測波 長為246nm，理論塔板數(shù)按補(bǔ)骨脂酚計(jì)算應(yīng)不低于3000,液相waters 1525,色譜柱（0DS， 5 μ m，4. 6_X 150mm)檢測波長246nm。柱溫25°C，流速0. 8mL/min。梯度洗脫條件見表1 :
[0041] 表1梯度洗脫條件
[0043] 樣品溶液制備：分別精密稱取補(bǔ)骨脂素，異補(bǔ)骨脂素與補(bǔ)骨脂酚標(biāo)準(zhǔn)品，以及 B-l，B-2, B-3和B-4實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
[0044] 表2補(bǔ)骨脂酚有效成分含量測定結(jié)果
[0046] 注：補(bǔ)骨脂酚收率指代補(bǔ)骨脂酚：藥材（w/w)
[0047] 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：由表2中的數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的補(bǔ)骨脂提取物補(bǔ)骨脂重量含量為80% 以上，不含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素。
[0048] 實(shí)施例六：補(bǔ)骨脂提取物或含其組合物治療骨質(zhì)疏松作用
[0049] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：AB系斑馬魚，以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行。每實(shí)驗(yàn)組為30尾，年齡 為受精后3天。
[0050] 實(shí)驗(yàn)方法：對(duì)骨質(zhì)疏松癥斑馬魚骨密度的影響：選取發(fā)育至3dpf時(shí)的斑馬魚用 10 μ g/ml潑尼松龍?zhí)幚?dpf斑馬魚6d(至9dpf)，建立斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，測定待測樣 品最大非致死濃度（MNLC)后，依據(jù)濃度致死曲線，選取3個(gè)濃度進(jìn)行檢測。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均 處理30尾已建模斑馬魚。樣品與潑尼松龍共同處理6d后，用0. 2%鈣黃綠素對(duì)斑馬魚進(jìn)行 染色；每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚，在熒光顯微鏡下觀察、拍照并保存；用圖像處理軟件進(jìn)行 圖像分析，計(jì)算骨熒光強(qiáng)度（S)。
[0051] 空白組：養(yǎng)魚用水處理組；陽性對(duì)照組：依替膦酸二鈉；陰性對(duì)照組：造模后的斑 馬魚。
[0052] 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以土SE表示；樣品的藥效計(jì)算公式如下：
[0054] 根據(jù)藥效百分率繪制劑量效應(yīng)曲線；
[0055] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用方差分析和Dunnett' s T-險(xiǎn)驗(yàn)，p < 0. 05為差異性顯著。其實(shí) 驗(yàn)結(jié)果如表3
[0056] 表3樣品增加骨質(zhì)疏松癥斑馬魚骨密度定量結(jié)果（η = 12)
[0059]注：1.與模型組相比，* * ρ <0· 01 * * * ρ <0· 001 ;
[0060] 2.組合物為按本發(fā)明方法所得補(bǔ)骨脂提取物：大豆異黃酮（> 50% )= I : I (w/ w) ·
[0061] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組斑馬魚骨熒光強(qiáng)度與空白組比較p < 0. 001，表明模型建立 成功；陽性對(duì)照藥依替膦酸二鈉骨熒光強(qiáng)度與模型組比較P < 0. 001，說明依替膦酸二鈉能 夠明顯增加斑馬魚骨質(zhì)疏松癥的骨密度。按本發(fā)明方法所得補(bǔ)骨脂提取物（補(bǔ)骨脂酚含量 >80%)對(duì)斑馬魚骨質(zhì)疏松癥的骨密度有明顯增加作用。三個(gè)濃度（0.05、0. 17和0.5 μ g/ mL)骨熒光強(qiáng)度分別為76467、92378和120521，其治療效率分別為66%、94%和145%，各 組與模型組相比P < 0. 001。大豆異黃酮（> 50% )對(duì)斑馬魚骨質(zhì)疏松癥的骨密度有的 明顯增加作用。三個(gè)濃度（0.25、0.83和2.5以8/1^)骨熒光強(qiáng)度分別為69988、88737和 94156,其治療效率分別為54%、88%和98%，各組與模型組相比p < 0. 01&p < 0. 001。組 合物對(duì)斑馬魚骨質(zhì)疏松癥的骨密度有明顯增加作用。三個(gè)濃度（0. 05、0. 17和0. 5 μ g/mL) 骨熒光強(qiáng)度分別為69078、73332和88095,其治療效率分別為47%、55%和81%，各組與模 型組相比P < 0.001。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，按本發(fā)明方法所得補(bǔ)骨脂提取物或含它的組合 物（大豆異黃酮、淫羊藿提取物、茶葉提取物等）均能明顯的增加骨質(zhì)疏松模型的骨密度， 具有開發(fā)為治療骨質(zhì)疏松巨大潛質(zhì)。
[0062] 對(duì)正常斑馬魚骨骼發(fā)育鈣化的影響：
[0063] 斑馬魚品系：野生型AB品系；測定待測樣品最大非致死濃度（MNLC)后，依據(jù)濃度 致死曲線，選取3個(gè)濃度進(jìn)行檢測。用樣品處理3dpf斑馬魚6d至9dpf ;
[0064] 空白組：養(yǎng)魚用水處理組；陽性對(duì)照組：維生素 D3 (0. 1 μ g/mL);每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均處 理30尾正常斑馬魚；樣品處理結(jié)束后，用0. 2%鈣黃綠素對(duì)斑馬魚進(jìn)行染色；每組隨機(jī)選取 10尾斑馬魚，在熒光顯微鏡下觀察、拍照并保存；用圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算斑馬 魚脊椎骨的數(shù)目（N)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以土SE表示；
[0065] 樣品的藥效計(jì)算公式如下：
[0067] 根據(jù)藥效百分率繪制劑量效應(yīng)曲線；
[0068] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用方差分析和Dunnett' s T-檢驗(yàn)，p < 0. 05為差異性顯著；實(shí)驗(yàn)結(jié) 果見表4 :
[0069] 表4樣品促進(jìn)正常斑馬魚骨骼發(fā)育鈣化定量結(jié)果（η = 15)
[0070]
[0071] 注：1·與空白組相比，* p < 0· 05 * * p < 0· 01 * * * p < 0· 001 ;
[0072] 2.組合物為按本發(fā)明方法所得補(bǔ)骨脂提取物：大豆異黃酮（> 50% )= I : I (w/ w) 〇
[0073] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：陽性對(duì)照藥維生素 D3的脊椎骨數(shù)目平均值與空白組比較ρ < 0. 001，說明維生素 D3對(duì)正常斑馬魚的骨骼發(fā)育鈣化具有明顯的促進(jìn)作用。按本發(fā)明方 法所得補(bǔ)骨脂提取物對(duì)正常斑馬魚骨骼發(fā)育鈣化有明顯的促進(jìn)作用。三個(gè)濃度（0.05、0. 17 和0. 5 μ g/mL)脊椎骨數(shù)目平均值分別為3. 9、4. 9和4. 6,其鈣化促進(jìn)率分別為12%、41 % 和 30%。與空白組相比，0.05yg/mL組ρ > 0.05 ;0. 17yg/mL 組ρ < 0.01 ;0.5yg/mL 組 P < 0. 05。大豆異黃酮（> 50% )對(duì)正常斑馬魚骨骼發(fā)育鈣化有明顯的促進(jìn)作用。三個(gè)濃 度（0. 25、0. 83和2. 5 μ g/mL)脊椎骨數(shù)目平均值分別為3. 7、4. 7和4. 3,其鈣化促進(jìn)率分別 為 6 %、34 % 和 23 %。與空白組相比，0· 25 μ g/mL 和 2. 5 μ g/mL 組 ρ > 0· 05 ;0· 83 μ g/mL 組 ρ < 0. 01。組合物對(duì)正常斑馬魚骨骼發(fā)育鈣化有明顯的促進(jìn)作用。三個(gè)濃度（0. 05、0. 17 和0. 5 μ g/mL)脊椎骨數(shù)目平均值分別為3. 8、4. 2和4. 7,其鈣化促進(jìn)率分別為12%、23 % 和 37%。與空白組相比，0· 05 μ g/mL 和 0· 17 μ g/mL 組 ρ >0· 05 ;0· 5 μ g/mL 組 ρ <0· 01。 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，按本發(fā)明方法所得補(bǔ)骨脂提取物或含它的組合物（大豆異黃酮、淫羊 藿提取物、茶葉提取物等）均能明顯的促進(jìn)正常骨骼發(fā)育鈣化，具有開發(fā)為預(yù)防和治療骨 質(zhì)疏松巨大潛質(zhì)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種補(bǔ)骨脂提取物，其特征在于：取補(bǔ)骨脂全草的鮮品或干品用醇分次提取，堿水 解，大孔樹脂純化，濃縮得到提取物，所述提取物不含補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素，補(bǔ)骨脂酚重 量含量大于80%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的補(bǔ)骨脂提取物，其特征在于包括下述步驟： (1) 補(bǔ)骨脂全草的鮮品或干品經(jīng)體積分?jǐn)?shù)80-85體積％的醇浸泡過夜，回流提取2-3 次，每次1-2小時(shí)； (2) 將步驟⑴濾液中的醇除去，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2-2 %的堿液，室溫下水解 3〇-80min； (3) 經(jīng)步驟（2)處理的水解樣品經(jīng)大孔樹脂柱洗脫，去離子水、體積分?jǐn)?shù)30-60%的醇、 體積分?jǐn)?shù)95 %的醇洗脫，濃縮干燥得到提取物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的補(bǔ)骨脂提取物，其特征在于所述醇選自甲醇、乙醇、異丙 醇或正丁醇中的一種或幾種；所述堿為氫氧化鈉，碳酸鈉或氫氧化鈣中的一種或幾種。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的補(bǔ)骨脂提取物，其特征在于所述大孔樹脂選自D101、 AB-8、UniPS30 和UniPS50 樹脂中的一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的補(bǔ)骨脂提取物，其特征在于所述補(bǔ)骨脂選用地上部分，所述 地上部分選自補(bǔ)骨脂的莖、葉、果實(shí)、花和/或種子或者它們的混合物。6. 權(quán)利要求1所述的補(bǔ)骨脂提取物的制備方法，其特征在于包括下述步驟：取補(bǔ)骨脂 全草的鮮品或干品用醇分次提取，堿水解，大孔樹脂純化，濃縮得到提取物，所述提取物不 含補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素，補(bǔ)骨脂酚重量含量大于80%。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于包括下述步驟： (1) 補(bǔ)骨脂全草的鮮品或干品經(jīng)體積分?jǐn)?shù)80-85 %的醇浸泡過夜，回流提取2-3次，每 次1-2小時(shí)； (2) 將步驟⑴濾液中的醇除去，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2-2 %的堿液，室溫下水解 3〇-80min； (3) 經(jīng)步驟（2)處理的水解樣品經(jīng)大孔樹脂柱洗脫，去離子水、體積分?jǐn)?shù)30-60%的醇、 體積分?jǐn)?shù)95 %的醇洗脫，濃縮干燥得到提取物。8. -種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-5之一的提取物和可藥用輔料。9. 根據(jù)權(quán)利要求8的藥物組合物，其是片劑、分散片、膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、顆粒 劑、注射劑、粉針劑、凍干粉針劑、微丸劑、滴丸劑、糖漿劑、散劑、浸膏劑、煎膏劑、口服液體 制劑及其他藥學(xué)上可以接受的劑型。10. 權(quán)利要求8或9的藥物組合物在制備增加骨質(zhì)疏松癥的骨密度，用于預(yù)防和治療骨 質(zhì)疏松的藥物或保健品方面的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種補(bǔ)骨脂提取物，其不含補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素，同時(shí)補(bǔ)骨脂酚重量含量在80％以上，并且所述提取物收率在10％以上。所述提取物能顯著增加骨質(zhì)疏松癥的骨密度和促進(jìn)正常骨骼發(fā)育鈣化的作用。
【IPC分類】A61P19/10, A61K36/487, A61K31/05
【公開號(hào)】CN105326897
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510887523
【發(fā)明人】王昭日, 劉明川, 金志強(qiáng), 楊勝杰, 林漢欽, 洪達(dá)
【申請(qǐng)人】杏輝天力（杭州）藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請(qǐng)日】2015年12月7日