(例如經口或經鼻）。在一些實施例中，本發(fā)明的多特異性結合劑經靜脈內投 與。在一些實施例中，本發(fā)明的多特異性結合劑經皮下投與。在一些實施例中，多特異性結 合劑連同其它生物活性劑一起投與。
[0164] 藥物組合物
[0165] 本發(fā)明進一步提供包含本發(fā)明的多特異性結合劑和藥學上可接受的載劑或賦形 劑的藥物組合物。組合物必要時也可W含有一或多種額外治療活性物質。
[0166] 盡管本文提供的藥物組合物的描述大體上設及適合于向人類的倫理投與的藥物 組合物，所屬領域的技術人員應了解，此類組合物總體上適合于向所有類型的動物投與。使 得組合物適合于向各種動物投與的適合于向人類投與的藥物組合物的修改經充分理解，且 一般獸醫(yī)藥理學家可W僅用一般實驗(如果存在)設計和/或進行此類修改。
[0167] 本文中所描述的藥物組合物的調配物可W通過藥理學技術中已知或此后研發(fā)的 任何方法制備。一般來說，此類制備型方法包括使活性成分與稀釋劑或另一賦形劑和/或一 或多種其它助劑締合，且隨后必要時和/或需要時將產物成形和/或包裝為所需單劑量或多 劑量單位的步驟。
[0168] 根據本發(fā)明的藥物組合物可W散裝、W單一單位劑量形式和/或W多個單一單位 劑量形式制備、包裝和/或出售。如本文中所用，"單位劑量"是包含預定量的活性成分的藥 物組合物的個別量?；钚猿煞值牧客ǔ５扔趯⑾蚴茉囌咄杜c的活性成分的劑量或此劑量的 適宜部分，如此劑量的一半或Ξ分之一。
[0169] 根據本發(fā)明的藥物組合物的活性成分、藥學上可接受的賦形劑和/或任何其它成 分的相對量將變化，其取決于所治療的受試者的身份、身材和/或情況并且進一步取決于投 與組合物的途徑。舉例來說，組合物可W包含0.1%與100%(w/w)之間的活性成分。
[0170] 藥物調配物可W另外包含藥學上可接受的賦形劑，其如本文中所用包括任何和所 有溶劑、分散介質、稀釋劑、或其它液體媒劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等張劑、增稠或 乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑等，如適于所需特定劑型。雷明頓氏藥學科學和實踐 (Remington's The Science and Practice of 化armacy),第21 版，A.R.根納羅 (八.3.66]1]1日1'〇)(利平科特，威廉姆斯和威爾金斯出版社化199；[]1(3〇1:1:,胖;[111日1113&胖;[化;[]13), 馬里蘭州己爾的摩(Baltimore,MD) ,2006; W引用的方式并入本文中）公開各種用于配制藥 物組合物的賦形劑和用于其制備的已知技術。除非任何常規(guī)賦形劑介質均不與物質或其衍 生物相容，如因產生任何非所需生物作用，或另外與醫(yī)藥組合物的任何其它組分W有害方 式相互作用，否則預期其使用在本發(fā)明的范圍內。
[0171] 在一些實施例中，藥學上可接受的賦形劑是至少95%、至少96%、至少97%、至少 98 %、至少99%或100 %純。在一些實施例中，賦形劑經批準用于人類和供獸用。在一些實施 例中，賦形劑經美國食品和藥物管理局批準。在一些實施例中，賦形劑為醫(yī)藥級的。在一些 實施例中，賦形劑符合美國藥典化SP)、歐洲藥典化P)、英國藥典和/或國際藥典的標準。
[0172] 用于制造藥物組合物的藥學上可接受的賦形劑包括(但不限于)惰性稀釋劑、分散 和/或粒化劑、表面活性劑和/或乳化劑、崩解劑、結合劑、防腐劑、緩沖劑、潤滑劑和/或油。 此類賦形劑可W任選地包括于藥物調配物中。如可可脂和栓劑蠟、著色劑、涂層劑、甜味劑、 調味劑和/或芳香劑的賦形劑可W根據調配者的判斷存在于組合物中。
[0173] 調配和/或制造藥劑中的一般考慮因素可W例如發(fā)現于雷明頓：醫(yī)藥科學和實踐 第21版，利平科特威廉姆斯和維爾金斯出版社，2005( W引用的方式并入本文中）。
[0174] 試劑盒
[0175] 本發(fā)明進一步提供包含一或多個用至少一種如本文所述的多特異性結合劑填充 的容器的藥物包或試劑盒。試劑盒可w任何可適用方法使用，包括例如診斷上。與此類容器 任選地相關的可W是呈由調控藥物或生物產品的制造、使用或出售的政府機構指定的形式 的布告，所述布告反映(a)由所述機構批準制造、使用或出售用于人類投與，（b)使用說明， 或兩者。
[0176] 實例
[0177] 現將通過W下非限制性實例進一步說明本發(fā)明。闡述運些實例W幫助理解本發(fā) 明，但不意圖且不應理解為W任何方式限制其范圍。實例不包括所屬領域的一般技術人員 將眾所周知的常規(guī)方法(分子選殖技術等)的詳細描述。除非另外規(guī)定，否則份數是重量份， 分子量是平均分子量，溫度是W攝氏度計并且壓力是處于大氣壓或接近大氣壓。
[0178] 實例1.設計和構筑具有二聚化組分的雙特異性融合蛋白
[0179] 本實例描述產生經特異性工程改造 W能夠二聚化來作為增強其腫瘤殺死效能的 策略的多特異性結合劑。此策略測試于可W介導GD2陽性腫瘤細胞的T細胞殺死的雙特異性 結合蛋白上。雙唾液酸神經節(jié)巧脂GD2高度表達于小兒和成人癌癥的腫瘤上，包括神經母細 胞瘤、成視網膜細胞瘤、黑素瘤、腦瘤、肉瘤和小細胞肺癌（莫達克(Modak)等人，2007,癌癥 調查（Cancer Invest. )25:67-77)。本實例尤其說明稱為GD2XCD3-皿D的能夠二聚化的融 合蛋白的結構，其由通過HNF-化二聚化組分彼此連接且祀向GD2和CD3的來自抗GD2和抗GD3 抗體的scFv多膚組成。盡管已知HNF-la本身二聚合，但不清楚HNF-la的二聚化組分是否可 用于二聚合其可附接的其它蛋白質，確切地說其抗體或組分。舉例來說，本發(fā)明人已確定當 附接到抗體組分時，已知自身二聚合的人類膚激素內皮素-UET1)不能夠二聚合。
[0180] 本文中呈現的其它實例展示如通過動態(tài)光散射檢定的此融合蛋白的成功的二聚 化、增加的與GD2的功能親和力、增強的腫瘤細胞的T細胞介導的體外殺死和植入有腫瘤的 小鼠中的腫瘤生長的抑制。運些實例展示本發(fā)明策略增加 T細胞接合抗體對于癌癥免疫療 法的效能的潛能。
[0181] 分子克隆
[0182] 抗GD2X抗CD3串聯scFv(GD2XCD3)雙特異性結合蛋白在不具有和具有HNF-化二 聚化組分的情況下（稱為GD2 X CD3和GD2 X CD3-HDD)構筑自含有抗GD2單克隆抗體5F11的 scFv(胡等人，2009，免疫學雜志（J. Immunol.) 183:5748-5755;張(Cheung)等人，2004，核醫(yī) 學雜志（J.Nucl.Med. )45:867-877)和抗CD3 0KT3的人類化scFv(伍德爾（Woodle)等人， 1992,免疫學雜志148:2756-2763)的單一多膚鏈。HDD組分放置在抗GD2 scFv的遠端，和抗 CD3 ScFv的近端。不希望受任何特定理論束縛，選擇此放置W使對遠端抗原(GD2)且并非近 端抗原(CD3)的功能親和力的潛在增強最大化，其將為幾何學上限制的。GD2結合的增強將 大概增強腫瘤殺死，而CD3結合的增強可導致增強的細胞激素風暴，T細胞接合雙特異性抗 體的已知副作用（蔡(Choi)等人，2011,生物療法專家觀點化Xpert Opin.Biol .Ther. )11: 843-853)。另外，串聯scFv雙特異性結合蛋白（MW約55-601d)a)的二聚化具有增強血清半衰 期的可能性，因為均二聚串聯scFv雙特異性結合蛋白可W避開小于60kDa的蛋白質經受的 腎清除率路徑。
[0183] 簡單來說，抗GD2抗體5F11和人類化抗CD3 0KT3(衍生自小鼠0KT3抗體)抗體的可 變區(qū)已先前地描述。5F11和人類化0KT3化0KT3)抗體的單鏈可變區(qū)片段（scFv)使用15個氨 基酸的連接子（（G4S)3)沿不同定向遺傳組裝且分開合成(新澤西州皮斯卡塔威基因腳本公 司（Genescript ,Piscataway ,NJ))。使用5F11抗體的可變區(qū)構筑Vh化或化Vh定向且使用抗 CD3 hOKT3抗體的可變區(qū)構筑Vh化定向。在本發(fā)明中利用的抗體組分的特定身份對于添加二 聚化組分改進由祀向兩個抗原的抗體組分組成的多特異性結合劑的活性的提供的桐察并 非至關重要。
[0184] 構筑自5F11抗體的單鏈可變區(qū)片段用化el和Apar消化且構筑自h0KT3抗體的scFv 用Apal和BamHI消化。消化片段依序接合到谷脫甘膚合成(GS)載體(茵維特羅根）中W制造 雙特異性結合蛋白5HLBT和5LHBT。
[0185] 通過突變誘發(fā)根據制造商的說明書（加利福尼亞州斯塔津（S化atagene，CA))對 5F11 scFv的兩個半脫胺酸殘基（重鏈S44C，輕鏈A100C)作出穩(wěn)定化突變W產生甜LDSBT和 化皿SBT。在5F11 scFv與h0KT3 scFv之間W及5HLDSBT與化皿SBT之間克隆長度為15個 ((G4S)3)或5個(G4S)氨基酸的連接子序列W用于比較。W類似方式，穩(wěn)定化半脫胺酸突變也 引入到0KT3 scFv中W產生5HLDS-DSBT。另外，兩個親和力成熟突變(P104Y和E31Q;胡等人， 2009，免疫學雜志183:5748-5755)分別引入到5HLDSBT中W分別產生Y-BT和Q-BT。
[0186] 使用W上所描述的方法，基于具有HNF-la二聚化組分的人類化抗GD2抗體3F8(張 等人，2012，腫瘤免疫學（OncoImmunol.) 1:4，477-486)和人類化抗CD3 0KT3(GD2 X CD3)構 筑其它抗GD2 X抗CD3串聯scFv(伍德爾等人，前述)雙特異性結合蛋白；且基于具有HNF-la 二聚化組分的單克隆抗GD3抗體KM64U太田（Ohta)等人，1993,癌癥免疫與免疫療法 Kancer Immunol. Immunother. )36(4) :26〇-266)和人類化抗CD3 0KT3(伍德爾等人，前述） 構筑抗GD3X抗CD3串聯scFv(GD3xCD3)雙特異性結合蛋白。二聚化組分使用一部分人類 IgG3較鏈(TPLGDTTHTSG)融合到抗CD3抗體組分的C末端。如上文所述的示例性融合蛋白顯 示于表5中。
[0187] 表5
[018 引
[0189] 產生和純化
[0190] 表達構筑體使用scFv日m-(G4S)3-scFvh日KT3融合蛋白（Y-BT，沈Q ID ^:10)的0酷在 具有(GD2XCD3-HDD)和不具有(GD2XCD3)含有HNF-化的元件(氨基酸1-32)，接著為6X組 氨酸標簽的二聚化組分的情況下制得。DNA通過使用核轉染儀II電穿孔機器（阿瑪薩 (Amaxa))和核轉染溶液V的電穿孔轉染到DG44 CH0-S細胞(茵維特羅根）中。經轉染的細胞 用50化g/ml G418經受藥物選擇。在約兩周之后，單一細胞通過連續(xù)稀釋接種到96孔板中。 照射的CH0-S細胞W每孔5000個細胞的濃度用作飼養(yǎng)細胞。來自每一克隆體的上清液經Ξ 周收獲且經受GD2結合檢定。展示與GD2的最高結合的克隆體選擇用于在細胞達到每毫升2 百萬個且處于對數期生長時用37°C和8%C02下的12虹pm的軌道震蕩按比例增大為大型培 養(yǎng)物。培養(yǎng)物上清液在達到所需抗體產率時或存活力下降到<40%時收獲。分泌到培養(yǎng)物上 清液中的雙特異性融合蛋白（GD2XCD3和GD2XCD3-皿D)通過Ni化瓊脂糖(通用電氣醫(yī)療集 團生物科學，瑞典)純化且用300mM咪挫洗脫。
[0191] 實例2.雙特異性融合蛋白的體外篩選和親和力
[0192] 此實例說明根據實例1制得的單鏈雙特異性融合蛋白的二聚化對與其標祀的功能 親和力的效應。在一些情況下，雙特異性單體可W持續(xù)短時間周期結合到其標祀(例如由于 尺寸的不佳滯留）。在此實例中，經工程改造 W形成同型二聚體的雙特異性融合蛋白展示對 于抗原增加的親和力。
[0193] 動態(tài)光散射
[0194] HNF-la的二聚化組分誘導雙特異性融合蛋白中的二聚化的能力通過動態(tài)光散射 測試。純化雙特異性融合蛋白使用動態(tài)光散射在Zetasizer Nano(馬爾文儀器有限公司 (Malvern Instruments,Ltd.))上測量流體動力半徑。表6闡述使用在實例1中描述的雙特 異性融合蛋白的示例性測量。純化雙特異性融合蛋白的額外樣品也使用如上文所述的動態(tài) 光散射測量流體動力半徑。結果顯示于表7中。
[01巧]如表6和7中所示，GD2XCD3(MW 55 kDa)具有7.2±1.7nm的流體動力半徑，而GD2 X CD3-皿D(就單體來說的MW 59kDa，就二聚物來說的118W)a)具有13.6 ± 0.化m(或11.1 ± 0.5)的流體動力半徑。如通過光散射所展示的尺寸的增加指示GD2 X CD3-HDD的二聚構形。
[0196]
[0197] ELISA 檢定
[0198] 為了確定皿D是否增強與GD2或CD3的功能親和力，使用純化GD2和杰卡特全細胞 (含有CD3的培養(yǎng)T細胞)進行化ISA檢定。簡單來說，96孔板在室溫下微克/毫升/孔的含 GD2的90%乙醇涂布過夜。第二天，板在室溫下持續(xù)一小時用每孔15化1的0.5%BSA阻斷。在 洗涂之后，將稀釋系列的雙特異性抗體添加到板且在室溫下培育兩小時。板隨后用PBS洗涂 四次且隨后用每孔10化1的1:1000稀釋度的含小鼠抗化S標簽抗體(AbD SeroteC公司）的 0.5%BSA在室溫下培育一小時。板再用PBS洗涂四次且隨后用每孔10化1的1:3000稀釋度的 含山羊抗小鼠 HRP抗體(杰克遜免疫研究(Jackson ImmunoResearch))的0.5%BSA在室溫下 培育一小時。板再用PBS洗涂四次且使用每孔15化1的0PD緩沖液（西格馬（Sigma))顯影。反 應用每孔30μ1的5N也S〇4停止。板隨后在分光光度計上在490nm處讀取。表8和圖2A(上圖）闡 述根據實例1制得的雙特異性融合蛋白的示例性GD2結合。圖2A(下圖）闡述根據實例1制得 的雙特異性融合蛋白的CD3/杰卡特細胞結合。純化雙特異性融合蛋白的額外樣品也關于 CD3/杰卡特細胞結合進行測量。結果顯示于圖2B中。
[0199] 體外結合動力學使用Biacore T-100生物傳感器（通用電氣醫(yī)療集團（GE Healthcare))測定。CM5傳感器忍片和相關試劑購自美國Biacore公司（Biacore USA)。神經 節(jié)巧脂GM1購自厄萊克西斯生物化學品公司(ALEXIS BiochemicalsK阿索拉有限責任公司 (AXX0RA L.L.C.)，且GD2購自先進免疫化學公司（Advanced Immuno化emical)。簡單來說， 神經節(jié)巧脂經由疏水相互作用直接固定到CM5傳感器忍片上。參考表面用GM1固定?；钚员?面用1:1比率的GD2和GM1固定。GD2和GM1的稀釋混合物(50μg/ml)經20分鐘W15μ1/π?η的流 動速率注射(300μ1)。接著為用lOmM NaOH的廣泛洗涂(通常為W扣1/min的流動速率的20μ1 的五次洗涂)直到獲得穩(wěn)定基線。
[0200] 純化的抗GD2單克隆抗體（5F11)在分析之前稀釋于改變濃度（50到leOOnM)的含 250mM化C1的皿S-E緩沖液中。樣品（6化1)經2分鐘W30yl/min的流動速率在感測器表面上 方注射。在完成締合階段之后，在含250mM化C1的皿S-E緩沖液中持續(xù)300秒在相同流動速 率下監(jiān)測解離。在每一循環(huán)結束時，表面使用經一分鐘的50μ1/π?η的流動速率下的50μ1 20mM NaOH和經兩分鐘的50μ1/π?η的流動速率下的100μΙ 4Μ MgCb再生。在固定GD2上方注 射樣品之后獲得的生物傳感器曲線減去在動力學分析之前在固定GM1上方注射的樣品的情 況下獲得的控制曲線。數據通過二價分析物模型和使用Biacore T-100評估軟件的速率常 數的默認參數設定分析。計算締合速率常數化合)、解離速率常數(k離)和平衡解離常數化D = k離/k合)。表9和圖3A闡述根據實例1制得的雙特異性融合蛋白的示例性Kd值傳感圖。純化雙 特異性融合蛋白的額外樣品也通過Biacore測試。示例性結果顯示于表10和圖3B中。
[0201]表8
[0204] 如表8中所示，ELISA結合檢定顯示GD2XCD3-HDD相對于GD2XCD3雙特異性結合蛋 白的GD2結合的6倍增強（也參見圖2A和2B的上圖）。與杰卡特細胞的結合并非顯著不同（參 見圖2A和2B的下圖）dGD2結合的Biacore分析（圖3A和3B;和表9和10)證實與腫瘤標祀GD2的 巧化倍的親和力增強。
[02化]在類似實驗中，如上文所述地測試化皿T-H孤(SEQ ID NO: 11)的GD2結合。結果顯 示于表11和圖7中。結果證實如本文所述，3LHBT-H孤顯示基于GD2結合的較好活性。確切地 說，3LHBT-H孤展示比3LHBT低約2.5倍的ECso。
[0206] 表11
[0207]
[0208] 結合在一起，運些數據展示人類HNF-化的二聚化組分有效地誘發(fā)單鏈雙特異性抗 體二聚化W形成同型二聚體，其和促進與雙特異性抗體的抗原中的一個(例如腫瘤抗原）的 功能親和力。
[0209] 實例3.腫瘤細胞的體外T細胞介導的細胞殺死
[0210] 此實例表明雙特異性同型二聚體起始通過T細胞介導的腫瘤細胞殺死的強化的能 力。通常，結合T細胞的雙特異性結合蛋白能夠將T細胞導引到進行腫瘤的T細胞介導的殺死 的腫瘤位點。在此實例中，顯示示例性雙特異性同型二聚體比雙特異性單鏈蛋白質更有效 地有效介導腫瘤細胞的T細胞殺死。 銘51(日1化)釋放檢定
[0212] 黑素瘤和神經母細胞瘤細胞（51(]\^1^、醒8-7、]\114、肥（1化、肌863、冊24、51(^〔2、 SKMEL28、冊9、化96和H345)在5%0)2含濕氣培育箱中在37°C下在補充有10%FBS(生命技術 化ife Technologies))的RPMI1640(Cellgro)中培養(yǎng)。神經母細胞瘤細胞系LAN1和黑素瘤 M14獲自洛杉機加州大學(University of California,Los Angeles)eSKNLD開發(fā)于紀念斯 隆-凱特琳癌癥中屯、（Memorial Sloan Kettering (Mincer Center)eSKLND細胞系衍生自美 國標準菌庫(ATCC) IMR-32。驗證通過短串聯重復(STR)DNA測序進行。
[0213]粘附細胞用1 X抓TA收獲。T細胞使用Pan T細胞分離試劑盒根據制造商的說明書 (美天旋生物技術公司（Miltenyi 81〇*6(3))純化自人類？81(：。〔03八028戴諾珠粒 (dynabead)(茵維特羅根（Invitrogen))用于根據制造商的說明書刺激和擴增T細胞。擴增 的T細胞培養(yǎng)和維持于補充有FBS和30U/mL白介素 -2(比-2)的RPMI中。T細胞群體通過使用 FACSARIA?的流動式細胞測量術用抗CD3-percep巧5.5、抗CD4-門TC、抗CD8-APC和抗CD56-陽抗體(碧迪生物科學公司(BD Biosciences))進行鑒別和分析。
[0214] 標祀腫瘤細胞持續(xù)一小時在37°C下用每106個細胞lOOyCi的"Cr銘酸鋼(伊利諾伊 州阿林頓高地的安瑪西亞(Amersham, Ar 1 ington Hei曲t, IL))標記。細胞經洗涂兩次。標革己 細胞(每孔5000個細胞)與效應細胞和雙特異性融合蛋白在96孔聚苯乙締圓底板(碧迪生物 科學公司）中滲和到每孔25化1的最終體積。板在37°C下培育四小時且隨后在400g下離屯、五 分鐘。上清液中的S1化釋放在伽碼計數器(gama counter)(伊利諾伊州唐納斯格羅夫的填充