專利名稱：眼病的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于眼病治療的方法和組合物；特別然而并非專門涉及青光眼的治療。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及RNAi技術(shù)的使用以下調(diào)眼房水(aqueous formation)形成基因和眼房水流出(aqueous outflow)基因。也提供了治療眼病的方法和組合物。
背景技術(shù)：
RNAi作為下調(diào)基因表達(dá)的工具 通過同源重組的基因?qū)ぐ型ǔＳ糜诖_定哺乳動(dòng)物中的基因功能，但是這是消耗成本和時(shí)間的方法。備選地，在用核酶或反義技術(shù)的mRNA抑制以后可以確定許多基因的功能。雖然在有些情況中是成功的，但是這些技術(shù)難以普遍應(yīng)用。SiRNA-定向的“擊倒”的出現(xiàn)在體細(xì)胞遺傳學(xué)中激起了革命，允許哺乳動(dòng)物中的基因功能的廉價(jià)并快速的分析。建立在mRNA水平敲除基因表達(dá)的方便并可靠的方法是過去15年在分子生物學(xué)中周期性的題目。在產(chǎn)生細(xì)胞或生物功能損失的努力中，已經(jīng)試驗(yàn)了多種分子，所述分子包括，例如，反義序列、核酶、和嵌合寡核苷酸，但是這樣分子的設(shè)計(jì)是基于反復(fù)試驗(yàn)，取決于目標(biāo)基因的性質(zhì)。而且，難以預(yù)知期望的效果，并且經(jīng)常僅實(shí)現(xiàn)弱抑制(Braasch Corey,2002)。在1990年代初該現(xiàn)象在植物中發(fā)現(xiàn)以后，1998年Andy Fire和Craig Meilo首次用線蟲(Caenorhabditis elegans)蟲表明dsRNA(雙鏈RNA)可以以非常有效的方式特異并選擇性抑制基因表達(dá)(Fire等，1998)。在他們的實(shí)驗(yàn)中，第一條鏈(稱為有義RNA)的序列與目標(biāo)信使RNA (mRNA)的相應(yīng)區(qū)域的序列符合。第二條鏈(反義RNA)對(duì)于該mRNA是互補(bǔ)的。得到的dsRNA結(jié)果是遠(yuǎn)比相應(yīng)的單鏈RNA分子(特別是，反義RNA)更有效(數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí))。Fire等，1998對(duì)RNA干涉命名為現(xiàn)象RNAi。這個(gè)有效的基因沉默機(jī)理已經(jīng)顯示在大多數(shù)系統(tǒng)發(fā)育的門之中的數(shù)個(gè)種類中起作用。當(dāng)叫作DICER的酶遇到dsRNA，并且將其切割成叫作小干擾RNAs或siRNAs的片段時(shí),RNAi開始。這種蛋白屬于RNase III核酸酶家族。當(dāng)?shù)鞍讖?fù)合物聚集這些RNA殘余物，并且將它們的密碼用作尋找和破壞細(xì)胞中具有匹配序列的任何RNAs諸如目標(biāo)mRNA的向?qū)?綜述參見 Bosher & Labouesse, 2000)。RNAi現(xiàn)象(Akashi等,2001)可以總結(jié)如下 步驟I :dsRNA識(shí)別和掃描過程。 步驟2 :通過RNAse III活性分解dsRNA，并且產(chǎn)生siRNAs。 步驟3 siRNAs和RISC復(fù)合體中締合因子的締合。 步驟4 :識(shí)別互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA。 步驟5 :在與siRNA互補(bǔ)區(qū)域中心分解目標(biāo)mRNA。 步驟6 :降解目標(biāo)mRNA，并且再生RISC復(fù)合體。
在將RNAi現(xiàn)象用作基因擊倒技術(shù)的嘗試中，很快意識(shí)到，哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)發(fā)展了針對(duì)病毒感染的各種保護(hù)現(xiàn)象，這些保護(hù)線性可以妨礙這種方法的應(yīng)用。實(shí)際上，極低水平的病毒dsRNA的存在引發(fā)了干擾素應(yīng)答，這導(dǎo)致翻譯的全面非特異性抑制，其又引發(fā)了程序性細(xì)胞死亡(Williams, 1997, Gil & Esteban，2000)。在2000年，使用dsRNA的第一次嘗試導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞和早期胚胎中的3種基因的特異性抑制(MmGFP受控于延伸因子la、E-鈣黏著蛋白和c_mos)。翻譯被抑制，因此，當(dāng)所述胚胎繼續(xù)發(fā)育時(shí)，沒有觀察到PKR應(yīng)答(Wianny & Zernicka-Goetz，2000)。一年后，關(guān)于Ribopharma AG (Ku lmbach, Germany)的研究首次證明了 RNAi在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能性。使用短的(20-24堿基對(duì))dsRNAs-其叫作SIRPLEX -它們甚至在人細(xì)胞中特異性地關(guān)閉基因，而不起始急性期反應(yīng)。后來其它的研究小組進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)(Elbashir等，2001 ;Caplen等.，2001)進(jìn)一步證明了這些結(jié)果。一年后，Paddison等(Paddison等,2002)嘗試應(yīng)用折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小RNAs來 抑制特異的基因的功能。這一工作受到早先的研究的啟發(fā)，早先的研究表明，線蟲中的一些基因通過編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAs的RNAs而天然地調(diào)控其它基因。在各種正常的和癌癥的人和小鼠細(xì)胞系中檢測(cè)，短的發(fā)夾RNAs (shRNAs)能夠如同它們的siRNA副本那樣有效地沉默基因。此外，shRNA在體內(nèi)展現(xiàn)出比等價(jià)雙鏈體更少的再締合動(dòng)力學(xué)。甚至更重要的，這些作者制備了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系被加工以合成在細(xì)胞分裂過程中表現(xiàn)出持續(xù)長久的抑制作用的shRNAs (Eurogentec)。最近,表明另一組小RNAs (也包括在21_25nt范圍內(nèi))介導(dǎo)基因表達(dá)的下調(diào)。已經(jīng)在線蟲中描述了這些叫作小的瞬時(shí)調(diào)控RNAs (stRNAs)的RNAs，在線蟲中，它們調(diào)控發(fā)育過程中基因表達(dá)時(shí)間。應(yīng)該注意到，盡管有明顯的相似性，但是stRNAs和siRNAs通過不同的作用模式發(fā)生(綜述參見Baner jee & Slack，2002)。與siRNAs相反，22nt長的stRNAs在翻譯起始后下調(diào)目標(biāo)mRNA的表達(dá)，而不影響mRNA的完整性。最近的研究表明，最初在線蟲類中描述的兩種stRNAs是線蟲類中存在的具有上百種其它微-RNAs (miRNAs)的大家族中的成員(Grosshans & Slack, 2002)?？茖W(xué)家開始將RNAi用在一些系統(tǒng)中，包括線蟲、果蠅、錐蟲和各種其它的無脊椎動(dòng)物。并且，應(yīng)用這種方法，一些小組最近描述了在不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系-特別是在Hela細(xì)胞中-的蛋白生物合成的特異性抑制，這表明RNAi是在體外用于基因沉默的廣泛適用的方法?；谶@些結(jié)果，RNAi已經(jīng)迅速地成為確定(鑒定和分配)基因功能的公認(rèn)工具。并且，應(yīng)用短dsRNA寡聚核苷酸的RNA干擾將允許解釋只被部分測(cè)序的基因的功能。因此，在諸如下列各項(xiàng)的研究中，RNAi將是不可避免的 在真核細(xì)胞中在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制基因表達(dá)。在這一內(nèi)容中，RNAi是快速評(píng)估基因功能和揭示無效表型的直接工具。 研發(fā)RNAi技術(shù)用于移植后的胚胎?！?RNA干擾主要的經(jīng)濟(jì)顯著性由其作為治療原理的應(yīng)用而建立。由于此，RNAi可以產(chǎn)生治療人類疾病的基于RNA的藥物。青光眼青光眼是盲的主要原因之一。世界范圍內(nèi)接近15%的盲的情況由青光眼產(chǎn)生。最普通的類型，原發(fā)性開角型青光眼，在超過40歲的一般人群中具有1/200的發(fā)病率。已經(jīng)將青光眼簡單限定為由眼內(nèi)壓力(IOP)持續(xù)升高超過其正常生理極限的所弓I起視覺組織破壞的過程。越來越清楚，許多形式的青光眼具有遺傳成分，并且更多的當(dāng)前研究集中在識(shí)別染色體區(qū)域和促進(jìn)青光眼的基因?？赡苁荗AG的病因?qū)W是多因素的，由超過一種基因中的突變的組合和至今未經(jīng)確認(rèn)的環(huán)境因素產(chǎn)生。關(guān)于青少年和成年人發(fā)作的0AG，已經(jīng)識(shí)別了數(shù)個(gè)基因座。然而，僅已知一種基因，即染色體Iq21_q31上的GLClA基因座處的肌纖蛋白/TIGR(小梁網(wǎng)可誘導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素反應(yīng))基因。在全世界的人種學(xué)多樣的人群中已經(jīng)識(shí)別了超過三十種該基因的突變。研究顯示了它僅導(dǎo)致了總OAG的大約5% (見Wirtz Samples,2003，和Khaw等，2004a中的評(píng)論)。發(fā)病機(jī)制雖然升高的水平可能不同，但是大多數(shù)的青光眼的特征在于升高的Ι0Ρ。在那些青光眼中，其中所述升高最初是低的(即，開角型青光眼、黑色素細(xì)胞青光眼)并且一些繼發(fā)性青光眼、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和視神經(jīng)損害發(fā)展緩慢。在閉角型青光眼中IOP的突然高度 升高經(jīng)常致使眼盲，無疑主要由于在篩板水平的軸漿流中止。在人的研究中，已經(jīng)廣泛地接受，組織壞死在青光眼發(fā)生的視神經(jīng)盤損害的引發(fā)或進(jìn)行中起作用。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退化可以是壞死，但是由IOP的升高觸發(fā)細(xì)胞凋亡的可能性是似乎合理的，并且認(rèn)為一氧化氮和谷氨酸的各自作用在所述疾病的進(jìn)行期間是相關(guān)的(對(duì)于這個(gè)問題上最近的綜述見Osborne等,2003)。治療雖然數(shù)種病因?qū)W涉及青光眼綜合征，但是療法選擇中絕對(duì)的決定因素是虹膜角膜角之內(nèi)壓力的原發(fā)性和/或誘導(dǎo)的改變量。雖然升高的IOP導(dǎo)致青光眼中神經(jīng)元損害的病理生理的機(jī)理是未知的，但是當(dāng)前的治療包括針對(duì)降低這種壓力的藥物治療或外科手術(shù)。可以利用四種類型的藥物嘗試醫(yī)藥抑制升高的IOP :眼房水形成抑制劑(在它們之中有碳酸酐酶抑制劑、β_腎上腺素能阻滯劑、或α 2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑)；縮瞳劑(即擬副交感神經(jīng)藥-膽堿功能藥物_、或抗膽堿酯酶抑制劑)；眼色素層鞏膜流出增強(qiáng)劑；和高滲試劑(穿過睫狀體上皮之內(nèi)的血液/水屏蔽產(chǎn)生滲透壓梯度)。將全部四種用于青光眼的治療中，前三種通常作為急診治療和長期的控制，而所述高滲試劑作為急診和手術(shù)前治療是寶貴的。第五類藥物，神經(jīng)保護(hù)試劑，正在開始出現(xiàn)為對(duì)于醫(yī)藥治療的重要的可能添加物。實(shí)際上，NOS和谷氨酸水平在青光眼中升高并且它們涉及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞壞死或細(xì)胞凋亡的觀察增加了神經(jīng)保護(hù)治療和甚至是神經(jīng)再生的可能性。因而氨基酸激發(fā)拮抗劑NOS抑制劑、谷氨酸受體拮抗體、細(xì)胞凋亡抑制劑和鈣通道封阻劑是將來青光眼治療的發(fā)展中的全部潛在的選擇物。所述鈣通道可以減少微循環(huán)對(duì)視神經(jīng)頭部的削弱效果，同時(shí)在小梁細(xì)胞水平潛在增加流出的可能性。在參考文獻(xiàn)中給出了多種眼病和它們的治療的評(píng)論，特別是在Bunce (2005)、Costagliola (1995，2000)、CulI inane(2002)、Sakaguchi (2002)、Shah (2000)、和Wang (2005)中。目前我們的現(xiàn)有治療肯定達(dá)不到目的并且與流出可能性的評(píng)價(jià)、治療的精確監(jiān)控和外科技術(shù)的復(fù)雜性有關(guān)的實(shí)際困難全部組合而困擾預(yù)后；全部青光眼中占優(yōu)勢(shì)的因素是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的退化，因而通過有效的低眼壓的神經(jīng)保護(hù)是我們使用的任何治療的基本需要(對(duì)于在這個(gè)問題上的最近綜述，見Khaw等2004b)。發(fā)明概述在本發(fā)明中發(fā)明人描述了用于治療眼病癥的方法，特征在于改變動(dòng)物包括人中的Ι0Ρ。特別是，眼病癥可以包括青光眼、葡萄膜炎、和炎癥。所述方法基于基因表達(dá)的下調(diào)，所述基因涉及眼中的眼房水(aqueous)形成或眼房水流出?？梢酝ㄟ^雙鏈核酸部分的使用影響下調(diào)，命名為SiNA或小干涉的NA，其定向于干涉多種候選基因的mRNA表達(dá)。盡管修飾的核酸或類似的化學(xué)合成的實(shí)體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是所述siNA優(yōu)選是siRNA。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及SiNA的局部施用。本發(fā)明的實(shí)施方案也提供了供治療眼病癥用的藥物組合物。本發(fā)明可以使用在局部眼治療、涉及青光眼發(fā)病機(jī)制的目標(biāo)基因、還有化學(xué)合成的實(shí)體治療動(dòng)物(包括人)疾病的用途的領(lǐng)域內(nèi)。除青光眼的治療之外，本方法也適于治療所述眼的前房的其它疾病。特別是，所述方法可以應(yīng)用于疾病的治療，其特征在于改變眼中的眼房水形成或流出?？梢灾委煹牟“Y 實(shí)例包括局部病癥諸如感染或炎癥，和一般病癥諸如葡萄膜炎或全身疾病的表現(xiàn)。另外，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供用于糖尿病性視網(wǎng)膜病的治療。發(fā)明詳述目標(biāo)基因本發(fā)明中，本發(fā)明發(fā)明人限定一系列目標(biāo)基因，其表達(dá)水平可以改變?chǔ)?Ρ。這些基因可以屬于涉及眼房水形成的基因的組或者涉及眼房水流出的基因的組。這里是我們的目標(biāo)基因系列 碳酸酐酶II、IV和XII·腎上腺素能藥受體β I和2以及α IA、IB和ID 乙酰膽堿酯酶 環(huán)加氧酶I和2 腺苷三磷酸酶α I、α 2、α 3、β I、β 2 內(nèi)皮性白細(xì)胞粘著分子I (ELAM-1) 血管緊張素系統(tǒng)血管緊張素II、血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶類(ACE I和ACE II)、血管緊張素II受體(ATR1和ATR2)和腎素# CochlinsiNA 的設(shè)計(jì)盡管RNAi的機(jī)制尚未已知，但是產(chǎn)生特異性的dsRNA寡核苷酸所需的步驟是清楚的。已經(jīng)表明，長度為21-26個(gè)核苷酸的dsRNA雙鏈體鏈在產(chǎn)生RNA干擾中最有效。選擇基因內(nèi)部正確的同源區(qū)域也是重要的。當(dāng)考慮產(chǎn)生用于RNAi的dsRNA時(shí)，諸如距起始密碼子的距離、G/C含量和腺苷二聚體的位置的因素是重要的。然而，這樣做的一個(gè)后果是人們可能需要檢測(cè)一些不同的序列，以發(fā)現(xiàn)最有效的RNAi，并且這可能是花費(fèi)大的。在1999年，Tuschl等揭示了 siRNAs的沉默機(jī)制，表明它們的效率是雙鏈體的長度、3'末端突出端長度和這些突出端的序列的函數(shù)。基于這一奠基性的工作，Eurogentec推薦靶點(diǎn)mRNA區(qū)域，以及因而應(yīng)該使用下述指導(dǎo)方針選擇siRNA雙鏈體的序列由于RNAi依賴建立復(fù)雜的蛋白相互作用，因而，明顯地，mRNA祀點(diǎn)應(yīng)該完全沒有不相關(guān)的結(jié)合因子。在這一情況下，由于它們可能更富含調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)，所以應(yīng)該避免5'和3'不翻譯區(qū)(UTRs)和臨近起始密碼子的區(qū)域。因此，siRNA的序列選擇如下 在mRNA序列中，選擇位于AUG起始密碼子下游或終止密碼子上游50_100nt的區(qū)域。 在這一區(qū)域，尋找下述序列AA (N19)，CA (N19)。 計(jì)算每個(gè)確定序列的G/C百分?jǐn)?shù)。理想地，G/C含量為50%，但是它必須小于70%并且大于30%。
優(yōu)選地，避免含有下列重復(fù)的序列AAA，CCC, GGG, TTT, AAAA, CCCC, GGGG, TTTT。 還進(jìn)行按照mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的可接近性預(yù)測(cè)。 還使用最適合前述標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸序列進(jìn)行BLAST ( S卩，NCBI ESTs數(shù)據(jù)庫)，以確保只有一種基因?qū)⒈皇Щ?。為了將結(jié)果的解釋最大化，當(dāng)使用siRNAs時(shí)，應(yīng)該進(jìn)行下列預(yù)防措施籲總是在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)有義和反義單鏈。 嘗試零亂的(scramble) siRNA雙鏈體。這應(yīng)該具有與你們的siRNA相同的核苷酸組成，但是缺少與任何其它基因(包括你們的基因)的顯著序列同源性。 如果可能,用2種獨(dú)立的siRNA雙鏈體擊倒(knock-down)相同的基因，以控制沉默方法的特異性。實(shí)際上，將每種選擇的基因作為核苷酸序列輸入到預(yù)測(cè)程序中，所述程序考慮到上述所有的變化，用于設(shè)計(jì)最佳的寡核苷酸。這種程序掃描任何mRNA核苷酸序列的易受siRNAs靶向的區(qū)域。這種分析的輸出是可能的siRNA寡核苷酸的得分。最高得分用來設(shè)計(jì)雙鏈寡核苷酸(盡管其它長度也是可能的，典型地21bp長)，其典型地通過化學(xué)合成制備。除了 siRNA之外，還可以使用修飾的核苷酸。我們計(jì)劃檢測(cè)本領(lǐng)域內(nèi)公知的一些化學(xué)修飾物。這些修飾物目的是增加siNA的穩(wěn)定性或可用性。適宜的修飾物的實(shí)例在下文參考的出版物中描述，每一份出版物通過參考結(jié)合于此。研究表明，用脫氧核糖核苷酸取代具有2個(gè)核苷酸3'-突出端的21-mer siRNA雙鏈體的3'-末端核苷酸突出端片段，對(duì)RNAi活性沒有不利作用。已經(jīng)報(bào)道用脫氧核糖核苷酸取代siRNA每端多達(dá)4個(gè)核苷酸是很好耐受的，而用脫氧核糖核苷酸完全取代導(dǎo)致沒有RNAi活性(Elbashir 2001)。另外，Elbashir等·還報(bào)道了用2' -O-甲基核苷酸取代siRNA完全消除了 RNAi活性?？梢允褂肳02005/044976中所述的親和力修飾的核苷。這一公布描述了包括修飾的核苷的寡核苷酸，以便具有對(duì)于靶點(diǎn)mRNA和/或互補(bǔ)siNA鏈中它們的互補(bǔ)核苷酸的增加的或減少的親和力。GB2406568描述了備用的修飾的寡核苷酸，其被化學(xué)修飾，以提供針對(duì)降解的提高的抗性或提高的吸收。這樣的修飾的實(shí)例包括硫代磷酸核苷酸間鍵合、2' -O-甲基核糖核苷酸、2'-脫氧-氟核糖核苷酸、2'-脫氧核糖核苷酸、“通用堿基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸和反向脫氧堿性(deoxyabasic)殘基結(jié)合。W02004/029212描述了被修飾以增強(qiáng)siRNA的穩(wěn)定性或增加靶向效率的寡核苷酸。修飾包括siRNA兩個(gè)互補(bǔ)鏈之間的化學(xué)交聯(lián)，和siRNA—條鏈3’末端的化學(xué)修飾。優(yōu)選的修飾為內(nèi)部修飾，例如，糖修飾、核堿基修飾和/或骨架修飾。描述了 2'-氟修飾的核糖核苷酸和2'-脫氧核糖核苷酸。
W02005/040537還描述了可以用于本發(fā)明的修飾的寡核苷酸。如應(yīng)用dsNA和修飾的dsRNA—樣好，本發(fā)明可以應(yīng)用短的發(fā)夾NA(shNA) ;siNA分子的兩條鏈可以通過接頭區(qū)連接，接頭可以是核苷酸接頭或非核苷酸接頭。除了與靶點(diǎn)區(qū)域完美互補(bǔ)的siNA之外，簡并的siNA序列也可以用來靶向同源區(qū)域。W02005/045037描述了靶向這樣的同源序列的siNA分子的設(shè)計(jì)，例如，通過結(jié)合非規(guī)范的喊基對(duì)，例如錯(cuò)配和/或搖擺(wobble)喊基對(duì)，其可以提供其它的祀點(diǎn)序列。在確定錯(cuò)配的實(shí)例中，非規(guī)范堿基對(duì)(例如，錯(cuò)配和/或搖擺堿基)可以用來產(chǎn)生靶向多于一種基因序列的siNA分子。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，非規(guī)范堿基對(duì)諸如UU和CC堿基對(duì)用來產(chǎn)生能夠靶向使共享序列同源性的靶點(diǎn)不同的序列的siNA分子。這樣，使用本發(fā)明的siNAs的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，單一的siNA可以設(shè)計(jì)成包括與在同源基因之間保守的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸序列。在這種方法中，單一的siNA可以用來抑制多于一種基因的表達(dá)，而不是使用多于一種的siNA分子來靶向不同的基因。 本發(fā)明優(yōu)選的siNA分子是雙鏈的。本發(fā)明的siNA分子可以包括平端的，S卩，不包括任何突出核苷酸的末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子可以包括一個(gè)或多個(gè)平端。在優(yōu)選實(shí)施方案中，siNA分子具有3'突出端。本發(fā)明的siNA分子可以包括具有η個(gè)核苷酸(5彡η彡I)的3'突出端的雙鏈體核酸分子。Elbashir (2001)表明，當(dāng)含有3'-末端二核苷酸突出端時(shí)，21個(gè)核苷酸的siRNA雙鏈體是最活躍的。為了促進(jìn)從動(dòng)物到人臨床研究的轉(zhuǎn)換，進(jìn)一步篩選了候選寡核苷酸的種間序列保守性。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用保守寡核苷酸；這允許單一寡核苷酸序列用于動(dòng)物模型和人臨床試驗(yàn)。圖I顯示了與通過備選剪接產(chǎn)生的P2RX7轉(zhuǎn)錄物對(duì)應(yīng)的GenBank登記號(hào)。在這些基因的一些中，備選的剪接產(chǎn)生在外顯子含量上不同的一族轉(zhuǎn)錄體。本發(fā)明容許各自轉(zhuǎn)錄體形式的單獨(dú)定向。RNAi針對(duì)其而選擇的寡核苷酸序列在圖2中顯示。顯示的序列是由siNA靶向的DNA序列。因此，本發(fā)明將應(yīng)用具有與指示DNA序列互補(bǔ)序列的NA雙鏈體。在圖2中顯示的序列不是限制性的。事實(shí)上，靶點(diǎn)DNA不必必要地在AA或CA之后。此外，靶點(diǎn)DNA可以由包含在圖2中的側(cè)連以任何鄰近序列的序列組成。體外和動(dòng)物研究獲得siRNA雙鏈體使用適當(dāng)保護(hù)的核糖核苷氨基磷酸酯(phosphoramidites)和常規(guī)DNA/RNA合成儀，優(yōu)選地化學(xué)合成RNAs。用2'-脫氧或2' -O-甲基寡核糖核苷酸取代siRNA雙鏈體的一條或兩條鏈，消除了蠅提取物中的沉默作用(Elbashir等.2001)。然而，在哺乳動(dòng)物中，用2' -O-甲基寡核糖核苷酸取代有義siRNA似乎是可能的(Ge等.2003)。最便利地，siRNAs從商業(yè)RNA寡聚物合成供應(yīng)商獲得，其出售不同質(zhì)量和價(jià)格的RNA-合成產(chǎn)物。一般地，21-nt RNAs不是很難合成的，并且易于以適合RNAi的質(zhì)量提供。RNA 合成試劑的供應(yīng)商包括 Proligo (Hamburg, Germany)、DharmaconResearch (Lafayette, CO, USA)、Glen Research (Sterling, VA, USA)、ChemGenes (Ashland,MA, USA)和 Cruachem(Glasgow, UK)、Qiagen(Germany)、Ambion(USA)和Invitrogen(Scotland)。早先常規(guī)的RNA合成公司具有目標(biāo)確認(rèn)的許可有資格提供siRNAs ο特別地，我們的siRNA供應(yīng)商是Ambion,、Dharmacon和Invitrogen,這些公司提供siRNA傳統(tǒng)常規(guī)的化學(xué)合成服務(wù)，并且提供用HPLC純化的siRNA，并且以干燥形式與沒有Rnase的水一起遞送。RNAi和siRNA方法的主要的基于網(wǎng)絡(luò)的來源，以及其它siRNA相關(guān)產(chǎn)物和服務(wù)的鏈接，可以在上述提及的供應(yīng)商的網(wǎng)頁上找到。當(dāng)用單鏈RNA分子操作時(shí)，退火步驟是必要的。嚴(yán)格地，所有的操作步驟都應(yīng)該在無菌、沒有Rnase的條 件下進(jìn)行。為了使RNAs退火,寡聚物必須通過260納米(nm)處的UV吸收而進(jìn)行定量。然后，將基于Elbashir等.(2001)的下述流程用于退火 獨(dú)立地將每種RNA寡聚物等分并且稀釋到50 μ M濃度。 將30 μ I每種RNA寡聚物溶液和15 μ I 5 X退火緩沖液組合。終緩沖液濃度為100mM 醋酸鉀，30mM HEPES-KOH pH 7. 4，2mM 醋酸鎂。終體積是 75 μ I。 將所述溶液在90°C溫育I分鐘，將管離心15秒，在37°C靜置I小時(shí)，然后在環(huán)境溫度下使用。所述溶液可以在_20°C冷凍保存，并且冷凍-解凍可達(dá)5次。siRNA雙鏈體的終濃度通常為20 μ M。備選地，已經(jīng)退火的dsRNA可以從供應(yīng)商那里購買。還可以使用化學(xué)修飾的核酸。例如，W003/070744給出了可以使用的修飾類型的總觀點(diǎn)，它的內(nèi)容通過參考結(jié)合于此。特別要注意的是這一公布的第11-21頁。其它可能的修飾如上文所述。有經(jīng)驗(yàn)的人應(yīng)該直到可以結(jié)合到RNA分子中的其它類型的化學(xué)修飾。體外系統(tǒng)為了檢驗(yàn)所述SiRNA干涉的特異性，采用表達(dá)所述目標(biāo)基因的不同細(xì)胞培養(yǎng)。用于這些實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞是兔非著色睫狀體上皮細(xì)胞NPE、人睫狀體上皮細(xì)胞0MDC、和人胚腎細(xì)胞HEK293。用相應(yīng)的siRNA雙鏈體溫育所述細(xì)胞，并且進(jìn)行所述目標(biāo)基因表達(dá)下調(diào)的分析。為了將siRNA擊倒與培養(yǎng)細(xì)胞中的特定表型相聯(lián)系，有必要證明目標(biāo)蛋白質(zhì)的減少或至少證明目標(biāo)mRNA的減少。靶點(diǎn)基因的mRNA水平可以通過實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)進(jìn)行定量。此外，蛋白水平可以以本領(lǐng)域公知的各種方法確定，諸如使用針對(duì)不同靶點(diǎn)的特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡分析允許對(duì)靶點(diǎn)蛋白減少的直接監(jiān)測(cè)。siRNA雙鏈體的轉(zhuǎn)染本領(lǐng)域眾所周知技術(shù)的數(shù)個(gè)實(shí)例如下本發(fā)明發(fā)明人可以利用陽離子的脂質(zhì)進(jìn)行siRNA雙鏈體的單一轉(zhuǎn)染，諸如RNAiFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)和Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)并且在轉(zhuǎn)染后24、48和72小時(shí)檢測(cè)沉默作用。典型的轉(zhuǎn)染方案可以如下進(jìn)行對(duì)于6-孔板的一個(gè)孔，本發(fā)明發(fā)明人利用IOOnM作為siRNA的終濃度轉(zhuǎn)染。在RNAiFect方案后，在轉(zhuǎn)染的前一天，本發(fā)明發(fā)明人將3ml的適當(dāng)生長培養(yǎng)基中的每孔接種2-4X IO5細(xì)胞，所述生長培養(yǎng)基含有DMEMUO%血清、抗生素和谷氨酰胺，并且在正常生長條件(37°C和5% C02)下溫育細(xì)胞。轉(zhuǎn)染那天，細(xì)胞必須30-50%匯合。本發(fā)明發(fā)明人將15 μ I的20 μ M的siRNA雙鏈體(相當(dāng)于IOOnm終濃度)稀釋在85 μ I的Buffer EC-R中，得到100 μ I的終體積,并通過潤流混合。對(duì)于復(fù)合體形成，本發(fā)明發(fā)明人將19μ I的RNAiFect轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的siRNA并通過移液管或渦流混合。在將所述樣品在室溫下溫育10-15分鐘而形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體以后，本發(fā)明發(fā)明人將所述復(fù)合體逐滴加入到細(xì)胞中，所述細(xì)胞具有2ml新鮮的低抗生素生長培養(yǎng)基。在旋渦所述板以確保轉(zhuǎn)染復(fù)合體均勻分布以后，本發(fā)明發(fā)明人在它們的正常生長條件下溫育所述細(xì)胞。第二天，除去所述復(fù)合體并加入新鮮的和完全生長培養(yǎng)基。為了監(jiān)控基因沉默，在轉(zhuǎn)染后24、48和72小時(shí)收集細(xì)胞。Lipofectamine 2000試劑的方案是相當(dāng)類似的。轉(zhuǎn)染的前一天，本發(fā)明發(fā)明人在3ml的適當(dāng)生長培養(yǎng)基中每孔接種2-4X IO5細(xì)胞，所述生長培養(yǎng)基含有DMEM、10%血清、抗生素和谷氨酰胺，并且在正常生長條件(37°C和5% C02)下溫育細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，細(xì)胞必須30-50%匯合。本發(fā)明發(fā)明人將12. 5μ I 20μ M的siRNA雙鏈體(相當(dāng)于IOOnm終濃度)稀釋在250 μ I的DMEM中，得到262. 5 μ I的終體積，并混合。同樣，將6 μ I的Lipofectamine 2000在250 μ I的DMEM中稀釋并混合。在室溫下溫育5分鐘以后，將稀釋的寡聚體和稀釋的Lipofectamine合并以容許在室溫下的20分鐘溫育期間形成復(fù)合體。然后，本發(fā)明發(fā)明人將所述復(fù)合體逐滴加入到細(xì)胞中，所述細(xì)胞具有2ml新鮮的低抗生素生長培養(yǎng)基，并通過來回?fù)u動(dòng)所述板而輕輕混合，以確保轉(zhuǎn)染復(fù)合體的均勻分布。本發(fā)明發(fā)明人在它們的正常生長條件下溫育所述細(xì)胞并且在次日除去所述復(fù)合體并加入新鮮的和完全的生長培養(yǎng)基。為了監(jiān)控基因沉默，在轉(zhuǎn)染后的24、48和72小時(shí)收集細(xì)胞。轉(zhuǎn)染效率可以取決于細(xì)胞類型，但是也取決于傳代次數(shù)和細(xì)胞的匯合。形成siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合體的時(shí)間和方式(例如，倒置相對(duì)旋轉(zhuǎn))也是關(guān)鍵的。低轉(zhuǎn)染效率是不 成功沉默作用的最常見的原因。良好的轉(zhuǎn)染是一個(gè)重要的問題，并且需要仔細(xì)檢驗(yàn)要應(yīng)用的每種新細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染效率可以通過轉(zhuǎn)染報(bào)道基因，例如CMV-驅(qū)動(dòng)的EGFP-表達(dá)質(zhì)粒(例如，來自Clontech)或B-Gal表達(dá)質(zhì)粒,然后在第二天通過相差和/或突光顯微鏡方法評(píng)估而檢測(cè)。檢測(cè)siRNA雙鏈體取決于靶點(diǎn)蛋白的豐度和壽命(或周轉(zhuǎn))，在1-3天后或者甚至以后，擊倒表型可以變得明顯。在沒有觀察到表型的情形中，蛋白的耗盡可以通過免疫熒光或蛋白質(zhì)印跡而觀察到。轉(zhuǎn)染后，從細(xì)胞提取的總RNA級(jí)分用DNase I預(yù)處理，并且使用隨機(jī)引物用于反轉(zhuǎn)錄。為了控制前-mRNAs的擴(kuò)增，使用覆蓋至少一個(gè)外顯子-外顯子連接的特異的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。還需要非靶點(diǎn)mRNA的RT/PCR作為對(duì)照。mRNA的有效耗盡而靶點(diǎn)蛋白的無法檢測(cè)的減少可能表明，在細(xì)胞中可能存在穩(wěn)定蛋白的大儲(chǔ)存庫。備選地，實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增可以用于以更精確的方法檢測(cè)mRNA的減少或消失。實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄(RT)PCR最特異性的、靈敏地和可重現(xiàn)性地定量模板的初始量。實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測(cè)在反應(yīng)過程中發(fā)射的熒光，作為在每一 PCR循環(huán)中擴(kuò)增子產(chǎn)生的指示。這種信號(hào)與反應(yīng)中PCR產(chǎn)物的量成正比例增加。通過記錄每一循環(huán)中發(fā)射的熒光量，可以在指數(shù)期監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)，在指數(shù)期，PCR產(chǎn)物量的第一次顯著增加與靶點(diǎn)模板初始量相關(guān)。為了證實(shí)在所述細(xì)胞培養(yǎng)中識(shí)別的差異表達(dá)基因的干涉模式，根據(jù)制造商的規(guī)程進(jìn)行qRT-PCR。對(duì)于定量的RT-PCR (qRT-PCR)，將接近250ng的總RNA用于反轉(zhuǎn)錄，接著是在含有Master SYBR Green I的反應(yīng)混合物中用各自基因的特定引物的PCR擴(kuò)增?；綪CR條件包含在91°C下30分鐘的初始步驟，接著是在95°C下5秒、在62°C下10秒和在72°C下15秒的40個(gè)循環(huán)。使用對(duì)應(yīng)于各自目標(biāo)基因的特定引物序列。將b-肌動(dòng)蛋白mRNA的定量用作數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)照。在所述樣品中，當(dāng)選擇的內(nèi)源性/內(nèi)部的對(duì)照是更大量的并保持恒定，與總RNA成比例時(shí)，相對(duì)基因表達(dá)比較運(yùn)行得最好。通過利用不變的內(nèi)源對(duì)照作為活性參考物，mRNA目標(biāo)的定量可以對(duì)于加入到各自反應(yīng)的總RNA的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)化。藥物制劑本發(fā)明可以包括一種或多種SiNA分子的同時(shí)施用。這些種類可以選擇靶向一種或多種靶點(diǎn)基因。本發(fā)明的SiNA分子及其制劑或組合物可以直接或表面局部地(例如，局部地)施用到眼，這通常是本領(lǐng)域已知的。例如，siNA分子可以包括施用給受試者的遞送載體，其包括脂質(zhì)體。在藥用制劑中可以存在載體和稀釋劑及它們的鹽。核酸分子可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種方法施用到細(xì)胞，這些方法包括，但不限于，包封到脂質(zhì)體中，通過離子電滲療法，或者通過結(jié)合其它載體，諸如可生物降解的聚合物、水凝膠、環(huán)式糊精聚(乳酸-共-乙二醇)酸(PLGA)和PLCA微球、可生物降解的微膠囊、和生物黏附性微球，或者 通過蛋白質(zhì)載體而施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子還可以與聚乙烯亞胺及其衍生物諸如聚乙烯亞胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亞胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物一起配制或復(fù)合。本發(fā)明的SiNA分子可以與膜分解劑和/或陽離子脂質(zhì)或輔助脂質(zhì)分子絡(luò)合?？梢杂糜诒景l(fā)明的遞送系統(tǒng)包括，例如，水性和非水性凝膠、乳膏劑、多樣乳劑、微乳劑、脂質(zhì)體、軟膏劑、水性和非水性溶液、洗液、氣溶膠、碳水化合物堿和粉劑，并且可以包含賦形劑諸如增溶劑，滲透增強(qiáng)劑(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，和親水聚合物(例如聚親碳物質(zhì)(polycarbophil)和聚乙烯卩比咯燒酮)。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥用載體是脂質(zhì)體或透皮增強(qiáng)劑。本發(fā)明的藥物制劑是適合施用例如全身或局部施用到細(xì)胞或受試者的形式，所述受試者包括例如人。適合的形式部分取決于應(yīng)用或者進(jìn)入的途徑，例如，口服、透皮或者通過注射。其它因素在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并且包括這樣的考慮，諸如防止所述組合物或制劑行使其作用的毒性和形式。本發(fā)明還包括用于儲(chǔ)存或施用而制備的組合物，其在藥用載體或稀釋劑中包括藥物有效量的需要的化合物。治療應(yīng)用的可用載體或稀釋劑在制藥領(lǐng)域內(nèi)是公知的。例如，可以提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和調(diào)味劑。這些包括苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸的酯。另外，可以施用抗氧化劑和混懸劑。藥物有效劑量是預(yù)防、抑制疾病狀態(tài)發(fā)生或者治療(在某種程度上減輕癥狀，優(yōu)選所有癥狀)疾病狀態(tài)所需要的劑量。藥物有效劑量取決于攪拌類型、所用的組合物、施用途徑、要治療的哺乳動(dòng)物類型、考慮中具體哺乳動(dòng)物的物理特征、協(xié)同藥物治療、以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到的其它因素?！愕?施用在O. lmg/kg和100mg/kg體重/天之間的量的活性成分。本發(fā)明的制劑可以以單位劑量制劑施用，其包括常規(guī)的無毒藥用載體、佐劑和/或載體。制劑可以是適于口服應(yīng)用的形式，例如，作為片劑、藥片、錠劑、水性或油性混懸液、可分散的粉劑或粒劑、乳劑、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。意欲用于口服使用的組合物可以按照本領(lǐng)域已知的關(guān)于藥物組合物制備的任何方法進(jìn)行制備，并且這樣的組合物可以包含一種或多種這樣的甜味劑、調(diào)味劑、著色劑或防腐劑，以提供藥學(xué)上美觀和可口的制劑。片劑在與適于制備片劑的無毒藥用賦形劑的混合物中含有活性成分。這些賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑；諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；?；捅澜鈩?，例如，玉米淀粉或褐藻酸；結(jié)合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯樹膠；和潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。片劑可以是沒有涂層的或者它們可以通過已知技術(shù)涂層。在一些情形中，這樣的涂層可以通過已知技術(shù)制備，以延緩崩解和在胃腸道中的吸收，并且由此在更長的時(shí)間段提供持續(xù)不變的作用。例如，可以應(yīng)用時(shí)間延緩物質(zhì)，諸如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。口服使用的制劑還可以作為硬明膠膠囊存在，其中活性成分與惰性固體稀釋劑如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或者作為軟明膠膠囊存在，其中活性成分與水或油性介質(zhì)如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。水性混懸液在與適于制備水性混懸液的賦形劑的混合物中含有活性物質(zhì)。這樣的賦形劑是混懸劑，例如羧甲基纖維素、甲基纖維素、羥丙基-甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、西黃蓍膠和阿拉伯樹膠；分散或濕潤劑可以是天然存在的磷脂如卵磷脂，或烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物如十七烷基乙烯氧基十六烷醇，或環(huán)氧乙烷與衍生于脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合物諸如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烯與衍生于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物如聚乙烯·脫水山梨糖醇單油酸酯。所述水性混懸液還可以包含一種或多種防腐劑如乙基、或正丙基對(duì)羥基苯甲酸，一種或多種著色劑，和一種或多種甜味劑諸如蔗糖或糖精。油性混懸液可以通過將活性成分懸浮在植物油如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油或者懸浮在礦物油諸如液體石蠟中而配制。油性混懸液可以含有增稠劑如蜂蠟、硬石蠟或十六烷醇?？梢约尤胩鹞秳┖驼{(diào)味劑以提供可口的口服制劑。這些組合物可以通過加入抗氧化劑諸如抗壞血酸而保存。適于通過加入水而制備水性混懸液的分散粉劑和粒劑，在與分散劑或濕潤劑、混懸劑和一種或多種防腐劑的混合物中提供活性成分。適當(dāng)?shù)姆稚┗驖駶檮┗蚧鞈覄┩ㄟ^上文已經(jīng)提及的那些而示例。還可以存在其它賦形劑，例如甜味劑、調(diào)味劑和著色劑。本發(fā)明的藥物組合物還可以是油-在-水的乳劑形式。油相可以是植物油或礦物油或這些油的混合物。適宜的乳化劑可以是天然存在的樹膠如阿拉伯樹膠或西黃蓍膠，天然存在的磷脂如大豆、卵磷脂，以及衍生于脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯如脫水山梨糖醇單油酸酯，以及所述偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。所述乳劑還可以含有甜味劑和調(diào)味劑。糖漿和酏劑可以與甜味劑如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖一起配制。這樣的制劑還可以含有緩和劑、防腐劑和調(diào)味劑以及著色劑。所述藥物組合物可以是無菌注射水性或油質(zhì)混懸液的形式。這種混懸液可以使用上文提及的那些適當(dāng)?shù)姆稚┗驖駶檮┖突鞈覄┌凑找阎夹g(shù)進(jìn)行配制。無菌注射制劑還可以是在腸胃外適用的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或混懸液，例如作為在1，3_ 丁二醇中的溶液。在可以應(yīng)用的可用載體和溶劑中，有水、Ringed s溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌的、不揮發(fā)的油可以便利地用作溶劑或混懸介質(zhì)。為了這一目的，可以應(yīng)用任何溫和的不揮發(fā)油，包括合成的單酸-或二脂酰甘油酯。另外，脂肪酸諸如油酸用于制備注射劑。本發(fā)明分核酸分子還可以以栓劑形式施用，例如，用于藥物的直腸投藥。這些組合物可以通過將藥物與適當(dāng)?shù)臒o刺激性賦形劑混合而制備，所述無刺激性賦形劑在常溫下是固體的但是在直腸溫度下是液體的，并且因此將在直腸中熔融而釋放所述藥物。這樣的物質(zhì)包括可可油和聚乙二醇。本發(fā)明的核酸分子可以在無菌介質(zhì)中進(jìn)行腸胃外施用。取決于所用的載體和濃度，藥物可以懸浮或者溶解在賦形劑中。有利地，佐劑諸如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑可以溶解在載體中。應(yīng)該理解，用于任何具體的受試者的具體的劑量水平取決于各種因素，包括所用的具體的化合物的活性、年齡、體重、綜合健康、性別、飲食、施用時(shí)間、施用途徑、和排泄速度、藥物組合以及正在進(jìn)行治療的具體疾病的嚴(yán)重性。對(duì)于施用給非人動(dòng)物，組合物還可以添加到動(dòng)物飼料或飲用水中?？梢苑奖愕嘏渲苿?dòng)物飼料和飲用水組合物，以便動(dòng)物在其飲食中攝取治療適當(dāng)量的組合物。還可以方便地將所述組合物作為添加到飼料或引用水中的預(yù)混合料存在。 本發(fā)明的核酸分子還可以與其它治療化合物組合施用給受試者，以提高綜合治療效果。應(yīng)用多種化合物治療一種指征可以增加有利效果而減少副作用的存在。備選地，本發(fā)明的某些SiNA分子可以在細(xì)胞內(nèi)從真核啟動(dòng)子表達(dá)。能夠表達(dá)SiNA分子的重組載體可以被遞送到并且保持在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)。備選地，可以使用提供核酸分子的瞬時(shí)表達(dá)的載體。當(dāng)需要時(shí)，這樣的載體可以重復(fù)施用。一旦表達(dá)，所述SiNA分子與靶點(diǎn)mRNA相互作用，并且產(chǎn)生RNAi反應(yīng)。SiNA分子表達(dá)載體的遞送可以是全身的，諸如通過靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用，通過施用給從受試者移植的靶點(diǎn)細(xì)胞然后再引入受試者，或者通過允許引入需要的靶點(diǎn)細(xì)胞的任何其它方法進(jìn)行遞送。動(dòng)物研究新西蘭兔是用來研究IOP的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)中的金標(biāo)準(zhǔn)。它易于操作并且它具有大眼睛，在大小上類似于人的器官。另外，測(cè)量IOP的現(xiàn)有裝備不適于用在具有小眼睛的動(dòng)物諸如小鼠或大鼠中。最后，兔具有IOP(約23mm Hg)，其可以利用局部商業(yè)的低血壓的藥物療法降低直到它的值的40%。因而，雖然可以產(chǎn)生兔青光眼模型(例如，外科阻塞鞏膜靜脈或人為閉塞所述小梁網(wǎng))，本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)使用了正常血壓的兔，因?yàn)椋诒景l(fā)明發(fā)明人手中，可以容易并可重復(fù)地測(cè)量IOP的藥理學(xué)降低。實(shí)驗(yàn)規(guī)程使用正常血壓的新西蘭白兔(雄性，2_3kg)。將所述動(dòng)物保存在具有食物和水自由入口的單獨(dú)籠中。將它們進(jìn)行人為的12小時(shí)光/暗循環(huán)，以避免IOP的不受控制的晝夜擺動(dòng)。依照 European Communities Council Directive (86/609/EEC)和 Associationfor Research in Vision and Ophthalmology 關(guān)于 Use of Animals in Ophthalmic andVision Research的聲明進(jìn)行動(dòng)物操作和治療。典型地通過在角膜表面上滴入小體積(一般是40 μ L)施用所述藥物。將對(duì)側(cè)的眼單獨(dú)用載體處理并且可以用作各自實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照，以免對(duì)于另一只眼存在交感現(xiàn)象。應(yīng)當(dāng)取消在相同動(dòng)物中的多重實(shí)驗(yàn)。利用接觸眼壓計(jì)(Τ0Ν0ΡΕΝXL, Mentor, Norwell, Massachusetts)進(jìn)行 IOP 測(cè)量。TonoPen眼壓計(jì)是很方便的，這是由于它的可靠性和小尺寸。將所述眼壓計(jì)的傳感器精巧地施加到角膜表面進(jìn)行該儀器的測(cè)量。已經(jīng)證明這裝置是用于在兔中測(cè)量3至30mm Hg范圍內(nèi)的眼內(nèi)壓所選擇的眼壓計(jì)(Abrams等，1996)。全部測(cè)量屬于這個(gè)時(shí)間間隔眼內(nèi)壓的平均基線值是17. O ± O. 39mm Hg (η = 100)。因?yàn)镮OP從夜間至白晝改變，所以全部實(shí)驗(yàn)是同時(shí)進(jìn)行的以容許IOP更穩(wěn)定并且容許與載體處理的客觀比較。為了避免使所述動(dòng)物受苦，將兔局部麻醉(oxibuprocaine/丁卡因,0. 4%/1%,在鹽溶液中(1/4體積比)。將所述溶液施用(10μ1)至所述角膜，之后進(jìn)行眼內(nèi)壓的各自測(cè)量。將SiRNA或鹽水以40 μ I的體積局部施用至所述角膜。用于在兔中的SiRNA施用的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程如下。在四個(gè)連續(xù)日期間，每天將終體積為40 μ I的siRNA在鹽溶液(0.9%重量/體積)的劑量施用至一個(gè)眼。將相對(duì)的眼作為對(duì)照并且在相同的時(shí)間點(diǎn)將40 μ I的無菌鹽水(O. 9%重量/體積)滴在其上。在各自施用以前測(cè)量IOP并且在10天期間在滴注之后的2h、4h和6h測(cè)量。在第二和第三天之間觀察到最大反應(yīng)。為了比較SiRNA與其它減血壓化合物的效果，檢定了 Xalatan(拉坦前列素O. 005% )和Trustop (多佐胺2% )并且在相同條件下測(cè)量眼內(nèi)壓。結(jié)果 實(shí)施例I體外檢定。為了利用RNAi技術(shù)確定涉及青光眼的不同目標(biāo)的抑制，第一步是在細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于每個(gè)目標(biāo)，根據(jù)前述的規(guī)則利用特定的軟件設(shè)計(jì)數(shù)個(gè)siRNAs。將所述siRNAs應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)，諸如NPE、0MDC和HEK293。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，通過實(shí)時(shí)PCR和半定量的PCR分析siRNAs對(duì)所述目標(biāo)基因的效果。利用肌動(dòng)蛋白作為持家基因?qū)⑺龌蚰繕?biāo)轉(zhuǎn)錄水平是標(biāo)準(zhǔn)化。下面的表I顯示對(duì)于上述一些目標(biāo)基因的實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。所述值表示siRNA對(duì)每個(gè)基因表達(dá)干涉的曾經(jīng)與對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的百分比的平均值和它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差。相比于所述對(duì)照細(xì)胞，在24和48h時(shí)間點(diǎn)的不同轉(zhuǎn)錄水平都在siRNA治療以后顯著減少。在所述表中包括一些測(cè)試的不同siRNAs和在所述目標(biāo)基因干涉中的不同功效。表中所用的siRNAs相應(yīng)于圖2中給出的所列人siRNA目標(biāo)，如下。AC2 SiRNAl :對(duì)于人SEQ. ID. 73同源的兔序列siRNA2 :對(duì)于人SEQ. ID. 54相同的兔序列siRNA3 :對(duì)于人SEQ. ID. 66相同的兔序列PTGSl SiRNAl :對(duì)于人 SEQ. ID. 353 同源的兔序列siRNA2 :對(duì)于人SEQ. ID. 369同源的兔序列PTGS2 SiRNAl :對(duì)于人 SEQ. ID. 426 相同的兔序列siRNA2 :對(duì)于人SEQ. ID. 421同源的兔序列siRNA3 :對(duì)于人SEQ. ID. 477同源的兔序列
權(quán)利要求
1.SiNA在藥物制備中的用途，所述藥物用于治療眼病癥的方法中，所述方法包含目標(biāo)基因在需要治療的患者中的減量表達(dá)，所述基因選自包含眼房水形成基因和眼房水流出基因的組。
2.權(quán)利要求I的用途，其中所述眼病癥的特征在于所述患者中改變的眼內(nèi)壓(IOP)。
3.權(quán)利要求I或2的用途，其中所述眼病癥選自包含青光眼，感染；炎癥，葡萄膜炎，和全身疾病的表達(dá)的組。
4.任何在前權(quán)利要求的用途，其 中所述眼病癥是青光眼。
5.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述眼病癥是糖尿病性視網(wǎng)膜病。
6.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述目標(biāo)基因表達(dá)在所述患者眼睛中是下調(diào)的。
7.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述目標(biāo)基因選自包含下列基因的組碳酸酐酶II、IV和XII ;腎上腺素能受體β I和2以及a IAUB和ID ;乙酰膽堿酯酶；環(huán)加氧酶I和2 ;腺苷三磷酸酶α1、α2、α3、β1、β2 ;內(nèi)皮性白細(xì)胞粘著分子I (ELAM-I);血管緊張素系統(tǒng)血管緊張素II，血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶類(ACE I和ACE II)，血管緊張素II受體(ATR1和 ATR2)和腎素；Cochlin。
8.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述SiNA是siRNA。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述siRNA是dsRNA。
10.權(quán)利要求8的用途，其中所述siRNA是shRNA。
11.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述siNA包含修飾的寡核苷酸。
12.任何在前權(quán)利要求的用途，其中將所述siNA局部施用至患者的眼睛。
13.權(quán)利要求12的用途，其中將所述siNA施用至患者的角膜。
14.任何在前權(quán)利要求的用途,其中使用多個(gè)種類的siNA。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述多個(gè)種類是靶向相同mRNA種類的。
16.權(quán)利要求14的用途，其中所述多個(gè)種類是靶向不同mRNA種類的。
17.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述siNA是靶向選自SEQID I至SEQ ID 1829的序列的。
18.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標(biāo)基因是碳酸酐酶IV，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID I至SEQ ID 46的序列的。
19.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標(biāo)基因是碳酸酐酶II，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 47至SEQ ID 98的序列的。
20.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標(biāo)基因是β腎上腺素能受體1，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 99至SEQ ID 109的序列的。
21.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標(biāo)基因是β腎上腺素能受體2，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 110至SEQ ID 160的序列的。
22.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標(biāo)基因是乙酰膽堿酯酶，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 161至SEQ ID 190的序列的。
23.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標(biāo)基因是ELAM-I(選擇蛋白Ε)，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 191至SEQ ID 318的序列的。
24.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標(biāo)基因是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 319至SEQ ID 374的序列的。
25.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 375至SEQ ID 491的序列的。
26.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是碳酸酐酶XII，并且所述siNA是靶向選自SEQID 492至SEQ ID 538的序列的。
27.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是α腎上腺素能受體1Α，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 539至SEQ ID 598的序列的。
28.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是α腎上腺素能受體1Β，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 599至SEQ ID 634的序列的。
29.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是腎上腺素能受體1D，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 635至SEQ ID 646的序列的。
30.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是血管緊張素原，并且所述siNA是靶向選自SEQID 647至SEQ ID 694的序列的。
31.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是血管緊張素II受體類型1，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 695至SEQ ID 749的序列的。
32.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是血管緊張素II受體類型2，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 750至SEQ ID 807的序列的。
33.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶I，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 808至SEQ ID 939的序列的。
34.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶2，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 940至SEQ ID 1139的序列的。
35.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是腎素，并且所述siNA是靶向選自SEQID 1140至SEQ ID 1196的序列的。
36.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是cochlin，并且所述siNA是靶向選自SEQID1197至SEQ ID 1307的序列的。
37.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是腺苷三磷酸酶α ，并且所述siNA是靶向選自 SEQ ID 1308 至 SEQ ID 1500 的序列的。
38.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是腺苷三磷酸酶α2，并且所述siNA是靶向選自 SEQ ID 1501 至 SEQ ID 1606 的序列的。
39.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是腺苷三磷酸酶α3，并且所述siNA是靶向選自 SEQ ID 1607 至 SEQ ID 1705 的序列的。
40.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是腺苷三磷酸酶β ，并且所述siNA是靶向選自 SEQ ID 1706 至 SEQ ID 1780 的序列的。
41.權(quán)利要求17的用途，所述目標(biāo)基因是腺苷三磷酸酶β2，并且所述siNA是靶向選自 SEQ ID 1780 至 SEQ ID 1829 的序列的。
42.一種眼病癥的治療方法，所述方法包含施用siNA而在患者中下調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)，所述目標(biāo)基因選自包含眼房水形成基因和眼房水流出基因的組。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述眼病癥選自包含青光眼，感染；炎癥，葡萄膜炎，和全身疾病的表達(dá)的組。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述眼病癥是青光眼。
45.權(quán)利要求42的方法，其中所述眼病癥是糖尿病性視網(wǎng)膜病。
46.權(quán)利要求42的方法，其中所述目標(biāo)基因選自包含下列基因的組碳酸酐酶II、IV和XII ;腎上腺素能受體β I和2以及a IAUB和ID ;乙酰膽堿酯酶；環(huán)加氧酶I和2 ;腺苷三磷酸酶α I、α 2、α 3、β I、β 2 ;內(nèi)皮性白細(xì)胞粘著分子I (ELAM-I);血管緊張素系統(tǒng)血管緊張素II，血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶類(ACE I和ACE II)，血管緊張素II受體(ATR1和ATR2)和腎素；Cochlin。
47.權(quán)利要求42的方法，其中所述siNA是siRNA。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述siRNA是dsRNA。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述siRNA是shRNA。
50.權(quán)利要求42的方法，其中所述siNA包含修飾的寡核苷酸。
51.一種用于眼病癥治療的分離的siNA分子，其特征在于在所述患者中改變的眼內(nèi)壓(IOP)，所述siNA對(duì)于選自SEQ ID I至SEQ ID 1829的核苷酸序列是互補(bǔ)的。
52.分離的siNA分子在制備用于眼病癥治療的藥物中的用途，所述分子具有對(duì)于選自SEQ ID I至SEQ ID 1829的核苷酸序列互補(bǔ)的序列。
53.一種藥物組合物，所述組合物包含具有對(duì)于選自SEQ ID I至SEQ ID 1829的核苷酸序列互補(bǔ)的序列的siNA。
全文摘要
公開了利用RNA干涉用于治療眼病癥的序列和規(guī)程。目標(biāo)基因選自負(fù)責(zé)眼房水流動(dòng)或眼房水流出的那些，而特別優(yōu)選的要治療的病癥包括青光眼和葡萄膜炎。
文檔編號(hào)A61P27/06GK102895673SQ201210342530
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2005年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月23日
發(fā)明者安娜·I·希門尼斯, 安吉拉·塞斯托, 何塞·P·羅曼, 伊雷妮·加斯孔, 貢薩洛·岡薩雷斯·德·布伊特拉格 申請(qǐng)人:西倫蒂斯私人股份公司