占⑶4+T淋巴細胞的比例，每組各取5只小 ￡3邱U
[0049] 6. 1小鼠脾臟單細胞懸液的制備
[0050] (1)小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，浸入75%的酒精中10分鐘，小鼠取右 側(cè)臥位，逐層剖開腹腔，充分暴露脾臟，無菌條件下取出脾臟放入含有1%BSA的無菌培養(yǎng) 皿中，小心去除筋膜與脂肪組織，并用剪刀將脾臟分割成小碎塊（1-2_);
[0051] (2)無菌50ml離心管上放置一無菌的40μπι無菌尼龍網(wǎng)，將分割完成的脾臟組織 置入其上，無菌滴管滴入1%BSA;
[0052] (3)用5ml的注射器內(nèi)栓輕輕研磨脾臟，同時加入適量1 %BSA沖洗，至研磨充分， 共約10ml脾臟單細胞懸液；
[0053] (4)將離心管置于離心機中，調(diào)整離心條件：25°C，1200rpm，離心5min，輕輕棄去 上清；
[0054] (5)加入5_6ml紅細胞裂解液并緩慢搖動使細胞重懸；
[0055] (6)室內(nèi)靜置4-5min，待紅細胞裂解完成，加入10ml無菌PBS終止細胞裂解；
[0056] (7)加入 10ml1 %BSA后離心，25°C，1200rpm，離心lOmin，棄上清，加入 10ml1 % BSA，輕晃離心管，重懸細胞；
[0057] (8)靜置 2-3min后，25°C，1200rpm，離心lOmin，棄上清，加入 700μ1 1%BSA，重 懸細胞；
[0058] (9)取10μ1單細胞懸液，行細胞計數(shù)；
[0059] (10)根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果調(diào)整細胞密度為5X106/ml。
[0060] 6. 2小鼠脾臟Thl和Thl7細胞的流式檢測
[0061] 6. 2. 1刺激Thl和Thl7細胞因子分泌
[0062] (1)取無菌24孔板，每孔加100μ1上述脾臟單細胞懸液，900μ1配好的培養(yǎng)基， 0·5μ1lmg/mlΡΜΑ(終濃度為 500ng/ml)，0.5yllmg/ml離子霉素（終濃度為 500ng/ml)， 1μ1BFA(1μg/ml)，輕輕混勾，37°C無菌溫箱培養(yǎng)4h。
[0063] (2)取出24孔板，輕輕混勻孔內(nèi)液體，吸出至相應(yīng)流式管中。
[0064] (3)將裝有細胞懸液的流式管置于離心機中離心：25°C，2000rpm，3min，棄上清。
[0065] (4)加 2mlPBS重懸細胞，25°C離心 2〇OOrpm，3min，棄上清。
[0066] 6. 2. 2Thl和Thl7細胞胞外染色
[0067] (1)流式管標(biāo)號，加入小鼠FITC-⑶4抗體，輕輕敲打混勻，室溫避光孵育15min;
[0068] (2)加入lmlPBS混勾，2000rpm，25°C，離心 5min，棄上清；
[0069] (3)再次加入lmlPBS重懸，2000rpm，25°C，離心 5min，棄上清。
[0070] 6. 2. 3胞內(nèi)染色
[0071] (1)各流式管中加入500μ1破膜劑，室溫避光破膜20min;
[0072] (2) 25°C，350g，離心 5min，棄上清；
[0073] (3)各流式管中加入1ml破膜buffer(1X)，重懸細胞，25°C，350g，離心5min，棄上 清；
[0074] (4)用于Thl細胞染色的流式管中加入1μ1小鼠PE-IL-17抗體，用于Thl7細胞 染色的流式管中加入1μ1小鼠PE-IFN-γ抗體，輕輕敲打混勻，室溫避光孵育20min;
[0075] (5)加入lmlPBS溶液，重懸細胞，置于離心機中離心，條件：25°C，350g，離心 5min，棄上清；
[0076] (6)重復(fù)上一步驟；
[0077] (7)加入500μ14%甲醛溶液固定細胞，4°C避光保存過夜；
[0078] (8) 25°C，350g，離心 5min，棄上清；
[0079] (9)加入500μ1鞘液重懸細胞，濾網(wǎng)過濾，上機檢測分析。
[0080] 7實驗結(jié)果
[0081] 7. 1甲氰咪胍干預(yù)下的小鼠眼底表現(xiàn)
[0082] 自小鼠免疫后的第12天起連續(xù)觀察對照組及甲氰咪胍組所有小鼠眼底的發(fā)病情 況，并于免疫后第21天對小鼠進行眼底圖片采集。圖像顯示對照組小鼠有明顯的眼結(jié)膜炎 性滲出、血管炎及視乳頭水腫（圖1Α)，而甲氰咪胍組小鼠眼底未發(fā)現(xiàn)明顯滲出、水腫或炎 性病變（圖1Β)。甲氰咪胍組小鼠較對照組小鼠眼底炎癥表現(xiàn)輕。
[0083] 甲氰咪胍組小鼠較對照組小鼠眼底炎癥表現(xiàn)輕。免疫后第21天對小鼠進行眼底 圖像采集。圖1A顯示，對照組小鼠眼底表現(xiàn)，可見明顯的眼結(jié)膜炎性滲出，眼結(jié)膜血管炎， 視乳頭水腫；圖1B顯示甲氰咪胍組小鼠眼底表現(xiàn)，眼結(jié)膜未見明顯滲出，血管走形正常，視 乳頭界限清楚
[0084] 7. 2甲氰咪胍干預(yù)下的臨床評分
[0085] 依據(jù)患病小鼠臨床評分標(biāo)準于免疫后第21天對兩組小鼠眼底情況進行臨床評 分。如圖2所示，甲氰咪胍組與對照組相比，臨床評分顯著降低。
[0086] 7. 3甲氰咪胍干預(yù)下的組織病理學(xué)評分
[0087] 依據(jù)患病模型臨床評分標(biāo)準對小鼠眼結(jié)膜HE染色切片進行組織病理學(xué)評分。如 圖3所示，甲氰咪胍組與對照組相比，組織病理學(xué)評分顯著降低。
[0088] 7· 4EB血管灌注造影眼結(jié)膜鋪片結(jié)果
[0089] 對對照組和甲氰咪胍組小鼠分別進行眼結(jié)膜鋪片，以評價甲氰咪胍對眼結(jié)膜血管 通透性及BRB完整性的作用。結(jié)果顯示：對照組可見EB廣泛而彌撒地自眼結(jié)膜血管向外滲 出（圖4A)，而甲氰咪胍組小鼠的眼結(jié)膜血管走形正常，未見明顯染料自血管滲出（圖4B)。
[0090] 如圖4A所示，對照組小鼠經(jīng)伊文思藍血管灌注循環(huán)2小時后，大量熒光染料自眼 結(jié)膜血管向外滲出。如圖4B所示，甲氰咪胍組小鼠未見明顯伊文思藍染料外滲。
[0091] 7. 5流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟輔助T淋巴細胞亞群結(jié)果
[0092] 流式細胞術(shù)是一種可以從功能水平上對細胞進行定量分析的新興檢測手段。采用 流式細胞術(shù)對對照組和甲氰咪胍組小鼠脾臟輔助T淋巴細胞亞群進行定量分析，探討甲氰 咪胍對患病小鼠脾臟輔助T淋巴細胞亞群的影響。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示甲氰咪胍組小鼠 Thl細胞、Thl7細胞占單個核細胞群比例較對照組小鼠降低（圖5A、B)。
[0093] 如圖5所示，A.流式細胞術(shù)檢測⑶4、IFN-γ標(biāo)記小鼠脾臟Thl細胞群，甲氰咪胍 組較對照組顯著降低。B.流式細胞術(shù)檢測⑶4、IL-17標(biāo)記小鼠脾臟Thl7細胞群，甲氰咪 胍組較對照組顯著降低。
[0094] 綜上所述，可以證明口服甲氰咪胍對自身免疫性結(jié)膜炎具有治療作用，其治療作 用是通過調(diào)節(jié)輔助T淋巴細胞亞群的不平衡，維持血眼結(jié)膜屏障的完整性，抑制眼內(nèi)巨噬 細胞浸潤實現(xiàn)的。
【主權(quán)項】
1. 式（I)化合物用于制備自身免疫性結(jié)膜炎治療藥物的應(yīng)用，2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是W降低Thl淋己細胞含量為藥 理作用的藥物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是W降低化17淋己細胞含量為藥 理作用的藥物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是W抑制Thl淋己細胞分泌 IFN-T為藥理作用的藥物。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是W抑制化17淋己細胞分泌 IL-17A為藥理作用的藥物。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是W抑制眼結(jié)膜巨隧細胞浸潤為 藥理作用的藥物。
【專利摘要】本發(fā)明提供了甲氰咪胍在制備自身免疫性結(jié)膜炎治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明創(chuàng)新性的發(fā)現(xiàn)甲氰咪胍可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)效應(yīng)，從而用于治療相關(guān)病理損傷。具體而言，可下調(diào)Th1細胞亞群、Th17細胞亞群比例，維持血眼結(jié)膜屏障完整性，抑制巨噬細胞浸潤，抑制眼內(nèi)炎癥反應(yīng)?；诩浊柽潆业囊陨闲滦再|(zhì)，本發(fā)明確定了利用其治療結(jié)膜炎的新用途，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，甲氰咪胍對自身免疫性結(jié)膜炎的治療起效快、療效確切，且未發(fā)現(xiàn)副作用，具有突出的推廣前景。
【IPC分類】A61K31/4164, A61P37/02, A61P27/02
【公開號】CN105362265
【申請?zhí)枴緾N201510868349
【發(fā)明人】孫維星
【申請人】孫維星
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年11月25日