Sirt1在角膜神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供Sirt1在角膜神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Sirt1不僅能促進角膜神經(jīng)損傷修復(fù)，還能促進角膜上皮的損傷修復(fù)，同時也能促進三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長?？捎糜谌嫔窠?jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、持續(xù)性角膜上皮缺損的修復(fù)、糖尿病角膜神經(jīng)損害的修復(fù)、神經(jīng)性角膜炎的修復(fù)。而且，沉默信號調(diào)控因子1和miR?182?5p激動劑聯(lián)合使用對于角膜神經(jīng)損傷修復(fù)的效果更好。
【專利說明】
Si rt1在角膜神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于眼科疾病治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及沉默信號調(diào)控因子I(Sirtl)在角膜 神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 角膜是一種無血管的透明組織，其營養(yǎng)物質(zhì)主要來自淚液、房水、及神經(jīng)纖維。角 膜含有豐富的神經(jīng)纖維，是人體內(nèi)神經(jīng)最密集的組織之一，對于冷、熱、痛、觸壓等都有敏銳 的感覺。角膜神經(jīng)由三叉神經(jīng)眼支發(fā)出，在維持角膜組織，尤其是角膜上皮功能和解剖完整 性等方面起重要作用。角膜神經(jīng)損傷后會引起角膜知覺減退，導(dǎo)致神經(jīng)營養(yǎng)性角膜上皮病 變，主要表現(xiàn)包括反復(fù)的上皮糜爛、上皮再生遲緩、持續(xù)性上皮缺損、潰瘍以及持續(xù)性炎癥 反應(yīng)等。
[0003] 角膜神經(jīng)屬于外周神經(jīng)，具有再生能力。然而，通常角膜的神經(jīng)再生是不完全的。 角膜神經(jīng)的再生方式有兩種:一種是由傷口周圍未受損的神經(jīng)和傷口內(nèi)再生的實質(zhì)層神經(jīng) 出芽再生，另一種是由傷口周圍粗的神經(jīng)干相繼發(fā)出細(xì)的和中等粗的神經(jīng)纖維，這是一種 實質(zhì)層和上皮下神經(jīng)的真正再生。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)角膜神經(jīng)再生分為兩個時期，首先創(chuàng)傷區(qū)內(nèi) 的所有神經(jīng)在短期內(nèi)發(fā)生變性，同時可見來自傷口周圍完整上皮下叢的粗大而且密集的神 經(jīng)軸索，垂直于傷口邊緣走行;其次是傷口極向軸索的變性與第二代軸索的出現(xiàn)，這些軸索 來自傷口邊緣或近傷口邊緣的再生的上皮下軸索。
[0004] 隨著角膜屈光術(shù)、角膜移植手術(shù)以及白內(nèi)障等眼部手術(shù)的廣泛開展，術(shù)后所表現(xiàn) 出的角膜神經(jīng)損傷問題也日益呈現(xiàn)，由于角膜神經(jīng)損傷導(dǎo)致的持續(xù)的上皮缺損及反復(fù)的上 皮剝脫，大大增加了患者眼部感染的風(fēng)險，已經(jīng)成為一種潛在的致盲性病變。由于角膜神經(jīng) 的損害，導(dǎo)致角膜的營養(yǎng)與代謝發(fā)生障礙，是引起角膜病變反復(fù)發(fā)作，難以治療的根本原 因。
[0005] 目前角膜神經(jīng)損傷修復(fù)的治療主要依靠藥物，如神經(jīng)生長因子(NGF)點眼液。另 外，針對角膜神經(jīng)損傷引起的持續(xù)性角膜上皮缺損，還有很多對癥治療，如淚液替代物，角 膜接觸鏡，眼瞼縫合術(shù)，生長因子、自體血清的應(yīng)用等。近年來又出現(xiàn)了羊膜移植術(shù)與角膜 緣干細(xì)胞移植術(shù)等手術(shù)方式，促進持續(xù)性角膜上皮缺損的愈合，但是這些治療方法對于角 膜神經(jīng)的損傷修復(fù)作用不大，未能從根本上解決角膜神經(jīng)再生的問題。因此，尋找新的促進 角膜神經(jīng)再生的因子與途徑，對臨床上治療角膜損傷修復(fù)具有積極的潛在治療意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供沉默信號調(diào)控因子I(Sirtl)在角膜神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用， 及沉默信號調(diào)控因子1在角膜神經(jīng)再生、持續(xù)性角膜上皮缺乏、糖尿病角膜病變的治療、神 經(jīng)性角膜炎的治療中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明一個方面是提供沉默信號調(diào)控因子I(Sirtl)在制備角膜神經(jīng)損傷修復(fù)制 品中的應(yīng)用；
[0008] 本發(fā)明同時還提供沉默信號調(diào)控因子1和miR-182-5p激動劑聯(lián)合使用來制備角膜 神經(jīng)損傷修復(fù)制品中的應(yīng)用；
[0009] 作為實施例優(yōu)選，制品中沉默信號調(diào)控因子1的濃度優(yōu)選為20-50ngAil;miR-182-5p激動劑優(yōu)選濃度為0 · 1-0 · 5nmol/ml，
[0010] 角膜神經(jīng)損傷修復(fù)中對三叉神經(jīng)眼支的修復(fù)占主要作用，因此體外培養(yǎng)三叉神經(jīng) 節(jié)細(xì)胞，并觀察沉默信號調(diào)控因子1對三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長的影響至關(guān)重要。
[0011] 因此，本發(fā)明另一個方面是提供沉默信號調(diào)控因子1在制備培養(yǎng)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 培養(yǎng)制品中的應(yīng)用，
[0012] 上述的應(yīng)用，其中沉默信號調(diào)控因子1和miR-182-5p激動劑聯(lián)合使用；
[0013]本發(fā)明再一個方面提供一種培養(yǎng)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法，是在培養(yǎng)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì) 胞的培養(yǎng)基中添加Sirtl;
[0014] 作為實施例的優(yōu)選，Sirtl的添加濃度為20-100ng/ml，
[0015] 更進一步的，培養(yǎng)基中還添加有miR-182-5p激動劑；
[0016] 作為實施例的優(yōu)選，miR-182-5p激動劑的添加濃度為0.1-0.5nmol/ml;
[0017] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Sirtl不僅能促進角膜神經(jīng)損傷修復(fù)，還能促進角膜上皮的損傷修復(fù)， 同時也能促進三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長?？捎糜谌嫔窠?jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、持續(xù)性角膜上皮缺 損的修復(fù)、糖尿病角膜神經(jīng)損害的修復(fù)、神經(jīng)性角膜炎的修復(fù)。
【附圖說明】
[0018] 圖I = Sirtl對三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長的促進作用圖。在三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng) 基中添加不同濃度的Sirtl，20ng/ml Sirtl能有效促進三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長。
[0019] 圖2: Sirtl與miR-182-5p激動劑聯(lián)合使用促進小鼠三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長的 圖。在三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加 20ng/ml Sirtl，同時在培養(yǎng)液中添加 0. 1或 0.5nmol/ml的miR-182-5p激動劑后，三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突長度顯著增加，且軸突的分支顯 著增加。
[0020] 圖3:外源性添加Sirtl對正常小鼠角膜角膜神經(jīng)損傷修復(fù)的影響圖。結(jié)膜下注射 50ng Sirtl能有效促進角膜神經(jīng)的再生。
[0021] 圖4:Sirtl對miR-182-5p表達水平的影響圖。
[0022]圖5: Sirtl及miR-182-5p激動劑或抑制劑聯(lián)合使用對正常小鼠角膜上皮損傷修復(fù) 的圖。結(jié)膜下注射50ng Sirtl能有效促進角膜上皮的損傷修復(fù);Sirtl聯(lián)合miR-182-5p激動 劑組與Sirtl組相比，其促進角膜上皮損傷修復(fù)的作用更加明顯。而Sirtl聯(lián)合miR-182-5p 抑制劑組與Sirtl組相比，其促進角膜上皮損傷修復(fù)的作用顯著減弱。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明在小鼠三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加一定劑量的Sirtl (例如20ng/ml)， 不僅能促進三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生長，而且顯著促進三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的生長;從而促成了 本發(fā)明。
[0024]沉默信號調(diào)控因子1是存在于哺乳動物的酵母染色質(zhì)沉默子Sir2同源體，是一種 依賴NAD+的組蛋白去乙?；浮?br>[0025] miR-182定位于人7號染色體(7q32.2)，與miR-96、miR-183形成了一個基因簇，其 序列為:5' -uuuggcaaugguagaacucacacu-3'。1]1丨1?-182-5口激動劑是運用化學(xué)方法合成，并采 用化學(xué)修飾的miRNA激動劑，穩(wěn)定性更高，適合進行長期的miRNA功能研究，通過模擬miRNA 調(diào)節(jié)靶mRNA的表達而發(fā)揮作用。miR-182-5p激動劑在動物體內(nèi)具有更高的穩(wěn)定性和miRNA 促進效果。且能克服體內(nèi)細(xì)胞膜、組織等障礙富集于靶細(xì)胞。在動物實驗中可以用全身或局 部注射、吸入、喂藥等方法進行給藥，作用效果持續(xù)時間可長達6周。
[0026] 下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明進行詳細(xì)的描述 [0027]實施例1 = Sirtl促進小鼠三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長
[0028] 應(yīng)用三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)液（Neurobasal?培養(yǎng)基，Invitrogen/Gibco，貨號 21103-049)，加B27(10X)(Invitrogen/Gibco,貨號 17504-044)。常規(guī)培養(yǎng)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞， 將1000個細(xì)胞接種至30mm培養(yǎng)皿中，然后于5 % CO2和37 °C的條件下培養(yǎng)，每3天更換新培養(yǎng) 基，同時添加Sirt 1因子，培養(yǎng)9天后固定細(xì)胞，使用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物Tubulin III染色， 觀察三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長情況。如圖1所示，培養(yǎng)液中添加20-50ng/ml的Sirtl后，三叉 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突長度顯著增加，且軸突的分支顯著增加，說明Sirtl能有效促進三叉神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞軸突生長。
[0029]實施例2: Sirtl與miR-182-5p激動劑聯(lián)合使用促進小鼠三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長
[0030] 應(yīng)用三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)液(NeurobasaK培養(yǎng)基，Invitrogen/Gibco，貨號 21103-049)，加B27(10X)(Invitrogen/Gibco,貨號 17504-044)。常規(guī)培養(yǎng)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞， 將1000個細(xì)胞接種至30mm培養(yǎng)皿中，向皿中添加Sirtl(20ng/ml)，然后于5%⑶ 2和37°C的 條件下培養(yǎng)，每3天更換新培養(yǎng)基，添加濃度為0.1或0.5nmol/ml的miR-182-5p激動劑，培養(yǎng) 9天后固定細(xì)胞，使用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物Tubulin III染色，觀察三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生 長情況。如圖2所示，培養(yǎng)液中添加0.1或0.5nmo Ι/ml的miR-182-5p激動劑后，三叉神經(jīng)節(jié)細(xì) 胞軸突長度顯著增加，且軸突的分支顯著增加，說明Sirtl與miR-182-5p激動劑聯(lián)合使用能 有效促進三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長。
[0031] 實施例3:外源性添加Sirtl對正常小鼠角膜角膜神經(jīng)損傷修復(fù)的影響
[0032] 將12只C57BL/6小鼠（6-8周齡）隨機分為對照組和實驗組，使用3mm環(huán)鉆和上皮刮 刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm區(qū)域內(nèi)的上皮，同時對照組小鼠右眼結(jié)膜下注射5μ1 PBS，實 驗組小鼠右眼結(jié)膜下注射50ng Sirtl(溶解于5μ1 PBS溶液中），于建模后21天使用神經(jīng)元 特異性標(biāo)志物Tubulin III染色觀察各組小鼠的角膜神經(jīng)再生情況，代表性照片見圖3。如 圖3所示，結(jié)膜下注射50ng Sirtl能有效促進角膜神經(jīng)的再生。
[0033] 實施例4:3丨竹1抑制11^1?-182-5?表達水平的影響
[0034] 應(yīng)用三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)液（.Heurobasa丨⑧.培養(yǎng)基，Invitrogen/Gibco,貨號 21103-049)，加B27(10X)(Invitrogen/Gibco,貨號 17504-044)。常規(guī)培養(yǎng)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞， 將IO5個細(xì)胞接種至60mm培養(yǎng)皿中，然后于5 %⑶2和37 °C的條件下培養(yǎng)24h，向皿中添加 Sirtl(20ng/ml)，分別于5%C02和37°C的條件下孵育培養(yǎng)0min、15min及30min后，提取各組 樣品的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用實時定量PCR方法檢測各組中miR-182-5p的表達水平。如 圖4所示，Sirtl作用15min及30min，均能明顯抑制miR-182_5p的表達水平。
[0035]實施例5: Sirtl及miR-182-5p激動劑或抑制劑聯(lián)合使用對正常小鼠角膜上皮損傷 修復(fù)的影響
[0036] 將24只C57BL/6小鼠（6-8周齡）隨機分為四組：PBS對照組、Sirtl組、Sirtl聯(lián)合 miR-182-5p激動劑組、Sirtl聯(lián)合miR-182-5p抑制劑組。使用3mm環(huán)鉆和上皮刮刀刮除小鼠 右眼角膜中央3mm區(qū)域內(nèi)的上皮，同時PBS對照組小鼠右眼結(jié)膜下注射5μ1 PBS，Sirtl組小 鼠右眼結(jié)膜下注射50ng Sirtl(溶解于5μ1 PBS)，Sirtl聯(lián)合miR-182-5p激動劑組小鼠右眼 結(jié)膜下注射50ng Sirtl及0.3nmol miR-182_5p激動劑（溶解于5μ1 PBS)，Sirtl聯(lián)合miR-182-5p激動劑組小鼠右眼結(jié)膜下注射50ng Sirtl及0.3nmol miR-182-5p抑制劑(溶解于5μ I PBS)，于建模后24、48和72h分別使用熒光素鈉染色及裂隙燈下照相，觀察各組小鼠的上 皮損傷修復(fù)的情況，代表性裂隙燈觀察照片見圖5。如圖5所示，建模后48h，結(jié)膜下注射50ng Sirtl能有效促進角膜上皮的損傷修復(fù);Sirtl聯(lián)合miR-182-5p激動劑組與Sirtl組相比，其 促進角膜上皮損傷修復(fù)的作用更加明顯。而Sirtl聯(lián)合miR-182-5p抑制劑組與Sirtl組相 比，其促進角膜上皮損傷修復(fù)的作用顯著減弱。
【主權(quán)項】
1. 沉默信號調(diào)控因子1在制備角膜神經(jīng)損傷修復(fù)與再生制品中的應(yīng)用。2. 沉默信號調(diào)控因子1和miR-182-5p激動劑在制備角膜神經(jīng)損傷修復(fù)與再生制品中的 應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的制品中沉默信號調(diào)控因子1的濃度為 2〇-100ng/yl〇4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的制品中miR-182-5p激動劑濃度為 0.04-0.lnmol/μL〇5. 沉默信號調(diào)控因子1在三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。6. 沉默信號調(diào)控因子1和miR-182-5p激動劑聯(lián)合使用在三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng) 用。7. -種培養(yǎng)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的方法是在培養(yǎng)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì) 胞的培養(yǎng)基中添加 Sirtl。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法是在培養(yǎng)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng) 基中還添加有miR-182-5p激動劑。9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的Sirtl添加濃度為20-100ng/ml。10. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的miR-182-5p激動劑添加濃度為0.1- 0.5nmol/ml〇
【文檔編號】A61K45/06GK105963683SQ201610505085
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】王曄, 牟曉峰, 張蓉, 慕瑩
【申請人】青島市中心醫(yī)院