蜜桶花片在制備抑制橫紋肌肉瘤細胞a-204細胞增殖藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種蜜桶花片在制備抑制橫紋肌肉瘤細胞A-204細胞增殖藥物中的應(yīng)用及蜜桶花片的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蜜桶花顆粒標準號WS-11440(ZD-1440)-2002,記載于國家中成藥標準匯編內(nèi)科肝 膽分冊。由蜜桶花1700g作為原料藥制成，具有清熱解毒，除濕利膽，用于肝膽濕熱所致的急 慢性肝炎。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有蜜桶花片在在制備抑制人橫紋肌肉瘤細胞A-204細胞增殖藥 物中的應(yīng)用的報道，也未見有蜜桶花片提取制備方面采用超臨界萃取的報道，而傳統(tǒng)水煎 煮的方法，工藝粗糖、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨 床上應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：本發(fā)明的目的在于提供一種蜜桶花片在制備抑制橫紋肌肉瘤細胞A-204細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[000引本發(fā)明的另一個目的在于提供一種蜜桶花片的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的： 蜜桶花片在制備抑制橫紋肌肉瘤細胞A-204細胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述蜜桶花片由 蜜桶花1700g作為原料藥制成，所述蜜桶花片的制備方法由下列步驟組成:取蜜桶花，加入 到C化超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取 壓力15-30MPa，溫度30-50°C，C02流量l-3ml/g生藥· min,萃取時間800-900min，得超臨界 萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0.50g。
[0007] 優(yōu)選的，上述的蜜桶花片在制備抑制橫紋肌肉瘤細胞A-204細胞增殖藥物中的應(yīng) 用，所述蜜桶花片的制備方法由下列步驟組成:取蜜桶花，加入到C〇2超臨界萃取器中，乙醇 作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，0)2流量 2ml/g生藥· min，萃取時間850min，得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制 顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0.50g。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)中，蜜桶花顆?？诜?，一次5g，一日3次。蜜桶花顆粒服藥量大。采用本發(fā) 明方法制備成的蜜桶花片每片重〇.50g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分 的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可W通過下述試驗證明。
[0009] 試驗一、不同方法制備的蜜桶花片中麥角醬巧含量的比較 1、儀器及試藥本發(fā)明蜜桶花片：按實施例1方法制備，使用1700g原料藥，經(jīng)提取制成 400片，每片重0.50g。原蜜桶花片，按照WS-11440(ZD-1440)-2002標準方法制備。 Agi 1 ent 1200高效液相色譜儀;METTLER AE240電子分析天平;麥角醬巧對照品（中國藥品生 物制品檢定所）。
[0010] 2、方法 照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定。
[0011] 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.5%醋酸 (42:58)為流動相;檢測波長為334nm。理論板數(shù)按麥角醬巧峰計算應(yīng)不低于3000。
[0012] 對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)五氧化二憐真空干燥至恒重的麥角醬巧對照品 4mg，置100ml棟色量瓶中，加甲醇制成每1ml含4化g的溶液，即得。
[0013] 供試品溶液的制備取本發(fā)明蜜桶花片10片，精密稱定，研細，取0.20g，精密稱定， 加水10ml使溶解，用水飽和的正下醇振搖提取4次，每次10ml，合并正下醇液，蒸干，殘渣加 甲醇使溶解，并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0014] 對照產(chǎn)品供試品溶液的制備取對照的蜜桶花顆粒20g，研細，取Ig，精密稱定，加 水10ml使溶解，用水飽和的正下醇振搖提取4次，每次10ml，合并正下醇液，蒸干，殘渣加甲 醇使溶解，并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0015] 測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液、對照產(chǎn)品供試品溶液各化1，注 入液相色譜儀，測定，即得。
[0016] 3、結(jié)果 結(jié)果表明，本發(fā)明蜜桶花片中麥角醬巧的含量為1.51-2.61mg/片;而原蜜桶花顆粒中 麥角醬巧的含量為1.02mg/袋(每袋含顆粒劑5g)，每次服用量2片的麥角醬巧含量為原顆粒 劑5g含量的3-5倍，在服用量減少的情況下，麥角醬巧含量有很大提高。
[0017] 上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的蜜桶花片，有效成分含量遠遠高于WS-11440(ZD-1440)-2002標準記載的方法制備的蜜桶花顆粒。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作更進一步的說明，W便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解 本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實例，凡基于本發(fā)明上述 內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0019] 實施例1 取蜜桶花1700g，加入到C〇2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，0)2流量2ml/g生藥· min，萃取時間850min，得 超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重 0.50邑。
[0020] 經(jīng)檢測，成品中麥角醬甘的含量為2.61mg /片。
[0021] 實施例2 取蜜桶花1700g，加入到C〇2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，0)2流量Iml/g生藥· min,萃取時間900min，得 超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重 0.50邑。
[0022] 經(jīng)檢測，成品中麥角醬巧的含量為1.58 mg/片。
[0023] 實施例3 取蜜桶花1700g，加入到C〇2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度60°C，0)2流量3ml/g生藥· min，萃取時間SOOmin，得 超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重 0.50g〇
[0024] 經(jīng)檢測，成品中麥角醬巧的含量為2.04mg /片。
[0025] 實施例4:蜜桶花片抑制人橫紋肌肉瘤細胞A-204細胞增殖的實驗研究資料 1.實驗材料 1.1實驗用細胞株 人橫紋肌肉瘤細胞A-204細胞，山東大學(xué)實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0026] 1.2實驗藥物 研究藥物:本發(fā)明蜜桶花片:按實施例1方法制備。
[0027] 藥液儲液:稱取lOOmg蜜桶花片，溶于5ml無水乙醇中，0.2脾濾器過濾，500yldoff 管分裝，-20°C存儲，同時0.化m濾器過濾無水乙醇W備對照組之用。
[0028] 1.3實驗試劑 DMEM( GIBC0公司Cat.No. 12100-061 Lot.No.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot. No. 100419); NaHC〇3(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot.No. 1088387) shypsinUMRESCO公司）；抓TAUMRESCO公司）；Penicillin G Sodium SalUAMRESCO公司1);S化eptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇（溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限 公司）;MTT (Biosha巧批號：0793) :PBS(實驗室自配）； 1.4實驗器材 萊卡倒置顯微鏡（德國Leica型號:DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型 號：S陽CTRAMAX 190) ; C化培養(yǎng)箱(FORMA型號：3111);超凈臺（蘇凈集團安泰公司制造型號： SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號：S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型 號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋（日本SANYO公 司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實驗設(shè)備公司型號：DHG9123A);冰箱 (西口子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號：2001);低速離屯、機(上海安亭科學(xué)儀器廠 型號:KA-1000) ;0. 濾器(MILLIP0RE型號：SLGP033RB) ; 1cm培養(yǎng)皿(肥ST公司）、96孔培養(yǎng) 板(肥ST公司）;細胞計數(shù)板;離屯、管、移液管、Tips若干。
[0029] 2.實驗方法 l)A-204細胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進行常規(guī)培養(yǎng)（10cm培養(yǎng)皿），當細胞生長至 對數(shù)期時，收集細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25%膜蛋白酶-0.04%EDTA，37°C 消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細胞后將其轉(zhuǎn)入離屯、管中，10(K)rpm 離屯、5min，調(diào)整細胞懸液濃度3 X 104個/ml。
[0030] 2)將細胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液18化1，培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中 (37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0031 ] 3)根據(jù)細胞生長情況，一般長至50%-70%，加入蜜桶花片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2地。
[0032] 4)2地后加入2化1 MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)地。
[0033] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入20化1二甲基亞諷，置搖床 上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0034] 6)同時設(shè)置本底(不加細胞，只加培養(yǎng)液），對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介 質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞諷），每組設(shè)定6個復(fù)孔。
[0035] 7)結(jié)果W藥物對細胞的抑制率表示:細胞增值抑制率(％)=(對照孔0D值-給藥孔0D 值）、對照孔0D值X 100%。實驗重復(fù)3次。
[0036] 3.統(tǒng)計處理 采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)Wmean±S.D. 表不。
[0037] 4.實驗結(jié)果 MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對A-204細胞增殖抑 制有差異(P<〇.〇5)，劑量在lOmg/ml時該差異具有顯著性(P<0.01)，當劑量達到15-20mg/ml 時有極顯著性差異(P<〇. 001)。
[0038] 表1蜜桶花片對A-204細胞增殖抑制影響研究（X±SD)_
注：與對照組比較，沖<0.01; *沖<0.001。
[0039] 5.實驗結(jié)論 本發(fā)明的蜜桶花片可W抑審ijA-204細胞增殖，減少A-204細胞的細胞生長數(shù)目，該作用 呈劑量依賴性。
【主權(quán)項】
1. 蜜桶花片在制備抑制橫紋肌肉瘤細胞A-204細胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述蜜桶花片 由蜜桶花1700g作為原料藥制成，其特征在于，所述蜜桶花片的制備方法由下列步驟組成： 取蜜桶花，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分 比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，C02流量l-3ml/g生藥·min，萃取時間800-900min，得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400 片，每片重0.50g。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜜桶花片在制備抑制橫紋肌肉瘤細胞A-204細胞增殖藥物中 的應(yīng)用，其特征在于，所述蜜桶花片的制備方法由下列步驟組成:取蜜桶花，加入到C02超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫 度40°C，C02流量2ml/g生藥·min，萃取時間850min，得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入 淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0.50g。
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蜜桶花片在制備抑制橫紋肌肉瘤細胞A-204細胞增殖藥物中的應(yīng)用及蜜桶花片的制備方法。所述蜜桶花片由蜜桶花1700g作為原料藥制成，采用超臨界萃取制備而成，使得麥角甾苷含量有很大提高。
【IPC分類】A61P35/00, A61K36/80, A61K9/20
【公開號】CN105456484
【申請?zhí)枴緾N201510986118
【發(fā)明人】王靜
【申請人】濟南新時代醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月25日