提供的多元測(cè)序接頭。在2%瓊脂糖凝膠(Low Range Ultra Agarose Biorad 161-3107)上進(jìn)行文庫(kù)的大小選擇。使用Ikb加梯帶（Invitrogenl0787-018)，并且以120V跑膠2 小時(shí)。300bp+/-50bp的片段被切下，并在Qiagen凝膠提取試劑盒柱(Qiagen 28704)上進(jìn)行 洗脫，并且洗脫在23μ1 EB中。
[0078]使用Illumina文庫(kù)擴(kuò)增索引流程，并進(jìn)行以下改變:使用22μ1 DNA并進(jìn)行21次循 環(huán)運(yùn)行。在Qiaquick PCR純化柱（Qiagen 28101)上對(duì)樣品進(jìn)行純化，并且洗脫在50μ1 EB 中，1:5稀釋，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至ΙΟμΚΙμΙ被施加到Agilent 2100HS DNA芯片上，并 且在Agilent 2100上通過(guò)涂片分析確定濃度。將樣品稀釋到ΙΟηΜ。用NaOH變性后，樣品被稀 釋到16pM。按照集群站用戶指南(Cluster Station User Guide)準(zhǔn)備配對(duì)末端流動(dòng)池。按 照HiSeq用戶指南進(jìn)行測(cè)序(執(zhí)行多元PE運(yùn)行），對(duì)于配對(duì)末端運(yùn)行，使用2X51循環(huán)。
[0079] 表5:由BCM-7處理調(diào)節(jié)的在葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)中涉及的基因（P〈0.01，n)R〈0.1)
[0081 ] 全基因組DNA MBD-seq揭示了差異甲基化的轉(zhuǎn)錄本(DMT)，如由假發(fā)現(xiàn)率(FDR)〈 0.1和事后學(xué)生t檢驗(yàn)后的AN0VA(p〈0.05)所定義。轉(zhuǎn)錄本包括差異甲基化/轉(zhuǎn)錄的基因和非 編碼RNA兩者。使用獨(dú)創(chuàng)性途徑分析(IPA)工具評(píng)估特定生物學(xué)或功能相關(guān)的途徑中由BCM-7誘導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)變化以及轉(zhuǎn)錄變化，并且鑒定了表現(xiàn)出最大影響的途徑。該結(jié)果在表5 中示出。也報(bào)告了負(fù)責(zé)葡萄糖代謝、合成和葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)的基因的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)的改變 也在BCM-7下改變，如圖5和6中所示。
[0082]實(shí)施例4: β-酪蛋白對(duì)胰島素受體的影響
[0083]從斷奶起，NOD小鼠（雄性和雌性)喂食富含A1或Α2β-酪蛋白乳蛋白的飲食。這些飲 食由Specialty Feeds Australia制作以確保充足的成分和營(yíng)養(yǎng)。來(lái)自每個(gè)性別和飲食的 小鼠的組(11 = 10)在101、201時(shí)安樂(lè)死并且在解剖時(shí)收集多種樣品并貯藏在-80°(3。在此研 究中跟蹤40只NOD小鼠：10只每組(雄性/雌性;A1/A2); 10只在IOW和20W時(shí)安樂(lè)死。收集胰腺 并冷凍在RNAlater?中。
[0084] 使用來(lái)自AmbionUustin，τχ)的RNAqueous@-4；PCR試劑盒，分離來(lái)自組織 的RNA用于分析RNA轉(zhuǎn)錄。以下流程根據(jù)制造商的方案。用DNase處理分離的RNA以純化RNA， 然后使用ND-1000Nan〇Dr〇p分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量。進(jìn)一步，使用來(lái)自Roche (Indianapolis，IN)的第一鏈cDNA合成如前所述合成CDNAcj添加 Img RNA，ImM dNTP混合物， 60mM隨機(jī)六聚體引物，以及足夠的分子生物學(xué)級(jí)別H20以達(dá)到最終樣品體積13mU妾著，在 65°C對(duì)樣品變性5分鐘，然后置于冰上。在反應(yīng)的第二部分中加入IYanscriptor RT(20單 位/ml) (Roche )，Protector RNase抑制劑（40U/ml) (Roche)，5Transcr ip tor Reverse Transcriptase Reaction Buffer(Roche)，和分子生物學(xué)級(jí)別H20至最終體積7ml并且最終 體積調(diào)整為20ml D此后在PTCThermocycIer(MJ Research，St · Bruno，QC，加拿大）在25°C卵季 育10分鐘并通過(guò)在55°C 30分鐘終止。最后，通過(guò)在85°C孵育5分鐘抑制反轉(zhuǎn)錄酶。
[0085] 表6:qRTPCR的引物序列
[0087] 隨后，使用來(lái)自Roche的LightCycler 480qRT_PCR儀對(duì)一式三份的樣品進(jìn)行qRT- PCR測(cè)定（Trivedi等人，Mol .Pharmcol · 2014)。使用最終體積20ml中的5ml cDNA模板，IOmM 有義和反義引物，來(lái)自Roche的IOml SYBR Green I Master，以及dH20進(jìn)行qRT-PCR。用于此 目的的引物的列表不于表6中。樣品通過(guò)以下方案:95°C孵育5分鐘，然后95°C 10秒，60°C 20秒，和72°C 30秒的45個(gè)循環(huán)，隨后為單個(gè)循環(huán)的95°C 5秒，1分鐘65°C，和97°C用于熔化 曲線，隨后在40°C冷卻90秒。在平板上運(yùn)行無(wú)模板對(duì)照(NTC)，并且生成解離曲線以確定非 特異性產(chǎn)物并且將此歸一化以避免任何非特異性的擴(kuò)增。數(shù)據(jù)使用Roche定量方法分析并 對(duì)β-肌動(dòng)蛋白水平歸一化。
[0088] 雖然本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)舉例的方式進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以做出變化和 修改而不脫離如權(quán)利要求書中限定的本發(fā)明的范圍。此外，當(dāng)針對(duì)特定特征存在已知等同 物時(shí)，這樣的等同物被并入本文，如同在本說(shuō)明書中具體提及一樣。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 組合物用于調(diào)節(jié)動(dòng)物的血中的葡萄糖水平的用途，其中組合物含有β-酪蛋白，并且 其中β-酪蛋白包含以重量計(jì)至少75%的β-酪蛋白Α2。2. 權(quán)利要求1中所述的用途，其中β_酪蛋白包含以重量計(jì)至少90 %的β-酪蛋白Α2。3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的用途，其中β-酪蛋白包含100%的β-酪蛋白Α2。4. 權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的用途，其中組合物是乳或乳產(chǎn)品。5. 權(quán)利要求4中所述的用途，其中乳是鮮乳、乳粉、從粉末重構(gòu)的液態(tài)乳、脫脂乳、均質(zhì) 乳、煉乳、蒸發(fā)乳、巴氏殺菌乳、或非巴氏殺菌乳。6. 權(quán)利要求4中所述的用途，其中乳產(chǎn)品是奶油、酸奶、夸克、乳酪、黃油、或冰淇淋。7. 權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的用途，其中調(diào)節(jié)葡萄糖的水平以避免或降低高血糖癥 或糖尿病的癥狀。8. 權(quán)利要求7中所述的用途，其中糖尿病是I型糖尿病或II型糖尿病。9. 權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中所述的用途，其中癥狀包括多尿癥、煩渴癥和多食癥中的 一種或多種。10. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的用途，其中調(diào)節(jié)葡萄糖的水平以降低發(fā)展與糖尿病有 關(guān)的包括心血管疾病、慢性腎衰竭、和糖尿病視網(wǎng)膜病變的任何一種或多種病況的風(fēng)險(xiǎn)。11. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的用途，其中調(diào)節(jié)葡萄糖的水平以控制動(dòng)物的重量。12. 權(quán)利要求11中所述的用途，其中控制動(dòng)物的重量形成肥胖的治療的一部分。13. 權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的用途，其中動(dòng)物是人、狗、或貓。14. 用于調(diào)節(jié)動(dòng)物的血中的葡萄糖水平的組合物，所述組合物含有β-酪蛋白并且其中 β-酪蛋白包含以重量計(jì)至少75 %的β-酪蛋白Α2。15. 調(diào)節(jié)動(dòng)物的血中的葡萄糖水平的方法，所述方法包括由動(dòng)物消費(fèi)含有β-酪蛋白的 組合物，或者將組合物提供給動(dòng)物用于消費(fèi)，其中β-酪蛋白包含以重量計(jì)至少75%的β-酪 蛋白Α2。
【專利摘要】調(diào)節(jié)動(dòng)物的血中的葡萄糖水平，包括由動(dòng)物消費(fèi)含有β-酪蛋白的組合物，或者將組合物提供給動(dòng)物用于消費(fèi)，其中β-酪蛋白包含以重量計(jì)至少75％的β-酪蛋白A2。用途包括管理高血糖癥和相關(guān)的病況包括糖尿病的癥狀。該作用是急性(暴露于組合物后)和持續(xù)的。
【IPC分類】A61P3/10, A61K38/17, A23J1/20
【公開號(hào)】CN105555295
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480046351
【發(fā)明人】A·J·克拉克
【申請(qǐng)人】艾爾牛奶有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2014年8月22日
【公告號(hào)】CA2920152A1, EP3035951A1, WO2015026245A1