫化蓖麻油 0.5檸檬酸 0.02檸檬酸鈉 0.08苯氧基乙醇 0.25N-椰子油脂肪酸?;鵏-精氨酸乙基DL-吡咯烷酮羧酸酯 0.1中國(guó)貓爪草提取物 0.0001
純化水 補(bǔ)足實(shí)施例4增白洗劑含量(份數(shù),以重量計(jì))乙醇10雙丙甘醇1聚乙二醇10001聚氧乙烯甲基葡糖苷 1霍霍巴油0.01甘油三(2-乙基己酸酯)0.1聚氧乙烯氫化蓖麻油 0.2聚二異硬脂酸甘油酯 0.15N-硬脂酰基-L-谷氨酸鈉 0.1檸檬酸 0.04檸檬酸鈉0.18氫氧化鉀0.4甘草酸二鉀 0.1精氨酸鹽酸鹽0.1L-抗壞血酸2-葡糖苷 2黃花(golden)提取物 0.1虎耳草提取物0.1對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)0.12野芝麻提取物0.1二丁基羥基甲苯 0.01EDTA三鈉0.05對(duì)甲氧基肉桂酸2-乙基己基酯 0.01肥皂草提取物0.005純化水 補(bǔ)足礦質(zhì)水 3香料適量實(shí)施例5加藥面膜(treatment mask)含量(份數(shù),以重量計(jì))乙醇101,3-丁二醇 6聚乙二醇40002橄欖油 1全緣葉澳洲堅(jiān)果 1羥基硬脂酸植物甾醇酯0.05乳酸0.05乳酸鈉溶液(50%)0.2L-抗壞血酸硫酸酯二鈉鹽 0.1DL-α-生育酚2-L-抗壞血酸磷酸二酯鉀鹽0.1維生素E乙酸酯 0.1魚(yú)膠原 0.1硫酸軟骨素鈉0.1對(duì)羥基苯甲酸酯 0.1羧甲基纖維素鈉 0.2聚乙烯醇12.5凝血酸 1粉狀白術(shù)提取物 0.001純化水 補(bǔ)足香料適量實(shí)施例6增白精華含量(份數(shù),以重量計(jì))
凡士林 2聚甲基硅氧烷 2乙醇 5二十二醇 0.5鯊肝醇 0.2甘油 71,3-丁二醇5聚乙二醇20000 0.5霍霍巴油 3角鯊?fù)?2羥基硬脂酸膽甾醇酯 0.5季戊四醇四(2-乙基己酸酯) 1聚氧乙烯氫化蓖麻油 1氫氧化鉀 0.1焦亞硫酸鈉 0.01六偏磷酸鈉 0.05硬脂基甘草酸酯 0.1泛醇乙基醚 0.1熊果甘 7生育酚乙酸酯 0.1透明質(zhì)酸鈉 0.05桉樹(shù)提取物 0.001對(duì)羥基苯甲酸酯 適量EDTA三鈉 0.054-叔-丁基-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷 0.1甘油二對(duì)甲氧基肉桂酸單-2-乙基己酸酯0.1黃色氧化鐵 適量黃原膠 0.1
羧乙烯基聚合物0.2純化水補(bǔ)足實(shí)施例7用于瘙癢的沐浴添加劑含量(份數(shù),以重量計(jì))液體石蠟 35聚乙二醇 20角鯊?fù)?2-乙基己酸十六醇酯5聚氧乙烯氫化蓖麻油5檸檬酸0.1檸檬酸鈉 0.2甘氨酸0.5透明質(zhì)酸鈉0.3苯氧基乙醇0.5墻草提取物1純化水補(bǔ)足香料 適量工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明,可以有效篩選抑制SCF生成和釋放的植物制劑。
權(quán)利要求
1.篩選通過(guò)抑制干細(xì)胞因子(以下稱(chēng)為SCF)的生成和/或釋放而顯示改善瘙癢、皮膚粗糙或皮膚敏感效果或皮膚增白效果的活性成分的方法,該方法的特征在于包括以下步驟使表達(dá)SCF的細(xì)胞與供試成分接觸,分析由所述細(xì)胞生成和/或釋放的SCF的量,并選擇可減少SCF生成和/或釋放量的供試成分作為活性成分,其中使所述表達(dá)SCF的細(xì)胞受到刺激以促進(jìn)SCF的生成和/或釋放。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的篩選方法,其中所述刺激是干燥刺激、紫外照射刺激或化學(xué)刺激。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的篩選方法,其中使所述表達(dá)SCF的細(xì)胞與所述供試成分接觸,之后使所述細(xì)胞受到刺激,然后分析所述細(xì)胞生成和/或釋放的SCF的量以選擇所述活性成分。
4.抑制SCF生成和/或釋放的皮膚外用制劑,其包含一種或多種選自如下的成分玫瑰提取物玫瑰水、大葉茶葉提取物、啤酒花提取物、山楂提取物、赤豆粉、白樺提取物、肉桂提取物、丁香提取物、山金車(chē)提取物、芍藥提取物、來(lái)檬、小球藻提取物、白花春黃菊提取物、紅茶提取物、桉樹(shù)提取物、粉狀蒼術(shù)提取物、粉狀白術(shù)提取物、粉狀烏龍茶提取物、芒柄花提取物、茜草科鉤藤提取物、葡萄葉提取物、防風(fēng)根提取物、桑樹(shù)皮提取物、墻草提取物、安息香樹(shù)提取物、甜葉菊提取物、柏木提取物、菖蒲提取物、大豆提取物、中國(guó)貓爪草提取物、肥皂草提取物、蜀葵提取物、otogiriso(小連翹)提取物和蒿屬植物提取物。
5.用于瘙癢的皮膚外用制劑,其包含抑制SCF生成和/或釋放的成分作為改善瘙癢的活性成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用于瘙癢的皮膚外用制劑,其中所述改善瘙癢的活性成分包括至少一種選自如下的成分啤酒花提取物、山楂提取物、赤豆粉、丁香提取物、白花春黃菊提取物、紅茶提取物、桉樹(shù)提取物、粉狀蒼術(shù)提取物、粉狀白術(shù)提取物、粉狀烏龍茶提取物、芒柄花提取物、防風(fēng)根提取物、墻草提取物、安息香樹(shù)提取物、甜葉菊提取物、菖蒲提取物、中國(guó)貓爪草提取物、肥皂草提取物、蜀葵提取物和otogiriso(小連翹)提取物。
7.用于預(yù)防皮膚粗糙的皮膚外用制劑,其包含抑制SCF生成和/或釋放的成分作為預(yù)防皮膚粗糙活性成分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用于預(yù)防皮膚粗糙的皮膚外用制劑,其中所述預(yù)防皮膚粗糙的活性成分包括至少一種選自以下的成分山楂提取物、粉狀蒼術(shù)提取物、粉狀白術(shù)提取物、芒柄花提取物、桑樹(shù)皮提取物、墻草提取物、安息香樹(shù)提取物、甜葉菊提取物、柏木提取物、菖蒲提取物、中國(guó)貓爪草提取物、肥皂草提取物和蜀葵提取物。
9.用于皮膚敏感的皮膚外用制劑,其包含抑制SCF生成和/或釋放的成分作為改善皮膚敏感的活性成分。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用于皮膚敏感的皮膚外用制劑,其中所述改善皮膚敏感的活性成分包括至少一種選自以下的成分玫瑰提取物玫瑰水、大葉茶葉提取物、啤酒花提取物、山楂提取物、赤豆粉、白樺提取物、肉桂提取物、丁香提取物、小球藻提取物、紅茶提取物、桉樹(shù)提取物、粉狀蒼術(shù)提取物、粉狀白術(shù)提取物、粉狀烏龍茶提取物、芒柄花提取物、茜草科鉤藤提取物、葡萄葉提取物、防風(fēng)根提取物、桑樹(shù)皮提取物、墻草提取物、安息香樹(shù)提取物、甜葉菊提取物、柏木提取物、菖蒲提取物、大豆提取物、中國(guó)貓爪草提取物、肥皂草提取物、蜀葵提取物、otogiriso(小連翹)提取物和蒿屬植物提取物。
11.用于皮膚增白的皮膚外用制劑,其包含抑制SCF生成和/或釋放的成分作為皮膚增白活性成分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的用于皮膚增白的皮膚外用制劑,其中所述皮膚增白活性成分包括一種或多種選自以下的成分玫瑰提取物玫瑰水、芒柄花提取物、茜草科鉤藤提取物、墻草提取物、安息香樹(shù)提取物、肥皂草提取物、小球藻提取物和桉樹(shù)提取物。
13.改善瘙癢、皮膚粗糙或皮膚敏感或增白皮膚的方法,其包括對(duì)人或哺乳動(dòng)物表皮施以通過(guò)抑制SCF生成和/或釋放而顯示改善瘙癢、皮膚粗糙或皮膚敏感效果或皮膚增白效果的活性成分。
14.一種藥物,包含抑制角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)答紫外線刺激而在內(nèi)部或細(xì)胞膜上所表達(dá)的SCF的成分。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物,其中所述成分是至少一種選自以下的成分玫瑰提取物玫瑰水、大葉茶葉提取物、啤酒花提取物、山楂提取物、赤豆粉、白樺提取物、肉桂提取物、丁香提取物、山金車(chē)提取物、芍藥提取物、來(lái)檬、小球藻提取物、白花春黃菊提取物、紅茶提取物、桉樹(shù)提取物、粉狀蒼術(shù)提取物、粉狀白術(shù)提取物、粉狀烏龍茶提取物、芒柄花提取物、茜草科鉤藤提取物、葡萄葉提取物、防風(fēng)根提取物、桑樹(shù)皮提取物、墻草提取物、安息香樹(shù)提取物、甜葉菊提取物、柏木提取物、菖蒲提取物、大豆提取物、中國(guó)貓爪草提取物、肥皂草提取物、蜀葵提取物、otogiriso(小連翹)提取物和蒿屬植物提取物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物,其中的成分是赤豆粉、山金車(chē)提取物、芒柄花提取物或安息香樹(shù)提取物。
全文摘要
本發(fā)明提供了篩選通過(guò)抑制干細(xì)胞因子(以下稱(chēng)為SCF)的生成和/或釋放而改善瘙瘁、皮膚粗糙或皮膚敏感或發(fā)揮增白效果的活性成分的方法,以及含有這些活性成分、用于改善皮膚瘙瘁、皮膚粗糙或皮膚敏感和/或增白的藥物。
文檔編號(hào)A61Q19/00GK1610828SQ0282632
公開(kāi)日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2002年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月27日
發(fā)明者蘆田豐, 青木宏文, 藤原留美子 申請(qǐng)人:株式會(huì)社資生堂
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