菌群恢復(fù)療法（mrt）、組合物和制造方法
【專利說明】菌群恢復(fù)療法(MRT)、組合物和制造方法 [0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]依照美國(guó)法典第35章第119條，本申請(qǐng)要求于2013年6月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專利 申請(qǐng)序列號(hào)61/831,409的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開是關(guān)于用于治療消化道疾病和/或病癥的組合物和方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 現(xiàn)已開發(fā)出了用于治療消化道疾病和/或病癥的多種組合物和方法。就已知的組 合物和方法而言，各自具有某些優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。對(duì)于提供用于治療消化道疾病和/或病癥的替 代組合物和方法存在著持續(xù)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本文中公開了菌群恢復(fù)治療組合物和用于制造、加工和/或輸送菌群恢復(fù)治療組 合物的方法。用于制造菌群恢復(fù)治療組合物的示例性方法可包括采集人糞便樣品、和將稀 釋劑添加到人糞便樣品中而形成稀釋樣品。稀釋劑可包含冷凍保護(hù)劑。該方法還可包括用 混合裝置將稀釋樣品混合、和過濾稀釋樣品。過濾可形成濾液。該方法還可包括將濾液轉(zhuǎn)移 到樣品袋、和將樣品袋密封。
[0006] -種用于制造、加工和包裝菌群恢復(fù)治療組合物的示例性方法可包括從預(yù)篩選的 供體中采集糞便樣品、將糞便樣品轉(zhuǎn)移到過濾袋、和將稀釋劑添加到過濾袋中。稀釋劑可包 含冷凍保護(hù)劑。該方法還可包括:將過濾袋密封、將密封的過濾袋轉(zhuǎn)移到混合器、和將濾液 從過濾袋轉(zhuǎn)移到樣品袋。將濾液從過濾袋轉(zhuǎn)移到樣品袋可將菌群恢復(fù)治療組合物限制在樣 品袋的內(nèi)部。該方法還可包括將樣品袋密封、使樣品袋冷卻、和將冷卻的樣品袋轉(zhuǎn)移到溫度 受控制的儲(chǔ)存設(shè)備。將冷卻的樣品袋轉(zhuǎn)移到溫度受控制的儲(chǔ)存設(shè)備可包括將菌群恢復(fù)治療 組合物冷凍。該方法還可包括:將冷凍的菌群恢復(fù)治療組合物解凍、將樣品袋在隔熱的包裝 系統(tǒng)中包裝、和將包裝的樣品袋運(yùn)送到治療設(shè)施。
[0007] -種用于醫(yī)療的示例性方法可包括:從預(yù)篩選的供體中采集糞便樣品、將糞便樣 品轉(zhuǎn)移到過濾袋、和將稀釋劑添加到過濾袋。稀釋劑可包含冷凍保護(hù)劑。該方法還可包括： 將過濾袋密封、將密封的過濾袋轉(zhuǎn)移到混合機(jī)、和將濾液從過濾袋轉(zhuǎn)移到樣品袋。將濾液從 過濾袋轉(zhuǎn)移到樣品袋可將菌群恢復(fù)治療組合物限制在樣品袋中。該方法還可包括:將樣品 袋密封、使樣品袋冷卻、和將冷卻的樣品袋轉(zhuǎn)移到溫度受控制的儲(chǔ)存設(shè)備。將冷卻的樣品袋 轉(zhuǎn)移到控制溫度的儲(chǔ)存設(shè)備可包括將菌群恢復(fù)治療組合物冷凍。該方法還可包括:將冷凍 的菌群恢復(fù)治療組合物解凍、將樣品袋在隔熱的包裝系統(tǒng)中包裝、將包裝的樣品袋運(yùn)送到 治療設(shè)施、和將菌群恢復(fù)治療組合物給藥予患者。
[0008] 上面對(duì)一些實(shí)施方式的概述并非意圖描述本公開的各公開實(shí)施方式或者每個(gè)實(shí) 施方案。下面的附圖和詳細(xì)說明更具體地舉例說明了這些實(shí)施方式。
【附圖說明】
[0009] 基于以下的詳細(xì)說明并結(jié)合附圖可更完全地理解本公開，在附圖中：
[0010] 圖1是示例性地描繪用于采集和檢查供體糞便樣品的過程的流程圖；
[0011]圖2是示意性地描繪用于篩選糞便供體的流程圖；
[0012] 圖3A和圖3B是描繪用于制造菌群恢復(fù)治療組合物的一個(gè)示例性方法的流程圖；
[0013] 圖4是描繪用于訂購和運(yùn)送菌群恢復(fù)治療組合物的示例性過程的流程圖；
[0014] 圖5是描繪用于訂購和運(yùn)送菌群恢復(fù)治療組合物的其他示例性過程的流程圖；
[0015] 圖6是一個(gè)示例性包裝系統(tǒng)的示意圖；
[0016] 圖7示出了一個(gè)示例性的樣品袋；
[0017] 圖8示出了一個(gè)示例性的管組件。
[0018] 雖然本公開適合于各種修改和替代形態(tài)，但通過在附圖中的舉例而揭示了其細(xì)節(jié) 并且將詳細(xì)地描述其細(xì)節(jié)。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，意圖并非是將本發(fā)明局限于所描述的具體 實(shí)施方式。相反，本發(fā)明包括落在本公開精神和范圍內(nèi)的所有修改、等同物、和替代物。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 就以下所定義的術(shù)語而言，應(yīng)當(dāng)采用這些定義，除非在權(quán)利要求中或者在本說明 書中的其他地方給出不同的定義。
[0020] 無論是否明確地指出，本文中的所有數(shù)值假定是由術(shù)語"大約"所修飾。術(shù)語"大 約"一般指代本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)為等同于所列舉值(例如，具有相同的功能或結(jié)果）的 數(shù)量范圍。在許多情況下，術(shù)語"大約"可包括被四舍五入到最接近的有效數(shù)字的數(shù)量。
[0021 ]利用端點(diǎn)對(duì)數(shù)值范圍的陳述包括在該范圍內(nèi)的所有數(shù)量(例如，1至5包括I、1.5、 2、2·75、3、3·80、4和5)。
[0022] 本說明書和所附權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)所 指對(duì)象，除非上下文中明確地規(guī)定。本說明書和所附權(quán)利要求中所使用的術(shù)語"或者"通常 是以包括"和/或"的意義而使用，除非上下文中明確地指出。
[0023] 應(yīng)注意的是，本說明書中對(duì)"一個(gè)實(shí)施方式"、"一些實(shí)施方式"、"其他實(shí)施方式"等 的引述表明所描述實(shí)施方式可包括1個(gè)以上的特定的特征、結(jié)構(gòu)和/或特性。然而，這種陳述 不一定意味著所有實(shí)施方式包括該特定的特征、結(jié)構(gòu)和/或特性。此外，當(dāng)結(jié)合一個(gè)實(shí)施方 式來描述特定的特征、結(jié)構(gòu)、和/或特性時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，無論是否明確地描述，這種特征、 結(jié)構(gòu)和/或特性也可使用于其他實(shí)施方式，除非明確地指出相反的情況。
[0024] 應(yīng)參照附圖來閱讀以下的詳細(xì)說明，其中在不同的附圖中對(duì)于類似的元件賦予相 同的編號(hào)。附圖（不一定按比例繪制)描繪了說明性的實(shí)施方式而并非意圖限制本發(fā)明的范 圍。
[0025] 本文中使用的"哺乳動(dòng)物"是指哺乳綱的任何成員，包括但不限于:人類和非人靈 長(zhǎng)類(如黑猩猩、及其他的猿和猴種）；家畜（如牛、綿羊、豬、山羊和馬）；家養(yǎng)哺乳動(dòng)物(如狗 和貓）；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括嚙齒類動(dòng)物(如小鼠、大鼠和豚鼠），等。該術(shù)語并不指代特定的年齡 或性別。因此，成年人和新生兒受試者以及胎兒，無論是雄性或雌性，均意圖被包括在該術(shù) 語的范圍內(nèi)。
[0026] 本文中使用的術(shù)語"冷凍保存"是指在低溫下冷卻和儲(chǔ)存生物細(xì)胞、組織或器官以 維持它們的存活的過程。作為非限制性例，冷凍保存可以是在低于凍結(jié)點(diǎn)的溫度下(例如，_ 20°C以下、_80°C以下，等)冷卻和儲(chǔ)存細(xì)胞的技術(shù)，該技術(shù)允許解凍時(shí)的細(xì)胞的高存活率。
[0027] 本文中使用的術(shù)語"冷凍保護(hù)劑"是指用于防止生物細(xì)胞或組織受到冷凍影響的 物質(zhì)。
[0028] 本文中所使用的"菌群"可以指代人類微生物組、人類菌群、或人腸道菌群。人類微 生物菌落(或人類菌群)可被理解成是存在于皮膚表面上和皮膚的深層中、唾液和口腔黏膜 中、結(jié)膜中、和人胃腸道中的微生物的聚集體。人類微生物組是由細(xì)菌、真菌、病毒、和古細(xì) 菌所組成。這些生物體中的至少部分執(zhí)行對(duì)人宿主有用的任務(wù)。在正常情況下，這些微生物 不導(dǎo)致人宿主的疾病，而是參與維持健康。因此，該種群的生物體常常被稱為"正常菌群"。
[0029] 生存于人胃腸道中的微生物種群通常被稱為"微生物菌群"、"腸道菌群"和/或"腸 道菌群"。人腸道的微生物菌群包括有助于消化、維生素合成、和形成并非由有人體所產(chǎn)生 酶的多種微生物。
[0030] 本文中所使用的詞組"菌群恢復(fù)治療劑"是指一種組合物，該組合物可包括但不限 于:取自患者或供體的含有活腸道菌群的人糞便材料、稀釋劑、和冷凍保護(hù)劑。其他組合物 包括等效的經(jīng)冷凍干燥并復(fù)原的糞便、或者"合成的"糞便組合物。在將其使用于菌群恢復(fù) 治療之前，對(duì)人糞便材料進(jìn)行篩檢以確定是否存在病原微生物。對(duì)人糞便材料進(jìn)行篩檢以 確定以下病原微生物的存在：梭菌屬（Clostridium species)(包括艱難梭菌 C.difficile)、諾如病毒Norovirus、腺病毒Adenovirus、腸道病原體entric pathogens、賈 第鞭毛蟲屬Giardia species、隱孢子蟲屬Cryptosporidia species的抗原、及其他病原體 (包括耐酸細(xì)菌acid-fast bactria、腸球菌enterococci，包括但不限于萬古霉素耐藥腸球 菌(VRE)、甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA))、以及任何卵或寄生體、或者芽孢形成寄生 蟲(包括但不限于等孢子球蟲、圓孢球蟲、和囊孢子蟲）。
[0031] 有多于1000個(gè)不同屬的細(xì)菌存在于健康的胃腸(GI)道中。梭菌是厭氧的產(chǎn)芽孢細(xì) 菌。某些屬的梭菌是產(chǎn)生對(duì)人類會(huì)是有害的毒素的病原體。艱難梭菌（"C diff"）是如果在 胃腸道中種群過密則可以釋放出會(huì)導(dǎo)致若干癥狀的毒素的梭菌的一個(gè)屬，所述癥狀包括胃 氣脹、便秘、腹瀉、炎癥、腹痛、在某些情況下會(huì)導(dǎo)致死亡的其他癥狀。
[0032] 當(dāng)受到應(yīng)激時(shí)，艱難梭菌形成可以耐受許多活性細(xì)菌所不能耐受的極端條件的芽 孢。通常，梭菌在健康的胃腸道中競(jìng)爭(zhēng)較弱。然而，抗生素會(huì)擾亂正常的腸內(nèi)菌群，從而導(dǎo)致 艱難梭菌的過度生長(zhǎng)。在某些實(shí)例中，艱難梭菌芽孢對(duì)各種抗生素會(huì)是耐藥。因此，當(dāng)正常 腸內(nèi)菌叢被清除時(shí)，艱難梭菌芽孢仍然存在，從而導(dǎo)致大的艱難梭菌群體。
[0033] 根據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)，在美國(guó)每年報(bào)告了大約337，000例艱難梭菌 感染(CDI)，其中導(dǎo)致大約14,000例死亡。目前的標(biāo)準(zhǔn)治療是抗生素治療;通常使用甲硝唑 和/或萬古霉素。在最初的抗微生物治療之后，大約25%的患者經(jīng)歷癥狀的復(fù)發(fā)。在這個(gè)復(fù) 發(fā)性患者人群中，大約45-65%形成持續(xù)的復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染。持續(xù)的復(fù)發(fā)性艱難梭菌感 染與高發(fā)病率和死亡率有關(guān)。例如，在美國(guó)每年艱難梭菌種群過密發(fā)生率據(jù)估計(jì)為150至 270萬例發(fā)生，并且還在增加中。在一個(gè)估計(jì)中，從2001年到2005年由于艱難梭菌的退院數(shù) 加倍，并且據(jù)估計(jì)具有5 %至25 %的復(fù)合年增長(zhǎng)率。目前的估計(jì)表明受艱難梭菌種群過密影 響的患者經(jīng)歷從3天到36天的延長(zhǎng)的住院時(shí)間，其中將近20%的受影響患者在180天內(nèi)重新 入院，各患者比未受影響的患者更有可能轉(zhuǎn)到長(zhǎng)期護(hù)理機(jī)構(gòu)。據(jù)估計(jì)艱難梭菌的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān) 是在每年10至30億美元。此外，據(jù)估計(jì)每天300例患者死亡歸因于艱難梭菌種群過密，死亡 率為1至7.7%，并且還在增加中。
[0034]艱難梭菌的傳統(tǒng)治療通常包括抗生素的應(yīng)用。由于低價(jià)格和高療效，甲硝唑 ("FlagyloT)是所選用的抗生素。然而，對(duì)于復(fù)發(fā)的病例（高達(dá)20%的總病例，例如對(duì)甲硝 唑耐藥）、懷孕患者、或者年齡小于10歲的患者而言，通常使用萬古霉素（"Vancocin?"）。 然而，萬古霉素，盡管通常具有比甲硝唑更少的副作用，但具有高得多的成本并且會(huì)導(dǎo)致現(xiàn) 存的艱難梭菌對(duì)其他抗生素產(chǎn)生耐藥性。
[0035]在第一次發(fā)生中，艱難梭菌的抗生素治療可以在2至4天內(nèi)以大約90%以上的比率 有效地快速地治療腹瀉。然而，艱難梭菌通常在第一次復(fù)發(fā)后(例如，抗生素中止使用的數(shù) 天至12周后）以估計(jì)的20%比率(例如，15%-30%)復(fù)發(fā)。然而，對(duì)于第一次復(fù)發(fā)后的各次復(fù) 發(fā)，復(fù)發(fā)率大大地增加到第二次復(fù)發(fā)后的估計(jì)的40%復(fù)發(fā)率，并且增加到其后的大于所估 計(jì)的60%以上的復(fù)發(fā)率。據(jù)估計(jì)，大約5%的患者具有6次以上的復(fù)發(fā)。
[0036] 各次發(fā)病之后艱難梭菌的治療通常有變化。例如，對(duì)于第一次輕度至中度的復(fù)發(fā)， 可以口服給予甲硝唑(例如，以500mg的劑量，每日三次（"TID"）達(dá)10至14天）。對(duì)于第二次復(fù) 發(fā)，可以以逐步減小的劑量或脈沖式劑量口服給予萬古霉素(例如，以125mg的劑量，每日四 次（"QID"）達(dá)14天；以125mg的劑量，每日兩次（"BID"）達(dá)7天；以125mg的劑量，每日一次 ("QD"）達(dá)7天；以125mg的劑量，每2天一次達(dá)8天（四次給藥）；以125mg的劑量，每3天一次達(dá) 15天(五次給藥)等）。對(duì)于第三次復(fù)發(fā)，可以以更大的劑量應(yīng)用萬古霉素（例如，以125mg的 劑量，每天四次（"QID"）達(dá)14天），并與用于復(fù)發(fā)性感染的任何其他選擇相結(jié)合，例如靜脈注 射免疫球蛋白（例如，以400mg/kg體重的劑量，每三周一次，根據(jù)效果總共2或3次給藥），或 者在萬古霉素給藥后使用利福霉素（例如，利福霉素，以400mg的劑量，每日兩次（"BID"）達(dá) 14天)等。
[0037] 糞便移植(FT)(是一種與菌群恢復(fù)治療(MRT)有關(guān)的治療方法)已被用作對(duì)于一些 具有復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染的患者的最后對(duì)策。在抗微生物治療后，將糞便移植用于在患者 胃腸道菌群中重新建立健康微生物混合物。在超過480個(gè)已報(bào)告病例中，在治愈復(fù)發(fā)性艱難 梭菌感染中有約90%的累積成功率，并且沒有歸因于糞便移植材料的任何不良事件。目前 的慣例是從家庭成員或治療機(jī)構(gòu)內(nèi)部的志愿者中獲取糞便樣品以便移植入患者。該治療技 術(shù)的一個(gè)明顯問題是糞便移植材料未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化。盡管所選擇的供體通常在提供時(shí)被認(rèn)為是 健康的，但這不足以同時(shí)保證被移植微生物的質(zhì)量和存活率?？纱嬖谟绊懠S便材料的、對(duì)供 體是未知的疾病狀態(tài)。除了糞便原材料的質(zhì)量外，在接受或治療機(jī)構(gòu)中缺乏用于加工和處 理的標(biāo)準(zhǔn)化程序會(huì)導(dǎo)致在給予患者的糞便移植材料的質(zhì)量和存活率方面的問題。此外，各 機(jī)構(gòu)必須對(duì)糞便原材料進(jìn)行處理，這并不方便。
[0038] 對(duì)于保證用于患者的菌群恢復(fù)治療產(chǎn)品在給藥時(shí)的質(zhì)量和存活率的標(biāo)準(zhǔn)化的、經(jīng) 預(yù)處理的菌群恢復(fù)治療產(chǎn)品存在著需求。還期望具有也可以在以易于處理和可輸送狀態(tài)下 進(jìn)行加工被運(yùn)送至合適的治療機(jī)構(gòu)的菌群恢復(fù)治療(MRT)產(chǎn)品，以避免在各機(jī)構(gòu)對(duì)糞便原 材料進(jìn)行處理。由于這些改進(jìn)，菌群恢復(fù)治療可以變?yōu)橐环N理想的/可行的用于艱難梭菌感 染(CDI)的主要治療選擇，而不是在少量機(jī)構(gòu)處的最后治療對(duì)策。
[0039] 此外，本專利文件描述了 ：接收取自多位供體的多個(gè)供體糞便樣品、并且利用各供 體糞便樣品的至少一個(gè)特性來儲(chǔ)存和檢索各個(gè)供體糞便樣品。在一個(gè)實(shí)例中，可以對(duì)供體 糞便樣品進(jìn)行篩選和加工以便隨后用于糞便細(xì)菌療法，從而用健康或期望的腸道菌群來代 替患者消化道中的致病性或不受歡迎的生物。
[0040] 本公開提供了一種菌群恢復(fù)治療組合物，該組合物包含有效量的糞便菌群與有效 量的冷凍保護(hù)劑的混合物。一個(gè)示例性的冷凍保護(hù)劑可包含聚乙二醇。此外，在本公開的菌 群恢復(fù)治療組合物中，聚乙二醇是以大約5_60g/ml、或者大約5-30g/ml、或者小于大約30g/ ml的濃度而存在。該組合物還可以包含生理鹽水作為稀釋劑。本公開的組合物可包含具有 在大約600至大約20000范圍內(nèi)的平均分子量的聚乙二醇。例如，可以使用具有3150的平均 分子量的PEG-3150。在某些實(shí)施方式中，菌群恢復(fù)治療組合物包括來源于1個(gè)以上的人糞便 樣品的糞便菌群。
[0041] 可使用其他的冷凍保護(hù)劑，例如右旋糖、甜菜堿、甘氨酸、蔗糖、聚乙烯醇、 Pluronic F-127、甘露醇、Tween-80、乙二醇、1,3-丙二醇、羥丙基纖維素、甘油、PEG/甘油混 合物、牛奶(例如，脫脂奶）、和丙二醇。
[0042] 在其他實(shí)施方式中，本公開的組合物的菌群的存活率可通過將菌群（和/或?yàn)V液 和/或細(xì)菌療法組合物)在擬桿菌膽鹽七葉苷瓊脂(BBE)平板(從Becton&Di ckinson公司購 得，產(chǎn)品編號(hào)221836，BBL ?擬桿菌膽鹽七葉苷瓊脂BBE平板）、或者疾病控制中心(CDC)平板 (從86(^〇11&0丨〇1^118〇11公司購得，產(chǎn)品編號(hào)221733,881*0)(：厭氧菌5%綿羊血瓊脂平板）、 或者這兩者中進(jìn)行培養(yǎng)而確定。至少在一些實(shí)施方式中，可以通過在1〇_ 5的系列稀釋下存在 大約30CFU至大約300CFU菌落形成單位(CFU)計(jì)數(shù)、或者在KT6的系列稀釋下存在大約30CFU 至大約300CFU的CFU計(jì)數(shù)，而確定本公開組合物在BBE平板和/或CDC平板上的菌群存活率。 還提供其中菌群的濃度為大約IO 7微生物/ml的菌群恢復(fù)治療組合物。此外，用于生產(chǎn)菌群 恢復(fù)治療組合物的方法還可包括進(jìn)行前供體篩選和后供體篩選的步驟，人糞便樣品在兩次 篩選之間米集。
[0043] 除了確定微生物的存活率外，平皿測(cè)試也可以確定所存在活微生物的多樣性。所 存在微生物的混合物或者微生物的多樣性是人糞便樣品質(zhì)量和由該樣品所制造的菌群恢 復(fù)治療產(chǎn)品質(zhì)量的另一個(gè)衡量尺度。CDC平板