眼病的治療的制作方法
【專利說(shuō)明】眼病的治療
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2005年8月23日、申請(qǐng)?zhí)枮?01210342530. 5、題為"眼病的治 療"的分案申請(qǐng)。其中申請(qǐng)?zhí)枮?01210342530. 5的發(fā)明申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00580036349.X 的分案申請(qǐng)。本申請(qǐng)是依據(jù)專利局對(duì)申請(qǐng)?zhí)枮?01210342530. 5的發(fā)明申請(qǐng)發(fā)出的駁回決 定中指出的單一性問(wèn)題所作出的分案申請(qǐng)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于眼病治療的方法和組合物；特別然而并非專門(mén)涉及青光眼的治 療。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及RNAi技術(shù)的使用以下調(diào)眼房水（aqueousformation) 形成基因和眼房水流出（aqueousoutflow)基因。也提供了治療眼病的方法和組合物。
[0003] 發(fā)明背景
[0004]RNAi作為下調(diào)基因表達(dá)的工具
[0005] 通過(guò)同源重組的基因?qū)ぐ型ǔＳ糜诖_定哺乳動(dòng)物中的基因功能，但是這是消耗成 本和時(shí)間的方法。備選地，在用核酶或反義技術(shù)的mRNA抑制以后可以確定許多基因的功 能。雖然在有些情況中是成功的，但是這些技術(shù)難以普遍應(yīng)用。siRNA-定向的"擊倒"的出 現(xiàn)在體細(xì)胞遺傳學(xué)中激起了革命，允許哺乳動(dòng)物中的基因功能的廉價(jià)并快速的分析。
[0006] 建立在mRNA水平敲除基因表達(dá)的方便并可靠的方法是過(guò)去15年在分子生物學(xué) 中周期性的題目。在產(chǎn)生細(xì)胞或生物功能損失的努力中，已經(jīng)試驗(yàn)了多種分子，所述分子 包括，例如，反義序列、核酶、和嵌合寡核苷酸，但是這樣分子的設(shè)計(jì)是基于反復(fù)試驗(yàn)，取決 于目標(biāo)基因的性質(zhì)。而且，難以預(yù)知期望的效果，并且經(jīng)常僅實(shí)現(xiàn)弱抑制（BraaschCorey， 2002)〇
[0007] 在1990年代初該現(xiàn)象在植物中發(fā)現(xiàn)以后，1998年AndyFire和CraigMeilo首次 用線蟲(chóng)（Caenorhabditiselegans)蟲(chóng)表明dsRNA(雙鏈RNA)可以以非常有效的方式特異 并選擇性抑制基因表達(dá)（Fire等，1998)。在他們的實(shí)驗(yàn)中，第一條鏈（稱為有義RNA)的序 列與目標(biāo)信使RNA(mRNA)的相應(yīng)區(qū)域的序列符合。第二條鏈（反義RNA)對(duì)于該mRNA是互 補(bǔ)的。得到的dsRNA結(jié)果是遠(yuǎn)比相應(yīng)的單鏈RNA分子（特別是，反義RNA)更有效（數(shù)個(gè)數(shù) 量級(jí)）。Fire等，1998對(duì)RNA干涉命名為現(xiàn)象RNAi。這個(gè)有效的基因沉默機(jī)理已經(jīng)顯示在 大多數(shù)系統(tǒng)發(fā)育的門(mén)之中的數(shù)個(gè)種類中起作用。
[0008] 當(dāng)叫作DICER的酶遇到dsRNA，并且將其切割成叫作小干擾RNAs或siRNAs的片 段時(shí)，RNAi開(kāi)始。這種蛋白屬于RNaseIII核酸酶家族。當(dāng)?shù)鞍讖?fù)合物聚集這些RNA殘余 物，并且將它們的密碼用作尋找和破壞細(xì)胞中具有匹配序列的任何RNAs諸如目標(biāo)mRNA的 向?qū)ВňC述參見(jiàn)Bosher&Labouesse，2〇00)〇
[0009]RNAi現(xiàn)象（Akashi等，2001)可以總結(jié)如下：
[0010] ?步驟1 :dsRNA識(shí)別和掃描過(guò)程。
[0011] ?步驟2:通過(guò)RNAseIII活性分解dsRNA，并且產(chǎn)生siRNAs。
[0012] ?步驟3 :siRNAs和RISC復(fù)合體中締合因子的締合。
[0013] ?步驟4:識(shí)別互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA。
[0014] ?步驟5:在與siRNA互補(bǔ)區(qū)域中心分解目標(biāo)mRNA。
[0015] ?步驟6:降解目標(biāo)mRNA，并且再生RISC復(fù)合體。
[0016] 在將RNAi現(xiàn)象用作基因擊倒技術(shù)的嘗試中，很快意識(shí)到，哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)發(fā)展 了針對(duì)病毒感染的各種保護(hù)現(xiàn)象，這些保護(hù)線性可以妨礙這種方法的應(yīng)用。實(shí)際上，極低水 平的病毒dsRNA的存在引發(fā)了干擾素應(yīng)答，這導(dǎo)致翻譯的全面非特異性抑制，其又引發(fā)了 程序性細(xì)胞死亡（Williams，1997,Gil&Esteban，2000)〇
[0017] 在2000年，使用dsRNA的第一次嘗試導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞和早期胚胎中的3種基因 的特異性抑制（MmGFP受控于延伸因子la、E-f丐黏著蛋白和c-mos)。翻譯被抑制，因此，當(dāng) 所述胚胎繼續(xù)發(fā)育時(shí)，沒(méi)有觀察到PKR應(yīng)答（Wianny&Zernicka-Goetz，2000)。一年后，關(guān) 于RibopharmaAG(Kulmbach，Germany)的研究首次證明了RNAi在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能 性。使用短的（20-24堿基對(duì)）dsRNAs-其叫作SIRPLEX?-它們甚至在人細(xì)胞中特異性地關(guān) 閉基因，而不起始急性期反應(yīng)。后來(lái)其它的研究小組進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)（Elbashir等，2001; Caplen等·，2001)進(jìn)一步證明了這些結(jié)果。
[0018] -年后，Paddison等（Paddison等，2002)嘗試應(yīng)用折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小RNAs來(lái) 抑制特異的基因的功能。這一工作受到早先的研究的啟發(fā)，早先的研究表明，線蟲(chóng)中的一些 基因通過(guò)編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAs的RNAs而天然地調(diào)控其它基因。在各種正常的和癌癥的人 和小鼠細(xì)胞系中檢測(cè)，短的發(fā)夾RNAs(shRNAs)能夠如同它們的siRNA副本那樣有效地沉默 基因。此外，shRNA在體內(nèi)展現(xiàn)出比等價(jià)雙鏈體更少的再締合動(dòng)力學(xué)。甚至更重要的，這些 作者制備了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系被加工以合成在細(xì)胞分裂過(guò)程中表現(xiàn)出持續(xù) 長(zhǎng)久的抑制作用的shRNAs(Eurogentec)。最近，表明另一組小RNAs(也包括在21-25nt范 圍內(nèi)）介導(dǎo)基因表達(dá)的下調(diào)。已經(jīng)在線蟲(chóng)中描述了這些叫作小的瞬時(shí)調(diào)控RNAs(stRNAs) 的RNAs，在線蟲(chóng)中，它們調(diào)控發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)時(shí)間。應(yīng)該注意到，盡管有明顯的相似性， 但是stRNAs和siRNAs通過(guò)不同的作用模式發(fā)生（綜述參見(jiàn)Banerjee&Slack，2002)。與 siRNAs相反，22nt長(zhǎng)的stRNAs在翻譯起始后下調(diào)目標(biāo)mRNA的表達(dá)，而不影響mRNA的完整 性。最近的研究表明，最初在線蟲(chóng)類中描述的兩種stRNAs是線蟲(chóng)類中存在的具有上百種其 它微-RNAs(miRNAs)的大家族中的成員（Grosshans&Slack，2002)。
[0019] 科學(xué)家開(kāi)始將RNAi用在一些系統(tǒng)中，包括線蟲(chóng)、果蠅、錐蟲(chóng)和各種其它的無(wú)脊椎 動(dòng)物。并且，應(yīng)用這種方法，一些小組最近描述了在不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系-特別是在Hela 細(xì)胞中-的蛋白生物合成的特異性抑制，這表明RNAi是在體外用于基因沉默的廣泛適用的 方法。基于這些結(jié)果，RNAi已經(jīng)迅速地成為確定（鑒定和分配）基因功能的公認(rèn)工具。并 且，應(yīng)用短dsRNA寡聚核苷酸的RNA干擾將允許解釋只被部分測(cè)序的基因的功能。因此，在 諸如下列各項(xiàng)的研究中，RNAi將是不可避免的：
[0020] ?在真核細(xì)胞中在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制基因表達(dá)。在這一內(nèi)容中，RNAi是快速評(píng)估 基因功能和揭示無(wú)效表型的直接工具。
[0021] ?研發(fā)RNAi技術(shù)用于移植后的胚胎。
[0022] ·RNA干擾主要的經(jīng)濟(jì)顯著性由其作為治療原理的應(yīng)用而建立。由于此，RNAi可 以產(chǎn)生治療人類疾病的基于RNA的藥物。
[0023] 青光眼
[0024] 青光眼是盲的主要原因之一。世界范圍內(nèi)接近15%的盲的情況由青光眼產(chǎn)生。最 普通的類型，原發(fā)性開(kāi)角型青光眼，在超過(guò)40歲的一般人群中具有1/200的發(fā)病率。
[0025] 已經(jīng)將青光眼簡(jiǎn)單限定為由眼內(nèi)壓力（Ι0Ρ)持續(xù)升高超過(guò)其正常生理極限的所 引起視覺(jué)組織破壞的過(guò)程。
[0026] 越來(lái)越清楚，許多形式的青光眼具有遺傳成分，并且更多的當(dāng)前研究集中在識(shí)別 染色體區(qū)域和促進(jìn)青光眼的基因?？赡苁?AG的病因?qū)W是多因素的，由超過(guò)一種基因中的 突變的組合和至今未經(jīng)確認(rèn)的環(huán)境因素產(chǎn)生。關(guān)于青少年和成年人發(fā)作的0AG，已經(jīng)識(shí)別了 數(shù)個(gè)基因座。然而，僅已知一種基因，即染色體Iq21-q31上的GLC1A基因座處的肌纖蛋白/ TIGR(小梁網(wǎng)可誘導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)）基因。在全世界的人種學(xué)多樣的人群中已經(jīng)識(shí)別 了超過(guò)三十種該基因的突變。研究顯示了它僅導(dǎo)致了總0AG的大約5% (見(jiàn)WirtzSamples， 2003，和Khaw等，2004a中的評(píng)論）。
[0027] 發(fā)病機(jī)制
[0028] 雖然升高的水平可能不同，但是大多數(shù)的青光眼的特征在于升高的Ι0Ρ。在那些青 光眼中，其中所述升高最初是低的（即，開(kāi)角型青光眼、黑色素細(xì)胞青光眼）并且一些繼發(fā) 性青光眼、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和視神經(jīng)損害發(fā)展緩慢。在閉角型青光眼中Ι0Ρ的突然高度 升高經(jīng)常致使眼盲，無(wú)疑主要由于在篩板水平的軸漿流中止。
[0029] 在人的研究中，已經(jīng)廣泛地接受，組織壞死在青光眼發(fā)生的視神經(jīng)盤(pán)損害的引發(fā) 或進(jìn)行中起作用。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退化可以是壞死，但是由I0P的升高觸發(fā)細(xì)胞凋亡的 可能性是似乎合理的，并且認(rèn)為一氧化氮和谷氨酸的各自作用在所述疾病的進(jìn)行期間是相 關(guān)的（對(duì)于這個(gè)問(wèn)題上最近的綜述見(jiàn)Osborne等，2003)。
[0030] 治療
[0031] 雖然數(shù)種病因?qū)W涉及青光眼綜合征，但是療法選擇中絕對(duì)的決定因素是虹膜角膜 角之內(nèi)壓力的原發(fā)性和/或誘導(dǎo)的改變量。
[0032] 雖然升高的Ι0Ρ導(dǎo)致青光眼中神經(jīng)元損害的病理生理的機(jī)理是未知的，但是當(dāng)前 的治療包括針對(duì)降低這種壓力的藥物治療或外科手術(shù)。
[0033] 可以利用四種類型的藥物嘗試醫(yī)藥抑制升高的Ι0Ρ:眼房水形成抑制劑（在它們 之中有碳酸酐酶抑制劑、β-腎上腺素能阻滯劑、或α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑）；縮瞳劑 (即擬副交感神經(jīng)藥-膽堿功能藥物_、或抗膽堿酯酶抑制劑）；眼色素層鞏膜流出增強(qiáng)劑； 和高滲試劑（穿過(guò)睫狀體上皮之內(nèi)的血液/水屏蔽產(chǎn)生滲透壓梯度）。將全部四種用于青 光眼的治療中，前三種通常作為急診治療和長(zhǎng)期的控制，而所述高滲試劑作為急診和手術(shù) 前治療是寶貴的。第五類藥物，神經(jīng)保護(hù)試劑，正在開(kāi)始出現(xiàn)為對(duì)于醫(yī)藥治療的重要的可能 添加物。實(shí)際上，N0S和谷氨酸水平在青光眼中升高并且它們涉及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞壞死或 細(xì)胞凋亡的觀察增加了神經(jīng)保護(hù)治療和甚至是神經(jīng)再生的可能性。因而氨基酸激發(fā)拮抗劑 N0S抑制劑、谷氨酸受體拮抗體、細(xì)胞凋亡抑制劑和鈣通道封阻劑是將來(lái)青光眼治療的發(fā)展 中的全部潛在的選擇物。所述鈣通道可以減少微循環(huán)對(duì)視神經(jīng)頭部的削弱效果，同時(shí)在小 梁細(xì)胞水平潛在增加流出的可能性。
[0034] 在參考文獻(xiàn)中給出了多種眼病和它們的治療的評(píng)論，特別是在Bunce(2005)、 Costagliola(1995,2000)、Cullinane(2002)、Sakaguchi(2002)、Shah(2000)、和 Wang(2005)中。
[0035]目前我們的現(xiàn)有治療肯定達(dá)不到目的并且與流出可能性的評(píng)價(jià)、治療的精確監(jiān)控 和外科技術(shù)的復(fù)雜性有關(guān)的實(shí)際困難全部組合而困擾預(yù)后；全部青光眼中占優(yōu)勢(shì)的因素是 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的退化，因而通過(guò)有效的低眼壓的神經(jīng)保護(hù)是我們使用的任何治療的基 本需要（對(duì)于在這個(gè)問(wèn)題上的最近綜述，見(jiàn)Khaw等2004b)。
[0036] 發(fā)明概述
[0037] 在本發(fā)明中發(fā)明人描述了用于治療眼病癥的方法，特征在于改變動(dòng)物包括人中的 Ι0Ρ。特別是，眼病癥可以包括青光眼、葡萄膜炎、和炎癥。所述方法基于基因表達(dá)的下調(diào)， 所述基因涉及眼中的眼房水（aqueous)形成或眼房水流出?？梢酝ㄟ^(guò)雙鏈核酸部分的使用 影響下調(diào)，命名為siNA或小干涉的NA，其定向于干涉多種候選基因的mRNA表達(dá)。盡管修飾 的核酸或類似的化學(xué)合成的實(shí)體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是所述siNA優(yōu)選是siRNA。
[0038] 本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及siNA的局部施用。本發(fā)明的實(shí)施方案也提供了供治 療眼病癥用的藥物組合物。本發(fā)明可以使用在局部眼治療、涉及青光眼發(fā)病機(jī)制的目標(biāo)基 因、還有化學(xué)合成的實(shí)體治療動(dòng)物（包括人）疾病的用途的領(lǐng)域內(nèi)。
[0039] 除青光眼的治療之外，本方法也適于治療所述眼的前房的其它疾病。特別是，所述 方法可以應(yīng)用于疾病的治療，其特征在于改變眼中的眼房水形成或流出?？梢灾委煹牟“Y 實(shí)例包括局部病癥諸如感染或炎癥，和一般病癥諸如葡萄膜炎或全身疾病的表現(xiàn)。另外，本 發(fā)明的某些實(shí)施方案提供用于糖尿病性視網(wǎng)膜病的治療。
[0040] 發(fā)明詳述
[0041] 目標(biāo)基因
[0042] 本發(fā)明中，本發(fā)明發(fā)明人限定一系列目標(biāo)基因，其表達(dá)水平可以改變?chǔ)?Ρ。這些基 因可以屬于涉及眼房水形成的基因的組或者涉及眼房水流出的基因的組。這里是我們的目 標(biāo)基因系列：
[0043] ?碳酸酐酶II、IV和XII
[0044] 魯腎上腺素能藥受體：β1和2以及αIA、IB和ID
[0045] ?乙酰膽堿酯酶
[0046] ?環(huán)加氧酶1和2
[0047] ?腺苷三磷酸酶：α1、α2、α3、β1、β2
[0048] ?內(nèi)皮性白細(xì)胞粘著分子I(ELAM-1)
[0049] ?血管緊張素系統(tǒng)：血管緊張素II、血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶類（ACEI和ACEII)、 血管緊張素II受體（ATR1和ATR2)和腎素
[0050] ·Cochlin
[0051] siNA的設(shè)計(jì)
[0052] 盡管RNAi的機(jī)制尚未已知，但是產(chǎn)生特異性的dsRNA寡核苷酸所需的步驟是清楚 的。已經(jīng)表明，長(zhǎng)度為21-26個(gè)核苷酸的dsRNA雙鏈體鏈在產(chǎn)生RNA干擾中最有效。選擇 基因內(nèi)部正確的同源區(qū)域也是重要的。當(dāng)考慮產(chǎn)生用于RNAi的dsRNA時(shí)，諸如距