， 通過從36英寸的高度將冷凍的EVA袋下落到拐角、表面和端口上而執(zhí)行跌落測試。跌落檢測 包括當把將來的產(chǎn)品從貯存中取出時使樣品下落到產(chǎn)品的拐角、端口、和平直表面上以便 模擬可能的處理誤差。然后，根據(jù)上述標準，在各跌落后對這些袋進行重新檢查。對于每個 樣品而言，除了袋周邊密封的初步檢查外，重復進行三次各跌落檢測。所有的樣品袋均通過 了檢測(未檢測到泄漏）。
[0131] 然后，這些袋經(jīng)歷解凍過程。將各樣品在甘油/水浴中在0°C下浸泡1小時。然后，取 出樣品，干燥，并且重復進行跌落檢測。再次，所有樣品袋通過所有檢測(未檢測出泄漏）。
[0132] 實施例3:臨床研究
[0133] 在2期臨床研究中，將本文中所公開的菌群恢復治療組合物給藥予31位受試者。未 報告嚴重不良事件，并且無不良事件與產(chǎn)品或其給藥有關。在這些受試者中，在使用一個或 兩個劑量的菌群恢復治療組合物之后27位受試者經(jīng)歷了他們的rCDAD(復發(fā)性艱難梭菌相 關性腹瀉)癥狀的成功消退，該消退被定義為在給藥后rCDAD癥狀不復發(fā)達56天。在這些27 位受試者中，在使用一個劑量的菌群恢復治療組合物之后，16位患者經(jīng)歷了rCDAD的完全消 退，并且其他11位受試者在第一次給藥后復發(fā)，但然后在菌群恢復治療組合物的第二次給 藥后成功地到達56天療效終點。在這些受試者中，4位受試者被認為是治療失敗:3位受試者 在接收他們的菌群恢復治療組合物的第二次給藥后經(jīng)歷了 rCDAD的復發(fā)，并且1位受試者在 第一次給藥之后復發(fā)且位接受第二次給藥。
[0134] 從可獲得的制成臨床批次中，隨機地選擇菌群恢復治療組合物藥劑。給藥的藥劑 反映了從4位供體中制造的產(chǎn)品。沒有任何產(chǎn)品屬性(藥劑的量、存活微生物、保存期、解凍 保存期等)似乎與臨床結(jié)果相關，或者可以用于預測給藥是否將導致成功的預后。此ID的結(jié) 束時，提供臨床結(jié)果信息。
[0135] 關于在2期臨床研究中給藥的菌群恢復治療組合物劑量的信息：
[0136] 將45個劑量的菌群恢復治療組合物解凍、運送，并且向患者給藥。提供了藥劑年齡 (AD)(從藥劑的生產(chǎn)日期到向臨床患者給藥的日期）。下面提供了與菌群恢復治療組合物的 若干屬性相關的統(tǒng)計結(jié)果：
[0137] AD平均時間=43.2小時
[0138] AD標準差= 14.9小時
[0139] AD最小時間= 22.1小時
[0140] AD最大時間=73.8小時
[0141]臨床結(jié)果(復發(fā)性艱難梭菌相關性腹瀉的消退)與這些產(chǎn)品屬性之間似乎沒有相 關性或損害。
[0142] 實施例4:冷凍保護劑的選擇
[0143] 冷凍保護劑，具體地聚乙二醇(PEG)的使用，已發(fā)現(xiàn)維持菌群恢復治療組合物在冷 凍和重新解凍后的存活率(通過CDC平板和BBE平板上的CFU而確定）。這包括從解凍開始的 時間段、在控制溫度包裝中運送并且允許從打開包裝直到治療患者的時間。如同上述的質(zhì) 量檢測，在被冷凍之前菌群恢復治療產(chǎn)品的最后可接受的計數(shù)范圍可以是在CDC平板上的 稀釋水平HT 6下在大約30至大約300CFU之間，在BBE平板上稀釋水平HT5下從大約30到大約 300CFU。確保存活率得以維持的一種方法是要求最終用戶或消費者(包括但不限于內(nèi)科醫(yī) 生或臨床醫(yī)生)在接收產(chǎn)品的48小時內(nèi)使用該產(chǎn)品。此外，將要求最終用戶在大約2和大約 29°C之間的溫度下儲存該產(chǎn)品直到使用。
[0144] 從兩個角度對冷凍保護劑的添加進行分析。首先，對若干個冷凍保護劑進行篩選 以評價將冷凍保護劑添加到菌群恢復治療產(chǎn)品中的最初效果。該檢測是用于確定當與特定 冷凍保護劑混合時菌群恢復治療產(chǎn)品的死亡率或存活率。所分析的第二角度是當將菌群恢 復治療產(chǎn)品冷凍然后重新解凍以便向患者給藥時特定冷凍保護劑對菌群恢復治療產(chǎn)品的 實際冷凍保護能力。該培養(yǎng)的結(jié)果表明在冷凍/解凍后該產(chǎn)品活力保持得怎樣。
[0145] 完成檢測以便檢查將多種不同的活菌群恢復治療冷凍保護劑添加到均質(zhì)化且過 濾的人糞便混合物(或菌群恢復治療產(chǎn)品）中的效果。這些檢測只是用于對細菌對冷凍保護 劑的最初添加的反應進行定量，并且不包括檢測在隨后的冷凍-解凍循環(huán)中冷凍保護劑是 否成功地保護細菌。在這些檢測中，將單個人糞便捐獻物劃分到各種檢測中，其中僅將等滲 生理鹽水（即，未添加冷凍保護劑）的"對照"樣品用于基線。同時使用CDC平板和BBE平板兩 者。對于所有的檢測，使用將兩種不同稀釋水平的結(jié)果加以復合的CFU計數(shù)的加權(quán)平均值。 所使用的冷凍保護劑包含：1〇%脫脂奶、5%甘油、10%甘油、10%DMS0和具有在從600到 20000范圍內(nèi)的分子量的聚乙二醇(PEG)。
[0146] 對于⑶C平板:10 %脫脂奶、10 %甘油、和PEG均合理地起作用，其中CFU計數(shù)停留在 生理鹽水對照品的大約25%內(nèi)。值得注意的是，較高濃度的甘油以劑量依賴性關系導致大 量的微生物死亡。
[0147] 對于BBE平板:僅PEG制劑不顯示顯著的微生物死亡率。值得注意的是，10%甘油制 劑獲得接近90%的死亡率(10%的生存率），較高濃度的甘油獲得100%的死亡率(如采用目 前的稀釋水平所看見）。
[0148] 基于來自10%甘油的BBE平板的結(jié)果，實施了附加的研究以判斷由于添加甘油所 導致的90%死亡率(在BBE平板上)是否可以消除。假設將甘油濃度減小到5%，或者在添加 甘油之前使微生物混合物冷卻（以減慢代謝活動)可以降低預期的高死亡率。5%甘油溶液 具有小于10%的死亡率，并且冷卻也以劑量依賴性關系降低死亡率。然而，這些效果并不足 夠強到克服基線結(jié)果，并且在所有的甘油與對照品的比較檢測中看到至少60%的死亡率。
[0149] 從人糞便采集的時間到將菌群恢復治療產(chǎn)品向患者給藥的時間維持菌群恢復治 療產(chǎn)品中微生物的存活率是重要的。因此，重要的是所添加的冷凍保護劑當最初添加時對 微生物不具有顯著的毒性作用。在所檢測的冷凍保護劑中，僅PEG制劑發(fā)揮良好的作用。在 BBE結(jié)果中，脫脂奶尤其不發(fā)揮良好的作用。使用牛奶的其他缺點包括提高牛奶過敏反應機 會的可能性以及牛奶的可變表征特性。同樣地，DMSO在BBE平板上并不發(fā)揮良好的作用。另 外，雖然將DMSO局部地使用于藥物用途，但目前尚未知在人胃腸系統(tǒng)中的使用。10%甘油在 ⑶C平板上發(fā)揮良好的作用，但在BBE平板上顯示80-90 %的死亡率(10-20 %生存率）。
[0150] 實施例5:其他的冷凍保護劑
[0151]將人腸道菌群從人糞便中提取到含有特定濃度的若干不同的潛在冷凍保護劑的 生理鹽水溶液中。檢測這些溶液的pH值并且在CDC平板和BBE瓊脂平板上進行培養(yǎng)以便測量 活微生物負荷，然后在_80°C下冷凍達1至7天之間，然后解凍。然后，檢測取自解凍溶液的樣 品的PH值，并且在CDC和BBE瓊脂平板上進行培養(yǎng)以便測量活微生物負荷。篩選結(jié)果為"++" 的冷凍保護劑顯示明顯大于PEG3350(和甘油）的存活率結(jié)果，篩選結(jié)果為"+"的冷凍保護劑 具有至少與甘油同樣好的結(jié)果，篩選結(jié)果為"〇"的冷凍保護劑具有混合結(jié)果并且可以或者 可以不是合適的冷凍保護劑，篩選結(jié)果為的冷凍保護劑的作用比甘油差并且不應被認 為是用于人腸道菌群溶液的有效冷凍保護劑。這些結(jié)果，基于使用CDC和BBE瓊脂平板的pH 測量和活微生物的計數(shù)，表明下列:在DMSO中的右旋糖、甜菜堿、甘氨酸、蔗糖、聚乙烯醇、和 Pluronic F-127具有被評分為"++"的結(jié)果。甘露醇、Tween-80、乙二醇、1,3-丙二醇、輕丙基 纖維素、甘油、PEG/甘油混合物、和丙二醇具有被評分為"+"的結(jié)果。丙二醇(3 % w/v)和魚油 具有被評分為"〇"的結(jié)果。氫氧化鎂、尿素、和黃原膠具有被評分為的結(jié)果。的評分 是用于表示pH值被發(fā)現(xiàn)是不是可接受的，但平板接種的結(jié)果被發(fā)現(xiàn)是可接受的。
[0152] 實施例6:示例性的生產(chǎn)工藝
[0153]完成了檢測以模擬示例性的整個生產(chǎn)工藝，其中使經(jīng)加工的人糞便(稀釋、均質(zhì) 化、和過濾)樣品冷卻、冷凍以便長期貯存、解凍、運送至消費者地點，并且在保留灌腸之前 升溫到體溫。該生產(chǎn)工藝模擬用于下列的名義工藝:人糞便的采集；以2:1至4:1的比率將人 糞便直接地稀釋進入冷凍保護液(或者稀釋劑或生理鹽水/PEG混合物）；名義的均質(zhì)化和過 濾過程;在循環(huán)的流體浴中使包裝產(chǎn)品冷卻;長期冷凍的貯存;在循環(huán)的流體浴中將包裝產(chǎn) 品升溫;產(chǎn)品的包裝以便使用"冰袋"并且在隔熱材料中輸送;隔夜運送給消費者;產(chǎn)品的床 側(cè)升溫以便立即輸入患者中。作為研究的一部分，改變?nèi)齻€參數(shù)以便檢查它們對總體微生 物存活率或生存率的作用（通過系列稀釋到CDC和BBE平板上以便進行CFU的保溫培養(yǎng)和計 數(shù)而測量）。這些參數(shù)包括冷凍保護劑的使用、冷卻浴的溫度、解凍浴的溫度。
[0154] 在冷凍保護劑檢測中，研究包括:無冷凍保護劑（生理鹽水）的樣品；10%甘油和 59g/升的PEG 3350。為了檢測冷卻浴的使用，研究包括:直接地放置入冷柜(_80°C)中因此 不經(jīng)歷冷卻浴的樣品；直接地放置入〇°C冷卻浴中的樣品；和直接地放置入-11°C冷卻浴的 樣品。在0°C、+10°C、和+20°C下對升溫進行檢測。將各檢測排列標準化為使用相同冷凍保護 劑的對照樣品，但立即進行平板接種而不經(jīng)歷任何冷凍-解凍過程。
[0155] 將冷凍保護劑，如果使用，與生理鹽水混合并且在均質(zhì)化過程期間添加(參見稀釋 劑和生理鹽水/PEG混合物的定義）。因此，由于冷凍保護劑的添加所導致的任何微生物死亡 率(例如，例如在使用甘油時看到的，特別是在BBE平板中）將只通過與對照樣品的CFU進行 比較來觀察
[0156]已發(fā)現(xiàn)，冷凍和解凍參數(shù)對于總體的微生物生存率有很小的作用。通常這對于⑶C 平板是清楚的，其中數(shù)據(jù)通常具有正常狀態(tài)并且所有冷凍-解凍參數(shù)的結(jié)果只在單個對數(shù) 水平的稀釋中變化。對于BBE平板而言，原始數(shù)據(jù)狀態(tài)差得多，具有表觀異常值的若干情況 和其中違反了對相鄰稀釋水平（即，對數(shù)水平)進行比較的10倍準則的情況。然而，由于冷 凍-解凍參數(shù)，因而仍然不存在表觀差異。
[0157]明確地觀察到由于使用不同冷凍保護劑的影響。對于此分析而言，使用來自不同 冷凍-解凍參數(shù)的結(jié)果的簡單算數(shù)平均數(shù)對冷凍保護劑性能進行比較。對于CDC平板而言， 在冷凍-解凍中"無冷凍保護"具有18%的生存率(82%的死亡率），而甘油和PEG的添加使死 亡率降低為大約30%(67%和75%的生存率，分別）。關于用甘油處理的樣品，以上結(jié)果忽略 了由于甘油的最初添加所導致的死亡率。當冷凍保護劑的最初添加加到冷凍/解凍的影響 時，該作用的量值為大約80%的死亡率。對此與使用PEG作為冷凍保護劑的樣品的大約32% 的死亡率進行了比較。
[0158] 在BBE平板上添加甘油的影響是80%至90%的非常高的死亡率。相反，PEG平板顯 示來自冷凍保護劑的毒性低或無毒性，并在冷凍-解凍循環(huán)中顯示強保護效果。相對于對照 品，使用PEG的總累積生存率為75% (25%的死亡率）。結(jié)論是，基于初始死亡率與冷凍-解凍 損失的組合為大約I-Iog的損失（10%的生存率）10%甘油在BBE平板上的作用差，。TOG-3350 在 CDC 平板和 BBE 平板兩者均上發(fā)揮良好的作用。 PEG 對微生物具有低的初始毒性 (很少 或沒有由于將冷凍保護劑添加到人糞便中蘇所造成的損失)并且相對于"無冷凍保護劑"它 提供顯著的保護。預計菌群恢復治療劑的各給藥將具有最小為IO 7微生物/mL的懸浮液，其 中每次給藥給予最小的IOOmL的懸浮液。
[0159] 實施例7:糞便移植套件
[0160] 在一個實例中，可以形成用于幫助糞便移植的各部件的套件。在一個實例中，可以 將捐獻物套件運送至臨床醫(yī)生。該捐獻物套件可以包括用于取自患者或者在某些實例中取 自健康供體的血液和糞便樣品的設備。因為許多的患者腸道菌群是厭氧的，所以許多生物 體會由于暴露于空氣而死亡。在一個實例中，捐獻套件可以包括在不損害樣品的情況下運 送血液和糞便樣品的材料(例如，快速冷凍、干冰等）。
[0161] -旦被運送至機構(gòu)（例如，一個地點、局部的地點、許多地點等），可以對樣品進行 檢測，并且可以確認艱難梭菌或者一種以上的其他疾病或病癥的存在或不存在。在其他實 例中，可以對健康的糞便樣品進行檢測并且進行制備以便用作治療劑。
[0162]在一個實例中，一旦對患者的樣品進行檢測以便驗證疾病或病癥，或者對供體的 樣品進行檢測以便驗證健康或其他適合性(例如，1種以上期望狀態(tài)的存在等）、可以制備治 療劑(例如，使用健康供體糞便樣品，至少一部分的一個以上的健康的儲存的糞便樣品，例 如取自糞便庫的材料，等）并且運送回到臨床醫(yī)生以便向患者的給藥和治療。在某些實例 中，在運送期間保持治療劑(例如，冷凍等）。該套件可以包含在滅菌容器(例如鼻飼(NG)管、 小玻璃瓶(例如，用于保留灌腸）、耐胃酸膠囊(例如，生物耐酸以便到達腸道，具有滅菌的外 偵D等）中的經(jīng)加工的糞便樣品或治療劑。在一個實例中，一旦被接收，臨床醫(yī)生可以以保存 菌群的方式儲存內(nèi)容物，直到已被插入患者中。
[0163] 實施例8:延長保存期制劑
[0164] 對供體糞便的健康人微生物內(nèi)容物生存的長期貯存進行了研究。在使用和不使用 冷凍保護劑的情況下對糞便樣品進行加工，并且在變化的控制溫度下進行冷卻/解凍。然 后，在-80°C和_20°C下貯存360天（12個月）后取出樣品，在受控制的溫度下進行解凍并且平 板接種于兩種類型的瓊脂平板(分別是疾病控制中心5%血瓊脂(CDC)和擬桿菌膽鹽七葉苷 瓊脂(BBE))上。對總每毫升菌落形成單位(CFU/mL)進行記錄和分析?；谠撗芯?，首先對不 使用冷凍保護劑情況下所保存的樣品進行分析，接著使用變化濃度的不同冷凍保護劑來保 存樣品。
[0165] 從"無冷凍保護劑"樣品中生長的CDC平板計數(shù)表明冷柜溫度和貯存時間對于可恢 復的CFU數(shù)具有顯著的影響。這些數(shù)據(jù)與在以前的時間點所記錄的數(shù)據(jù)是一致的。在此模型 中，R 2值表明數(shù)據(jù)中大約59%的變化(相鄰的R2)是由該模型進行解釋，該模型表明在180天 (6個月）的貯存后從大約80 %的下降。
[0166] 當在-20°C下儲存時，大部分的生產(chǎn)樣品CFU/mL計數(shù)下降至低于產(chǎn)品規(guī)格中認為 是可接受的下限（IO8CFUAiL)。相反，在-80°C下儲存的樣品所顯示的計數(shù)仍然在產(chǎn)品規(guī)格 的期望下限之上。由此得出的結(jié)論是，不使用冷凍保護劑的所制備樣品的長期貯存以及在-80°C下的存放被發(fā)現(xiàn)導致大于在_20°C下所存放樣品的存活率。
[0167] 就從使用冷凍保護劑存放的樣品中所采集的數(shù)據(jù)而言，貯存時間和冷柜溫度是 CDC計數(shù)反應(單位為CFU/mL)的最顯著的因素。在該數(shù)據(jù)中所看到的大部分的變化可由貯 存時間、冷柜溫度、和這些之間的相互作用而解釋，正如可以由在0.59處所獲得的R 2值所可 見。
[0168] 與冷凍保護劑混合且在_20°C下存放的樣品繼續(xù)顯示可恢復CFU/mL更顯著的減 小。在-20°C下存放的樣品在60天和90天(2和3個月）之間，每毫升菌落形成單位開始下降至 低于IO 8產(chǎn)品規(guī)格下限。在超過60天的（2個月）的貯存后，可恢復CFU/mL的數(shù)量減小速率減 慢。然而，在_80°C的貯存溫度下，在270天(9個月）的貯存期間，可恢復CFU/mL計數(shù)保持相對 穩(wěn)定。此外，大部分的計數(shù)仍然超過IO 8CFUAiL的產(chǎn)品規(guī)格最小限。
[0169] 在較低的冷柜溫度下存放樣品達較短時間對計數(shù)具有積極作用一一隨著從生產(chǎn) 點開始時間進一步推移，變得更加難以保證CFU/mL的可靠恢復，該CFU/mL表示產(chǎn)品的活微 生物群體。然而，數(shù)據(jù)表明貯存時間的作用會由于添加作為冷凍保護劑的PEG 3550、以及將 物料儲放在低溫下(在這種情況下，-80°C)而減弱。
[0170] 實施例9:延長保存期制劑
[0171] 以如本文中所公開的方式對人糞便進行加工;使用經(jīng)加工懸浮液的初始樣品而形 成用于瓊脂平板的接種的系列稀釋。一旦將樣品從懸浮液中取出，則將剩余的懸浮液(大約 150mL)轉(zhuǎn)移到兩個(2個)單獨的滅菌EVAIC存袋中。將各袋在-80°C下冷凍1周。
[0172] 在1周后，根據(jù)菌群恢復治療組合物批次方