多西環(huán)素在制備治療或預(yù)防衰老性疾病的藥物中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及多西環(huán)素在制備治療和/或預(yù)防衰老性疾病的藥物中的用途，其中所述多西環(huán)素以小于2μg/ml的劑量施用，所述衰老性疾病主要包括皮膚老化、神經(jīng)退行性疾病、2型糖尿病、線粒體疾病和由高血脂與高膽固醇引發(fā)的動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病。多西環(huán)素在小于2μg/ml時可以減少成纖維細(xì)胞分泌的顆粒物，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增值以及降低III型膠原蛋白的表達(dá)量；還可以減少細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激性顆粒，促進(jìn)線粒體缺陷型細(xì)胞的增值；刺激胰島beta細(xì)胞的胰島素分泌以及肝臟細(xì)胞的胰島素敏感性；最后，多西環(huán)素能與脂肪代謝調(diào)節(jié)分子SREBP特異性結(jié)合，抑制脂肪與膽固醇合成。
【專利說明】
多西環(huán)素在制備治療或預(yù)防衰老性疾病的藥物中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及多西環(huán)素的新用途，具體地說，設(shè)及多西環(huán)素在制備和/或治療衰老性 疾病的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 多西環(huán)素(Doxycycline，DOC)是四環(huán)素家族的一種抗生素，別名脫氧±霉素、強(qiáng)力 霉素，屬于第Ξ代半合成四環(huán)素類廣譜抗生素。它是在四環(huán)素母環(huán)
[0003] 6α-位上脫氧而得到的一種半合成四環(huán)素。D0C具有四環(huán)素類藥物的共同特征，可 W絡(luò)合金屬離子，如化2+、化2+。主要作用于細(xì)菌核蛋白體30S亞基，干擾氨基酸t(yī)RNA與30S亞 基上的作用位點結(jié)合，阻斷氨基酷t(yī)RNA與核糖體mRNA復(fù)合體結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮 抑菌作用。
[0004]
[0005] 隨著對多西環(huán)素的深入廣泛研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素除了很強(qiáng)的抗菌和抗炎作用 夕h還具有多種其它方面的藥理作用。例如，有研究表明多西環(huán)素具有抗炎癥、抗氧化的作 用。另一方面多西環(huán)素可W抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性從而作用于腫瘤細(xì)胞，影響腫瘤細(xì) 胞的增殖調(diào)亡、侵襲轉(zhuǎn)移等過程。雖然關(guān)于多西環(huán)素的研究越來越多，其生物學(xué)意義和臨床 應(yīng)用也獲得深入研究，但是，到目前為止，還沒有多西環(huán)素在衰老性疾病方面的相關(guān)研究和 應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的主要目的是擴(kuò)展多西環(huán)素的應(yīng)用范圍，尤其是其在衰老性疾病預(yù)防和/ 或治療方面的新的制藥用途，從而為治療和/或預(yù)防衰老性疾病提供新的方法和策略。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：多西環(huán)素在制備治療和/或預(yù)防衰老性疾病的藥物中的 用途，其中所述多西環(huán)素 W等于或小于化g/ml的劑量施用；其中所述衰老性疾病包括皮膚 老化、神經(jīng)退行性疾病、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、冠屯、病。本發(fā)明人經(jīng)過大量的研究發(fā)現(xiàn)， 低濃度(等于或低于化g/ml)的多西環(huán)素能夠促進(jìn)細(xì)胞(例如，NIH3T3,化La細(xì)胞和INS-1細(xì) 胞)的生長，降低III型膠原蛋白表達(dá)量，減少細(xì)胞中的應(yīng)激性顆粒，增加膜島分泌量和敏感 性等作用。而一旦多西環(huán)素的作用濃度大于化g/ml，其在上述某些方面具有完全相反的作 用，導(dǎo)致總體作用效果大幅下降。
[000引作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述衰老性疾病為皮膚老化。隨著年齡 增長，皮膚老化突顯，可表現(xiàn)為皮膚干燥粗糖，皺紋增多、加深，皮膚松弛，彈性下降。
[0009] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述皮膚老化由成纖維細(xì)胞數(shù)量減少而 引起。成纖維細(xì)胞是皮膚真皮中最主要的細(xì)胞成分，在合成分泌纖維和細(xì)胞外基質(zhì)中扮演 著重要的角色。皮膚老化的臨床表現(xiàn)都與成纖維細(xì)胞數(shù)量減少、合成功能下降或異常有關(guān)。 成纖維細(xì)胞既合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白，生成膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和彈性纖維，也合 成和分泌糖胺多糖和糖蛋白質(zhì)等基質(zhì)成分。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素在低至化g/ ml的濃度作用時，可W明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長。
[0010] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述皮膚老化由III型膠原蛋白表達(dá)量 提高而引起。研究發(fā)現(xiàn)在皮膚成纖維細(xì)胞的衰老過程中膠原蛋白的表達(dá)分泌會發(fā)生明顯改 變。膠原蛋白隨著年齡的增加而流失、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，組成比例和代謝平衡都有變化。皮膚 結(jié)構(gòu)的松弛、皺紋的產(chǎn)生都與膠原蛋白息息相關(guān)。在嬰兒和青年人皮膚中，I型膠原蛋白含 量約占70%，111型膠原蛋白占30%。在衰老過程中，成纖維細(xì)胞合成ΙΠ 型膠原蛋白增加 ，I 型膠原蛋白減少。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素在低至化g/ml的濃度作用時，可W提高 I型膠原蛋白表達(dá)量，降低ΠΙ型膠原蛋白表達(dá)量，實現(xiàn)皮膚年輕化。
[0011] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述皮膚老化由細(xì)胞分泌的顆粒物增加 而引起。細(xì)胞分泌的顆粒物會排到細(xì)胞外，而且細(xì)胞表面粗糖。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，多 西環(huán)素在低至化g/ml的濃度作用時，細(xì)胞外的顆粒物質(zhì)明顯減少，細(xì)胞表面更光滑。
[0012] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述衰老性疾病為神經(jīng)退行性疾病。近 年來采用組織化學(xué)方法在人腦中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)不溶性沉積物(包涵體），進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)些 沉積物是由于某些蛋白質(zhì)異常聚集或淀粉樣化形成的，是某些神經(jīng)退行性疾病的主要致病 原因。
[0013] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述神經(jīng)退行性疾病由應(yīng)激性顆粒而引 起。應(yīng)激性顆粒是用于儲存、修復(fù)或者降解RNA的場所，如果mRNA不能正常翻譯，運(yùn)些mRNA會 被儲存在應(yīng)激性顆粒中，進(jìn)行修復(fù)，一旦無法修復(fù)，會被降解。應(yīng)激性顆粒的增加，會導(dǎo)致各 種神經(jīng)退行性疾病，例如，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、阿茲海默癥等。本發(fā)明人在研究中發(fā) 現(xiàn)，多西環(huán)素在低至化g/ml的濃度作用時，可W明顯減少細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激性顆粒。
[0014] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述神經(jīng)退行性疾病由損傷性線粒體而 引起。線粒體是細(xì)胞功能代謝中屯、，同時也是環(huán)境化學(xué)外源物毒害作用的優(yōu)先祀標(biāo)，線粒體 損傷包括形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞、線粒體DNA突變等，線粒體與細(xì)胞衰老之間有明密切的關(guān)系。本發(fā) 明人在研究中發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞經(jīng)過邸(漠化乙錠)處理后，會發(fā)生線粒體損傷而死亡，而在適 合濃度的多西環(huán)素存在的情況下，經(jīng)過邸處理的細(xì)胞依然可W生長。也就是說，適合濃度的 多西環(huán)素可W保護(hù)細(xì)胞免受線粒體損傷的影響。
[0015] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述衰老性疾病為2型糖尿病。糖尿病是 一種與衰老相關(guān)的疾病，特別是2型糖尿病，衰老會導(dǎo)致膜島細(xì)胞分泌膜島素能力和敏感性 嚴(yán)重下降，而且難W抵抗外界刺激壓力，最終導(dǎo)致功能缺失或者調(diào)亡。
[0016] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述2型糖尿病為膜島beta細(xì)胞調(diào)亡引 起。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素在低至化g/ml的濃度作用時，可W明顯促進(jìn)膜島be化 細(xì)胞的增殖。
[0017] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述2型糖尿病為膜島素分泌不足引起。 本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素在低至化g/ml的濃度作用時，可W明顯促進(jìn)膜島素的分 泌。
[0018] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述2型糖尿病為膜島素阻抗引起。膜島 素阻抗主要發(fā)生在肝臟、肌肉和脂肪組織。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素在低至化g/ml 的濃度作用時，可W明顯促進(jìn)肝臟細(xì)胞的生長及對膜島素的敏感性。
[0019] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述衰老性疾病為由高血脂與高膽固醇 引發(fā)的動脈粥樣硬化、冠屯、病等屯、血管疾病。由高血脂與高膽固醇引發(fā)的動脈粥樣硬化、冠 屯、病等屯、血管疾病主要是由于脂肪代謝通路異常，大量脂肪與膽固醇存在于血液中，從而 誘發(fā)相關(guān)疾病。
[0020] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述屯、血管疾病為脂肪代謝異常引起。 在膽固醇水平不足的情況下，細(xì)胞內(nèi)的脂肪代謝調(diào)節(jié)分子SREBP(固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白） 會被激活并與細(xì)胞DNA結(jié)合，促進(jìn)脂肪合成;在膽固醇水平過高的情況下，SREBP受到抑制， 阻礙脂肪合成。本發(fā)明人通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素與SR邸P可發(fā)生特異性結(jié)合， 抑制SREBP激活，阻礙脂肪和膽固醇合成，減少細(xì)胞內(nèi)的脂肪滴，從而降低血脂和膽固醇水 平。
[0021] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述多西環(huán)素 W等于或小于化g/ml的劑 量施用。
[0022] 作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，其中所述多西環(huán)素也包含化學(xué)修飾的各種四 環(huán)素，包括:四環(huán)素、米諾霉素等。
[0023] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素能有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長，促進(jìn)I型膠原蛋白表達(dá)，降 低ΠΙ型膠原蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞分裂的顆粒物質(zhì)，實現(xiàn)細(xì)胞的年輕化。多西環(huán)素還能減 少細(xì)胞在EB誘導(dǎo)后的應(yīng)激性顆粒，延緩神經(jīng)退行性疾病。另外一方面，多西環(huán)素可W保護(hù)細(xì) 胞免受線粒體損傷的影響，實現(xiàn)細(xì)胞的活力增強(qiáng)，并實現(xiàn)年輕化。而且，多西環(huán)素能還促進(jìn) 膜島beta細(xì)胞的生長，而且能有效提高膜島素的分泌量和敏感性。最后，多西環(huán)素能與脂肪 代謝調(diào)節(jié)分子SREBP特異性結(jié)合，抑制脂肪和膽固醇的合成。因此，多西環(huán)素為治療和/或預(yù) 防衰老性疾病提供新的方法和策略。
【附圖說明】
[0024] 圖1為顯示多西環(huán)素對NIH3T3成纖維細(xì)胞外顆粒物的影響的顯微鏡觀察圖。
[0025] 圖2為顯示多西環(huán)素對NIH3T3成纖維細(xì)胞生長的影響的柱狀圖。
[00%] 圖3為顯示多西環(huán)素對NI冊T3成纖維細(xì)胞III型膠原蛋白表達(dá)量的影響的western blot 圖。
[0027] 圖4為顯示多西環(huán)素對化La細(xì)胞和邸處理后的化La細(xì)胞的影響的顯微鏡觀察圖。
[0028] 圖5為顯示多西環(huán)素對化La細(xì)胞和邸處理后的化La細(xì)胞數(shù)量的影響的柱狀圖。
[0029] 圖6為顯示多西環(huán)素對線粒體缺陷型化La細(xì)胞增殖的影響的顯微鏡觀察圖。
[0030] 圖7為顯示多西環(huán)素對線粒體缺陷型化La細(xì)胞增殖的影響的柱狀圖。
[0031] 圖8為顯示多西環(huán)素促進(jìn)線粒體缺陷型化La細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激性顆粒減少的顯微鏡觀察 圖。
[0032] 圖9為顯示多西環(huán)素促進(jìn)線粒體缺陷型化La細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激性顆粒減少的免疫巧光染 色圖。
[0033] 圖10為顯示INS-1膜島beta細(xì)胞在不同濃度多西環(huán)素條件下培養(yǎng)24h的顯微鏡觀 察圖。
[0034] 圖11為顯示INS-1膜島beta細(xì)胞在不同濃度多西環(huán)素條件下培養(yǎng)4她的顯微鏡觀 察圖。
[0035] 圖12為顯示INS-1膜島beta細(xì)胞在不同濃度多西環(huán)素條件下培養(yǎng)72h的顯微鏡觀 察圖。
[0036] 圖13為顯示INS-1膜島be化細(xì)胞在不同濃度多西環(huán)素條件下培養(yǎng)2地、4她和7化的 流式細(xì)胞計數(shù)圖。
[0037] 圖14為顯示INS-1膜島beta細(xì)胞在不同濃度多西環(huán)素條件下培養(yǎng)4她后膜島素總 量的柱狀圖。
[0038] 圖15為顯示INS-1膜島beta細(xì)胞在不同濃度多西環(huán)素條件下培養(yǎng)4她后高糖刺激 膜島素分泌量的柱狀圖。
[0039] 圖16為顯示多西環(huán)素對高糖刺激下的膜島素分泌敏感性影響的柱狀圖。
[0040] 圖17為顯示肝臟細(xì)胞在多西環(huán)素條件下培養(yǎng)7化的顯微鏡觀察圖。
[0041] 圖18為顯示羅丹明-多西環(huán)素復(fù)合物與SREBP特異性結(jié)合，并定位在細(xì)胞核周圍與 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微鏡觀察圖。
【具體實施方式】
[0042] 實施例1:多西環(huán)素減少NI冊T3成纖維細(xì)胞外顆粒物
[0043] 在96孔板每孔接種IxlO4個NIH3T3細(xì)胞(成纖維細(xì)胞），分別用0、化g/ml、化g/ml、5 μg/ml、10μg/ml、20μg/ml濃度的多西環(huán)素處理。在倒置顯微鏡下分別對不同濃度DOC處理后 的細(xì)胞進(jìn)行拍照，結(jié)果如圖1所示。在圖1中，0XD0C、1XD0C、2XD0C、5XD0C、10XD0C、20XD0C分 別表示多西環(huán)素處理細(xì)胞的濃度為0、：Lμg/ml、aig/ml、扣g/ml、lOμg/ml、20μg/ml。10X為10: 10倍物鏡;20X為20:20倍物鏡。由圖1可W看出，與未加多西環(huán)素的細(xì)胞相比，加入多西環(huán)素 后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的顆粒物質(zhì)明顯減少，成纖維細(xì)胞表面更為光滑。
[0044] 實施例2:多西環(huán)素促進(jìn)成NI冊T3纖維細(xì)胞生長
[0045] 在96孔板每孔接種IxlO4的NI冊T3細(xì)胞，分別用0、化g/ml、2μg/ml、扣g/ml、lOyg/ ml、2化g/ml濃度的多西環(huán)素處理24小時、48小時、72小時。立個時間點后，分別用流式細(xì)胞 儀對不同濃度D0C處理后的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可W看出，與沒有加入D0C 的細(xì)胞相比，在24h時，各個濃度的D0C都可W促進(jìn)細(xì)胞生長;到了4她和7化后，2μg/ml的D0C 依然可W促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長，然而隨著D0C濃度的增加，反而會逐漸抑制成纖維細(xì)胞的 生長。
[0046] 實施例3:多西環(huán)素減少NIH3T3成纖維細(xì)胞ΙΠ 型膠原蛋白的表達(dá)量
[0047] 在6孔板每孔接種30xl04的NIH3T3細(xì)胞，用0、化g/ml濃度的多西環(huán)素分別處理24 小時和72小時，然后用RAPI裂解法提取總蛋白，測定蛋白濃度后，每條泳道上樣50yg總蛋 白，進(jìn)行western blot，結(jié)果如圖3所示。由圖3可W看出，與沒有加入D0C相比，2μg/ml的D0C 可W明顯減低ΠΙ型膠原蛋白的表達(dá)量。
[004引實施例4:多西環(huán)素對化La細(xì)胞和邸處理后化La細(xì)胞的影響
[0049] 將化La細(xì)胞和加入邸處理的化La細(xì)胞(加入邸后，細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài))分別用0、化 g/ml、化g/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml濃度的多西環(huán)素處理4天，在倒置顯微鏡下分別對 不同濃度D0C處理后的細(xì)胞進(jìn)行拍照，結(jié)果如圖4所示。同時，分別用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行 計數(shù)，計數(shù)前經(jīng)艦化丙晚(PI)染色，除去死亡細(xì)胞，結(jié)果如圖5所示。由圖4和圖5(A)可W看 出，對于未經(jīng)邸處理的化La細(xì)胞而言，與沒有加入D0C的細(xì)胞相比，lyg/m巧日化g/ml的D0C可 W促進(jìn)細(xì)胞的生長，然而隨著D0C濃度的增加，反而會逐漸抑制細(xì)胞的生長；由圖4和圖5 (B)，可W看出對于經(jīng)邸處理的化La細(xì)胞而言，未加入DO別寸，細(xì)胞生長狀態(tài)明顯下降，加入 D0C可W促進(jìn)細(xì)胞的生長，尤其是D0C的濃度為化g/m巧日化g/ml時，促進(jìn)作用非常明顯，然而 隨著D0C濃度的增加，促進(jìn)作用逐漸減弱，但依然存在促進(jìn)作用?？蒞看出，合適濃度的多西 環(huán)素可W保護(hù)細(xì)胞免受線粒體損傷的影響，并促進(jìn)細(xì)胞的生長。
[0050] 實施例5:多西環(huán)素對線粒體缺陷型細(xì)胞的影響
[0051] 先用EB處理化La細(xì)胞12天，使得化La細(xì)胞的線粒體發(fā)生缺失。然后分別用0、化g/ ml、2μg/ml、扣g/ml、lOμg/ml、20μg/ml濃度的西環(huán)素處理4天。在倒置顯微鏡下分別對不同 濃度D0C處理后的細(xì)胞進(jìn)行拍照，結(jié)果如圖6所示。同時，分別用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行計 數(shù)，計數(shù)前經(jīng)艦化丙晚(PI)染色，除去死亡細(xì)胞，結(jié)果如圖7所示。由圖6和圖7可W看出，對 于經(jīng)EB處理的線粒體已發(fā)生缺失的化La細(xì)胞，與沒有加入D0C的細(xì)胞相比，隨著DO切農(nóng)度的 增加，細(xì)胞量也逐漸增加，也就是線粒體缺失的條件下，低濃度D0C不足W保護(hù)細(xì)胞，而高濃 度D0C才可W保護(hù)細(xì)胞，表明D0C不但可W通過調(diào)節(jié)線粒體而促進(jìn)細(xì)胞生長的，而且可能在 線粒體缺失的條件下，高濃度D0C可W通過其他通路保護(hù)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞生長。
[0052] 實施例6:多西環(huán)素對線粒體缺陷型化La應(yīng)激性顆粒的影響。
[0化3]用0、化g/ml濃度的多西環(huán)素分別處理EB處理后化La細(xì)胞4天、8天和12天，在運(yùn)Ξ 個時間點后用顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激性顆粒，同時對細(xì)胞進(jìn)行免疫巧光染色(4%多聚甲 醒固定20分鐘，0.2%曲拉通處理20分鐘，一抗G3BP1 (應(yīng)激小體)解育2小時，二抗紅色巧光 解育1小時，DAPI染色5分鐘），置于共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果如圖8和圖9所示，D4、D8、D2分別 代表第4天、第8天、第12天。由圖8和圖9可W看出，與沒有加入D0C的細(xì)胞相比，加入化g/ml DOC處理的細(xì)胞中的應(yīng)激性顆粒（即圖8中細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒物，圖9中的紅色巧光）明顯減 少。
[0054] 實施例7:多西環(huán)素對INS-1膜島Be化細(xì)胞生長的影響
[005引用膜酶消化并收集6孔板的INS-1細(xì)胞(膜島瘤細(xì)胞），用新鮮的DMEM重懸后，將其 W20 %的密度均勻鋪到96孔板，并分別加入0μg/ml，化g/ml，2μg/ml，扣g/ml，10μg/ml，20μ g/ml濃度的DOC,每個濃度3個復(fù)孔;分別培養(yǎng)24h，4她，72h后，用倒置巧光顯微鏡拍攝不同 DO切農(nóng)度條件下INS-1細(xì)胞10X、20X、40X的圖片，每個濃度每個孔分別取3~5個視野，結(jié)果如 圖10~12所示。由圖10~12可W看出，與沒有加入D0C的細(xì)胞相比，當(dāng)D0C濃度為化g/ml和化 g/ml時，可W明顯促進(jìn)INS-1細(xì)胞的生長，然而，隨著DO切農(nóng)度的增加，運(yùn)種促進(jìn)作用明顯逐 漸減弱。
[0056] 實施例8:細(xì)胞流式術(shù)檢測多西環(huán)素對INS-1膜島Be化細(xì)胞生長的影響
[0057] 用膜酶消化并收集6孔板的INS-1細(xì)胞，用新鮮的DMM重懸后，將其W20%的密度 均勻鋪到96孔板，并分別加入0μg/ml，lμg/ml，化g/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml濃度的 DOC,每個濃度至少5個復(fù)孔;分別培養(yǎng)24h、4她、7化后，用膜酶消化并收集各組96孔細(xì)胞，通 過流式細(xì)胞術(shù)檢測INS-1細(xì)胞數(shù)，結(jié)果圖13所示。由圖13可W看出，與沒有加入DOC的細(xì)胞相 比，當(dāng)D0C濃度為化g/m巧日化g/ml時，可W明顯促進(jìn)INS-1細(xì)胞的生長，然而，隨著D0C濃度的 增加，運(yùn)種促進(jìn)作用明顯逐漸減弱，該結(jié)果與實施例7的結(jié)果一致。
[0化引實施例9:化ISA法檢測多西環(huán)素對INS-1細(xì)胞胞內(nèi)膜島素的影響。
[0059] 用膜酶消化并收集6孔板的INS-1細(xì)胞，用新鮮的DMM重懸后，將其W30%的密度 均勻鋪到96孔板，并分別加入0μg/ml，化g/ml，化g/ml，化g/ml，10μg/ml，20μg/ml濃度的D0C 濃度的DOC，每個濃度至少5個復(fù)孔;培養(yǎng)4她后，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，膜酶消化并收集各組 細(xì)胞沉淀，1.5%鹽酸乙醇解育20分鐘，-80°C/4 °C反復(fù)凍融3次，離屯、取上清，用化ISA檢測 分泌的膜島素的總量，結(jié)果如圖14所示。由圖14可W看出，與沒有加入D0C的細(xì)胞相比，當(dāng) DO切農(nóng)度為化g/ml和化g/ml時，INS-1細(xì)胞的膜島素分泌量明顯增加，然而，隨著D0C濃度的 增加，INS-1細(xì)胞的膜島素分泌量逐漸降低。
[0060] 實施例10:ELISA法檢測多西環(huán)素對INS-1細(xì)胞的葡萄糖刺激的膜島素分泌量 [0061 ]用膜酶消化并收集6孔板的INS-1細(xì)胞，用新鮮的DMM重懸后，將其W30%的密度 均勻鋪到96孔板，分別加入0μg/ml，lμg/ml，化g/ml，扣g/ml，10μg/ml，20μg/ml濃度的D0C， 每個濃度至少5個復(fù)孔;培養(yǎng)4她后，棄培養(yǎng)液，KRB緩沖液洗1次，先用不含葡萄糖的KRB緩沖 液解育化，再用含25mM葡萄糖的KRB緩沖液解育8小時，收集上清，PBS洗涂2次，用RIPA裂解 細(xì)胞，收集并離屯、，取上清進(jìn)行BCA蛋白測定。結(jié)果如圖15所示。由圖15可W看出，在高濃度 的葡萄糖刺激下，與沒有加入D0C的細(xì)胞相比，當(dāng)DO切農(nóng)度為化g/ml和化g/ml時，INS-1細(xì)胞 的膜島素分泌量增加，然而，隨著DO切農(nóng)度的增加，INS-1細(xì)胞的膜島素分泌量逐漸降低，當(dāng) D0C濃度高至20μg/ml時，膜島素的分泌被抑制。
[0062] 實施例11:ELISA法檢測多西環(huán)素對INS-1細(xì)胞的葡萄糖刺激后不同時間點的膜島 素分泌量
[0063] 用膜酶消化并收集6孔板的INS-1細(xì)胞，用新鮮的DMM重懸后，將其W30%的密度 均勻鋪到96孔板，分別加入化g/m巧日化g/ml濃度的D0C，每個濃度至少5個復(fù)孔;培養(yǎng)4她后， 棄培養(yǎng)液，KRB緩沖液洗1次，先用不含葡萄糖的KRB緩沖液解育化，再用含25mM葡萄糖的KRB 緩沖液解育后的15min、30min、化、2h和4h 5個時間點，收集上清，PBS洗涂2次，用RIPA裂解 細(xì)胞，收集并離屯、，取上清進(jìn)行BCA蛋白測定，結(jié)果如圖16所示。由圖16可W看出，在高濃度 的葡萄糖刺激下，與沒有加入D0C的細(xì)胞相比，當(dāng)DCX：濃度為lμg/ml時，在各個時間點INS-1 細(xì)胞的膜島素分泌量均有增加，尤其在葡萄糖刺激后15分鐘和30分鐘時，膜島素的分泌量 相差顯著。
[0064] 實施例12:多西環(huán)素促進(jìn)成LM3肝臟細(xì)胞生長
[0065] 在96孔板每孔接種IxlO4個LM3肝臟細(xì)胞，分別用0和化g/ml濃度的多西環(huán)素處理。 在倒置顯微鏡下分別對不同濃度D0C處理后的細(xì)胞進(jìn)行拍照，結(jié)果如圖17所示。在圖17中， 0XD0C、1XD0C、分別表示多西環(huán)素處理細(xì)胞的濃度為0、化g/ml。10X為10:10倍物鏡。由圖17 可W看出，與未加多西環(huán)素的細(xì)胞相比，加入多西環(huán)素后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的顆粒物質(zhì)明顯減 少，LM3肝臟細(xì)胞表面更為光滑，細(xì)胞生長加快，說明多西環(huán)素有利于降低膜島素阻抗，因為 肝臟細(xì)胞的膜島素阻抗是產(chǎn)生2型糖尿病的一個重要原因。
[0066] 實施例13:羅丹明-多西環(huán)素與SREBP的結(jié)合及其在細(xì)胞中的定位
[0067] SREBP與脂肪和膽固醇的合成相關(guān)，本發(fā)明人經(jīng)過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SREBP蛋 白可能與多西環(huán)素特異性結(jié)合。為了驗證此推斷，利用化學(xué)合成方法，合成了羅丹明-多西 環(huán)素復(fù)合物，使多西環(huán)素化被標(biāo)記上紅色巧光，然后通過免疫化學(xué)方法，對Ad293細(xì)胞用4 % 多聚甲醒固定，PBS洗Ξ次，加入羅丹明-多西環(huán)素復(fù)合物，解育30小時后用PBS洗Ξ次，置于 共聚焦顯微鏡下觀察?？蒞觀察得到，細(xì)胞的核膜周圍和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處發(fā)出紅色巧光，表明羅丹 明-多西環(huán)素復(fù)合物與定位在核膜周圍和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的物質(zhì)特異性結(jié)合，而SREBP在沒有被激活 的情況下，是定位在核膜周圍和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處，因此，SREBP可與多西環(huán)素特異性結(jié)合。
【主權(quán)項】
1. 多西環(huán)素在制備治療和/或預(yù)防衰老性疾病的藥物中的用途，其中所述多西環(huán)素以 等于或小于2μg/ml的劑量施用； 其中所述衰老性疾病包括皮膚老化、神經(jīng)退行性疾病、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、冠心 病。2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述衰老性疾病為皮膚老化。3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述皮膚老化由成纖維細(xì)胞數(shù)量減少而引起。4. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述皮膚老化由I型膠原蛋白表達(dá)量下降而III型膠 原蛋白表達(dá)量提尚而引起。5. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述皮膚老化由細(xì)胞分泌的顆粒物增加而引起。6. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述衰老性疾病為神經(jīng)退行性疾病。7. 如權(quán)利要求6所述的用途，其中所述神經(jīng)退行性疾病由應(yīng)激性顆粒引起。8. 如權(quán)利要求6所述的用途，其中所述神經(jīng)退行性疾病由損傷性線粒體而引起。9. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述衰老性疾病為2型糖尿病。10. 如權(quán)利要求9所述的用途，其中所述2型糖尿病由胰島Beta細(xì)胞增殖障礙引起。11. 如權(quán)利要求9所述的用途，其中所述2型糖尿病由胰島素釋放不足引起。12. 如權(quán)利要求9所述的用途，其中所述2型糖尿病由胰島素阻抗引起。13. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述衰老性疾病為動脈粥樣硬化和/或冠心病。14. 如權(quán)利要求13所述的用途，其中所述動脈粥樣硬化和/或冠心病由脂肪代謝異常引 起。15. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述多西環(huán)素包含化學(xué)修飾的四環(huán)素和米諾霉素。
【文檔編號】A61P5/50GK105998037SQ201610427906
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】魏熾炬, 林浩鵬, 王娜, 潘峰, 鄭德錦
【申請人】汕頭大學(xué)