、IFN-γ與內(nèi)參基因GAPDH平均CT的差值 (ACT)為縱坐標(biāo)的關(guān)系圖（見(jiàn)圖3A，3B，3C)。3個(gè)基因相應(yīng)的對(duì)數(shù)回歸方程分別為Y= 0.0363Log(X)+ 2.9808、Y = -0.0233Log(X)+ 3.0099、Y = 0.0495Log(X)+ 3.0035Jt 應(yīng)的直線斜率分別為0. 0363、-0. 0233、0. 0495,所得直線斜率的絕對(duì)值接近于0,說(shuō)明目標(biāo) 基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同，可以用Λ Λ CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0061] 2. 3不結(jié)球白菜提取物（NCCE)對(duì)雞脾臟IL-2、IL-4及IFN-γmRNA相對(duì)表達(dá)量的 影響 不結(jié)球白菜提取物（NCCE)對(duì)雞脾臟IL-2、IL-4及IFN-γmRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 見(jiàn)圖4所示(標(biāo)注小寫(xiě)字母不同表示差異顯著（P〈0. 05)，標(biāo)注相同字母表示差異不顯著 (P>0. 05)，1-6 組分別為對(duì)照組及 100, 300, 500, 700,900mg/kgNCCE組）。由圖 4A和 4B可 知，日糧中添加NCCE增加了雞脾臟IL-2和IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，除 100mg/kgNCCE組外，日糧中添加 300,500,700,90〇11^/1^~0^顯著增加了雞脾臟11^-2 和IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)水量（P〈 0.05) ;300, 500, 700,900mg/kgNCCE組比 100mg/kg 組增加了雞脾臟IL-2 和IL-4mRNA(P〈(X05)，300,500,700,900mg/kgNCCE組間差異不顯 著（P> 0.05)。其中500和700mg/kgNCCE組IL-2和IL-4mRNA相對(duì)表達(dá)量的增加呈現(xiàn) 減弱的趨勢(shì)。從擬合的回歸方程來(lái)看，AA肉雞脾臟IL-2mRNA和IL-4mRNA相對(duì)表達(dá)量隨 著NCCE添加量的增加均呈二次曲線增加趨勢(shì)，曲線方程分別為Y= -0.1054X2 + 1.0118X -0· 11和Υ=-0· 0821X2+0. 9579X-0. 04。擬合結(jié)果說(shuō)明日糧NCCE的添加對(duì)肉雞脾臟IL-2 和IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)有較大影響，且呈現(xiàn)二次曲線的劑量依賴關(guān)系。
[0062] 由圖4C可知，添加不結(jié)球白菜提取物（NCCE)增加了雞脾臟IFN-γmRNA的相對(duì) 表達(dá)量。與對(duì)照組相比，500,700,90〇11^/1^~0^組雞脾臟正^丫1111?熟的相對(duì)表達(dá)量顯 著提高（P〈 〇. 05);100和300mg/kgNCCE組與對(duì)照組IFN-γmRNA的表達(dá)量差異不顯著 (P> 0.05);500,700,900mg/kgNCCE組比 100 和 300mg/kgNCCE組IFN-γmRNA的相對(duì) 表達(dá)量顯著提高（P〈 0.05)，100和300mg/kgNCCE組間差異不顯著（P〈0. 05)。其中500 NCCE組IFN-γmRNA相對(duì)表達(dá)量的增加呈現(xiàn)減弱的趨勢(shì)。從擬合的回歸方程來(lái)看，肉雞脾 臟IFN-γmRNA相對(duì)表達(dá)量隨著日糧NCCE添加量的增加呈現(xiàn)二次曲線增加趨勢(shì)，曲線方程 為Y= -0.0679X2 + 0.8179X+ 1E-14。擬合結(jié)果說(shuō)明日糧添加不結(jié)球白菜提取物（NCCE) 對(duì)肉雞脾臟IFN-γmRNA的相對(duì)表達(dá)量有較大影響，且呈現(xiàn)二次曲線的劑量依賴關(guān)系。
[0063] 3 結(jié)論 隨著植物活性提取物研究的不斷深入，已發(fā)現(xiàn)有不少提取物對(duì)細(xì)胞因子和其他免疫分 子的產(chǎn)生及生物活性具有極其重要的調(diào)節(jié)作用。這對(duì)于從分子水平上闡明植物活性物質(zhì)防 治疾病的免疫學(xué)機(jī)制有著十分重要的意義。IL-2是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子， 具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，能夠活化B細(xì)胞、T細(xì)胞，誘導(dǎo)B、T細(xì)胞增殖和分化，激活這些細(xì)胞的生 物活性，促進(jìn)NK細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其細(xì)胞毒性并誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，可以有效提高動(dòng)物機(jī)體免 疫功能。在畜牧生產(chǎn)上，IL-2己配合疫苗作為免疫佐劑使用，可大大提高疫苗的免疫效果， 克服免疫抑制以及預(yù)防某些疾病感染。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比，添加不同量的不結(jié)球 白菜提取物（NCCE)均使IL-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量提高。日糧中添加100, 300和500mg/kg 不結(jié)球白菜提取物（NCCE)與雞脾臟組織IL-2mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)二次曲線的劑量依賴關(guān)系， 但當(dāng)添加量增加到700mg/kg時(shí)，雞脾臟組織IL-2mRNA的表達(dá)也有增高，但增高呈現(xiàn)減弱 趨勢(shì)，因此，基礎(chǔ)日糧中添加500mg/kg的不結(jié)球白菜提取物（NCCE)可最大程度的提高肉 雞脾臟組織IL-2mRNA的表達(dá)。
[0064] IL-4可使B細(xì)胞表面la抗原表達(dá)升高，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)MHC-II類分子的表達(dá)，經(jīng)IL-4 刺激的B細(xì)胞抗原遞呈能力顯著增強(qiáng)，促進(jìn)Th細(xì)胞產(chǎn)生IL-2。IL-4是Th2型細(xì)胞產(chǎn)生的 一種多效應(yīng)性免疫活性調(diào)節(jié)分子，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮非常重要的作用，它可間接介導(dǎo)細(xì)胞 免疫。本試驗(yàn)中，日糧中添加不同劑量的NCCE均能促進(jìn)雞脾臟組織細(xì)胞中IL-4mRNA的表 達(dá)。干擾素是機(jī)體自身產(chǎn)生的一種抵御病干擾素是生命有機(jī)體自身產(chǎn)生的一種抵御病毒入 侵，維持機(jī)體或細(xì)胞功能的防御性物質(zhì)。IFN-γ是由Thl細(xì)胞分泌的，它的產(chǎn)生受基因組控 制。在正常生理情況下，IFN-γ基因處于抑制狀態(tài)，當(dāng)有誘導(dǎo)劑作用于細(xì)胞膜后，使IFN-γ 基因解除抑制，IFN操縱子打開(kāi)，合成mRNA，成熟的IFN分泌到胞外。雞IFN-γ是一種重要 的細(xì)胞因子，是目前所知的發(fā)揮作用最快的病毒防御及免疫調(diào)節(jié)因子，具有控制細(xì)胞生長(zhǎng)、 分化以及抗腫瘤等多種作用。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，不同添加量的NCCE均能促進(jìn)雞脾臟 組織細(xì)胞中IFN-γmRNA的表達(dá)。
[0065] IL-2、IL-4及IFN-γ的分泌水平與組織細(xì)胞中IL-2、IL-4及IFN-γmRNA密切相 關(guān)，提示IL-2、IL-4及IFN-γ表達(dá)的調(diào)控可能與mRNA的轉(zhuǎn)錄水平有密切關(guān)系。本試驗(yàn)選 用雞看家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，因?yàn)樗皇芡饨绛h(huán)境因素的影響，在雞各組織細(xì)胞中 都能恒定的表達(dá)。對(duì)目標(biāo)基因IL-2、IL-4、IFN-y及內(nèi)參基因GAPDH分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定 量PCR，使用2-ΛΛCT法測(cè)定三個(gè)目標(biāo)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，日糧中添加 不同劑量的NCCE能夠誘導(dǎo)AA肉仔雞脾臟組織細(xì)胞的IL-2、IL-4及IFN-γmRNA的表達(dá)， 提高細(xì)胞免疫水平，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。
[0066] 綜上所述表明：本發(fā)明根據(jù)植物化學(xué)，從植物中提取有效成分，明確有效成分作用 機(jī)理，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，穩(wěn)定性良好、無(wú)毒副作用、功能明顯，具有安全性、可靠性、有效性、質(zhì) 量可控性，作為一種新型植物化學(xué)功效原料，可作為保健食原料，也可以作為藥物進(jìn)行深度 開(kāi)發(fā)，具有良好的市場(chǎng)發(fā)展前景和技術(shù)擴(kuò)展空間。
[0067] 以上所述，僅是本發(fā)明較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明的技術(shù)范圍作任何限制，故 凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何細(xì)微修改、等同變化與修飾，均仍屬 于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從不結(jié)球白菜提取天然活性物質(zhì)的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 凍干粉碎：將不結(jié)球白菜凈化后用聚乙烯膜真空包裝，迅速用液氮冷凍，真空冷凍 干燥后粉碎； (2) 提?。阂砸掖妓芤簽槿軇?，將凍干粉碎的不結(jié)球白菜用50-95v/v%乙醇水溶液 提取30-120分鐘，得提取液，提取液蒸發(fā)濃縮得到粗提物； (3) 萃?。簩⒋痔嵛镉谜麴s水溶解得到水懸液，將其用極性溶劑萃取得萃取液，該極性 溶劑包含但不限于石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇； (4) 濃縮：萃取液經(jīng)蒸發(fā)濃縮得到濃縮提取物； (5) 低壓冷凍干燥：濃縮提取物在< 0.OIMPa真空度下進(jìn)行脫水干燥，即得粉狀天然活 性物質(zhì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從不結(jié)球白菜提取天然活性物質(zhì)的方法，其特征在于： 步驟（1)中粉碎細(xì)度為50-250目。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從不結(jié)球白菜提取天然活性物質(zhì)的方法，其特征在于： 步驟（2)可以用下列方式進(jìn)行提?。?在超聲功率為100~500W，時(shí)間為40~90min，料液比1:2-20、乙醇濃度65-75%條件 下提取，抽濾，濾渣重復(fù)以上操作一次，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，得到不結(jié)球白 菜粗提物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從不結(jié)球白菜提取天然活性物質(zhì)的方法，其特征在于： 步驟（3)將不結(jié)球白菜粗提物用蒸餾水超聲溶解15-60min，得到水懸液，將其用0. 5-2倍 乙酸乙酯萃取2-5次，合并萃取液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從不結(jié)球白菜提取天然活性物質(zhì)的方法，其特征在于： 步驟（4)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方式濃縮。6. 權(quán)利要求1所述的活性物質(zhì)以100~700mg/kg的量添加在肉雞的基礎(chǔ)日糧中，用于 提高飼養(yǎng)動(dòng)物產(chǎn)肉性能、免疫功能、抗氧化水平以及改善肉雞細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的用 途。
【專利摘要】本發(fā)明一種從不結(jié)球白菜提取天然活性物質(zhì)的方法及其應(yīng)用，所述天然活性物質(zhì)由以下方法制得:不結(jié)球白菜采收后用聚乙烯膜真空包裝，迅速用液氮冷凍，真空冷凍干燥后粉碎，粉碎物在超聲下用65～75％的乙醇水溶液提取，提取液濃縮至近干，得到不結(jié)球白菜粗提物；將該不結(jié)球白菜粗提物用蒸餾水超聲溶解得到水懸液，用乙酸乙酯萃取，萃取液蒸發(fā)濃縮后經(jīng)冷凍干燥后得粉狀天然活性物質(zhì)，主要組份為黃酮和多酚類等生物活性物質(zhì)；由本發(fā)明制得的目標(biāo)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的生物活性功能，應(yīng)用后可顯著提高細(xì)胞免疫水平，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，顯著提高飼養(yǎng)動(dòng)物的產(chǎn)肉能力、免疫功能和抗氧化水平，改善細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平。
【IPC分類】A61P37/04, A61P39/06, A61K36/31
【公開(kāi)號(hào)】CN105362326
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510595889
【發(fā)明人】馬景蕃, 洪燕萍, 陳小紅
【申請(qǐng)人】龍巖學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年9月18日