專利名稱：普洱茶在制備抗免疫衰老或其相關(guān)疾病的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗免疫衰老或其相關(guān)疾病的藥物，具體涉及普洱茶在制備抗免疫 衰老或其相關(guān)疾病的藥物或保健品中的用途。
背景技術(shù)：
普洱茶作為云南省特有的歷史名茶，以其獨特的加工工藝和保健功能聞名于海內(nèi) 外。但普洱茶的保健功能大多為長期經(jīng)驗總結(jié)或民間流傳，缺乏科學(xué)依據(jù)。目前對于普洱茶 功效的研究主要是針對非衰老實驗動物進行的。而在實際應(yīng)用過程中，普洱茶提取物還對 老年人群具有多方面的保健功效，而對老年人群的保健作用的原理至今還未得到確實的、 科學(xué)的闡明。免疫衰老(immunosenescence)是指伴隨衰老，機體出現(xiàn)進行性免疫衰退的現(xiàn) 象(Aw D, Silva AB, Palmer DB.2007. Immunosenescence :emerging challenges for an ageing population. Immunology. 120(4) :435_46)，其表現(xiàn)為老年人群易患感染、癌癥等疾 病，并對預(yù)防接種反應(yīng)低下等狀態(tài)。雖然免疫衰老的變化涉及體內(nèi)多種細胞和因子，但最 主要的變化為獲得性免疫系統(tǒng)的初始T細胞(naYveT lymphocyte)隨年齡增長逐漸減 少，與此同時，記憶 T 細胞(memory T lymphocyte)卻大量積聚(Vallejo AN. 2007. Immune remodeling :lessons from repertoire alterations during chronologicalaging and in immune-mediated disease. Trends Mol Med. 13(3) :94_102)。在固有的免疫系統(tǒng)中，維 持日常免疫功能的免疫細胞主要為自然殺傷細胞，即NK細胞，其伴隨衰老而減少。這些變 化的后果是機體內(nèi)針對新入侵病原體的保護細胞減少，即有效抗感染的“武器”減少，結(jié)果 導(dǎo)致老年人群的抗感染能力下降，同時導(dǎo)致機體炎性細胞和因子增多，即老年人群并不僅 僅表現(xiàn)為免疫功能低下，還表現(xiàn)出慢性炎癥過程，如血液中的炎性因子(pro-inflammatory cytokines)，如 IL—6 等的水平增高(Gupta S, Agrawal A, Agrawal S, et al. 2006. A paradox of immunodeficiency and inflammation inhuman aging :lessons learned from apoptosis. Immun Ageing. 3 5)。這些炎癥因子參與常見老年性疾病的發(fā)病機制。上述證據(jù)提示衰老機體處于免疫低下與慢性炎癥并存的狀態(tài)，因此單純免疫增強 或單純抗炎手段可能并不是理想的抗衰老策略。針對衰老的雙重表現(xiàn)和機制，逆轉(zhuǎn)衰老的 上述病理變化可能更有助于提高抗衰老的實際效果。從抗免疫衰老與抗炎的雙重用途探討 普洱茶及其提取物的功效迄今未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了對普洱茶的保健功效進行科學(xué)實驗的確證，特別是研究證明其對衰老以及老 年常見病患者的保健作用，本發(fā)明針對普洱茶對老年人群的衰老免疫調(diào)節(jié)功能以及作用機 理等進行了系列研究，闡明其治療、保健功能并探討其作用機理，目的在于提供一種有效預(yù) 防和/或治療免疫衰老或其相關(guān)疾病的藥物或保健品。用于實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下
普洱茶或其提取物在制備預(yù)防和/或治療免疫衰老或其相關(guān)疾病的藥物或保健 品中的用途。優(yōu)選地，免疫衰老為老年人的免疫衰老。在上述用途中，免疫衰老或其相關(guān)疾病可以選自抗感染能力下降；癌癥；預(yù)防接 種反應(yīng)下降；慢性炎癥，例如動脈粥樣硬化，慢性腸道炎性疾病，骨質(zhì)疏松癥，II型糖尿病和 慢性關(guān)節(jié)炎；以及DNA損傷誘發(fā)的衰老和疾病，例如DNA損傷誘發(fā)的癌癥中的一種或多種。 其中，抗感染能力下降具體為感染發(fā)生率提高和/或感染嚴(yán)重程度增加；慢性腸道炎性疾 病具體為克羅恩氏病和/或潰瘍性結(jié)腸炎。在上述用途中，普洱茶可以為普洱茶生茶和/或普洱茶熟茶。優(yōu)選地，普洱茶提取 物為普洱茶水提取物。普洱茶提取物的制備方法可以包括將普洱茶加水煮沸后過濾，取濾液。具體來說， 普洱茶提取物的制備方法可以包括以下步驟(1)將普洱茶加水煮沸20分鐘，普洱茶與水的質(zhì)量比為1 20;(2)過濾，再將普洱茶加水煮沸20分鐘，普洱茶與水的質(zhì)量比為1 20 ；(3)過濾，再將普洱茶加水煮沸10分鐘，普洱茶與水的質(zhì)量比為1 10 ；(4)合并濾液，減壓濃縮。上述藥物還可以包含藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。本發(fā)明的實驗結(jié)果表明，普洱茶提取物具有逆轉(zhuǎn)衰老機體免疫功能低下與慢性 炎癥并存的病理狀態(tài)的功效，因而可適用于抗衰老免疫以及由衰老免疫異常所導(dǎo)致的老 年性疾病的預(yù)防、保健或治療，其中包括預(yù)防老年人感染，降低其感染的嚴(yán)重程度，加快感 染痊愈等用途。此外，由于炎性因子，特別是IL-6等參與了許多老年慢性炎性疾病的發(fā) 病機制，如動脈粥樣硬化(atherosclerosis)、骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)、II型糖尿病 (Type2Diabetes)、慢性關(guān)節(jié)炎(chronic arthritis)、克羅恩(Crohn)氏病、潰瘍性結(jié)腸 炎(ulcerative colitis)，而本發(fā)明證明普洱茶或其提取物可減低衰老動物炎性因子的水 平，因而有利于上述老年疾病的預(yù)防、保健或治療。本發(fā)明的有益效果包括(1)對普洱茶的抗衰老免疫作用及其原理進行了研究分 析，拓展了普洱茶或其提取物的應(yīng)用范圍；(2)證明了普洱茶或其提取物具有通過逆轉(zhuǎn)衰 老免疫細胞(降低記憶性T細胞以及增加NK細胞)的作用，增強減退的免疫功能，同時抑 制衰老機體炎癥反應(yīng)過亢的雙重作用，能夠?qū)崿F(xiàn)抗免疫衰老的目的。為了觀察普洱茶或其提取物的抗衰老免疫作用，本發(fā)明采用國際上公認的衰老動 物模型 _ 快速老化亞系(Senescence accelerated mouse/prone, SAM—P8 系，8 月齡)為 實驗觀察動物。同時采用抗快速老化亞系(Senescence accelerated mouse/resistance, SAM-R1系，8月齡)為青年對照鼠。月齡的選擇依據(jù)國際上選擇P系、R系的主要標(biāo)準(zhǔn)，即 老化度評分，結(jié)果顯示SAM-P8鼠在8月齡時衰老程度表現(xiàn)明顯突出，而同月齡的SAM-R1鼠 處于青壯年階段。本發(fā)明通過給SAM-P8鼠(8月齡)灌喂不同劑量的普洱茶提取物。用藥一個月后， 通過用流式細胞技術(shù)方法，分析動物外周血與脾中淋巴細胞中與衰老免疫有關(guān)細胞亞群的 比例，同時分析血漿中與衰老有關(guān)的淋巴細胞因子水平的變化。實驗結(jié)果顯示，快速老化鼠 SAM-P8血液中的初始性T細胞(NaYve T)在外周血淋巴細胞中所占的比例明顯低于抗老 化鼠SAM-R1 (青年鼠)，而記憶性T細胞(memory T)在外周血淋巴細胞中的比例則明顯高于抗老化鼠SAM-R1，P < 0. 001。不同劑量的普洱茶生茶和熟茶提取物均能顯著升高脾臟 細胞中初始T淋巴細胞(NaifveT)的比例，p < o. 05-0.001。不同劑量的普洱茶生茶和熟 茶提取物均能顯著降低血液中的記憶性T淋巴細胞的比例，P < 0. 05-0. 001。對血液中的 初始性T細胞的比例未顯示明顯的作用，P > 0. 05。初始T細胞的下降與記憶T細胞的積 聚是衰老免疫最顯著的特征之一。此外，自然殺傷細胞是機體固有免疫系統(tǒng)中的主要細胞?？焖倮匣骃AM-P8血液 中的自然殺傷細胞(natural killer,NK)在外周血淋巴細胞中所占的比例明顯低于抗老化 鼠SAM-R1，P < 0. 001。不同劑量的普洱茶提取物均能顯著增加血液中的NK細胞在外周血 淋巴細胞中所占的比例，P < 0. 001。白細胞介素-6(IL_6)是機體主要的炎性因子之一，其參與許多老年疾病炎癥的 病理過程?？焖倮匣骃AM-P8血液中的炎性細胞因子IL-6的含量與抗老化鼠SAM-R1相 比明顯增高，P < 0. 001。普洱茶生茶的各個劑量組與普洱茶熟茶的各個劑量組的血清IL-6 含量顯著降低，P < 0. 05-0. 001。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖1 不同濃度的普洱茶生茶和熟茶提取物對衰老小鼠SAM脾淋巴細胞初始 T(Naive T lymphocytes)細胞比例的影響。數(shù)值均以均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。###P < 0. 001， SAM-P8 與 SAM-R1 比較；< 0. 001，*P < 0. 05，各治療組與 SAM-P8 比較。P8 :SAM_P8 快 速老化鼠；R1 :SAM-R1抗老化青年鼠；生茶-低生茶低劑量組125mg/kg ；生茶-中生茶中 劑量組250mg/kg ；生茶-高生茶高劑量組500mg/kg ；熟茶-低熟茶低劑量組125mg/kg ； 熟茶_中熟茶中劑量組250mg/kg ；熟茶-高熟茶高劑量組500mg/kg。圖2 不同濃度的普洱茶生茶和熟茶提取物對衰老小鼠SAM外周血淋巴細胞記憶 T(Memory T lymphocytes)細胞比例的影響。數(shù)值均以均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。###P < 0. 001， SAM-P8 與 SAM-R1 比較；***P < 0. 001，**P < 0. 01，*P < 0. 05，各治療組與 SAM-P8 比較。 P8 :SAM-P8快速老化鼠；R1 :SAM-R1抗老化青年鼠；生茶-低生茶低劑量組125mg/kg ；生 茶-中生茶中劑量組250mg/kg ；生茶-高生茶高劑量組500mg/kg ；熟茶-低熟茶低劑 量組125mg/kg ；熟茶-中熟茶中劑量組250mg/kg ；熟茶-高熟茶高劑量組500mg/kg。圖3 不同濃度的普洱茶生茶和熟茶提取物對衰老小鼠SAM脾臟自然殺傷細胞 (Natural Killer,NK)陽性細胞數(shù)目的作用。數(shù)值均以均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。##P<0.01， SAM-P8 與 SAM-R1 比較。*P < 0. 05，**P < 0. 01，各治療組與 SAM-P8 比較。P8 :SAM_P8 快 速老化鼠；R1 :SAM-R1抗老化青年鼠；生茶-低生茶低劑量組125mg/kg ；生茶-中生茶中 劑量組250mg/kg ；生茶-高生茶高劑量組500mg/kg ；熟茶-低熟茶低劑量組125mg/kg ； 熟茶_中熟茶中劑量組250mg/kg ；熟茶-高熟茶高劑量組500mg/kg。圖4 不同濃度的普洱茶生茶和熟茶提取物對衰老小鼠SAM外周血自然殺傷細胞 (Natural Killer, NK)細胞數(shù)目的作用。數(shù)值均以均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。###P < 0.001， SAM-P8與SAM-R1比較。***P < 0. 001，各治療組與SAM-P8比較。P8 :SAM_P8快速老化 鼠；R1 :SAM-R1抗老化青年鼠；生茶-低生茶低劑量組125mg/kg ；生茶-中生茶中劑量 組250mg/kg ；生茶-高生茶高劑量組500mg/kg ；熟茶-低熟茶低劑量組125mg/kg ；熟
5茶-中熟茶中劑量組250mg/kg ；熟茶-高熟茶高劑量組500mg/kg。圖5 不同濃度的普洱茶生茶與熟茶提取物對衰老小鼠SAM血中炎性因子IL-6 水平的作用。數(shù)值均以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。###P < 0. 001，SAM-P8與SAM-R1比較。*P < 0. 05，_P < 0. 001，各治療組與 SAM-P8 比較。P8 :SAM_P8 快速老化鼠；R1 :SAM_R1 抗 老化青年鼠；生茶-低生茶低劑量組125mg/kg ；生茶-中生茶中劑量組250mg/kg ；生 茶-高生茶高劑量組500mg/kg ；熟茶-低熟茶低劑量組125mg/kg ；熟茶-中熟茶中劑 量組250mg/kg ；熟茶-高熟茶高劑量組500mg/kg。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。實施例1普洱茶水提取物的制備分別取普洱茶生茶或熟茶，粉碎成粗粉。沸水浸提三次，茶葉與水的質(zhì)量比分別為 1 20；1 20；1 10 ；浸提時間分別為20分鐘、20分鐘、10分鐘。合并濾液，60°C減壓 濃縮得茶湯濃縮液。將茶湯濃縮液裝瓶滅菌(120°C，20分鐘)，低溫冷藏(4°C)備用，或?qū)?提取液經(jīng)真空干燥得普洱茶提取物。實施例2普洱茶提取物的藥理活性研究1.實驗藥物普洱茶提取物的制備工藝參見實施例1。2.實驗動物實驗動物選用國際上公認的衰老動物模型_快速老化亞系 (Senescenceaccelerated mouse/prone, SAM-P8，雄性，8 月齡)，采用抗快速老化亞系 (Senescence accelerated mouse/resistance, SAM-R1,雄性，8 月齡)為青年對照鼠。通 過口服灌喂，分別給予快速老化鼠SAM-P8不同劑量的普洱茶生茶提取物與普洱茶熟茶提 取物，抗快速老化亞系(青年對照組)和快速老化亞系(老年對照組)每天灌胃等量蒸餾 水，連續(xù)用藥4周。3.實驗方法用藥4周后，動物經(jīng)乙醚麻醉，眼眶取血，肝素抗凝。將部分肝素抗凝血液離心 (3000rpm，30分鐘)。取血漿分裝到EP管中，分2管，每管100 yl，置于_60°C冰箱保存。 通過流式細胞儀 FACS Calibur TM(BDBiosciences, San Diego, CA, USA)采用流式細胞微 球捕獲芯片技術(shù)CBA(Cytometric Bead Array)同步檢測與衰老炎癥有關(guān)的血漿淋巴因子 IFN- y，TNF- a，IL-6, MCP-1 以及抗炎因子 IL_12p70，IL-10 等。通過采用特異性熒光標(biāo)記的淋巴細胞表面抗體標(biāo)記外周血和脾的淋巴細胞，然后 對血和脾的淋巴細胞亞群進行流式細胞分析。將血液中的細胞搖勻，分別置于BD流式專用 試管中。每管100 iU，每一管加相應(yīng)淋巴細胞表面標(biāo)記的抗體。室溫避光孵育30分鐘后， 每管加紅細胞裂解液1ml，充分混勻，室溫避光5分鐘。離心1500轉(zhuǎn)/分，5分鐘，棄上清。 將沉淀細胞用PBS洗三遍。將所有沉淀的細胞懸浮起來，用美國FACS Caliber流式細胞儀 (FACS Calibur TM，BD Biosciences, San Diego, CA, USA)上機對淋巴細胞亞群進行流式檢 測和分析。
4.實驗結(jié)果不同濃度的普洱茶生茶或熟茶提取物對衰老小鼠SAM脾淋巴細胞中初始T (Naive T lymphocytes)細胞比例的影響。初始T細胞的減少是衰老免疫最顯著的特征之一，也是 導(dǎo)致衰老免疫功能減退的主要原因。本實驗結(jié)果顯示快速老化鼠SAM-P8脾細胞中的初始 性T細胞(NaiVe T)在脾淋巴細胞中所占的比例明顯低于抗老化鼠SAM-R1 (青年鼠)，P
<0. 001。不同劑量的普洱茶生茶或熟茶提取物均能顯著提高脾細胞中的NaYve T細胞的 比例，P < 0. 05-0. 001，參見圖 1。普洱茶提取物對快速老化鼠(SAM-P8)血中記憶性T細胞(MemoryT cell)的影響。 記憶T細胞積聚是衰老免疫最顯著的特征，也是導(dǎo)致免疫衰老的主要原因之一。本實驗結(jié) 果顯示快速老化鼠SAM-P8血液中的記憶性T細胞(memory T)在外周血淋巴細胞中的比例 明顯高于抗老化鼠SAM-R1，P< 0.001。低、中、高劑量的普洱茶生茶提取物以及低、中、高 劑量的普洱茶熟茶提取物均能顯著降低血液中的記憶T細胞的比例，P < 0. 05-0. 001，參見 圖2。普洱茶提取物對快速老化鼠脾細胞中自然殺傷細胞(natural killer，NK)的影 響。自然殺傷細胞是機體固有免疫系統(tǒng)中的主要細胞?？焖倮匣骃AM-P8脾細胞中的自 然殺傷細胞(natural killer,NK)在脾淋巴細胞中所占的比例明顯低于抗老化鼠SAM-R1， P < 0. 01。中、高劑量的普洱茶生茶或熟茶提取物均能顯著提高脾中的NK細胞在脾淋巴細 胞中所占的比例，P < 0. 05-0. 01，參見圖3。普洱茶提取物對快速老化鼠外周血中自然殺傷細胞(natural killer，NK)的影 響。自然殺傷細胞是機體固有免疫系統(tǒng)中的主要細胞?？焖倮匣骃AM-P8血液中的自然殺 傷細胞(natural killer,NK)在外周血淋巴細胞中所占的比例明顯低于抗老化鼠SAM-R1， P < 0. 001。不同劑量的普洱茶提取物均能顯著增加血液中的NK細胞在外周血淋巴細胞中 所占的比例，P < 0. 001，參見圖4。普洱茶提取物對快速老化鼠血清白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)含量的 影響。IL-6是機體主要的炎性因子之一，參與許多老年疾病炎癥的病理過程?？焖倮?化鼠SAM-P8血液中的炎性細胞因子白細胞介素-6的含量比青年鼠SAM-R1明顯增高，P
<0. 001。不同劑量的普洱茶提取物能夠顯著降低血清IL-6的含量，P < 0. 05-0. 001，參 見圖5。
權(quán)利要求
普洱茶或其提取物在制備預(yù)防和/或治療免疫衰老或其相關(guān)疾病的藥物或保健品中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述免疫衰老為老年人的免疫衰老。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述免疫衰老或其相關(guān)疾病選自抗感 染能力下降；癌癥；預(yù)防接種反應(yīng)下降；慢性炎癥，例如動脈粥樣硬化，慢性腸道炎性疾病， 骨質(zhì)疏松癥，II型糖尿病和慢性關(guān)節(jié)炎；以及DNA損傷誘發(fā)的衰老和疾病，例如DNA損傷誘 發(fā)的癌癥中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的用途，其特征在于，所述抗感染能力下降為感染 發(fā)生率提高和/或感染嚴(yán)重程度增加；所述慢性腸道炎性疾病為病克羅恩病和/或潰瘍性 結(jié)腸炎。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的用途，其特征在于，所述普洱茶為普洱茶生茶和/或普洱茶熟茶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的用途，其特征在于，所述普洱茶提取物為普洱茶 水提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的用途，其特征在于，所述普洱茶提取物的制備方 法包括將普洱茶加水煮沸后過濾，取濾液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的用途，其特征在于，所述普洱茶提取物的制備方 法包括以下步驟(1)將普洱茶加水煮沸20分鐘，普洱茶與水的質(zhì)量比為1 20 ；(2)過濾，再將普洱茶加水煮沸20分鐘，普洱茶與水的質(zhì)量比為1 20 ；(3)過濾，再將普洱茶加水煮沸10分鐘，普洱茶與水的質(zhì)量比為1 10 ；(4)合并濾液，減壓濃縮。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的用途，其特征在于，所述藥物包含藥學(xué)上可接受 的載體和/或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了普洱茶在制備抗免疫衰老或其相關(guān)疾病的藥物中的用途。本發(fā)明對普洱茶的抗衰老免疫作用及其原理進行了研究分析，證明了普洱茶或其提取物具有通過逆轉(zhuǎn)衰老免疫細胞(降低記憶性T細胞以及增加NK細胞)的作用，增強減退的免疫功能同時抑制衰老機體的炎癥反應(yīng)過亢的雙重作用，能夠?qū)崿F(xiàn)抗免疫衰老的目的，拓展了普洱茶或其提取物的應(yīng)用范圍，提供一種有效預(yù)防和/或治療免疫衰老或其相關(guān)疾病的藥物或保健品。
文檔編號A61P39/06GK101856434SQ201010205429
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者屠鵬飛, 張可, 張梁, 袁力豐, 邵宛芳, 馬旭, 馬治中 申請人:馬治中;邵宛芳;屠鵬飛