一種從不結球白菜提取天然活性物質的方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從植物材料提取天然活性物質的方法及其應用，尤其涉及一種從 不結球白菜提取天然活性物質的方法及該提取物的多種應用。
【背景技術】
[0002] 不結球白菜（Brassicacampestrisssp.chinensisMakino)是長江中下游地區(qū) 主栽蔬菜品種之一，中醫(yī)認為不結球白菜微寒味甘，有養(yǎng)胃生津、除煩解渴、利尿通便、清 熱解毒之功效。民間素有用帶根不結球白菜120克，佐以生姜、蔥白各10克，煨湯服之，防治 感冒與咳嗽。近20多年來，國內外學者從不結球白菜中分離得到一系列復雜的化學成分， 其中相當一部分具有生理活性。在不久前，日本科學家發(fā)現(xiàn)，不結球白菜提取物抗氧化"銹 蝕"的效果非常好，尤以未完全成熟，葉形舒展的嫩株抗氧化效果尤佳。美國國立癌癥研究 所發(fā)表的防癌食品排行榜中，將不結球白菜排在大蒜的后面，名列第二。最新研究還發(fā)現(xiàn)， 不結球白菜提取物能提升血中"好"雌激素代謝物一2羥雌酮的水平，對預防乳腺癌有益。 這說明不結球白菜不但可作為一種較好的綠色食品，同時又具有較好的醫(yī)學保健作用、藥 用價值和經(jīng)濟價值。
[0003] 用DPPH·自由基分析法，即通過檢測樣品對自由基DPPH·的清除能力來評價該物 質的抗氧化能力的方法去檢測不結球白菜提取物的抗氧化性。其抗氧化能力用抑制率表 示，抑制率越大，抗氧化能力越強。類似的方法還有· 0H、02- ·、ABTS+ ·抗氧化活性分析 法。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種從不結球白菜提取天然活性物質的方法及其應用，該 天然活性物質天然無毒安全，具有較強的生物活性功能，應用后可顯著提高細胞免疫水平， 增強機體免疫功能。
[0005] 本發(fā)明一種從不結球白菜提取天然活性物質的方法，具體提取方法如下： (1) 凍干粉碎：將不結球白菜凈化后用聚乙烯膜真空包裝，迅速用液氮冷凍，真空冷凍 干燥后粉碎； (2) 提?。阂砸掖妓芤簽槿軇瑢龈煞鬯榈牟唤Y球白菜用50-95v/v%乙醇水溶液 提取30-120分鐘，得提取液，提取液蒸發(fā)濃縮得到粗提物； (3) 萃?。簩⒋痔嵛镉谜麴s水溶解得到水懸液，將其用極性溶劑萃取得萃取液，該極性 溶劑包含但不限于石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇； (4) 濃縮：萃取液經(jīng)蒸發(fā)濃縮得到濃縮提取物； (5) 低壓冷凍干燥：濃縮提取物在< 0.OIMPa真空度下進行脫水干燥，即得粉狀天然活 性物質。
[0006] 所述的步驟（1)中粉碎細度為50-250目。
[0007] 所述的步驟（2)可以用下列方式進行提?。涸诔暪β蕿?00~500W，時間為 40~90min，料液比1:2-20、乙醇濃度65-75%條件下提取，抽濾，濾渣重復以上操作一次，合 并兩次濾液，旋轉蒸發(fā)濃縮至近干，得到不結球白菜粗提物。
[0008] 所述的步驟（3)將不結球白菜粗提物用蒸餾水超聲溶解15-60min，得到水懸液， 將其用〇. 5-2倍乙酸乙酯萃取2-5次，合并萃取液。
[0009] 所述的步驟（4)使用旋轉蒸發(fā)方式濃縮。
[0010] 所述的活性物質以100~700mg/kg的量添加在肉雞的基礎日糧中，用于提高飼養(yǎng) 動物產(chǎn)肉性能、免疫功能、抗氧化水平以及改善肉雞細胞因子mRNA表達水平的用途。
[0011] 本發(fā)明從植物中提取有效成分，明確有效成分作用機理，經(jīng)過試驗驗證，穩(wěn)定性良 好、無毒副作用、功能明顯，具有安全性、可靠性、有效性、質量可控性，作為一種新型植物化 學功效原料，可作為保健食原料，也可以作為藥物進行深度開發(fā)，具有良好的市場發(fā)展前景 和技術擴展空間。
[0012] 本發(fā)明有益效果還包括：1、不結球白菜作為天然活性物質的提取原料來源具有產(chǎn) 量高，生長周期短，便宜易得的優(yōu)點；2、能有效提取不結球白菜中的活性物質，提取物有較 強的抗氧化生物活性功能，應用效果好，可顯著提高細胞免疫水平，增強機體免疫功能；3、 拓展了不結球白菜資源在食品及醫(yī)學等領域的應用，有利于不結球白菜進一步開發(fā)和相關 種植業(yè)的發(fā)展。
[0013]
【附圖說明】
[0014] 圖1A為不同料液比對Trolox濃度的影響； 圖1B為不同超聲時間對Trolox濃度的影響； 圖1C為不同乙醇濃度對Trolox濃度的影響； 圖1D為不同超聲功率對Trolox濃度的影響； 圖2為總RNA的瓊脂糖電泳圖； 圖3A為目標基因IL-2㈧與內參基因GAPDH的擴增效率關系圖； 圖3B為目標基因IL-4(B)與內參基因GAPDH的擴增效率關系圖； 圖3C目標基因IFN-γ(C)與內參基因GAPDH的擴增效率關系圖； 圖4ANCCE對雞脾臟IL-2 (A)mRNA相對表達量的影響關系圖； 圖4BNCCE對雞脾臟IL-4 (B)mRNA相對表達量的影響關系圖； 圖4CNCCE對雞脾臟IFN-γ(C)mRNA相對表達量的影響關系圖； 圖5不結球白菜不同極性部位清除DPPH·的能力示意圖； 圖6不結球白菜不同極性部位清除· 0H的能力示意圖； 圖7不結球白菜不同極性部位清除02- ·的能力示意圖； 圖8不結球白菜不同極性部位清除ABTS+·的能力示意圖。
[0015] 以下結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳述。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1: 不結球白菜用聚乙烯膜真空包裝，迅速用液氮冷凍，真空冷凍干燥后粉碎過100目篩， 在超聲功率317W、超聲時間60min、溫度25-30°C，料液比1:20 (m:V)、乙醇濃度70%的條 件下提取，抽濾，濾渣重復以上操作一次，合并兩次濾液。旋轉蒸發(fā)濃縮至近干，即為不結球 白菜粗提物。將粗提物用蒸餾水超聲溶解35min，得到水懸液，將其用等體積乙酸乙酯萃取 4次，合并萃取液，旋轉蒸發(fā)濃縮后真空冷凍干燥至恒重，即為不結球白菜提取物（NCCE)， 主要組份為黃酮和多酚類等生物活性物質，將其置于4°C冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?br>[0017] 實施例2: 按照上述從不結球白菜提取天然活性物質的方法，不結球白菜用聚乙烯膜真空包裝， 迅速用液氮冷凍，真空冷凍干燥后粉碎過100目篩，在超聲功率317W、超聲時間60min、料 液比1:20 (m:V)、乙醇濃度70%的條件下提取，抽濾，濾渣重復以上操作一次，合并兩次濾 液。旋轉蒸發(fā)濃縮至近干，即為不結球白菜粗提物。將粗提物用蒸餾水超聲溶解35min，得 到水懸液，依次用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次，合并各自的萃 取液并保留最后的水相，依次得到石油醚部、氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部的萃取 物。各部經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥至恒重，置于4°C冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?br>[0018] 以上5部分萃取物分別采用清除DPPH·、· 0H、02- ·、ABTS+ ·自由基能力測定， 不同萃取劑提取物的活性測試結果見圖5至圖8。
[0019] 由圖5至圖8可知，乙酸乙酯萃取物清除自由基的能力最強。
[0020] 實施例3: 1日齡健康AA肉仔雞，采用地面平養(yǎng)，自由采食、飲水，給24h光照，飼喂玉米-豆柏 型基礎日糧，配制參照NRC1994《家禽的營養(yǎng)需要量》，基礎日糧組成及營養(yǎng)水平見表1在 基礎日糧中添加根據(jù)實施例所得500mg/kg的不結球白菜提取物（NCCE)。
[0021] 不結球白菜提取物（NCCE)，主要組份為黃酮和多酚類等生物活性物質，添加植物 黃酮類物質，可顯著提高肉雛雞免疫器官指數(shù)，植物多酚可增加正常小鼠和免疫抑制小鼠 的脾臟和胸腺重量?？梢姴唤Y球白菜活性提取物可以促進免疫器官的發(fā)育，抑制其細胞凋 亡，提高機體抵抗力。
[0022] 發(fā)明人采用響應而分析法（ResponseSurfaceMethod,RSM)法優(yōu)化了不結球白 菜活性物質的提取工藝，以確定各因素及其交互作用對各指標的影響。
[0023] 材料選擇：試驗材料不結球白菜品種"蘇州青"由龍巖學院生物技術課題組提供。 采收后，用聚乙烯膜真空包裝，迅速用液氮冷凍，真空冷凍干燥后粉碎過100目篩。
[0024] 方法：DPPH自由基清除試驗 稱取12. 012mg的Trolox標準品，用蒸餾水定容至200mL。利用超聲波將使Trolox標準品得到充分溶解，得到濃度為240μmol/L的Trolox標準品溶液，加入蒸餾水稀釋后 分別得到濃度為40,80,120,160, 200μmol/L的Trolox標準品溶液。將質量為10mg的 DPPH用入甲醇定容至100mL，將其稀釋后得到濃度為20mg/L的DPPH甲醇溶液。吸取 10μL的Trolox水溶液，加入990μL的DPPH甲醇溶液，用甲醇定容至4mL，混合均勻，暗 處避光反應30min，在517nm處測吸光光度值（ABS)。根據(jù)試驗結果，使用EXCEL軟件的 線性擬合功能繪制DPPH自由基清除法Trolox標準曲線，并得出線性回歸方程。
[0025] 步驟一、提取不結球白菜抗氧化活性物質的單因素試驗 最佳提取料液比研究 準確稱取5.0g不結球白菜粉，在乙醇濃度70%，功率400w，提取時間40min的條件 下，分別考察1:10、1:15、1:20、1:25、1:30及1:35(m:V)的料液比對不結球白菜抗氧化活 性物質提取的影響。
[0026] 最佳超聲波處理時間研究 準確稱取5.0g不結球白菜粉，乙醇濃度70%，功率400w，料液比1: 20,考察30min、 40min、50min、60min、70min及80min的不同超聲時間對不結球白菜抗氧化活性物質 提取的影響。
[0027] 1. 2. 2. 3最佳提取乙醇濃度研究 準確稱取5.0g不結球白菜粉，功率400w，料液比1:20,超聲時間60min，考察40%、 50%、60%、70%、80%及90%的乙醇濃