，還可通過本領(lǐng)域已知的方 法來(lái)合成。對(duì)于藥物組合物，通常使用鹽酸普萘洛爾(propranolol hydrochloride)。合適 的制劑包括，例如，含有約10_80mg的口服固體劑型，含有約20-40mg/5ml的口服液體劑型， 含有約60-160mg的延長(zhǎng)釋放口服劑型，和含有約lmg/ml的鹽酸普萘洛爾的靜脈內(nèi)可注射的 液體劑型。
[0156] C0X2-選擇性抑制劑-例如，依托度酸:
[0157] 依托度酸可通過CAS注冊(cè)號(hào)41340-25-4標(biāo)識(shí)。它是市售的，還可通過本領(lǐng)域已知的 方法來(lái)合成。合適的制劑包括，例如，含有約200-500mg的口服固體劑型，含有約400-600mg 的延長(zhǎng)釋放口服劑型。
[0158] 本發(fā)明的組合物中的化合物的對(duì)治療特定病況有效的量取決于病況的性質(zhì)，并可 通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來(lái)確定。參見，例如，Goodman和Gilman;The Physician's Desk Reference,Medical Economics Company，Inc·，0radell，N.J·，1995;和to Drug Facts and Comparisons,Facts and Comparisons，Inc.，St.Louis，Mo.，1993〇
[0159] 制劑中采用的確切劑量會(huì)取決于施用的路徑和疾病的嚴(yán)重性，并且應(yīng)根據(jù)醫(yī)師的 判斷和每個(gè)患者的情況來(lái)決定。
[0160] 方法和用途
[0161] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于減少或防止受試者中轉(zhuǎn)移發(fā)展的方法。
[0162] 在一些實(shí)施方案中，所述方法包括施用包含吡喃葡萄糖基脂質(zhì)佐劑(GLA)或其藥 學(xué)上可接受的鹽作為活性成分的藥物組合物的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括向 受試者施用包含吡喃葡萄糖基脂質(zhì)佐劑(GLA)或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分的藥物 組合物的步驟，進(jìn)一步與向受試者施用β腎上腺素能受體阻斷劑和/或C0X2抑制劑組合。
[0163] 在一些實(shí)施方案中，提供用于減少或防止受試者中轉(zhuǎn)移發(fā)展的方法，其通過向受 試者局部-區(qū)域性地單獨(dú)施用GLA、或施用GLA與β腎上腺素能受體阻斷劑和C0X2抑制劑的組 合來(lái)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，提供用于減少或防止受試者中轉(zhuǎn)移發(fā)展的方法，其通過向受 試者局部-區(qū)域性地單獨(dú)施用GLA、或施用GLA與β腎上腺素能受體阻斷劑和C0X2抑制劑組合 來(lái)進(jìn)行，而無(wú)腫瘤切除。
[0164] 在一些實(shí)施方案中，提供了用于在腫瘤切除手術(shù)后減少或防止受試者中轉(zhuǎn)移發(fā)展 的方法，其通過在腫瘤切除手術(shù)的圍手術(shù)期過程中向受試者單獨(dú)施用GLA或施用GLA與β腎 上腺素能受體阻斷劑和C0X2抑制劑的組合，由此減少或防止手術(shù)后的轉(zhuǎn)移發(fā)展。
[0165] 在一些實(shí)施方案中，在手術(shù)之前(術(shù)前)和手術(shù)之后(術(shù)后)施用GLA。在一些實(shí)施方 案中，在手術(shù)之前（術(shù)前）和手術(shù)之后（術(shù)后）施用β腎上腺素能受體阻斷劑和/或C0X2抑制 劑。
[0166] 可使用本領(lǐng)域已知的任何施用方法。在一些實(shí)施方案中，GLA的施用通常通過局 部-區(qū)域性遞送來(lái)進(jìn)行。在某些情況下，例如在圍手術(shù)期過程中，使用系統(tǒng)性(systemic)施 用。如本申請(qǐng)使用的，系統(tǒng)性施用不包括靜脈內(nèi)施用。
[0167] GLA施用可作為單一注射或多次注射進(jìn)行。
[0168] 通常，本發(fā)明的方法包括施用GLA而無(wú)癌癥抗原。施用的GLA的藥物組合物優(yōu)選基 本上沒有癌癥抗原。
[0169] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括在圍手術(shù)期過程中共施用β腎上腺素能 受體阻斷劑和C0X2抑制劑。
[0170] 在一些實(shí)施方案中，GLA在術(shù)前施用，而β腎上腺素能受體阻斷劑和/或C0X2抑制劑 在術(shù)前和術(shù)后施用。
[0171] 在一些實(shí)施方案中，所有三種活性成分均在術(shù)前和術(shù)后施用。
[0172] 每種活性成分的具體劑量，以及它們相對(duì)于切除手術(shù)的具體施用日期，應(yīng)由醫(yī)師 根據(jù)腫瘤的類型、嚴(yán)重程度和患者總體狀況來(lái)確定。
[0173] 本發(fā)明的方法所治療的受試者是患癌癥(包括實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤)的哺乳動(dòng)物，通 常是人。每種可能性代表本發(fā)明的分別的實(shí)施方案。在一些實(shí)施方案中，受試者是患原發(fā)性 實(shí)體瘤且即將接受腫瘤切除的人。受試者可患有任何類型的實(shí)體惡性腫瘤，例如，癌瘤，如 呼吸系統(tǒng)癌瘤、胃腸系統(tǒng)癌瘤、泌尿生殖系統(tǒng)癌瘤、睪丸癌瘤、乳腺癌瘤、前列腺癌瘤、內(nèi)分 泌系統(tǒng)癌瘤、和黑素瘤。示例性癌瘤包括由下述的組織形成的癌瘤:子宮頸、肺、前列腺、乳 腺、頭和頸、結(jié)腸和卵巢，還有癌肉瘤(例如，包括由癌瘤性和肉瘤性組織組成的惡性腫瘤） 和腺癌（來(lái)源于腺組織，或其中腫瘤細(xì)胞形成可識(shí)別的腺結(jié)構(gòu)）。待用本文公開的方法治療 的惡性腫瘤的另外的實(shí)例包括肉瘤，即支持組織或結(jié)締組織(例如骨或軟骨）的惡性腫瘤， 和淋巴瘤，即淋巴組織的腫瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥的實(shí)例包括但不限于癌瘤，包括腺 癌（adenocarcinoma)、淋巴瘤（lymphoma)、囊胚（blastula)、黑素瘤(melanoma)和肉瘤 (sarcoma)。所述癌癥的更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、肺癌（如小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺 癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌）、胃腸癌、何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞 瘤、子宮頸癌、憂郁（gloom)、卵巢癌、肝癌（如肝癌瘤（hepatic carcinoma)和血腫 (hematoma ))、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(如 腎細(xì)胞癌和維爾姆斯氏瘤）、基底細(xì)胞癌、黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌、食道癌、和 各種類型的頭頸癌。
[0174] 可使用本領(lǐng)域已知的方法隨訪受試者中腫瘤切除后轉(zhuǎn)移的形成，所述方法包括成 像技術(shù)、活組織檢查、血液測(cè)試等。
[0175] 提供以下實(shí)施例以更全面地說明本發(fā)明的某些實(shí)施方案。然而它們不應(yīng)以任何方 式解釋為限制本發(fā)明的寬范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地設(shè)計(jì)出本文所公開的原理的 許多變化和修飾而不背離本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例
[0176] 材料和方法
[0177] 1.動(dòng)物
[0178] 四至八月齡(不同實(shí)驗(yàn)之間年齡變化)雄性和雌性Fischer 344(F344)大鼠每籠3-4只飼養(yǎng)于我們?cè)谔乩S夫大學(xué)(Tel Aviv University)的動(dòng)物飼養(yǎng)所，隨意供給食物和 水、12:12光-暗循環(huán)、22±1°C。在實(shí)驗(yàn)之前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行至少4次操作，以減少可能的程序應(yīng) 激。在所有實(shí)驗(yàn)程序中配衡(counterbalance)體重、性別和藥物施用。飼養(yǎng)條件由特拉維夫 大學(xué)的動(dòng)物保護(hù)和利用委員會(huì)（Institutional Animal Care and Use Committee)監(jiān)測(cè)， 該委員會(huì)也批準(zhǔn)了本文所述的全部研究。
[0179] 2.藥劑
[0180] I. GLA及其施用
[0181] 將溶解于穩(wěn)定的乳劑（SE)(2000μg/ml)的GLA(IDRI，Seattle，WA)在PBS中稀釋為3 μg/ml-200μg/ml的終濃度（取決于相關(guān)實(shí)驗(yàn)）。在即將接種MADB106腫瘤細(xì)胞之前、接種前 4h、前12h、前24h、前48h或前96h(取決于相關(guān)實(shí)驗(yàn)），將所選濃度的一百μL皮下（s.c.)注射 至每只動(dòng)物(〇 · 3yg-20yg/動(dòng)物）。
[0182] 2.穩(wěn)定乳劑(SE)/佐劑乳劑
[0183] 將SE(穩(wěn)定的乳劑；IDRI ,Seattle，WA)以與GLA完全一致的方式稀釋和施用。
[0184] 3.抗-NKR-Pl
[0185] 抗-NKR-Pl是一種IGg單克隆抗體(mAb)(原先稱為mAb 3.2.3)，其結(jié)合NKR-Pl表面 抗原，該抗原在大鼠的新鮮自然殺傷(NK)細(xì)胞和IL-2激活的自然殺傷(NK)細(xì)胞上表達(dá)，在 多形核(PMNs)細(xì)胞上亦表達(dá)，但程度低得多。用抗-NKR-Pl體內(nèi)處理大鼠可選擇性地耗竭NK 細(xì)胞，并消除NK依賴和抗體依賴的非MHC限制性細(xì)胞細(xì)胞毒性。T細(xì)胞功能和T細(xì)胞、外周血 單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)及PMN的百分?jǐn)?shù)不受影響。先前已經(jīng)顯示，此抗體在施用后可立即在體內(nèi) 使得NK細(xì)胞無(wú)效，并在一日內(nèi)選擇性地耗竭NK細(xì)胞，而同種型對(duì)照抗體則不能。在MADB106 腫瘤細(xì)胞接種的同時(shí)將該抗體在輕度異氟烷麻醉下靜脈注射。
[0186] 3.腫瘤細(xì)胞系
[0187] I.MADB106
[0188] MADB106是一種經(jīng)選擇的變體細(xì)胞系，由F344大鼠中化學(xué)誘導(dǎo)的乳腺癌(MADB100) 的肺轉(zhuǎn)移獲得。MADB106腫瘤細(xì)胞僅轉(zhuǎn)移至肺，而肺腫瘤保留（LTR) -其強(qiáng)烈指示數(shù)周后會(huì) 發(fā)展的轉(zhuǎn)移的數(shù)目一依賴于此模型中的NK細(xì)胞。此外，因?yàn)镸ADB106的轉(zhuǎn)移過程主要在接種 后的最先24h中對(duì)NK活性敏感，故LTR相比實(shí)際轉(zhuǎn)移數(shù)更能反映體內(nèi)NK活性水平。將MADB106 細(xì)胞系在完全培養(yǎng)基(RPMI-1640培養(yǎng)基，補(bǔ)充10%熱失活的胎牛血清(FCS)、50yg/mL的慶 大霉素、2mM的1-谷氨酰胺、0 . ImM的非必需氨基酸，和ImM的丙酮酸鈉 ）（Biological Industries，Kibbutz Biet Haemek，Israel)中 100%濕度，5 %C〇2、37°C維持單層培養(yǎng)。用 胰蛋白酶溶液(0.25%于PBS)將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶移出，并用完全培養(yǎng)基洗滌。肺腫瘤保留的體 內(nèi)評(píng)估和NK細(xì)胞毒性的體外檢查都使用該細(xì)胞系。
[0189] 2.YAC-I
[0190] YAC-I淋巴瘤是用于評(píng)估嚙齒類體外NK細(xì)胞毒性的標(biāo)準(zhǔn)靶細(xì)胞系。將細(xì)胞系在完 全培養(yǎng)基中1 〇〇 %濕度、5 % CO2、37°C下維持懸浮培養(yǎng)。
[0191] 4. MADBl 06腫瘤細(xì)胞的放射標(biāo)記和肺腫瘤保留的評(píng)估
[0192] 通過將 0.5yCi/ml 的125 鵬脫氧尿苷（Iododeoxyuridine)(125IDUR，Danyel Biotech，Reho vot ,Israel)添加至細(xì)胞培養(yǎng)物，歷時(shí)24h來(lái)完成用于評(píng)估LTR的腫瘤細(xì)胞DNA 放射性標(biāo)記。對(duì)于腫瘤細(xì)胞注射，將大鼠用異氟烷輕度麻醉，將4 X 105/kg MADB106腫瘤細(xì) 胞(溶于含有〇. 1%牛血清白蛋白（BSA)的2ml/kg PBS中）注射入它們的尾靜脈。一些實(shí)驗(yàn)還 另外皮下注射〇. 5ml溶于緩慢釋放乳劑(4份PBS、3份礦物油(Sigma，Rehovot，Israe 1)和1份 二縮甘露醇單油酸酯（mannide-monooIeate)(-種非特異性表面活性乳化劑，Sigma， Rehovot，Israel))中的腎上腺素(雌性1.8mg/kg，雄性0.6mg/kg)，以便放大肺中的MADB106 保留，從而允許更好的組區(qū)分。為評(píng)估LTR，將動(dòng)物用CO 2處死，在用125IDUR-標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞 接種后24h移出它們的肺，置于γ-計(jì)數(shù)器中評(píng)估該器官中保留的放射性百分比。使用下式 計(jì)算LTR:(肺的放射性計(jì)數(shù)-背景放射性）X 100/(總的注射的細(xì)胞懸浮物的放射性計(jì)數(shù)-背 景放射性）。
[0193] 5. NK細(xì)胞毒性的離體評(píng)估
[0194] 1 ·收獲并制備循環(huán)白細(xì)胞（circulating leukocy