專利名稱：干擾素－tau在藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有干擾素-tau的藥物組合物以及其應(yīng)用方法。更特別地，本發(fā)明涉及治療對干擾素-tau有響應(yīng)的疾病的方法，通過以足以改變2′，5′-寡腺苷酸合成酶的血液水平的劑量口服施用干擾素-tau。
背景技術(shù)：
干擾素-tau(此后稱為“IFNτ”或“干擾素-τ”)最初是作為反芻動(dòng)物的孕體的滋養(yǎng)外胚層產(chǎn)生的妊娠識(shí)別激素發(fā)現(xiàn)的(Imakawa，K.等，Nature，330377-379，(1987))；Bazer，F(xiàn).W.和Johnson，H.M.Am.J.Repro.Immunol.，2619-22，(1991))。IFNτ基因的分布限制在反芻動(dòng)物中，包括牛、綿羊和山羊，(Alexenko，A.P.等，J.Interferon and CytokineRes.，191335-1341，(1999))，但在其他包括人類和老鼠的物種的細(xì)胞中顯示出具有活性(Pontzer，C.H.等，Cancer Res.，515304-5307，(1991)；Alexenko A.P.等，J.Interferon and Cytokine Res.，20817-822，(2000))。例如，IFNτ已顯示出具有抗病毒(Pontzer，C.H.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，152801-807，(1988))、抗增殖(Pontzer，C.H.等，1991)和免疫調(diào)節(jié)活性(Assal-Meliani，A.，Am.J.Repro.Immunol.，33267-275(1995))。盡管IFNτ顯示出許多與例如干擾素-α和干擾素-β的類型I的IFNs經(jīng)典相關(guān)的活性，在IFNτ和其他類型I的IFNs之間仍存在著相當(dāng)大的差別。最明顯的差別是IFNτ在反芻動(dòng)物物種妊娠中的作用。其他IFNs在妊娠識(shí)別中沒有相似的活性。另一個(gè)差別是病毒誘導(dǎo)。除了IFNτ的所有類型I的IFNs很容易被病毒和dsRNA誘導(dǎo)(Roberts，等，Endocrine Reviews，13432(1992))。誘導(dǎo)的IFN-α和IFN-β的表達(dá)很短暫，持續(xù)大約幾個(gè)小時(shí)。相反，一旦被誘導(dǎo)，IFNτ的合成能維持?jǐn)?shù)天的時(shí)間(Godkin，等，J.Reprod.Fert.，65141(1982))。基于每一個(gè)細(xì)胞，產(chǎn)生了比其他的類型I的IFNs多300倍的IFNτ(Cross，J.C.和Roberts，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883817-3821(1991))。另一個(gè)差別是IFNτ和其他類型I的干擾素的氨基酸序列。干擾素α2b、β1、ω1、γ和τ之間的氨基酸序列相似性百分比見下表。
從下列參考文獻(xiàn)中確定序列比較Taniguchi等，Gene，10(1)11(1980).
Adolf等，Biochim.Biophys.Acta，1089(2)167(1991).
Streuli等，Science，2091343(1980).
Imakawa等，Nature，330377(1987)重組綿羊的IFNτ(rIFNτ)與IFNα2b具有48.8％的同源性，與IFNβ1具有33.8％的同源性。由于在IFNτ和IFNα以及在IFNτ和IFNβ之間的該受限的同源性，不能預(yù)測口服施用時(shí)IFNτ是否能夠以與IFNα或IFNβ相同的方式作用。還報(bào)道IFNτ對人類細(xì)胞上的類型I受體具有低的受體結(jié)合親和力(Brod，S.，J.Interferon and Cytokine Res.，18841(1999)；Alexenko，A.等，J.Interferon and Cytokine Res.，17769(1997))。另外，IFNτ是非內(nèi)源性人類蛋白的事實(shí)使得當(dāng)將IFNτ引入到人體中時(shí)有可能形成系統(tǒng)化的中和抗體(Brod，S.，J.Interferonand Cytokine Res.，18841(1999)。由于IFNτ和其他干擾素之間的差別，很難預(yù)測當(dāng)施用到人類時(shí)IFNτ能否提供治療的好處?，F(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于IFNα、IFNβ或其他任何非-tau的干擾素的教導(dǎo)不能夠提供用于勾勒IFNτ的期望的基礎(chǔ)。使用IFNτ以及蛋白和多肽的一個(gè)限制性因素通常與生物分布相關(guān)，當(dāng)腸胃外使用時(shí)受蛋白與血漿蛋白和血細(xì)胞的相互作用的影響?？诜┯寐窂接捎谠谖钢械鞍姿舛鴨栴}更多，胃中的酸性環(huán)境會(huì)在其到達(dá)指定目標(biāo)之前破壞其分子。例如，胃和胰腺酶產(chǎn)生的多肽和蛋白片段被腸道的刷狀緣膜中的外-和內(nèi)切酶分裂至二-和三-肽。如能夠避免胰腺酶的蛋白水解，多肽還要經(jīng)受刷狀緣肽酶的降解。能夠通過胃而存活的多肽或蛋白要經(jīng)受腸粘膜中的新陳代謝，在那里滲透障礙防止其進(jìn)入細(xì)胞。出于該原因，很多努力已經(jīng)集中到以錠劑或在口腔中含一段時(shí)間的溶液的形式將蛋白釋放到口腔-咽部。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于治療人體中對干擾素治療有響應(yīng)的疾病的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于治療通過口服施用IFNτ的疾病的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括一種用于治療人體中對干擾素治療有響應(yīng)的疾病的方法，通過將IFNτ口服施用到治療對象的腸道中，施用的劑量能夠使得治療對象的血液2，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)水平相對于沒有施用IFNτ時(shí)治療對象中的OAS水平有相當(dāng)?shù)奶岣?。定期以該有效量將IFNτ口服施用到治療對象的腸道中，每周至少幾次，持續(xù)至少一個(gè)月。在另一方面，本發(fā)明包括用于制備用于治療人體中對干擾素-tau治療有響應(yīng)的疾病的藥物的組合物，其中該疾病選自自身免疫性疾病、癌癥或病毒感染。組合物包括配制成口服施用到對象的腸道的干擾素-tau，其量有效地使得治療對象中的血液2′，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)水平相對于沒有施用干擾素-tau時(shí)治療對象中的血液OAS水平產(chǎn)生初始可測量的提高，其中定期以該有效量將干擾素-tau施用到治療對象的腸道中，每周至少幾次，持續(xù)至少一個(gè)月，而與治療對象的血液OAS水平的變化無關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，IFNτ是綿羊IFNτ。在具體的實(shí)施方案中，綿羊IFNτ的序列為SEQ ID NO2或SEQ ID NO3。更一般地，IFNτ的氨基酸序列與綿羊IFNτ具有至少大約80％的同源性。IFNτ可以是重組產(chǎn)生的IFNτ。連續(xù)施用可以是每天進(jìn)行，或每周數(shù)次，例如每48小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將IFNτ施用到例如多發(fā)性硬化病的自身免疫性疾病的患者。在該方法中，將IFNτ在有疾病癥狀期間施用，通常在患者的終生施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將IFNτ施用到例如HCV的病毒感染的患者中。該方法還進(jìn)一步包括檢測對象中感染的存在、以及在檢測不到感染后幾個(gè)月后繼續(xù)施用IFNτ。在用IFNτ治療期間，該對象還可用第二種抗病毒劑治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將IFNτ施用到以細(xì)胞增殖為特征的疾病、例如癌癥的患者中。在用IFNτ治療期間，該對象還可用第二種抗癌劑治療。IFNτ的劑量形式優(yōu)選為將蛋白主要輸送到小腸的形式。例如劑量形式可以包含保護(hù)和/或穩(wěn)定腸道環(huán)境中的蛋白的粘膜粘著劑聚合物。該粘膜粘著劑配制物增強(qiáng)了干擾素與腸道壁的襯里的細(xì)胞的結(jié)合。該治療可以進(jìn)一步包括監(jiān)測血液OAS水平以確定OAS水平的提高是否是初始服用IFNτ的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)整初始施用到患者的IFNτ的量以獲得血液OAS的可測量的提高，相對于在口服施用IFNτ之前所觀察到的水平。當(dāng)閱讀下列本發(fā)明的詳細(xì)說明和附圖時(shí)，可以更清楚完整地理解本發(fā)明的這些和其他目的和特征。
附圖簡介

圖1顯示在健康小鼠中腹膜內(nèi)或胃施用IFNτ后的血液OAS濃度，單位為pmol/dL。圖2顯示以1×103U、1×104U和1×105U的劑量胃施用IFNτ后的血液OAS濃度，單位為pmol/dL。圖3為在幾個(gè)小鼠系(ICR，BALB/c，C57BL，NZW/N和SJL/J)中口服施用IFNτ(105U)后的血液OAS濃度的柱狀圖，單位為pmol/dL。對照小鼠接受沒有IFNτ的10％麥芽糖的溶液。每一柱圖代表兩次操作的具有相似結(jié)果的每一實(shí)驗(yàn)(3-5小鼠)的平均±S.E.。圖4A-4B為顯示施用IFNτ接著禁食6個(gè)小時(shí)后在小鼠中誘導(dǎo)血液OAS活性的柱狀圖。通過口腔或腹膜內(nèi)注射施用IFNτ。圖4A顯示為表示為對照的百分比的血液OAS水平，為用沒有干擾素的10％麥芽糖的溶液治療的小鼠中的血液OAS，在零時(shí)和施用IFNτ(105U)8小時(shí)、16小時(shí)和24小時(shí)后的血液樣品。圖4B為表示為對照的百分比的血液OAS水平，在濃度為0、102、103、104和105U的IFNτ輸送后24小時(shí)。每一柱圖代表兩次操作的具有相似結(jié)果的每一實(shí)驗(yàn)(3只小鼠)的平均±S.E.。圖5A-5D為顯示通過在小鼠中施用IFNτ的血液OAS誘導(dǎo)的禁食條件的效果的柱狀圖。血液OAS的誘導(dǎo)顯示為對照的百分比，為用沒有干擾素的10％麥芽糖的溶液治療的小鼠中的血液OAS。治療的小鼠在指定的進(jìn)食6小時(shí)后接受104U的IFNτ(通過腹膜內(nèi)注射或口服)圖5A，沒有食物和水；圖5B，有水沒有食物；圖5C，有食物沒有水；圖5D，有食物和水。每一柱圖代表兩次操作的具有相似結(jié)果的每一實(shí)驗(yàn)(3只小鼠)的平均±S.E.。圖6是顯示表示為對照的百分比的血液OAS活性誘導(dǎo)的柱狀圖，為在用沒有干擾素的10％的麥芽糖的溶液治療的小鼠的血液OAS，口服或通過腹膜內(nèi)注射將鼠IFNα(0、102、103和104IU)施用給ICR小鼠。IFNα施用16小時(shí)后分析血液中的OAS活性。每一柱圖代表兩次操作的具有相似結(jié)果的每一實(shí)驗(yàn)(3只小鼠)的平均±S.E.。圖7A-7C顯示在三個(gè)人類患者中在口服施用4.9×108單位/天IFNτ后的丙型肝炎(HCV)RNA和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平。圖8A-8B顯示在兩個(gè)人類患者中在口服施用1.5×109單位/天IFNτ后的丙型肝炎(HCV)RNA和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平。圖9顯示通過口服喂養(yǎng)(填充的柱圖)或i.p.注射(空心的柱圖)施用后用抗病毒分析測量的NZW鼠血清中的IFNτ量。圖10A-10C顯示與不接受治療的小鼠(圖10A)相比，通過口服施用(圖10C)和i.p.注射(圖10B)IFNτ在SJL小鼠中對慢性復(fù)發(fā)實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)的預(yù)防.圖11A-11C顯示用甲酚紫染色的小鼠脊髓切片，用于檢測不接受IFNτ治療(圖11A)、通過i.p.注射接受IFNτ治療(圖11B)或通過口服喂養(yǎng)接受IFNτ治療(圖11C)的EAE誘導(dǎo)的動(dòng)物中的淋巴細(xì)胞的滲透。圖12顯示通過i.p.注射或口服喂養(yǎng)用單劑量或延長的IFNτ治療的IL-10的誘導(dǎo)。圖13顯示在免除IFNτ治療后在SJL小鼠中EAE的復(fù)發(fā)。圖14顯示在i.p.注射或口服喂養(yǎng)IFNτ后在IFNτ治療的小鼠的血清中抗IFNτ抗體的ELISA檢測。
序列簡介SEQ ID NO1是合成基因編碼的綿羊干擾素-T(IFNτ)的核苷酸序列。SEQ ID NO2對應(yīng)于成熟綿羊干擾素-τ(IFNτ；oTP-1；GenBank Accession No.Y00287；PID g1358)的氨基酸序列。SEQ ID NO3對應(yīng)于成熟綿羊IFNτ的氨基酸序列，其中相對于SEQ ID NO2序列，該序列的位置5和6的氨基酸殘余被修飾。SEQ ID NO4是編碼SEQ ID NO3的蛋白的合成核苷酸序列。
發(fā)明詳述I.定義干擾素-tau，縮寫為IFNτ或干擾素-τ，指的是具有下列兩組特征中的至少一個(gè)特征的干擾素蛋白族中的任何一個(gè)(i)(a)抗黃體溶解性，(b)抗病毒性，(c)抗細(xì)胞增殖性；和(ii)和α-干擾素具有大約45-68％的氨基酸同源性，對已知IFNτ序列具有大于70％的氨基酸同源性(例如，Ott，等，J.Interferon Res.，11357(1991)；Helmer，等，J.Reprod.Fert.，7983(1987)；Imakawa等，Mol.Endocrinol，3127(1989)；Whaley，等，J.Biol.Chem.，26910846(1994)；Bazer，等，WO94/10313(1994))。氨基酸同源性可以用例如帶有缺省參數(shù)的LALIGN程序測定。該程序?yàn)镕ASTA版本1.7套的序列對比程序(Pearson andLipman，PNAS，852444(1988)；Pearson，Methods in Enzymology，18363(1990)；program available from William R.Pearson，Department ofBiological Chemistry，Box 440，Jordan Hall，Charlottesville，VA)。IFNτ序列已在多個(gè)反芻動(dòng)物物種中識(shí)別，包括但不限于牛(Bovine sp.，HelmerS.D.，J.Reprod.Fert.，7983(1987)；Imakawa，K.，Mol.Endocrinol.，119532(1988))、綿羊(Ovine sp.)、麝牛(Ovibos sp.)、長頸鹿(Giraffa sp.，GenBank Accession no.U55050)、馬(Equus caballus)、斑馬(Equusburchelli，GenBank Accession no.NC005027)、河馬(Hippopotamus sp.)、象(Loxodonta sp.)、駱駝(Llama glama)、山羊(Capra sp.，GenBankAccession nos.AY 357336，AY357335，AY347334，AY357333，AY357332，AY357331，AY357330，AY357329，AY357328，AY357327)和鹿(Cervidaesp.)。許多這些物種的IFNτ核苷酸序列在公共數(shù)據(jù)庫和/或文獻(xiàn)(參見例如Roberts，R.M.等，J.Interferon and Cytokine Res.，18805(1998)，Leaman D.W.等，J.Interferon Res.，121(1993)，Ryan，A.M.等，Anim，Genet.，349(1996))中有報(bào)道。術(shù)語“干擾素-tau”用于包括來此任何反芻動(dòng)物物種，例如上述引用的反芻動(dòng)物物種的干擾素-tau蛋白，其具有上述的兩組特征中的至少一個(gè)特征。綿羊IFNτ(IFNτ)指的是具有此處所定義為SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白，以及具有例如中性氨基酸取代的氨基酸取代和改變的蛋白，其中該取代和改變不會(huì)顯著地影響蛋白的活性，例如此處定義為SEQ ID NO3的IFNτ蛋白。更一般地，綿羊IFN-τ蛋白是與定義為SEQ ID NO2的序列具有大約80％、更優(yōu)選90％的序列同源性的蛋白?！按笥赬單位的每日劑量”，其中“X”是確定數(shù)值，例如5×108或1.5×109，指的是足以提供大于大約5×108的抗病毒單位的蛋白的IFNτ的量，其中IFNτ的抗病毒活性用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞致病作用抑制分析測定，例如在如下方法部分中所述?？梢岳斫獾氖翘囟咳談┝俊癤”單位所提供的蛋白的量(即mg)根據(jù)蛋白的特定抗病毒活性而變化。治療疾病指的是施用有效的治療物質(zhì)以減少疾病的癥狀和/或減輕疾病的嚴(yán)重性。口服指的是任何通過口或直接施用到胃或腸的施用路徑，包括胃施用。腸指的是從胃的低端開口延伸到肛門的消化道的部分，由小腸(十二指腸、空腸和回腸)和大腸(升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和直腸)組成。OAS水平指的是血液2′，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)蛋白的濃度或活性。ALT指的是丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶。HCV指的是丙型肝炎?！把篛AS水平的可測量的提高”指的是在血液(血清和/或血細(xì)胞)OAS水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的提高，通常比在相同條件下測量的治療前水平提高至少25％。該水平可以通過可檢測的OAS酶的提高或細(xì)胞內(nèi)OAS mRNA水平的提高來測定，例如血液淋巴細(xì)胞。測定血液中OAS酶水平的方法此處用放射性免疫測定試劑盒，以及文獻(xiàn)(Satoh，Y.等，J.Interferon and Cytokine Res.，19887(1999))中的方法。用于測定細(xì)胞中OAS的mRNA表達(dá)水平的方法在文獻(xiàn)中已知(Takayama，S.等，J.Interferon and Cytokine Res.，19895(1999))。
II.干擾素-τ組合物和治療方法A.干擾素-τ第一個(gè)需要識(shí)別的IFNτ是綿羊IFNτ(IFNτ)，作為18-19kDa蛋白。在孕體(胚胎和周邊膜)的勻漿中識(shí)別到數(shù)個(gè)同種型(Martal，J.等，J.Reprod.Fertil.5663-73(1979))。然后，將釋放到孕體培養(yǎng)介質(zhì)中的低分子量蛋白凈化，其顯示出熱不穩(wěn)定、易成為蛋白酶(Godkin，J.D.，等，J.Reprod.Fertil.65141-150(1982))。IFNτ起初稱為綿羊滋養(yǎng)層蛋白-1(oTP-1)，這是由于其是由綿羊孕體的滋養(yǎng)外胚層在綿羊體內(nèi)母性識(shí)別的關(guān)鍵期最初產(chǎn)生的主要的分泌蛋白。隨后的試驗(yàn)已確定IFNτ是在例如綿羊和牛的反芻動(dòng)物中建立對懷孕的生理反應(yīng)基本的妊娠識(shí)別激素(Bazer，F(xiàn).W.，和Johnson，H.M.Am.J.Reprod.Immunol.2619-22(1991))。通過用合成的寡核苷酸探測綿羊的胚泡庫獲得的IFNτcDNA，其代表N-終端的氨基酸序列(Imakawa，等，1987)，具有和來自人類、大鼠、小鼠和豬的IFN-αs具有45-55％的同源性、以及和現(xiàn)在稱為IFN-Ω的牛IFN-αII具有70％同源性的預(yù)知的氨基酸序列。已報(bào)道了可能代表不同同種型的幾個(gè)cDNA序列(Stewart，H.J.，等，Mol.Endocrinol.265(1989)；Klemann，S.W.，等，Nuc.Acids Res.186724(1990)；和Charlier，M.，等，Mol.Cell Endocrinol.76161-171(1991))。所有均大約1kb，帶有編碼23個(gè)氨基酸前導(dǎo)序列和172個(gè)氨基酸成熟蛋白的585基本開發(fā)閱讀框(base open readingframe)。預(yù)測的IFNτ結(jié)構(gòu)為附著有氨基和羧基終點(diǎn)的四個(gè)螺旋束，進(jìn)一步支持其分類為類型I IFN(Jarpe，M.A.，等，Protein Engineering7863-867(1994))。
干擾素概覽 盡管IFNτ顯示出一些常規(guī)和類型I IFNs相關(guān)的活性(參見上表)，在它和其它的類型I IFNs之間仍存在著相當(dāng)大的差別。最顯著的差別是其在妊娠中的作用，詳見上表。另一個(gè)差別是病毒誘導(dǎo)性。除了IFNτ的所有的類型I IFNs很容易被病毒和dsRNA誘導(dǎo)(Roberts，R.M.，等，Endocrin.Rev.13432-452(1992))。誘導(dǎo)的IFN-α和IFN-β的表達(dá)是短暫的，持續(xù)大約幾個(gè)小時(shí)。相反，一旦誘導(dǎo)，IFNτ的合成能維持?jǐn)?shù)天的時(shí)間(Godkin，等，1982)。在單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，與其它的類型I IFNs相比，產(chǎn)生了300倍更多的IFN-τ(Cross，J.C.，和Roberts，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883817-3821(1991))。其它差別可能在于IFNτ基因的調(diào)節(jié)區(qū)。例如，用牛IFNτ基因轉(zhuǎn)染人類滋養(yǎng)層細(xì)胞系JAR產(chǎn)生抗病毒活性，而用牛的IFN-Ω基因轉(zhuǎn)染則沒有產(chǎn)生。這意味著IFNτ基因表達(dá)的獨(dú)特的反式作用因子。與此一致的是，觀察到盡管IFNτ的近端啟動(dòng)區(qū)(從126到轉(zhuǎn)錄起始位置)與IFN-α和IFN-β高度同源；從-126到-450的區(qū)域沒有同源性，并且只增強(qiáng)了IFNτ表達(dá)(Cross，J.C.，和Roberts，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883817-3821(1991))。因此，與其它類型I的IFNs相比，IFNτ的表達(dá)涉及了不同的調(diào)節(jié)因子。綿羊-IFNτ的172氨基酸序列已提出，例如在美國專利No.5,958,402，其同源的牛-IFNτ序列描述在例如Helmer等，J.Reprod.Fert.7983-91(1987)和Imakawa，K.等，Mol.Endocrinol.，3127(1989)。來自這些參考文獻(xiàn)的綿羊-IFNτ和牛-IFNτ序列在此引入作為參考。綿羊IFNτ的氨基酸序列此處表示為SEQ ID NO2。
1.IFNτ的分離IFNτ可以從收集自懷孕的綿羊的孕體中分離，并在修飾的極限必需培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，如在Godkin，J.D.，等，J.Reprod.Fertil.65141-150(1982)和Vallet，J.L.，等，Biol.Reprod.371307(1987)中描述?？梢酝ㄟ^離子交換色譜和凝膠過濾從孕體培養(yǎng)液中將IFNτ凈化。分離的IFNτ同源性可以用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析(Maniatis，T.，等，in MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1982)；Ausubel，F(xiàn).M.，等，in CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，Inc.，Media，PA(1988))，在凈化的IFNτ樣品中的蛋白濃度的確定可以用二辛可寧酸(BCA)分析進(jìn)行(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL；Smith，P.K.等，Anal.Biochem.15076(1985))。
2.IFNτ的重組生產(chǎn)IFNτ重組蛋白可以用使用合適的表達(dá)系統(tǒng)從任何選定的IFNτ多核苷酸片段生產(chǎn)，例如細(xì)菌或酵母細(xì)胞。IFNτ多核苷酸和多肽序列的分離在PCT公布WO/94/10313中有所描述，此處引入作為參考。為制備IFNτ表達(dá)載體，將IFNτ編碼序列(例如SEQ IDNOS1或4)放置在表達(dá)載體中，例如細(xì)菌表達(dá)載體，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法表達(dá)。合適的載體的例子包括λ(lambda)gtll(Promega，Madison W1)；pGEX(Smith，P.K.等，Anal.Biochem.15076(1985))；pGEMEX(Promega)；和pBS(Strategene，La Jolla CA)載體。也可以使用其它含有合適的啟動(dòng)子的細(xì)菌表達(dá)載體，例如T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子或tac啟動(dòng)子。將IFNτ合成多核苷酸克隆到修飾的pIN III omp-A表達(dá)載體中在Materials and Methods中有所描述。對于此處所述的研究，將在SEQ ID NO4中存在的IFNτ編碼序列克隆到適于酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的載體中，其含有甲醇調(diào)節(jié)的醇類氧化酶(AOX)啟動(dòng)子和Pho1信號序列。載體用于轉(zhuǎn)化P.pastoris宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照制造商的指示用于表達(dá)蛋白(Invitrogen，SanDiego，CA)。其它適用于表達(dá)IFNτ用于本發(fā)明的方法的酵母載體包括2微米的質(zhì)粒載體(Ludwig，D.L.等，Gene，13233(1993))、酵母整合型質(zhì)粒(Shaw，K.J.等，DNA，7117(1988))、YEP載體(Shen，L.P.等，Sci.Sin.，29856(1986))、酵母著絲粒質(zhì)粒(YCps)、和其它帶有可調(diào)節(jié)的表達(dá)的載體(Hitzeman，R.A.等，U.S.專利No.4,775,622，1988年10月4日授權(quán)；Rutter，W.J.等，U.S.專利No.4,769,238，1988年9月6日授權(quán)；Oeda，K.等，U.S.專利No.4,766,068，1988年8月23日授權(quán))。優(yōu)選載體包括含有有效酵母啟動(dòng)子的表達(dá)盒，例如MFα1啟動(dòng)子(Bayne，M.L.等，Gene 66235-244(1988)，GADPH啟動(dòng)子(甘油醛-3-磷酸鹽-脫氫酶；Wu，D.A.等，DNA，10201(1991))或半乳糖-可誘導(dǎo)的GAL10啟動(dòng)子(Ludwig，D.L.等，Gene，13233(1993)；Feher，Z.等，Curr.Genet.，16461(1989))；Shen，L.P.等，Sci.Sin.，29856(1986))。酵母轉(zhuǎn)化宿主通常為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，然而，如上所述，也可以使用其它適用于轉(zhuǎn)化的酵母(例如裂殖酵母非洲粟酒(Schizosaccharomyces pombe)，Pichia pastoris等)。進(jìn)一步地，可以將編碼IFNτ多肽的DNA克隆到任何數(shù)量的市售的載體中以在合適的宿主系統(tǒng)中產(chǎn)生多肽的表達(dá)。該系統(tǒng)包括上述的細(xì)菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)以及如下bacullrus表達(dá)(Reilly，P.R.等，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORSA LABORATORYMANUAL，(1992)；Beames等，Biotechniques，11378(1991)；Clontech，Palo Alto CA)；植物細(xì)胞的表達(dá)、轉(zhuǎn)基因植物的表達(dá)和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)(Clontech，Palo Alto CA；Gibco-BRL，Gaithersburg MD)。重組的多肽可以表示為融合蛋白或天然蛋白?？梢詫⒍鄠€(gè)特征配制到表達(dá)載體中，例如啟動(dòng)表達(dá)的序列分泌到培養(yǎng)基中的前導(dǎo)序列。重組生產(chǎn)的多肽通常從溶解的細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離出?？梢杂矛F(xiàn)有技術(shù)中已知X的方法來凈化，包括分級鹽析、離子交換層析和親和層析。如上所述可以使用免疫親和層析，使用在IFNτ多肽基礎(chǔ)上產(chǎn)生的抗體。除了重組方法外，可以通過基于親和的對方法從選擇的細(xì)胞中將IFNτ蛋白或多肽分離出，例如使用合適的抗體。進(jìn)一步地，可以使用現(xiàn)有技術(shù)中普通技術(shù)人員所公知的方法化學(xué)合成IFNτ肽(例如SEQ ID NOS2或3)。
B.IFNτ的口服施用在支持本發(fā)明的研究中，將IFNτ口服施用給小鼠和人類，監(jiān)測全血中已公知的IFN行為的標(biāo)記2′，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)活性的誘導(dǎo)(Shindo，M.等，Hepatology 8366-370，(1988))?？梢岳斫獾氖潜O(jiān)測OAS水平的其它方法也是適用的，可能在精確度和靈敏度方面提供長處。例如，可以使用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCT技術(shù)來測量OAS的細(xì)胞mRNA表達(dá)水平(Takayama，S.等，J.Interferon and Cytokine Res.，19895(1999)。
1.將IFNτ施用給小鼠在用于支持本發(fā)明的研究中，對口服施用的IFNτ檢驗(yàn)其誘導(dǎo)OAS的能力。如實(shí)施例1所述，通過口服或腹膜內(nèi)(i.p.)將IFNτ施用給小鼠。測定施用IFNτ后在全血24小時(shí)中的OAS活性，結(jié)果見圖1。圖1顯示以pmol/dL為單位的OAS的血液濃度，用含有10％麥芽糖的鹽水治療的對照動(dòng)物中的濃度剛剛超過1,000pmol/dL。用在含有10％麥芽糖的鹽水中的5×108單位的IFNτ通過腹膜內(nèi)治療的小鼠的OAS血液水平大約為1700pmol/dL。用相同IFNτ劑量的口服治療的小鼠的血液OAS水平大約為2000pmol/dL。在另一個(gè)研究中，如實(shí)施例2詳述，將IFNτ口服施用給小鼠以測定其以與劑量相關(guān)的方式誘導(dǎo)OAS的能力。將IFNτ以0(對照)、1×103、1×104、1×105的單位口服施用給測試小鼠的胃的上部?？诜┯?2小時(shí)后，從心臟取全血，測定OAS濃度。如圖2所示，全血中OAS的濃度以與劑量相關(guān)的方式增長。實(shí)施例3描述了在小鼠上進(jìn)行的進(jìn)一步的研究。在這些研究中，在施用IFNτ前，將小鼠禁食和飲料至少6小時(shí)，口服或腹膜內(nèi)(i.p.)注射施用IFNτ。口服施用時(shí)，用口服輸送針將IFNτ直接引入到胃的上部。圖3顯示胃施用IFNτ對多個(gè)小鼠物種的血液中誘導(dǎo)OAS活性的效果ICR、BALB/c、C57BL/9、NZW/N和SJL/J。所有的試驗(yàn)小鼠用IFNτ(105U)口服治療。對照小鼠只口服接受沒有IFNτ的10％麥芽糖的溶液。每一柱圖代表兩次操作的具有相似結(jié)果的每一實(shí)驗(yàn)(3-5小鼠)的平均±S.E.。如圖3所示，在所有的小鼠物種中OAS活性水平隨著口服施用IFNτ而提高，盡管提高的程度在物種間變化。在ICR、C57BL/9和NZW/N小鼠中誘導(dǎo)的活性水平高于BALB/c和SJL/J小鼠。在另一個(gè)研究中，監(jiān)測施用IFNτ后作為時(shí)間的函數(shù)的OAS活性。在該研究中，動(dòng)物(ICR小鼠)在施用IFNτ(105U)之前接受6個(gè)小時(shí)的禁食(進(jìn)水但不進(jìn)食)。在施用IFNτ8小時(shí)、16小時(shí)和24小時(shí)后取血樣。結(jié)果見圖4A。圖4A顯示在施用IFNτ后在所指示的時(shí)間間隔取樣的血液樣品中，表示為用鹽水/10％麥芽糖賦形劑治療的對照小鼠的百分比的血液OAS水平。在圖4A中，每一柱圖代表兩次操作的具有相似結(jié)果的每一實(shí)驗(yàn)(3只小鼠)的平均±S.E.。全血中的OAS活性以與時(shí)間相關(guān)的方式提高，而無論其是口服或腹膜內(nèi)注射的施用路徑，但是在口服施用后的24小時(shí)點(diǎn)觀察到比腹膜內(nèi)注射更高的水平。在另一個(gè)研究中，將不同濃度的IFNτ(0、102、103、104和105U)在6小時(shí)的禁食后施用給小鼠。在24小時(shí)后取血，分析OAS的活性。結(jié)果見圖4B。圖4B顯示將濃度為0、102、103、104和105U的IFNτ施用24小時(shí)后表示為對照小鼠的百分比的血液OAS水平。每一柱圖代表兩次操作的具有相似結(jié)果的每一實(shí)驗(yàn)(3只小鼠)的平均±S.E.。腹膜內(nèi)注射后，在低劑量(102U)時(shí)活性水平相當(dāng)高，在更高劑量的IFNτ(104和105U)時(shí)達(dá)到飽和。相反，p.o.施用后活性水平的提高與劑量相關(guān)。圖4A-4B中的數(shù)據(jù)顯示口服施用的IFNτ誘導(dǎo)的血液OAS活性的水平高于腹膜內(nèi)注射所誘導(dǎo)的水平。特別地，在IFNτ劑量高于大約103U時(shí)和在施用后超過大約8個(gè)小時(shí)后，口服誘導(dǎo)的血液OAS水平高于腹膜內(nèi)注射誘導(dǎo)的血液OAS水平。在另一個(gè)研究中，評價(jià)了禁食條件對施用IFNτ誘導(dǎo)血液OAS的影響。在該研究中，小鼠在6小時(shí)內(nèi)接受給定量的食物和水。在6小時(shí)給定飲食后，將104U的IFNτ通過口服管飼或腹膜內(nèi)注射和食物和水一起施用。給定量的飲食如下情況I，沒有食物和水；情況II有水沒有食物；情況III，只有食物；情況IV，有食物和水。在24小時(shí)從心臟取全血，測定OAS活性的水平。結(jié)果見圖5A-5D。圖5A-5D分別對應(yīng)于接受上段中給定的食物和水的情況I-V的小鼠。圖5A-5D的結(jié)果顯示表示為對照的百分比的血液OAS的誘導(dǎo)，其中對照為用沒有干擾素的10％麥芽糖的溶液治療的小鼠的血液OAS。結(jié)果表明在禁食狀態(tài)口服施用IFNτ的對象誘導(dǎo)的血液OAS水平更高，這可從沒有接受食物的小鼠的圖5A和圖5B中看出。在該研究中，觀察到有水供應(yīng)或沒有時(shí)，消化了幾乎相同量的食物。然而，水?dāng)z入量在沒有進(jìn)食(情況I和情況II)時(shí)低于進(jìn)食(情況III和情況IV)時(shí)。在某些動(dòng)物中，禁食6小時(shí)后，口服施用含有藍(lán)色染料的0.2mL麥芽糖溶液，檢測管道胃和腸道中染料的分布(數(shù)據(jù)未顯示)。食物攝取(情況III和情況IV)后，小鼠的胃膨脹，染料主要位于胃部，這可能是因?yàn)槭澄镂樟巳玖?。然而，?dāng)沒有攝取食物時(shí)，染料快速轉(zhuǎn)移到了腸。該觀察結(jié)果表明口服施用的IFNτ可能在腸發(fā)揮其作用以誘導(dǎo)血液中高水平的OAS活性。進(jìn)行對比研究以測量口服施用MuIFN-α對血液OAS水平的影響。在該研究中，用不同濃度(0、102、103和104IU)的MuIFN-α通過p.o.或i.p.路徑治療ICR小鼠。分析施用MuIFN-α16小時(shí)后獲得的血液中OAS活性。結(jié)果見圖6，其中每一柱圖代表兩次操作的具有相似結(jié)果的每一實(shí)驗(yàn)(3只小鼠)的平均±S.E.。圖6的柱圖顯示口服或通過腹膜內(nèi)注射施用MuIFN-α(0、102、103和104IU)后表示為對照小鼠的百分比的血液OAS活性的誘導(dǎo)。通過每一種施用路徑，OAS活性水平的提高與劑量相關(guān)，i.p.注射比p.o.施用對血液OAS活性的誘導(dǎo)更強(qiáng)。該結(jié)果與用IFNτ觀察到的結(jié)果相反，其中口服施用IFNτ比用腹膜內(nèi)注射IFNτ獲得更高的血液OAS水平。而且，施用MulFN-α?xí)r小鼠的體溫略微升高，但用IFNτ時(shí)沒有升高(數(shù)據(jù)未顯示)。圖1-6中顯示的數(shù)據(jù)說明施用到腸道的IFNτ體內(nèi)誘導(dǎo)或向上調(diào)節(jié)OAS的反應(yīng)。盡管以前在文獻(xiàn)中報(bào)道過口服施用IFNτ(例如參見WO 96/28183)，但還沒有研究表明該非內(nèi)源性的干擾素能夠口服施用以誘導(dǎo)OAS反應(yīng)。在本研究中，將IFNτ直接施用到腸道，沒有與口粘膜接觸，因此排除了任何口咽區(qū)域的吸收。與通過口腔粘膜吸收IFNτ相比，從胃部直接吸收IFNτ會(huì)減少抗IFNτ的抗體的形成，特別是在長期施用IFNτ的情況下。
2.施用給丙型肝炎的人類患者征募感染丙型肝炎的人類患者用于研究。將患者分成四個(gè)試驗(yàn)組用口服IFNτ(SEQ ID NO4)治療。如實(shí)施例4所述，每一試驗(yàn)組中的每一患者每日自己施用3次的1mg/mL的IFNτ溶液的定量體積。測試組I、II、III和IV中的患者每日的總劑量分別為1mg IFNτ、3mgIFNτ、9mg IFNτ和15mg IFNτ?；颊咴诖_定的間隔返回到測試門診以提供血液樣品用于分析(i)(a)在血漿中和(b)在外周血單核細(xì)胞中的2′，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)的水平；(ii)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平；和(iii)病毒價(jià)水平(每mL的丙型肝炎R(shí)NA的拷貝數(shù))。每一測試組中一些患者的結(jié)果顯示在下表3-5中和繪制在圖7-8中。表3A-3B顯示劑量組I中每日用0.33mg的口服IFNτ治療三次的6個(gè)患者的數(shù)據(jù)。單位為pmol/dL的血清2-5OAS水平列于標(biāo)記為“2-5A(血清)”的欄中。其中的兩個(gè)患者PAB/001和JRJ/006的血液OAS水平?jīng)]有提高。其他的四個(gè)患者的血液OAS水平有可測量的提高，標(biāo)記為MSM/002和LER/004的患者顯示出顯著的提高?；颊進(jìn)SM/002的基線OAS水平為11.0pmol/dL。在第15測試日，其提高到51.5，超過四倍的增長?；颊遉-I/005的基線OAS水平為43.4pmol/dL。在第29測試日該OAS水平提高到74.8pmol/dL。表4顯示劑量組II中每日用1mg IFNτ治療三次的三個(gè)患者的數(shù)據(jù)。患者AMC/007和DBF/012對IFNτ治療有反應(yīng)，血液OAS水平顯著提高。例如，患者AMC/007的基線OAS水平為11.2pmol/dL。其在治療的前29日內(nèi)穩(wěn)定提高，最大為在第29測試日測量的120pmol/dL。在整個(gè)測試日71日內(nèi)OAS水平保持為基線水平的四倍多?；颊逥BF/012在治療前的初始OAS水平為28.8pmol/dL。該水平在整個(gè)測試日71日治療期間內(nèi)提高和降低，在第15和71日時(shí)測量到較高的水平，超過100pmol/dL。在第8和第71日之間觀察到至少1.5倍的提高。表5顯示劑量組II中每日用3mg IFNτ治療三次的三個(gè)患者的數(shù)據(jù)。在研究日測定血液OAS的基線水平?；颊逤LR/011根據(jù)提高的血液OAS水平有輕微的反應(yīng)?；颊逪CM/010顯示血液OAS水平的大約1.5倍的增長，患者VCC/009在第29測試日顯示出在血液OAS水平的超過4倍的提高。表3-5中的數(shù)據(jù)說明患有病毒丙型肝炎的個(gè)體對口服IFNτ的不同的反應(yīng)。很多患者的血液OAS水平提高，典型地，血液OAS為初始基線水平的1.5倍的提高，通常為2倍的提高，在某些情況下提高4倍。每一患者的反應(yīng)取決于眾多因素，包括感染的狀態(tài)和身體對治療的個(gè)體化反應(yīng)。因此，本發(fā)明考慮將IFNτ口服施用給需要治療的患者，其中選擇IFNτ的起始劑量以對于該特定患者獲得血液OAS水平的提高。以針對于患者腸道、而不是口腔的方式施用IFNτ。劑量的選擇或劑量選擇的確定可以通過例如檢測血液OAS或OAS mRNA的水平來進(jìn)行，例如在治療前和在治療啟動(dòng)后。或者可以根據(jù)不同疾病條件下對給定劑量響應(yīng)的模型病人預(yù)確定有效劑量。例如，對給定年齡范圍內(nèi)和具有特定疾病、例如HCV感染或MS的患者監(jiān)測對不同起始IFN-tau水平有響應(yīng)的血液OAS的變化，以預(yù)確定具有那個(gè)年齡/疾病情況的病人的合適劑量，并且這種劑量確定方法可以提供給治療醫(yī)生。本發(fā)明的一個(gè)方面包括IFN-tau治療試劑盒，其含有以口服輸送并適于將蛋白靶向腸道中的形式的IFN-tau，例如，IFN-tau的腸涂層的形式，和產(chǎn)品資料和插入物以提供對不同患者情況的有效劑量的說明。即在OAS血液水平中產(chǎn)生可以測量的提高的有效劑量。優(yōu)選，該插入物提供了劑量范圍和OAS響應(yīng)的預(yù)知的初始變化。初始施用后，或達(dá)到在血液OAS水平中產(chǎn)生可測量的提高的劑量(有效劑量)時(shí)，繼續(xù)施用有效劑量的IFNτ，優(yōu)選在延長的治療期內(nèi)每日或每周數(shù)次的基礎(chǔ)上。在延長的基礎(chǔ)上施用的有效劑量是在血液OAS中產(chǎn)生初始可測量的提高的有效量，而與延長的治療期間的實(shí)際的血液OAS水平的行為無關(guān)，不論繼續(xù)的有效劑量是否與初始的有效劑量相同或不同。因此，在治療期間，血液OAS水平可能在提高的水平上保持恒定、繼續(xù)增長、或甚至下降(例如，對感染病毒的下降水平的響應(yīng))，盡管患者繼續(xù)接受能夠在血液OAS水平中產(chǎn)生初始可測量的提高的有效劑量的IFNτ。該有效劑量典型地在105到1010單位IFNτ/日，并可以調(diào)整該劑量以獲得所期望的血液OAS的初始提高，例如是正常、未治療的水平的1.5到4倍。圖7-8為該研究中幾個(gè)患者的病毒價(jià)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平的數(shù)據(jù)。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶是催化將丙氨酸中的γ-酮基團(tuán)轉(zhuǎn)化至酮戊二酸鹽中的γ-酮基團(tuán)的血清酶，導(dǎo)致草酰乙酸和丙酮酸的形成。ALT主要在肝臟中找到，患有肝臟疾病、例如丙型肝炎的患者在血液中的ALT水平很高(HARRISON’S PRINCIPLE OF INTERNAL MEDICINE，Wilson等，Eds.，12thEditions，Part Nine，page 1309，(1991))。健康的人的血清ALT水平大約為1-45U/L。圖7A-7C顯示口服施用4.9×108單位/日(0.33mg t.i.d.)的IFNτ后，劑量組I中的三個(gè)患者，患者PAB/001(圖7A)、MSM/002(圖7B)和DMA/003(圖7C)，的丙型肝炎(HCV)RNA病毒價(jià)(帶有陰影的柱圖)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平(菱形線)?；颊進(jìn)SM/002和DMA/003(圖7B、7C)在整個(gè)169日的治療期間內(nèi)ALT水平連續(xù)下降?；颊逷AB/001(圖7A)顯示出具有更多變化的ALT血液水平，該水平有所提高，但作為IFNτ治療的結(jié)果，其ALT水平總體下降。圖8A-8B顯示用1.5×109單位/日(1.0mg t.i.d.)的口服IFNτ治療后，劑量組II中的患者AMC/007(圖8A)和VCC/009(圖8B)的丙型肝炎(HCV)RNA和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平。這兩個(gè)患者響應(yīng)不同，VCC/009顯示出在第一個(gè)周的治療中ALT的初始提高，然后從大約第8天至第113天ALT水平連續(xù)下降?？梢岳斫獾氖菍τ谀承┗颊吆湍承┘膊?，考慮將IFNτ和其他治療劑結(jié)合施用。例如，將IFNτ與其他已識(shí)別的肝炎抗病毒試劑結(jié)合可能對某些患者有益。更經(jīng)常地，考慮將IFNτ與任何已知的藥劑結(jié)合。
3.將IFNτ施用給具有試驗(yàn)的變應(yīng)性腦脊髓炎的小鼠在另一個(gè)研究中使用多發(fā)性硬化的公認(rèn)的模型說明口服施用IFNτ來治療自身免疫性疾病。該研究通過評價(jià)具有試驗(yàn)的變應(yīng)性腦脊髓炎的嚙齒動(dòng)物中的響應(yīng)(EAE；Zamvil，S.S.等，Ann.Rev.Immunol.，8579-621(1990))總體評價(jià)了IFNτ在治療自身免疫性疾病的效力，該嚙齒動(dòng)物為抗原誘導(dǎo)的自身免疫性疾病的動(dòng)物模型。EAE在其臨床和病理表示方面類似于人類多發(fā)性硬化(MS)，因此可以用于評價(jià)對例如MS的人類自身免疫性疾病的治療。EAE是T-細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的炎性自身免疫性脫髓鞘病，通過將易受感染的小鼠、大鼠或豚鼠物種用髓磷脂堿性蛋白(MBP)或用致腦炎的肽片段免疫進(jìn)行誘導(dǎo)。模型動(dòng)物物種中的遺傳易感性部分地基于致腦炎的肽結(jié)合特定類型II的主要的組織相容性配合物(MHC-II)分子的能力(Fritz，R.B.，等，J.Immunol.130(3)1024-1026(1983)；Wraith，D.C.，等，Cell 59247(1989))。特別地，具有H-2u單模標(biāo)本的小鼠易感染EAE。易感染的小鼠物種包括PL/J小鼠(Klein，J.，等，Immunogenetics 17553(1983))、(PL/J×SJL)F1小鼠(Zamvil，S.S.等，Ann.Rev.Immunol.，8579-621(1990)；Wraith，等，1989)、B10.PL小鼠(Figuero，F(xiàn).，等，Immunogenetics 15(4)399-404(1982))、NZW小鼠(Kotzin，B.L.，等，J.Exp.Med.2651237(1987))和(NZB×NZW)F1(Kotzin，B.L.，等，J.Exp.Med.2651237(1987))小鼠。支持本發(fā)明的研究和下面的詳述表明口服施用的IFNτ組合物與注射的IFNτ組合物在治療疾病或從用IFNτ治療中受益的疾病情況的效力方面是相當(dāng)?shù)摹２粌H口服施用的IFNτ在治療從用IFNτ治療中受益的疾病(EAE)方面有效，而且施用的口服路徑相對用注射的IFNτ組合物的治療帶來未預(yù)料到的優(yōu)勢。例如，口服施用的IFNτ在被治療的個(gè)體的血漿中導(dǎo)致明顯很低的抗IFNτ的抗體水平。這是有益的，因?yàn)榭诜┯玫腎FNτ因此更不可能被宿主的免疫反應(yīng)無效(即對治療的脫敏作用和/或劑量水平顯著降低)，并且接受治療的個(gè)體更不可能由于這種免疫反應(yīng)而經(jīng)受不利的副作用。表明這些和相關(guān)發(fā)現(xiàn)的試驗(yàn)結(jié)果見下。
a.口服施用的IFNτ抑制EAE的發(fā)展如實(shí)施例5所述，測試口服施用和注射的IFNτ防止EAE誘導(dǎo)的能力。將EAE在新西蘭白鼠(NZW)中通過用牛髓磷脂堿性蛋白(bMBP)免疫進(jìn)行誘導(dǎo)。接受者NZW小鼠在用牛髓磷脂堿性蛋白(bMBP)免疫之日前48小時(shí)、在免疫日和在免疫日之后48小時(shí)通過i.p.注射或口服接受OvIFNτ來誘導(dǎo)試驗(yàn)性的變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)?？诜桂B(yǎng)和i.p.注射OvIFNτ均能防止EAE(實(shí)施例5，表6)。所有通過i.p.注射接受IFNτ的動(dòng)物和9只口服接受IFNτ的動(dòng)物中的7只動(dòng)物沒有EAE癥狀。而且，抗OvIFNτ單克隆抗體HLI27在部分中和OvIFNτ阻滯EAE的能力方面有效。這些試驗(yàn)表明口服施用的IFNτ在治療多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型的EAE的癥狀方面有效。
b.口服施用后OvIFNτ存在于血清中為證實(shí)口服施用的IFNτ進(jìn)入循環(huán)中，用細(xì)胞致病作用(抗病毒)分析(Familetti，P.C.等，Meth.Enzymol.78387(1981))檢驗(yàn)通過i.p.注射或口服施用接受IFNτ的小鼠的血清中IFNτ的存在，如實(shí)施例6所述。結(jié)果顯示在圖9中。特定活性表示為抗病毒單位/mg從用MDBK細(xì)胞進(jìn)行的抗病毒分析獲得的蛋白?？诜桂B(yǎng)(填充的柱圖)后檢測最多2小時(shí)的OvIFNτ的水平為200U/mL。這些數(shù)據(jù)表明口服施用的IFNτ進(jìn)入循環(huán)，并且在施用后在血清(serum)中停留大約2小時(shí)。
c.口服施用OvIFNτ缺少毒性以前已表明類型I IFNs IFNα和IFNβ當(dāng)用作人類的治療劑時(shí)誘導(dǎo)有毒的副作用，其表現(xiàn)為與流感相似的癥狀、發(fā)熱、惡心和不適(Degre，M.，Int.J.Cancer 14699(1974)；Fent，K.和G.Zbinden，Trnds.Pharm.Sci.561-26(1987))。相反，OvIFNτ在體外和體內(nèi)均顯示出明顯的毒性缺少。支持本發(fā)明的研究比較了OvIFNτ與IFNα和IFNβ的毒性誘導(dǎo)，其通過測量口服喂養(yǎng)給予時(shí)在外周血中淋巴細(xì)胞的衰減進(jìn)行。從尾部取血，白細(xì)胞(WBC)的計(jì)數(shù)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算。WBC差別計(jì)數(shù)在Wright-Giemsa染色的血涂片上完成。結(jié)果見表1A、1B和1C。在用IFNα和β喂養(yǎng)的小鼠中檢測到顯著水平的毒性，而在用105、2×105或5×105U的OvIFNτ或單獨(dú)用PBS喂養(yǎng)的小鼠中沒有檢測到顯著的淋巴細(xì)胞衰減。這些數(shù)據(jù)表明與其它類型I的IFNs相比，口服施用的OvIFNτ能夠顯著的減少毒性。
表1A.口服喂養(yǎng)后IFNsτ、β和α的毒性比較
表1B.口服喂養(yǎng)后IFNsτ、β和α的毒性比較
*p＜0.05表1C.口服喂養(yǎng)后IFNsτ、β和α的毒性比較
*p＜0.05**p＜0.03d.OvIFNτ防止EAE的慢性復(fù)發(fā)除了防止與EAE相關(guān)的癥狀的初起之外，口服施用的OvIFNτ還能在EAE的慢性復(fù)發(fā)的模型中防止麻痹，如實(shí)施例7詳述。而用MBP免疫(以誘導(dǎo)EAE)、并且沒有接受OvIFNτ治療的5/5小鼠發(fā)展了慢性復(fù)發(fā)的麻痹，用OvIFNτ治療(或者通過i.p.注射，或者口服喂養(yǎng)，每48小時(shí)施用)的4/5動(dòng)物完全沒有該疾病(圖10B和10C)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了上述結(jié)果，并且表明口服施用IFNτ能夠阻滯慢性復(fù)發(fā)的EAE的發(fā)展。該研究還表明在延長的期間內(nèi)以每48小時(shí)施用一次的頻率口服施用IFNτ與i.p.注射在治療對用IFNτ治療有響應(yīng)的疾病情況方面一樣有效。
e.口服施用IFNτ后EAE小鼠的脊髓的組織學(xué)分析通過分析OvIFNτ治療疾病的細(xì)胞結(jié)果的效力來評價(jià)OvIFNτ防止EAE的能力，其中疾病為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中脊髓白質(zhì)中淋巴細(xì)胞的損害。損害指示了淋巴細(xì)胞滲透入CNS的程度。MBP-免疫的小鼠或者沒有治療(對照)或者用OvIFNτ通過口服或i.p.路徑治療，將脊髓腰區(qū)的部分染色，用以評價(jià)淋巴細(xì)胞，如實(shí)施例8所述。組織部分的顯微照片見圖11A-11C。淋巴細(xì)胞損害存在于對照動(dòng)物的脊髓白質(zhì)中(圖11A)，但不存在于用OvIFNτ通過i.p.注射(圖11B)或口服喂養(yǎng)(圖11C)治療的小鼠中。這些數(shù)據(jù)表明IFNτ的保護(hù)性作用與對CNS中淋巴細(xì)胞的滲透的抑制相關(guān)。而且，這些數(shù)據(jù)顯示IFNτ治療抑制了自身免疫性疾病的細(xì)胞顯示(manifestation)，而不是簡單地掩飾癥狀。
f.停止用OvIFNτ的治療導(dǎo)致復(fù)發(fā)性的麻痹實(shí)施例10描述了用于確定在用MBP注射的小鼠中有效防止EAE的類型和治療持續(xù)時(shí)間，結(jié)果見圖13。小鼠通過i.p.注射或口服喂養(yǎng)(每48小時(shí))OvIFNτ的治療來防止EAE，只要持續(xù)該治療(在實(shí)施例10中是58日)，但在終止OvIFNτ治療后發(fā)展了疾病的癥狀(圖13)。該結(jié)果表明盡管IFNτ可能不能治愈象EAE的自身免疫性疾病(例如MS)，只要持續(xù)該治療，其在抑制疾病的病理顯示方面還是有效的治療。
g.口服施用OvIFNτ減少了抗OvIFNτ的抗體的響應(yīng)如實(shí)施例11所述，口服施用IFNτ的治療(相對于注射)的一個(gè)優(yōu)勢是在接受口服治療的個(gè)體中抗IFNτ的抗體效價(jià)的減少。停止OvIFNτ治療后，將每一治療組中的小鼠混合，用ELISA檢驗(yàn)其血清中抗OvIFNτ的抗體的存在。盡管通過i.p.注射接受IFNτ的小鼠顯示出抗IFNτ的抗體的水平的上升，口服喂養(yǎng)接受IFNτ的動(dòng)物顯示出低的多的抗IFNτ的抗體效價(jià)(通常低3-5倍)。如所預(yù)計(jì)的，沒有接受OvIFNτ治療的小鼠沒有顯示出抗OvIFNτ的抗體。還檢驗(yàn)了血清在MDBK細(xì)胞系中中和OvIFNτ抗病毒活性的能力。沒有一份來自i.p.注射或口服喂養(yǎng)的小鼠的血清具有中和活性(表7)。該結(jié)果表明口服喂養(yǎng)OvIFNτ能大量地規(guī)避針對OvIFNτ蛋白的抗體響應(yīng)。在口服治療的對象中這種減少的抗體響應(yīng)減少了IFNτ治療的不期望的與免疫系統(tǒng)相關(guān)的副作用。
III.使用的方法在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供抑制治療人類的對干擾素治療有響應(yīng)的疾病或情況?！皩Ω蓴_素治療有響應(yīng)的”情況指的是當(dāng)施用干擾素、特別是類型I干擾素、更特別地是干擾素-tau后，其中疾病的存在、進(jìn)展或癥狀能夠發(fā)生改變。對用IFNα或IFNβ治療有響應(yīng)的情況也可能對用IFNτ的治療有響應(yīng)。更優(yōu)選地，對干擾素治療有響應(yīng)的情況指的是當(dāng)以非口服路徑、例如注射的方式施用IFNτ時(shí)能減輕疾病的存在、進(jìn)展或癥狀。此處所述的方法包括以口服施用的劑量的形式提供IFNτ，以治療有效量施用到胃和/或腸，其通過受體的血液OAS水平的增加得以證實(shí)。IFNτ在作為抗病毒劑、抗增殖劑和在治療自身免疫性疾病中具有生物活性(參見例如U.S.專利Nos.5,958,402；5,942,223；6,060,450；6,372；206，其在此處并入作為參考)。因此，本發(fā)明打算口服施用IFNτ來治療對注射施用的IFNτ有響應(yīng)的任何情況?？梢杂帽景l(fā)明的方法治療的情況和疾病包括自身免疫性疾病、炎性疾病、增殖性疾病和過度增殖性疾病、以及免疫介導(dǎo)的疾病。
A.免疫系統(tǒng)疾病的治療本發(fā)明的方法在治療與免疫系統(tǒng)超過敏性相關(guān)的情況方面有優(yōu)勢。有四種類型的免疫系統(tǒng)超過敏性(Clayman，C.B.，Ed.，AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION ENCYCLOPEDIA OFMEDICINE，Random House，New York，N.Y.，(1991))。類型I或速發(fā)性/致過敏的超過敏是由于對過敏原(例如花粉)有響應(yīng)的肥大細(xì)胞的脫粒，包括哮喘、過敏性鼻炎(花粉熱)、蕁麻疹(蕁麻疹)、過敏性休克和其它具有過敏性性質(zhì)的疾病。類型II或自身免疫性超過敏是由于在個(gè)體的自身細(xì)胞中針對察覺到的“抗原”的抗體。類型III超過敏是由于抗原/抗體免疫配合物的形成，其位于各種組織中，并且活化進(jìn)一步的免疫響應(yīng)，是造成例如血清病、變應(yīng)性肺泡炎和有時(shí)在強(qiáng)化接種后形成的大塊腫脹的情況的原因。類型IV超過敏是由于淋巴因子從激活的T-細(xì)胞中的釋放，其造成炎性反應(yīng)。例子包括接觸性皮炎、麻疹的疹和對某些藥物的“變應(yīng)性“反應(yīng)。何種情況會(huì)在某些個(gè)體中造成超過敏的機(jī)理通常還沒有完全理解，但可能涉及到基因和外因。例如，細(xì)菌、病毒或藥物在對自身免疫性疾病已具有基因傾向的個(gè)體中可能會(huì)對引發(fā)自身免疫響應(yīng)起作用。已表明某些類型的超過敏的發(fā)生可能與其它相關(guān)聯(lián)。例如，曾提議具有某些普通的過敏的個(gè)體更容易得自身免疫性疾病。自身免疫性疾病可以大體分成主要限制于特定器官或組織的組和影響整個(gè)身體的組。器官特異性疾病的例子(器官受影響)包括多發(fā)性硬化(在神經(jīng)過程上的髓磷脂層)、類型I的糖尿病mellitus(胰腺)、Hashimotos甲狀腺炎(甲狀腺)、惡性貧血(胃)、Addison’s疾病(腎上腺)、重癥肌無力(在神經(jīng)肌肉連接處的乙酰膽堿受體)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(關(guān)節(jié)襯里)、葡萄膜炎(眼睛)、牛皮癬(皮膚)、Guillain-Barre綜合癥(神經(jīng)細(xì)胞)和Grave’s疾病(甲狀腺)。系統(tǒng)性的自身免疫性疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡和皮肌炎。超過敏疾病的其它例子包括哮喘、濕疹、特應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎、其它濕疹性皮炎、脂溢性皮炎、鼻炎、扁平苔癬、pemplugus、大皰性類皰瘡、大皰性表皮松懈癥、uritcaris、angioedemas、血管炎、紅斑、皮膚嗜伊紅細(xì)胞增多、斑禿、動(dòng)脈粥樣硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬化和腎病綜合征。相關(guān)的疾病包括腸炎，例如乳糜泄、直腸炎、嗜酸性胃腸炎、肥大細(xì)胞增生病、炎性腸病、Chrohs’s疾病和潰瘍性結(jié)腸炎以及與食物相關(guān)的過敏。對使用本發(fā)明的方法進(jìn)行的治療特別具有相應(yīng)地自身免疫性疾病包括多發(fā)性硬化、類型I(胰島素依賴型)糖尿病、紅斑狼瘡、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、Crohn’s疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、口腔炎、哮喘、葡萄膜炎、過敏和牛皮癬。本發(fā)明的方法用于治療和因此減輕自身免疫性疾病，如上述的疾病。自身免疫性疾病的治療此處以對多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型EAE的治療為例。當(dāng)用于治療自身免疫性疾病時(shí)，在IFNτ施用的初期階段將IFNτ以足以獲得OAS的可測量的提高的劑量施用。一旦獲得所期望的有效劑量，患者在延長的期間內(nèi)用有效的IFNτ劑量治療，而與OAS血液水平的進(jìn)一步變化無關(guān)。治療期延長到至少患者有癥狀的期間。一旦與自身免疫性疾病相關(guān)的癥狀停止時(shí)，可以向下調(diào)節(jié)劑量或停止治療?；颊呖梢栽谟肐FNτ治療期間用另一種試劑共同治療，例如已知的抗發(fā)炎性或免疫抑制劑。
B.病毒感染的治療本發(fā)明的方法還可以用于治療與病毒感染相關(guān)的疾病。IFNτ的抗病毒活性具有廣泛的治療應(yīng)用，且沒有通常與IFNαs相關(guān)的有毒的作用，而且IFNτ發(fā)揮其治療活性并對細(xì)胞沒有不利的作用。IFNτ中細(xì)胞毒素的相對缺少使其作為體內(nèi)治療劑非常有價(jià)值，并將IFNτ和大多數(shù)其它已知的抗病毒試劑和所有其它已知的干擾素分開。含有IFNτ的制劑可以口服施用以抑制病毒的復(fù)制。對用于治療病毒感染，將蛋白以足以在患者的血液OAS中獲得可測量的提高的劑量施用。此后，以有效劑量繼續(xù)治療，而無論血液OAS水平的進(jìn)一步變化，例如由于病毒負(fù)荷減少而造成的OAS血液水平的下降。繼續(xù)施用IFNτ直至病毒感染的水平減少，其中病毒感染的水平通過例如血液病毒價(jià)或臨床觀察與病毒感染相關(guān)的癥狀來測量。可以用口服施用的IFNτ治療的特定的病毒疾病的例子包括但不限于肝炎A、肝炎B、丙型肝炎、非A、非B、非C肝炎、Epstein-Barr病毒感染、HIV感染、皰疹病毒(EB，CML，單純性皰疹)、乳頭狀瘤、痘病毒、細(xì)小的核糖核酸病毒、腺病毒、鼻病毒、HTLV I、HTLV II、和人類輪狀病毒?；颊呖梢栽谥委熎陂g用第二種抗病毒試劑共同治療，例如核苷類似物、抗致敏劑(antisense agent)等。
C.治療細(xì)胞增殖性疾病的方法在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于治療以過度增殖為特征的疾病。IFNτ顯示潛在的抗細(xì)胞增殖活性。因此，考慮通過口服施用IFNτ來抑制細(xì)胞生長的方法，以抑制、防止或減緩不受控制的細(xì)胞生長?？梢杂每诜┯玫腎FNτ治療的特定的細(xì)胞增殖性疾病的例子包括但不限于發(fā)型細(xì)胞白血病、Kaposi’s肉瘤、慢性粒細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、表淺性膀胱癌、皮膚癌(基細(xì)胞癌和惡性黑瘤)、腎臟細(xì)胞癌、卵巢癌、低級淋巴和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。當(dāng)用于治療細(xì)胞增殖性疾病時(shí)，將IFNτ以足以獲得患者中血液OAS的初始的可測量的提高的劑量施用。隨后以有效的劑量繼續(xù)治療，而無論血液OAS水平的進(jìn)一步變化，例如由于身體中癌細(xì)胞的減少而造成的OAS血液水平的下降。繼續(xù)以有效劑量施用IFNτ直至觀察到期望的退化水平，其中退化水平通過例如腫瘤大小或在特定組織中癌細(xì)胞的程度來測量?；颊呖梢栽谥委熎陂g用第二種抗癌試劑共同治療，例如順鉑、阿霉菌或紫杉醇。
D.制劑和劑量可以用已知的用于制備藥物組合物的方法來配制含有IFNτ的口服制劑。通常，配制IFNτ治療組合物使得有效量的IFNτ和合適的添加劑、載體和/或賦形劑結(jié)合以便于有效地口服施用該組合物。例如，可以通過將IFNτ(例如凍干的IFNτ蛋白)與例如藥物上可以接受的載體(例如乳糖、玉米淀粉、微晶纖維素、蔗糖)、粘結(jié)劑(例如α-形式的淀粉、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮)、崩解劑(例如羧甲基纖維素鈣、淀粉、低取代的羥基丙基纖維素)、表面活性劑(例如吐溫80、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物)、抗氧化劑(例如L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、抗壞血酸鈉)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石)等結(jié)合來制備含有IFNτ的片劑和膠囊。而且，本發(fā)明的IFNτ多肽可以與固體、粉塵或其它載體混合來壓縮形成藥片，例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、例如馬鈴薯淀粉、玉米淀粉的淀粉、millopectine、纖維素衍生物或明膠，也可以包括潤滑劑，例如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、或聚乙二醇蠟。通過使用多層的載體或稀釋劑，可以制備緩釋片劑?？梢詫⒖诜┯玫囊后w制劑制成酏劑、糖漿或懸浮劑的形式，例如含有大約0.1重量％至大約30重量％的IFNτ、糖、和乙醇、水、甘油、丙烯、二醇和其它可能的具有常規(guī)性質(zhì)的添加劑的混合物的溶液。另一種合適的制劑是防護(hù)性劑量形式，其保護(hù)蛋白在胃和腸的存活直至被腸粘膜吸收。蛋白的防護(hù)性劑量形式是本領(lǐng)域所公知的，包括和腸溶衣和/或粘膜粘附聚合物溶衣。示例性粘膜粘附聚合物制劑包括乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、Eudragit、羧基乙烯基聚合物、卡波姆(carbomer)等。考慮了施用到胃通過攝取來輸送活性形式的IFNτ到腸道、特別是小腸的劑量形式。另外，IFNτ可以與蛋白酶抑制劑一起施用，用聚合材料穩(wěn)定或以脂質(zhì)或聚合物顆粒封裝以提供防止胃和/或腸環(huán)境的保護(hù)。將口服有效的IFNτ藥物組合物以治療有效量施用到需要治療的個(gè)體中。劑量可變化很大，取決于各個(gè)因素例如疾病嚴(yán)重性、患者的年齡和體重、患者正在接受的其它藥物治療等。該數(shù)量或劑量通常由主治醫(yī)生決定。劑量通常為在大約1×104和1×1010單位/日之間，更優(yōu)選大于大約5×108單位/日，優(yōu)選大于大約1×109單位/日。要求血漿中穩(wěn)定升高水平的IFNτ的疾病有益的用藥頻率為大約每2小時(shí)至大約每4小時(shí)，而其它例如多發(fā)性硬化的疾病可以以更低的頻率間隔施用治療有效量得以有效治療，例如每日一次或每48小時(shí)一次。單個(gè)劑量的施用速率通常由主治醫(yī)生調(diào)整以確保施用最低的總劑量而能減輕治療的疾病的嚴(yán)重性。如上所討論，該方法將第一劑量的IFNτ口服施用給需要治療的患者，監(jiān)測生物標(biāo)志以確定單個(gè)患者對第一劑量水平的響應(yīng)?？梢允褂美绶派湫悦庖邷y定試劑盒通過抽血和分析例如血液中的OAS酶的標(biāo)志來很容易地進(jìn)行監(jiān)測。也可以通過抽血和分析例如血液淋巴細(xì)胞的細(xì)胞中OAS的mRNA表達(dá)水平來進(jìn)行監(jiān)測。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明考慮了用于治療患有對IFNτ有響應(yīng)的疾病的患者的試劑盒。試劑盒包括由含有一個(gè)或多個(gè)劑量形式單位、用于口服施用IFNτ的容器組成的第一部分和由用于監(jiān)測IFNτ的生物標(biāo)志的組分組成的第二部分，例如分析血液OAS酶或mRNA水平所需要的組分。一旦患者的情況得以改善，如需要可以施用維持劑量。隨后，可以減少作為癥狀的函數(shù)的劑量或施用頻率、或兩者至能維持所改善的情況的水平。當(dāng)然可以理解的是按照本發(fā)明口服施用IFNτ可以與其它治療結(jié)合使用。例如，IFNτ可以與指向自身免疫性反應(yīng)的抗原一起施用。例子包括共同施用髓磷脂堿性蛋白和IFNτ以治療多發(fā)性硬化；共同施用膠原蛋白和IFNτ以治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，共同施用乙酰膽堿受體多肽和IFNτ以治療重癥肌無力。而且，IFNτ可以和已知的例如類固醇的免疫抑制劑口服施用以治療例如多發(fā)性硬化的自身免疫性疾病。免疫抑制劑可以和IFNτ協(xié)同作用，帶來比單獨(dú)用相同劑量的IFNτ或用免疫抑制劑所獲得的治療更有效的治療。類似地，在癌癥或病毒性疾病的治療中，IFNτ可以與例如治療有效量的一種或多種化學(xué)治療劑一起施用，化學(xué)療法試劑例如白消安、5-氟尿嘧啶(5-FU)、疊氮胸苷(AZT)、甲酰四氫葉酸、美法蘭、波尼松、環(huán)磷酰胺、氮烯咪胺、順鉑、雙嘧達(dá)莫等。
IV.實(shí)施例下列實(shí)施例進(jìn)一步解釋了此處所述的發(fā)明，并且決沒有任何限制本發(fā)的范圍的意圖。
材料和方法A.IFNτ的生產(chǎn)在一個(gè)實(shí)施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)分子方法(Ausubel，等，1988)通過將含有編碼IFNτ氨基酸序列的DNA序列的鄰接部分的寡核苷酸連接來制備合成的IFNτ基因。使用的DNA序列可以是SEQ ID NO1或4或在Imakawa，等，1987中所示的序列。所得的IFNτ多核苷酸編碼序列可跨越位置16到531172氨基酸的編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將全部長度的合成基因Stul/SStl片斷(540bp)克隆到修飾的pIN III omp-A表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)變成E.coli.的競爭的SB221系。對于IFNτ蛋白的表達(dá)，載有表達(dá)載體的細(xì)胞在含有安芐青霉素的L-培養(yǎng)液中生長至OD(550nm)為0.1-1，用IPTG(異丙基-1-硫代-b-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)3小時(shí)，并用離心收集。通過超聲處理或滲透分極分離將可溶的重組IFNτ從細(xì)胞中釋放出。對于酵母中的表達(dá)，IFNτ基因可以通過聚合酶鏈反應(yīng)用分別在5’和3’端含有StuI和SacI限制位點(diǎn)的PCR引物進(jìn)行放大(PCR；Mullis，K.B.，U.S.專利No.4,683,202，1987年7月28日授權(quán)；Mullis，K.B.，等，U.S.專利No.4,683,195，1987年7月28日授權(quán))。放大的片斷被StuI和SacII消化，連接到pBLUESCRIPT+(KS)的SacII和SmaI位點(diǎn)，產(chǎn)生pBSY-IFNτ。質(zhì)粒pBSY-IFNτ被SacII和EcoRV消化，將含有合成IFNτ基因的片斷分離出。酵母表達(dá)載體pBS24Ub(Ecker，D.J.，等，J.Biol.Chem.2647715-7719(1989))被SaII消化。使用T4 DNA聚合酶產(chǎn)生平端尾。載體DNA用沉淀的苯酚和乙醇提取(Sambrook，J.，等，in MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989))。回收的質(zhì)粒用ScaII消化，通過瓊脂糖凝膠電泳凈化，連接到從pBSY-IFNτ分離出的SacII-EcoRV片斷。獲得的重組質(zhì)粒定義為pBS24Ub-IFNτ。將重組質(zhì)粒pBS24Ub-IFNτ轉(zhuǎn)化成E.coli.。將含有IFNτ插入片段的重組克隆物分離出，用限制酶分析確認(rèn)。將IFNτ編碼序列從pBS24Ub-IFNτ中分離出，克隆到含有醇氧化酶(AOX1)啟動(dòng)子的Pichiapastoris載體中(Invitrogen，San Diego，CA)。然后該載體用于改變Pichiapastoris GS115 His-宿主細(xì)胞，根據(jù)制造商的指示表達(dá)蛋白。該蛋白進(jìn)入培養(yǎng)基中，用連續(xù)的DEAE-纖維素和羥磷灰石層析法凈化至電泳均勻，其通過SDS-PAGE和銀染色測定。
B.抗病毒分析以測定特定的抗病毒活性用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞致病作用檢測分析來分析抗病毒活性(Familletti，P.C.，等，Methods in Enzymology，78387-394(1981)；Rubinstein，S.等，J.Virol.，37755-758(1981))。簡言之，IFNτ的稀釋用Madin-Darby牛腎臟(MDBK)細(xì)胞在37℃培育16-18小時(shí)。培育后，在細(xì)胞致病作用檢測分析中用水泡性口炎病毒作為攻擊病毒來確定病毒復(fù)制的抑制。一個(gè)抗病毒單位(U)導(dǎo)致對單層的破壞減少50％。對于此處所述的大多數(shù)研究，IFNτ的特定活性為大約4.9×108抗病毒U/mg蛋白。
實(shí)施例1.口服和腹膜內(nèi)施用到小鼠的綿羊IFNτ對OAS的誘導(dǎo)將IFNτ(4.99×108單位/mg蛋白；Pepgen Corp.，California orBiological Process Development Facility，Dept.of Food Science andTechnology，University of NE-Lincoln，Lincoln，NE；SEQ ID NO4)溶于10％的麥芽糖溶液中來制備IFNτ溶液。本發(fā)明也考慮了使用IFNτ(SEQID NO2)。將兩百微升的IFNτ溶液口服施用給ICR小鼠(平均體重約30g，6周大小，雌性)，使用20規(guī)格的一次性口頭音(disposable oralsound)(Fuchigami，Kyoto)將其直接注射入胃的上部分(胃施用；GA)。將100微升的IFNτ溶液用于腹膜內(nèi)施用(i.p.)。注射入胃的上部的樣品通過施用染料進(jìn)行確認(rèn)。施用24小時(shí)后，用戊巴比妥鈉麻醉小鼠。從小鼠的心臟取血，用2-5A RIA試劑盒測定全血中的OAS活性(Eiken Chemical，Tokyo；Shindo，M.等，Hepatology，9715-719(1989))。結(jié)果見圖1。
實(shí)施例2.通過將IFNτ口服施用給小鼠的劑量依賴型誘導(dǎo)使用與實(shí)施例1相同的方法，將IFNτ以0、103、104、或105單位的劑量口服施用給ICR小鼠?？诜┯?2小時(shí)后，從小鼠的心臟取全血，測定全血中的OAS活性。結(jié)果見圖2。
實(shí)施例3.將IFNτ施用給小鼠從Japan SLC Inc.，Hamamatsu購買ICR、BALB/c、C57BL/9、NZW/N和SJL/J品系的沒有病原體的5周大小的雌性小鼠。試驗(yàn)前將小鼠在實(shí)驗(yàn)室中喂養(yǎng)1周。獲得具有序列為SEQ ID NO3的重組綿羊IFNτ(IFNτ)(Pepgen Corporation，Alameda，CA)。本研究中使用的制劑的特定活性為5×108單位(U)/mg蛋白，其通過在用VSV攻擊的MDBK細(xì)胞中分析，并用人類IFN-α標(biāo)準(zhǔn)化。天然鼠科IFN-α(MuIFN-α)由Sumitomo Pharmaceutical Co.(Osaka，Japan)提供，其特定活性為1×108國際單位(IU)/mg蛋白。為施用給小鼠，將IFNτ溶于含有10％麥芽糖的溶液中。將0.2ml的樣品通過經(jīng)口(p.o.)治療或腹膜內(nèi)(i.p.)注射施用給小鼠(6周大小的雌性小鼠)。當(dāng)經(jīng)口給予時(shí)，將樣品使用20規(guī)格的口服喂養(yǎng)針管直接引到胃的上部。施用前，將小鼠禁食和飲料6小時(shí)，在1pm開始，7pm結(jié)束。禁食后，在6小時(shí)將IFNτ以p.o.或i.p.路徑施用，并提供食物和水。然后，在24小時(shí)從心臟取全血。用Eiken’s 2-5A RIA試劑盒分析全血中的2′，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)活性。稀釋的血液與polyl:C-瓊脂糖凝膠混合，沖洗凝膠后加入ATP，產(chǎn)生的2-5A用RIA方法分析(Shindo，M.等，Hepatology，9715-719(1989))。每一樣品進(jìn)行兩次這種分析。使用至少3只小鼠來估計(jì)血液OAS的水平。
實(shí)施例4.口服施用IFNτ到人類患者中引起的減少的ALT、減少的HCV病毒價(jià)和OAS誘導(dǎo)A.IFNτ的制備在第一日，從冰箱中取出一瓶IFNτ(SEQ ID NO4)，患者按照表2自己服用正確體積的測試材料。也可以相同的方式制備和施用IFNτ(SEQ ID NO2)。
表2重組Ov-IFNτ患者的劑量施用
B.患者的給藥指導(dǎo)所有測試材料的小瓶和注射器都放置在維持在2到8℃的冰箱中。在自己服用藥物前，患者從冰箱中取出一個(gè)小瓶和一只注射器。將注射器的針頭的蓋子取走，將注射器的針頭置于藥物瓶中，按照第一日臨床指導(dǎo)將適當(dāng)體積的藥物吸取到注射器中。將注射器的針頭放置于口中，壓活塞將注射器的內(nèi)容物倒入口中?；颊呷缓笸萄氏聹y試材料。如需要，允許患者喝一杯水。患者在他/她的日記卡中記錄服用測試材料的日期和時(shí)間。每天以大約8小時(shí)的間隔重復(fù)三次上述步驟早上一次，中午一次，晚上一次。
C.結(jié)果在169天的測試期間內(nèi)在規(guī)定的間隔采血樣。施用2-5ARIA試劑盒(Eiken Chemical，Tokyo)分析樣品中血清和外周血單核細(xì)胞(PBMC)中2′，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)的水平。稀釋的血液與polyl:C-瓊脂糖凝膠混合，沖洗凝膠后加入ATP，產(chǎn)生的2-5A用RIA方法分析(Shindo，M.等，Hepatology，9715-719(1989))。每一樣品進(jìn)行兩次這種分析。也測定了使用逆轉(zhuǎn)錄酶多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的丙型肝炎的病毒價(jià)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的血清濃度。每一受體的結(jié)果見下表3-5和圖7-8。觀察到在口服施用綿羊IFNτ后OAS水平提高、ALT和病毒價(jià)的水平均下降。
表3A.劑量組1中的三個(gè)患者的病毒價(jià)、ALT和2-5A水平(每日三次0.33mg IFNτ)
表3B劑量組1中的三個(gè)患者的病毒價(jià)、ALT和2-5A水平(每日三次0.33mg IFNτ)
表4.劑量組2中的三個(gè)患者的病毒價(jià)、ALT和2-5A水平(每日三次1mg IFNτ)
表5.劑量組3中的三個(gè)患者的病毒價(jià)、ALT和2-5A水平(每日三次3mg IFNτ)
實(shí)施例5.口服施用的OvIFNτ阻滯了試驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎的發(fā)展接受者新西蘭白(NZW)小鼠在用牛髓磷脂堿性蛋白(bMBP)免疫之日前48小時(shí)、在免疫日和在免疫日之后48小時(shí)通過i.p.注射或口服喂養(yǎng)接受OvIFNτ(105U/ml)來誘導(dǎo)試驗(yàn)性的變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)。將105U的IFNτ與PBS混合至總體積為100uL，用放置在食道以下的喂養(yǎng)管施用到胃。施用前馬上配制IFNτ在磷酸鹽緩沖的鹽水中的稀釋液。為了在NZW小鼠中誘導(dǎo)EAE，將300μg的牛髓磷脂堿性蛋白(bMBP)在含有8mg/mL H37Ra的完全弗氏佐劑(CFA)中(Mycobacterium tuberculosis，Difco，Detroit，MI)乳化，并注射入尾巴的基部的兩邊。在免疫日和48小時(shí)后，也注射入400ng的Pertussis毒素(List Biologicals，Campbell，CA)。對于在SJL/J小鼠中的EAE誘導(dǎo)，使用所描述的相同的步驟，不同的是小鼠在初次免疫后的第7天再次免疫。每日檢查小鼠的EAE跡象，疾病的嚴(yán)重性按照如下刻度進(jìn)行分級 為確定EAE的防止是否對OvIFNτ的治療是特異性的，一種抗OvIFNτ單克隆抗體(mAb)，HL127用于中和OvIFNτ阻滯EAE的能力(對準(zhǔn)SEQ ID NO2的氨基酸殘基139-172的抗體HL127在用MDBK細(xì)胞系的抗病毒分析中中和OvIFNτ的抗病毒活性)。HL127的1∶10稀釋液在i.p.注射或口服喂養(yǎng)施用之前用OvIFNτ培育2小時(shí)。對準(zhǔn)IFNτ抗原的抗體可以用此處的信息結(jié)合已知的抗體制備技術(shù)來制備(例如Harlow，E.，等in ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1988))。結(jié)果見下表6。口頭喂養(yǎng)和i.p.注射的OvIFNτ均能防止EAE的急性誘導(dǎo)。通過i.p.注射接受IFNτ的動(dòng)物沒有一只發(fā)展了EAE的癥狀，而口服接受IFNτ的動(dòng)物中，9只中的7只(78％)受到了保護(hù)?？筄vIFNτ的抗體HL127在部分中和OvIFNτ阻滯EAE的能力方面有效。這些數(shù)據(jù)表明口服施用的IFNτ對多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型的治療有效。
表6.口服施用的IFNτ對小鼠中急性EAE的發(fā)作和嚴(yán)重性的影響
在MBP免疫前48小時(shí)、MBP免疫之日和在MBP免疫后48小時(shí)通過i.p.注射或口服喂養(yǎng)施用OvIFNτ(105U)。HL127，為對OvIFNτ特異性的單克隆抗體，在施用前用OvIFNτ培育2小時(shí)。
實(shí)施例6.口服施用后在血清中檢測OvIFNτ比較了口服喂養(yǎng)或i.p.注射OvIFNτ后，隨時(shí)間變化在小鼠(如上治療)的血清中可檢測到的OvIFNτ的量。將3×105U的OvIFNτ施用給小鼠，在施用IFNτ后的0.5、2、4、6、24和48小時(shí)流血。通過細(xì)胞致病作用(病毒斑)分析(Familetti，P.C.等，Meth.Enzymol.78387(1981))來測試血清以確定樣品中IFNτ的量。簡言之，將IFNτ的稀釋液加入到生長至匯合在平底96孔板中的MDBK細(xì)胞中，在37℃培育18-24小時(shí)。室溫下將水泡性口炎病毒(VSV)加入到板中45分鐘。移走病毒，加入甲基纖維素，將板在37℃培育48小時(shí)。移走甲基纖維素后，將板用結(jié)晶紫染色以清楚地顯現(xiàn)斑點(diǎn)。對于IFN中和的測量，用血清或HL127(對OvIFNτ特異性的單克隆抗體)在37℃培育濃度為500U/mL的OvIFNτ1小時(shí)。一個(gè)抗病毒單位導(dǎo)致對單層的破壞減少50％，相對于用VSV感染的未治療的MDBK細(xì)胞(對照板)。同時(shí)對所有的樣品進(jìn)行分析以消除分析之間的變化。如圖9所示，口服喂養(yǎng)后(填充的柱圖)0.5小時(shí)和2小時(shí)檢測的OvIFNτ的水平為200U/mL。通過比較，i.p.注射(空心的柱圖)后在24小時(shí)的期間內(nèi)探測到略微高的水平的OvIFNτ。這些數(shù)據(jù)表明上述劑量的IFNτ能在口服施用大約兩小時(shí)后在血清中探測得到。
實(shí)施例7.口服施用OvIFNτ來防止試驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎的慢性復(fù)發(fā)使用EAE的慢性復(fù)發(fā)的模型來測試OvIFNτ防止麻痹的能力，其中用MBP免疫的SJL小鼠發(fā)展了該疾病的慢性形式，其中癥狀的出現(xiàn)以復(fù)發(fā)-緩解型的方式發(fā)生(Zamvil，S.S.等，Ann.Rev.Immunol.8579-621(1990))?；救缟纤?，在SJL小鼠中誘導(dǎo)EAE。小鼠在免疫日(第0日)、隨后在試驗(yàn)期間每隔48小時(shí)通過i.p.注射或口服喂養(yǎng)用105U的IFNτ治療。結(jié)果見圖10A，用MBP免疫、但沒接受IFNτ治療的SJL小鼠發(fā)展了慢性復(fù)發(fā)的麻痹，發(fā)病率為5/5，最高的平均嚴(yán)重性～2.5發(fā)生在試驗(yàn)開始后的14天。相反，通過i.p.注射或口服喂養(yǎng)用OvIFNτ的治療(分別為圖10B和10C)能免于EAE。在IFNτ治療的兩個(gè)組中疾病的發(fā)生減少到1/5動(dòng)物，平均嚴(yán)重性為～1.0。這些數(shù)據(jù)表明口服施用IFNτ能夠阻滯慢性復(fù)發(fā)的EAE的發(fā)展，說明當(dāng)在延長的期間內(nèi)大約每48小時(shí)喂養(yǎng)IFNτ時(shí)，口服施用的IFNτ可能與i.p.注射一樣有效。
實(shí)施例8.組織學(xué)分析進(jìn)行組織學(xué)分析來確定淋巴細(xì)胞滲透入MBP-免疫的小鼠的CNS中的程度，其中該小鼠通過口服和i.p.路徑用OvIFNτ治療。對小鼠灌注4％的多聚甲醛，取出脊柱，用福爾馬林處理2-3天。將脊髓解剖出，浸泡在0.5％的蔗糖中，4℃過夜。將脊髓切片包埋，在切片機(jī)中切片。將切片放置在4％多聚甲醛中的載玻片中，用甲酚紫染色以清楚地顯現(xiàn)發(fā)炎的滲透物。結(jié)果見圖11A-11C，最終的放大率為222×。淋巴細(xì)胞的損傷出現(xiàn)在對照的脊髓白質(zhì)中(圖11A)。相反，在通過i.p.注射(圖11B)或口服喂養(yǎng)(圖11C)用OvIFNτ治療的小鼠中沒有探測到淋巴細(xì)胞的滲透液。這些數(shù)據(jù)表明IFNτ的防護(hù)性作用與對淋巴細(xì)胞滲透到CNS中的抑制有關(guān)。
實(shí)施例9.用OvIFNτ治療來誘導(dǎo)IL-10在SJL用OvIFNτ治療以防止慢性復(fù)發(fā)EAE的過程中，對小鼠抽血，檢測血清中白細(xì)胞介素10(IL-10)的存在。通過酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)使用IL-10 ELISA試劑盒(Genzyme，Cambridge，MA)對來自接受單個(gè)IFNτ(105U)治療(通過i.p.注射或口服喂養(yǎng))、延長的IFNτ(105U)治療(通過i.p.注射或口服治療大于20天)或沒有接受治療的小鼠的血清分析IL-10。所有的血清樣品均檢測兩次。對在治療細(xì)胞增殖疾病中的應(yīng)用，將IFNτ以足以在患者的血液OAS中獲得初始的可測量的提高的劑量施用。隨后，以有效劑量繼續(xù)治療，而無論血液OAS水平的進(jìn)一步變化，例如由于身體中癌細(xì)胞的減少而造成的OAS血液水平的下降。繼續(xù)以有效劑量施用IFNτ直至觀察到期望的退化水平，其中退化水平通過例如腫瘤大小或在特定組織中癌細(xì)胞的程度來測量。患者可以在治療期間用第二種抗癌試劑共同治療，例如順鉑、阿霉菌或紫杉醇al喂養(yǎng)。對延長的IFNτ(105U)治療(通過i.p.注射或口服治療大于20天)或沒有接受治療的小鼠通過酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)使用IL-10 ELISA試劑盒(Genzyme，Cambridge，MA)來分析IL-10。所有的血漿樣品均檢測兩次。結(jié)果見圖12。在對照小鼠、或通過i.p.注射或口服喂養(yǎng)接受單次OvIFNτ治療的小鼠中未探測到IL-10。相反，在通過i.p.注射或口服喂養(yǎng)在大于20天的期間內(nèi)每48小時(shí)接受OvIFNτ的SJL小鼠的在血清有可探測的IL-10水平。這些數(shù)據(jù)表明IFNτ誘導(dǎo)的IL-10的產(chǎn)生可能是起作用的機(jī)理，通過該機(jī)理OvIFNτ防止EAE的發(fā)展。
實(shí)施例10.停止用OvIFNτ的治療導(dǎo)致復(fù)發(fā)性麻痹對通過i.p.注射或口服喂養(yǎng)(每48小時(shí))的OvIFNτ治療來防止EAE的SJL小鼠跟蹤58天，在該期間內(nèi)沒有觀察到疾病的發(fā)展。然后停止OvIFNτ的治療，再對小鼠觀察22天疾病的癥狀。結(jié)果見圖13。在圖下面用加號表示IFNτ的治療，用減號表示IFNτ治療的停止。每一治療組中疾病的發(fā)生如下PBS對照＝3/4(方塊)；i.p.注射＝3/3(三角)；口服喂養(yǎng)＝3/4(圓圈)。以前通過OvIFNτ治療而免于EAE的兩組小鼠均在停止OvIFNτ治療6-12天后發(fā)展了麻痹的跡象。這些數(shù)據(jù)表明通過i.p.注射或口服喂養(yǎng)的正在進(jìn)行的IFNτ施用在EAE的慢性復(fù)發(fā)模型中能連續(xù)保護(hù)以免于EAE。
實(shí)施例11.口服施用OvIFNτ減少了抗OvIFNτ的抗體響應(yīng)在上述實(shí)施例10中的試驗(yàn)中停止OvIFNτ的治療后，對每一治療組中的小鼠抽血，檢查血清中抗OvIFNτ抗體(Ab)的存在。將抗原OvIFNτ以600ng/孔的濃度吸附到塑料的組織培育孔的平底中，過夜。接著蒸發(fā)干燥。該板用在PBS中的5％的牛奶(Carnation)處理2小時(shí)以阻止非特異性結(jié)合，然后用含有0.05％的吐溫20的PBS清洗3次。加入未治療的、通過i.p.注射進(jìn)行OvIFNτ治療的，和通過口服喂養(yǎng)進(jìn)行OvIFNτ治療的小鼠的不同的血清稀釋液，培育3小時(shí)。用偶聯(lián)到辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠免疫球蛋白來確定結(jié)合。加入鄰苯二胺和H2O2后在ELISA板閱讀器(Bio-Rad，Richmond，CA)中在492nm處監(jiān)測顏色的發(fā)展，該反應(yīng)用2M的H2SO4終止。示例性結(jié)果見圖14。通過ELISA使用多種稀釋液對未治療的、通過i.p.注射進(jìn)行OvIFNτ治療的和通過口服喂養(yǎng)進(jìn)行OvIFNτ治療(2只小鼠/組)的血清進(jìn)行分析，包括1∶30(空心的柱圖)和1∶120(填充的柱圖)。通過口服喂養(yǎng)接受OvIFNτ的小鼠顯示出最低的抗體水平，而通過i.p.注射接受OvIFNτ的小鼠顯示出升高的抗OvIFNτAb水平。與所預(yù)計(jì)的一樣，沒有接受OvIFNτ治療的小鼠沒有顯示出抗OvIFNτAb。也分析了血清在MDBK細(xì)胞上中和OvIFNτ抗病毒的活性的能力，如上所述。結(jié)果見下表7。沒有一個(gè)來自i.p.注射或口服喂養(yǎng)的小鼠的血清擁有中和活性。這些數(shù)據(jù)表明用IFNτ進(jìn)行口服治療避開了在i.p.注射治療的個(gè)體中觀察到的直接針對OvIFNτ蛋白的抗體響應(yīng)，沒有一個(gè)治療通常會(huì)導(dǎo)致中和抗體的產(chǎn)生。
表7.用OvIFNτ治療的小鼠的血清OvIFNτ效價(jià) 盡管按照特定實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行描述，對本領(lǐng)域技術(shù)人員很明顯的是可以進(jìn)行各種變化和修改而不偏離本發(fā)明。
序列表<110>派普根公司<120>干擾素-TAU在藥物中的應(yīng)用<130>556008013W00<140>
<141>
<150>US 10/698,927<151>2003-10-31<150>US 10/719,472<151>2003-11-21<160>4<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>516<212>DNA<213>Ovis Aries<400>1tgctacctgt cgcgaaaact gatgctggac gctcgagaaa atttaaaact gctggaccgt 60atgaatcgat tgtctccgca cagctgcctg caagaccgga aagacttcgg tctgccgcag 120gaaatggttg aaggtgacca actgcaaaaa gaccaagctt tcccggtact gtatgaaatg 180ctgcagcagt ctttcaacct gttctacact gaacattctt cggccgcttg ggacactact 240cttctagaac aactgtgcac tggtctgcaa cagcaactgg accatctgga cacttgccgt 300ggccaggtta tgggtgaaga agactctgaa ctgggtaaca tggatccgat cgttactgtt 360aaaaaatatt tccagggtat ctacgactac ctgcaggaaa aaggttactc tgactgcgct 420tgggaaatcg tacgcgttga aatgatgcgg gccctgactg tgtcgactac tctgcaaaaa 480cggttaacta aaatgggtgg tgacctgaat tctccg516<210>2<211>172<212>PRT<213>Ovis Aries<400>2
Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu35 40 45Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu85 90 95Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly100 105 110Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr115 120 125Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val130 135 140Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys145 150 155 160Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro165 170<210>3<211>172<212>PRT<213>人工的<220>
<223>基于Ovis aries序列的重組IFNTau<400>3Cys Tyr Leu Ser Glu Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu35 40 45Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr
65 70 75 80Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu85 90 95Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly100 105 110Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr115 120 125Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val130 135 140Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys145 150 155 160Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro165 170<210>4<211>516<212>DNA<213>人工的<220>
<223>基于Ovis aries序列的重組IFNTau<400>4tgctacctgt cggagcgact gatgctggac gctcgagaaa atttaaaact gctggaccgt 60atgaatcgat tgtctccgca cagctgcctg caagaccgga aagacttcgg tctgccgcag 120gaaatggttg aaggtgacca actgcaaaaa gaccaagctt tcccggtact gtatgaaatg 180ctgcagcagt ctttcaacct gttctacact gaacattctt cggccgcttg ggacactact 240cttctagaac aactgtgcac tggtctgcaa cagcaactgg accatctgga cacttgccgt 300ggccaagtta tgggtgaaga agactctgaa ctgggtaaca tggatccgat cgttactgtt 360aaaaaatatt tccagggtat ctacgactac ctgcaggaaa aaggttactc tgactgcgct 420tgggaaatcg tacgcgttga aatgatgcgg gccctgactg tgtcgactac tctgcaaaaa 480cggttaacta aaatgggtgg tgacctgaat tctccg51權(quán)利要求
1.一種用于制備用于治療人類患者中對干擾素-tau治療有響應(yīng)的疾病的藥物的組合物，其中該疾病選自自身免疫性疾病、癌癥或病毒感染，所述組合物包括配制成用于口服施用到患者的腸道的干擾素-tau，以足以在患者的血液2′，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)水平中，相對于沒有施用干擾素-tau的患者的血液OAS水平產(chǎn)生初始的可測量的提高的量施用，其中所述的干擾素-tau以該有效量施用到患者的腸道中，在每周至少數(shù)次的調(diào)節(jié)基礎(chǔ)上，在至少一個(gè)月的期間內(nèi)，而與患者的血液OAS水平的變化無關(guān)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的干擾素-tau是具有識(shí)別為SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的序列的綿羊干擾素-tau。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述干擾素-tau在每日的基礎(chǔ)上在至少一個(gè)月的期間內(nèi)施用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其用于患者中多發(fā)性硬化的治療，其中所述的干擾素-tau在對應(yīng)于患者的癥狀存在的期間內(nèi)施用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其用于患者中丙型肝炎感染的治療，其中所述的干擾素-tau在患者中檢測不到病毒感染后的幾個(gè)月的期間內(nèi)施用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其用于患者中癌癥的治療，其中在干擾素-tau施用期間內(nèi)還向患者施用一種抗癌劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中在施用干擾素-tau期間監(jiān)測患者的血液OAS水平以確定OAS水平是否提高。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種用于制備用于治療人類患者中對干擾素治療有響應(yīng)的疾病的藥物的組合物。該組合物包括以適用于口服施用到腸道的劑量形式的干擾素－tau，以足以提高患者的血液(2′，5′)－寡腺苷酸合成酶(OAS)水平的量施用，相對于沒有施用干擾素－tau的患者的血液OAS水平。
文檔編號A61P37/00GK1897968SQ200480038330
公開日2007年1月17日 申請日期2004年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月31日
發(fā)明者宗川吉汪, 劉治平 申請人:派普根公司