一種病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟：(1)獲取目的基因；(2)PCR擴(kuò)增：在微量離心管中，以步驟(1)中得到的1μg/mL目的基因?yàn)槟０錎NA，加入適量的緩沖液、4種dNTP混合物、0.5-2.5U/50μL的DNA聚合酶體系、一對(duì)0.1-0.5μmol/L合成DNA的引物，體系PH為6.8-7.8；(3)基因重組；(4)轉(zhuǎn)化；(5)分離純化；(6)基因表達(dá)；(7)修飾；(8)凍干，本發(fā)明的干擾素能夠在短時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)，用聚乙二醇修飾之后，延長(zhǎng)了干擾素的半衰期，提高了對(duì)腎炎病毒靶向性，并且抗原性弱，不會(huì)引起人體的免疫反應(yīng)，藥效好，固定化生產(chǎn)，穩(wěn)定性好，適于推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】
一種病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工
-H-
O
【背景技術(shù)】
[0002]病毒性腎炎感染后發(fā)病多呈隱匿性，持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致尿毒癥和原發(fā)性腎壞死，死亡率很高，對(duì)于最終發(fā)展成尿毒癥的患者，唯一有效的治療就是進(jìn)行腎臟移植，但是在腎移植手術(shù)不能普及的情況下，對(duì)慢性病毒性腎炎進(jìn)行早期治療就顯得尤為重要，目前，病毒性腎炎的治療尚無(wú)特效藥，主要采用干擾素、核苷類抗病毒藥和各類中成藥，即是免疫增強(qiáng)藥，但是現(xiàn)行市場(chǎng)上的干擾素半衰期短，靶向性不足，更嚴(yán)重的是天然干擾素藥物具有抗原活性，申請(qǐng)?zhí)枮镃N200510069269.6公開了一種乙型肝炎基因工程靶向干擾素及其生產(chǎn)工藝，乙型肝炎基因工程靶向干擾素采用構(gòu)建人源抗HBsAg的dsFv基因，與a-干擾素(IFN-a)基因連接，運(yùn)用基因工程技術(shù)表達(dá)乙肝靶向干擾素(dsFv-1FV融合蛋白)，乙型肝炎基因工程靶向干擾素的生產(chǎn)工藝，將制成的培養(yǎng)基與菌株接種后送進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，完成培養(yǎng)后的細(xì)菌在繁殖間大量繁殖，然后通過(guò)分離收集細(xì)菌，并裂解分離包涵體蛋白，在折疊液中復(fù)性，再經(jīng)純化、濃縮，最后分裝凍干，親和層析純化后證明該融合蛋白具有干擾素活性和與乙肝病毒表面抗原的反應(yīng)性，融合蛋白屬于人源，避免異源性帶來(lái)的危害，但是該干擾素仍具有抗原性，另外靶向性不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為克服現(xiàn)有技術(shù)上的不足，本發(fā)明目的是提供一種病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝。
[0004]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0005]—種病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟:
[0006](I)獲取目的基因:從病毒性腎炎患者體內(nèi)獲取效應(yīng)T細(xì)胞，在溫度為37°C，PH為
7.0的條件下，用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行部分酶解，得到控制干擾素合成的目的基因，備用；
[0007](2)PCR擴(kuò)增:在微量離心管中，以步驟⑴中得到的lyg/mL目的基因?yàn)槟０錎NA,加入適量的緩沖液、4 種 dNTP (即 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合物、0.5-2.5U/50 μ L 的DNA聚合酶體系、一對(duì)0.1-0.5 ymol/L合成DNA的引物，體系PH為6.8-7.8, PCR擴(kuò)增包括如下基本反應(yīng)步驟:
[0008]①預(yù)變性:溫度92 °C，反應(yīng)5min，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈；
[0009]②變形:溫度92°C，反應(yīng)65s，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈
[0010]③復(fù)性:溫度55°C，反應(yīng)45s，引物與模板DNA單鏈互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合；
[0011]④延伸:溫度72°C，反應(yīng)5min，“模板-引物結(jié)合物”在DNA聚合酶作用
[0012]下，以脫氧核糖核苷為原料，以靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成新的DNA鏈。
[0013]⑤重復(fù)“變性一復(fù)性一延伸”的循環(huán)25次，得到所需數(shù)量的目的基因；
[0014](3)基因重組:以質(zhì)粒作為運(yùn)載體，運(yùn)用步驟(I)中的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒以及目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端，再經(jīng)過(guò)DNA聚合酶將步驟(2)中得到的擴(kuò)增后的目的基因?qū)胭|(zhì)粒基因中，得重組質(zhì)粒；
[0015](4)轉(zhuǎn)化:將大腸桿菌懸浮于3°C的0.4mol/L氯化鈣溶液中，并加入步驟(3)中的重組質(zhì)粒，混合后放置約半小時(shí)，然后短暫升溫至42°C使細(xì)菌進(jìn)入熱休克狀態(tài)，加入富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基以進(jìn)行復(fù)蘇，使之處于感受態(tài)主動(dòng)攝取外源遺傳物質(zhì)。
[0016](5)分離純化:在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)步驟(4)得到的大腸桿菌，挑取含有標(biāo)記基因的菌落，將其接種到另一培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)挑取培養(yǎng)過(guò)程，直至達(dá)到純度要求；
[0017](6)基因表達(dá):經(jīng)過(guò)分離純化的工程菌置于發(fā)酵罐中培養(yǎng)，控制溫度為37°C，PH為
6.8，從發(fā)酵罐流出液中即可提取，得到干擾素；
[0018](7)修飾:向反應(yīng)釜里加入分子量20000直鏈單甲氧基聚乙二醇、步驟(6)所得干擾素、50mmol/L磷酸鹽緩沖液，混合均勻，在溫度為25°C、PH為8.5、200r/min震蕩反應(yīng)4h，用30%的冰醋酸終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)0.45 μ m尼龍膜過(guò)濾、脫氣后，讓流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，采用線性梯度洗脫和等度洗脫相結(jié)合的方法進(jìn)行提純，得修飾干擾素；
[0019](8)凍干:將樣品稀釋至lX106IU/ml，加入2%蔗糖、3%甘氨酸、0.5%吐溫-80，
0.2%明膠作為保護(hù)劑，分裝至西林瓶中，每瓶1ml，放入凍干箱凍干，得產(chǎn)品。
[0020]優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶。
[0021]優(yōu)選的，所述步驟⑵中，所述緩沖液為10-50mmol/L的磷酸緩沖液、50mmol/L的KCl、5mmol/L的二硫蘇糖醇、100 μ g/mL的牛血清白蛋白、0.5mmol/L-2mmol/L的Mg2+的混合溶液。
[0022]優(yōu)選的，所述步驟⑶中，所述保護(hù)劑中各物質(zhì)含量為2%蔗糖、3%甘氨酸、0.5%吐溫-80，0.2%明膠。
[0023]有益效果:本發(fā)明通過(guò)獲取目的基因、PCR擴(kuò)增、基因重組、轉(zhuǎn)化、分離純化、基因表達(dá)、修飾、凍干八大步驟完成病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，能夠在短時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)，用聚乙二醇修飾之后，延長(zhǎng)了干擾素的半衰期，提高了對(duì)腎炎病毒靶向性，并且抗原性弱，不會(huì)引起人體的免疫反應(yīng)，藥效好，固定化生產(chǎn)，穩(wěn)定性好，整個(gè)成產(chǎn)過(guò)程嚴(yán)格控制溫度和PH，得到的干擾素穩(wěn)定性好，可以有效進(jìn)行批量化生產(chǎn)，在PCR擴(kuò)增步驟中，PCR技術(shù)具有速度快，靈敏度高的特點(diǎn)，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行，擴(kuò)增精確，另外擴(kuò)增量大，所選DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶，TaqDNA聚合酶耐熱性能好，保證DNA鏈在高溫條件下正常聚合，緩沖液中的100 μ g/mL牛血清白蛋白、二硫蘇糖醇具有很好的穩(wěn)定酶活性的作用，Mg2+是DNA聚合酶的激活劑，影響酶的活性和真實(shí)性，濃度在0.5mmol/L-2mmol/L之間時(shí)，酶的活性高，采用聚乙二醇對(duì)干擾素進(jìn)行氨基化修飾，增加了干擾素的分子量，穩(wěn)定性得到提高，減少藥物排泄，屏蔽了一些干擾素分子表面的抗原決定簇，減少免疫原性，降低體內(nèi)清除率，并減緩了蛋白酶的水解，延長(zhǎng)干擾素的半衰期，凍干步驟中加入2 %蔗糖、3 %甘氨酸、0.5 %吐溫-80，0.2 %明膠，有效的保證了干擾素的生物活性在1.4 X 108IU/mg以上，且在4°C、6個(gè)月的環(huán)境下仍具有良好的溫定性能。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面
[0025]結(jié)合【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0026]實(shí)施例1:
[0027]本實(shí)施例的一種病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟:
[0028](I)獲取目的基因:從病毒性腎炎患者體內(nèi)獲取效應(yīng)T細(xì)胞，在溫度為37°C，
[0029]PH為7.0的條件下，用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行部分酶解，得到控制干擾素合成的目的基因，備用；
[0030](2)PCR擴(kuò)增:在微量離心管中，以步驟(I)中得到的lyg/mL目的基因?yàn)槟０錎NA，加入適量的緩沖液、4 種 dNTP(即 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合物、0.5U/50 μ L 的 DNA聚合酶體系、一對(duì)0.lmol/L合成DNA的引物，體系PH為6.8，PCR擴(kuò)增包括如下基本反應(yīng)步驟:
[0031 ] ①預(yù)變性:溫度92°C，反應(yīng)5min，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈；
[0032]②變形:溫度92°C，反應(yīng)65s，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈
[0033]③復(fù)性:溫度55°C，反應(yīng)45s，引物與模板DNA單鏈互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合；
[0034]④延伸:溫度72°C，反應(yīng)5min，“模板-引物結(jié)合物”在DNA聚合酶作用
[0035]下，以脫氧核糖核苷為原料，以靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成新的DNA鏈。
[0036]⑤重復(fù)“變性一復(fù)性一延伸”的循環(huán)25次，得到所需數(shù)量的目的基因；
[0037](3)基因重組:以質(zhì)粒作為運(yùn)載體，運(yùn)用步驟(I)中的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒以及目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端，再經(jīng)過(guò)DNA聚合酶將步驟(2)中得到的擴(kuò)增后的目的基因?qū)胭|(zhì)?；蛑?，得重組質(zhì)粒；
[0038](4)轉(zhuǎn)化:將大腸桿菌懸浮于3°C的0.4mol/L氯化鈣溶液中，并加入步驟(3)中的重組質(zhì)粒，混合后放置約半小時(shí)，然后短暫升溫至42°C使細(xì)菌進(jìn)入熱休克狀態(tài)，加入富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基以進(jìn)行復(fù)蘇，使之處于感受態(tài)主動(dòng)攝取外源遺傳物質(zhì)。
[0039](5)分離純化:在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)步驟(4)得到的大腸桿菌，挑取含有標(biāo)記基因的菌落，將其接種到另一培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)3次挑取培養(yǎng)過(guò)程，直至達(dá)到純度要求；
[0040](6)基因表達(dá):經(jīng)過(guò)分離純化的工程菌置于發(fā)酵罐中培養(yǎng)，控制溫度為37°C，PH為
6.8，從發(fā)酵罐流出液中即可提取，得到干擾素；
[0041](7)修飾:向反應(yīng)釜里加入分子量20000直鏈單甲氧基聚乙二醇、步驟(6)所得干擾素、50mmol/L磷酸鹽緩沖液，混合均勻，在溫度為25°C、PH為8.5、200r/min震蕩反應(yīng)4h，用30%的冰醋酸終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)0.45 μ m尼龍膜過(guò)濾、脫氣后，讓流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，采用線性梯度洗脫和等度洗脫相結(jié)合的方法進(jìn)行提純，得修飾干擾素；
[0042](8)凍干:將樣品稀釋至lX106IU/ml，加入2%蔗糖、3%甘氨酸、0.5%吐溫-80，
0.2%明膠作為保護(hù)劑，分裝至西林瓶中，每瓶1ml，放入凍干箱凍干，得產(chǎn)品。
[0043]其中，所述步驟⑵中，所述DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶，關(guān)鍵的是，所述步驟
(2)中，所述緩沖液為lOmmol/L的磷酸緩沖液、50mmol/L的KCl、5mmol/L的二硫蘇糖醇、100 μ g/mL的牛血清白蛋白、0.5mmol/L的Mg2+的混合溶液，而且，所述步驟⑶中，所述保護(hù)劑中各物質(zhì)含量為2 %蔗糖、3 %甘氨酸、0.5 %吐溫-80，0.2 %明膠。
[0044]實(shí)施例2:
[0045]其余與所述實(shí)施例1相同，不同之處在于，所述步驟⑵中，所述DNA聚合酶體系為2.5U/50 μ L的DNA聚合酶體系，0.5 μ mol/L合成DNA的引物，體系PH為7.8，。
[0046]實(shí)施例3:
[0047]其余與所述實(shí)施例1相同，不同之處在于，所述步驟(2)中，所述DNA聚合酶體系為2U/50yL的DNA聚合酶體系，0.3ymol/L合成DNA的引物，體系PH為7，所述步驟(2)中，所述緩沖液為30mmol/L的磷酸緩沖液、50mmol/L的KCl、5mmol/L的二硫蘇糖醇、100 μ g/mL的牛血清白蛋白、1.5mmol/L的Mg2+的混合溶液。
[0048]上述三個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)到的DNA聚合酶活性在0.8X 10sIU/mg以上，PCR擴(kuò)增效果明顯，經(jīng)過(guò)聚乙二醇氨基化學(xué)修飾后，單鏈聚乙二醇-干擾素含量和修飾率分別達(dá)到
0.25mg/ml和36.63%，具有典型的聚乙二醇修飾蛋白的特性，體外抗原活性保留了天然抗原活性的15%，凍干后的干擾素，6個(gè)月后生物活性在1.0X10sIU/mg以上。
[0049]經(jīng)實(shí)際應(yīng)用中可知，通過(guò)獲取目的基因、PCR擴(kuò)增、基因重組、轉(zhuǎn)化、分離純化、基因表達(dá)、修飾、凍干八大步驟完成病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，能夠在短時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)，用聚乙二醇修飾之后，延長(zhǎng)了干擾素的半衰期，提高了對(duì)腎炎病毒靶向性，并且抗原性弱，不會(huì)引起人體的免疫反應(yīng)，藥效好，固定化生產(chǎn)，穩(wěn)定性好，整個(gè)成產(chǎn)過(guò)程嚴(yán)格控制溫度和PH，得到的干擾素穩(wěn)定性好，可以有效進(jìn)行批量化生產(chǎn)，在PCR擴(kuò)增步驟中，PCR技術(shù)具有速度快，靈敏度高的特點(diǎn)，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行，擴(kuò)增精確，另外擴(kuò)增量大，所選DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶，TaqDNA聚合酶耐熱性能好，保證DNA鏈在高溫條件下正常聚合，緩沖液中的100 μ g/mL牛血清白蛋白、二硫蘇糖醇具有很好的穩(wěn)定酶活性的作用，Mg2+是DNA聚合酶的激活劑，影響酶的活性和真實(shí)性，濃度在0.5mmol/L-2mmol/L之間時(shí)，酶的活性高，采用聚乙二醇對(duì)干擾素進(jìn)行氨基化修飾，增加了干擾素的分子量，穩(wěn)定性得到提高，減少藥物排泄，屏蔽了一些干擾素分子表面的抗原決定簇，減少免疫原性，降低體內(nèi)清除率，并減緩了蛋白酶的水解，延長(zhǎng)干擾素的半衰期，凍干步驟中加入2 %蔗糖、3 %甘氨酸、0.5 %吐溫-80，0.2 %明膠，有效的保證了干擾素的生物活性在1.4 X 108IU/mg以上，且在4°C、6個(gè)月的環(huán)境下仍具有良好的溫定性能。
[0050]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書內(nèi)容所作的等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括如下步驟: (1)獲取目的基因:從病毒性腎炎患者體內(nèi)獲取效應(yīng)T細(xì)胞，在溫度為37°C，PH為7.0的條件下，用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行部分酶解，得到控制干擾素合成的目的基因，備用； (2)PCR擴(kuò)增:在微量離心管中，以步驟⑴中得到的lyg/mL目的基因?yàn)槟０錎NA,加入適量的緩沖液、4種dNTP混合物、0.5-2.5U/50 μ L的DNA聚合酶體系、一對(duì)0.1-0.5 ymol/L合成DNA的引物，體系PH為6.8-7.8，PCR擴(kuò)增包括如下基本反應(yīng)步驟: ①預(yù)變性:溫度92°C，反應(yīng)5min，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈； ②變形:溫度92°C，反應(yīng)65s，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈 ③復(fù)性:溫度55°C，反應(yīng)45s，引物與模板DNA單鏈互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合； ④延伸:溫度72°C，反應(yīng)5min，“模板-引物結(jié)合物”在DNA聚合酶作用 下，以脫氧核糖核苷為原料，以靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成新的DNA鏈。 ⑤重復(fù)“變性一復(fù)性一延伸”的循環(huán)25次，得到所需數(shù)量的目的基因； (3)基因重組:以質(zhì)粒作為運(yùn)載體，運(yùn)用步驟⑴中的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒以及目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端，再經(jīng)過(guò)DNA聚合酶將步驟(2)中得到的擴(kuò)增后的目的基因?qū)胭|(zhì)?；蛑?，得重組質(zhì)粒； (4)轉(zhuǎn)化:將大腸桿菌懸浮于:TC的0.4mol/L氯化鈣溶液中，并加入步驟(3)中的重組質(zhì)粒，混合后放置約半小時(shí)，然后短暫升溫至42°C使細(xì)菌進(jìn)入熱休克狀態(tài)，加入富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基以進(jìn)行復(fù)蘇，使之處于感受態(tài)主動(dòng)攝取外源遺傳物質(zhì)。 (5)分離純化:在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)步驟(4)得到的大腸桿菌，挑取含有標(biāo)記基因的菌落，將其接種到另一培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)挑取培養(yǎng)過(guò)程，直至達(dá)到純度要求； (6)基因表達(dá):經(jīng)過(guò)分離純化的工程菌置于發(fā)酵罐中培養(yǎng)，控制溫度為37°C，PH為6.8，從發(fā)酵罐流出液中即可提取，得到干擾素； (7)修飾:向反應(yīng)釜里加入分子量20000直鏈單甲氧基聚乙二醇、步驟(6)所得干擾素、50mmol/L磷酸鹽緩沖液，混合均勻，在溫度為25°C、PH為8.5、200r/min震蕩反應(yīng)4h，用30%的冰醋酸終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)0.45 μ m尼龍膜過(guò)濾、脫氣后，讓流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，采用線性梯度洗脫和等度洗脫相結(jié)合的方法進(jìn)行提純，得修飾干擾素； (8)凍干:將樣品稀釋至lX106IU/ml，加入2%蔗糖、3%甘氨酸、0.5%吐溫-80，0.2%明膠作為保護(hù)劑，分裝至西林瓶中，每瓶Iml，放入凍干箱凍干，得產(chǎn)品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟(2)中，所述DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟⑵中，所述緩沖液為10-50mmol/L的磷酸緩沖液、50mmol/L的KCl、5mmol/L的二硫蘇糖醇、100 μ g/mL的牛血清白蛋白、0.5mmol/L-2mmol/L的Mg2+的混合溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒性腎炎治療藥物干擾素的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟(8)中，所述保護(hù)劑中各物質(zhì)含量為2%蔗糖、3%甘氨酸、0.5%吐溫-80，0.2%明膠。
【文檔編號(hào)】A61P13/12GK105879012SQ201410693755
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年11月27日
【發(fā)明人】張愛(ài)標(biāo)
【申請(qǐng)人】張愛(ài)標(biāo)