m MA)和 1% 青霉素-鏈霉素-兩性霉素 B (Thermo HyClone)的RPMI 1640 (Cellgro)中培養(yǎng)的THP-1 κ B-LUC THP-l’s (含有穩(wěn)定整合的NF- κ B螢光素酶報道基因的THP-1細(xì)胞)用RPMI 1640 (Cellgro)洗滌3次，并以120萬/mL的濃度轉(zhuǎn)移至24-孔0.4μπι截止值透明孔板(Corning)的底隔室。然后將洗滌的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物的稀釋物以指定的最初感染復(fù)數(shù)(MOI)加入透明孔系統(tǒng)的頂室。將細(xì)胞在37°C溫育18小時，在此時將60，000個細(xì)胞的等分試樣轉(zhuǎn)移至384-孔白底板(Thermo)中的孔。為了評價螢光素酶基因表達(dá)，將Bright-Glo Luciferase Assay Reagent (Promega)加入每個孔中，并使用Perkin Elmer TopCount NXT系統(tǒng)(Perkin Elmer)分析平板的螢光素酶活性。與以前的結(jié)果相一致，當(dāng)在培養(yǎng)系統(tǒng)中與活細(xì)菌共培養(yǎng)時，κ B-LUC THP-1報告細(xì)胞表現(xiàn)出報告物活性的MOI依賴性的增加(圖5A)，所述培養(yǎng)系統(tǒng)允許細(xì)菌產(chǎn)物的被動擴(kuò)散，但是阻止完整金黃色葡萄球菌細(xì)菌和kB-LUC THP-1報告細(xì)胞之間的直接接觸。
[0079]為了確定通過調(diào)節(jié)鈣通量是否可以進(jìn)一步增強(qiáng)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的產(chǎn)物的識另IJ，將kB-LUC THP-1報告細(xì)胞在有1:100稀釋(V/V)的無菌過濾的金黃色葡萄球菌調(diào)理的(即消耗的)或未使用的無菌培養(yǎng)基存在下溫育，并用如上所述的次優(yōu)劑量(20 nM)的毒胡蘿卜內(nèi)酯或二甲亞砜(DMSO)媒介物對照處理。簡而言之，如下產(chǎn)生條件培養(yǎng)基:在搖動培養(yǎng)箱中在37°C在含有10%胎牛血清的RPMI中培養(yǎng)金黃色葡萄球菌過夜，此后將細(xì)菌通過離心進(jìn)行沉淀，并將上清液使用0.2Mm過濾器(VWR Radnor PA)過濾除菌。如上所述在螢光素酶測定之前將κ B-LUC THP-1細(xì)胞在有調(diào)理的/消耗的培養(yǎng)基存在下溫育18小時。令人感興趣的是，在有毒胡蘿卜內(nèi)酯存在下顯著增強(qiáng)了 kB-LUC THP-1報告細(xì)胞對調(diào)理的/消耗的細(xì)菌培養(yǎng)物的應(yīng)答(圖5B)。
[0080]為了確定觀察到的通過次優(yōu)的毒胡蘿卜內(nèi)酯處理實現(xiàn)的細(xì)菌產(chǎn)物對KB-LUCTHP-1細(xì)胞的活化的增強(qiáng)是否對于鈣離子載體A23187和離子霉素也適用，分別在316 nM和I μ M的次優(yōu)劑量使用這些離子載體重復(fù)該實驗。在所有3種情況下，在有任何鈣通量激動劑存在下顯著增強(qiáng)了金黃色葡萄球菌調(diào)理的/消耗的培養(yǎng)基的識別(圖5C-5E)。可能同樣感興趣的是，從該圖可以容易地看出，通過加入細(xì)胞外螯合劑EGTA (ImM)可以抑制I丐通量誘導(dǎo)的協(xié)同作用。
[0081]細(xì)胞外鈣在人細(xì)胞中的作用
為了研究人細(xì)胞中的應(yīng)答是否受鈣通量的性質(zhì)影響，發(fā)明人試驗了被金黃色葡萄球菌感染的原代人單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。從圖6中的數(shù)據(jù)可以看出，為了吞噬的金黃色葡萄球菌的最佳殺死，人原代單核細(xì)胞和粒細(xì)胞對細(xì)胞外Ca2+存在明顯需求。簡而言之，使用 Dynabeads Untouched Human Monocyte 試劑盒(Life Technologies, GrandIsland, NY)按照生產(chǎn)商的建議從商購可得的外周血單核細(xì)胞制品(Human Buffy CoatLeukocytes, Innovat1n Research, Novi MI)純化原代人單核細(xì)胞。按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)通過 Ficoll-Paque 密度離心將正常供體血液分成2個級分，純化原代人粒細(xì)胞。然后拋棄外周血單核細(xì)胞級分，并將紅細(xì)胞/粒細(xì)胞級分按照生產(chǎn)商的方案(B1legend, San Diego CA)進(jìn)行紅血細(xì)胞裂解緩沖液處理，隨后在漢克氏緩沖的鹽溶液(Cellgro)中洗滌2次以除去裂解試劑和細(xì)胞碎片。接著，將金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)物在胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基(Cellgro)中培養(yǎng)過夜。在實驗開始之前使用得到的培養(yǎng)物接種新培養(yǎng)物以確保對數(shù)期生長。將細(xì)菌培養(yǎng)物沉淀(2000 X g離心10 min)，并用漢克氏緩沖的鹽溶液(Cellgro)洗滌3次。然后在適用時給如上制備的原代單核細(xì)胞/粒細(xì)胞補(bǔ)充10%人血清(Innovative Research, Novi Ml)和ImM EGTA(Sigma-Adrich, St.Louis MO)，并在冰上冷卻30分鐘。30分鐘以后，加入金黃色葡萄球菌(3.33的MOI)，并將混合物在冰上溫育另外20分鐘以使結(jié)合同步化。然后將試管在37°C溫育20分鐘。20分鐘以后，將10U/mL溶葡萄球菌酶(Sigma-Aldrich)加入每個試管中以消除未內(nèi)化的金黃色葡萄球菌。在期望的時間點(20、30、60分鐘)，取出20uL等分試樣并在1mL水中稀釋。將稀釋試管渦旋并將其在室溫靜置10分鐘以確保原代細(xì)胞的適當(dāng)裂解。10分鐘以后，將稀釋試管在2000 X g離心10分鐘，將剩余的金黃色葡萄球菌濃縮20倍。然后將含有金黃色葡萄球菌的樣品一式三份地鋪板在胰蛋白酶大豆瓊脂(Cellgr0)上，并在37 °C溫育過夜以允許次日菌落計數(shù)。
[0082]關(guān)于感染和傷口愈合的體片模型
如上面已經(jīng)指出的，鈣通量激動劑與TLR和NOD配體協(xié)作以活化與免疫活化有關(guān)的途徑。鑒于TLR和NOD配體在感染和損傷中的普遍，發(fā)明人因此預(yù)見到，鈣通量激動劑在這些背景下的引入會極大地縮短疾病的持續(xù)時間和/或增進(jìn)修復(fù)功能。為了證實這樣的模型，在感染前治療實驗中試驗了不同鈣通量激動劑的改變傷口愈合動力學(xué)和影響細(xì)菌清除的能力。
[0083]為了確定鈣通量激動劑(諸如離子載體A23187和離子霉素)或SERCA栗抑制劑毒胡蘿卜內(nèi)酯是否可以用作細(xì)菌感染的預(yù)治療，發(fā)明人用僅媒介物或含有2 mM A23187、離子霉素或毒胡蘿卜內(nèi)酯的制劑處理了 6-8周齡雄性C57B1/6小鼠的剃毛背側(cè)皮膚。I天后，發(fā)明人用2xl06 CFU的金黃色葡萄球菌在淺表感染5只小鼠組的背側(cè)皮膚，并在接下來的一周中評價細(xì)菌負(fù)荷和創(chuàng)傷大小。使用該模型，發(fā)明人研究了鈣通量激動劑是否對傷口愈合具有有益效果(通過大小來測量)，如在圖7中證實的。令人感興趣的是，用離子載體或毒胡蘿卜內(nèi)酯治療的動物在感染的第3、5和7天表現(xiàn)出與對照治療動物相比明顯更小的創(chuàng)傷大小(p〈0.01，通過Student氏T-檢驗確定)。此外，用含有離子載體或毒胡蘿卜內(nèi)酯的制劑預(yù)治療的動物在第7天在感染部位處具有與媒介物對照相比顯著更少的細(xì)菌(圖8)。
[0084]局部遞送:將A23187和離子霉素和毒胡蘿卜內(nèi)酯在無水乙醇(SpectrumChemicals, Gardena CA)中重構(gòu)至適當(dāng)濃度用于以后配制。在感染前體片研究中，局部制劑由 75% 無水乙醇(Spectrum Chemicals)、22% 環(huán)己燒(Sigma-Aldrich)和 3% 二甲亞諷(Sigma-Aldrich)組成。如下遞送每個局部制劑:浸漬具有1.0厘米直徑的圓形Whatman紙(Whatman, a divis1n of GE Healthcare)塊，并將所述圓塊施加于每個受體的皮膚5分鐘。
[0085]用于皮膚接種的金黃色葡萄球菌的制備:簡而言之，將中對數(shù)期的金黃色葡萄球菌細(xì)菌洗滌2次，并以指定的濃度再懸浮于無菌鹽水(0.9%)中。小鼠:在所有實驗中使用6-8周齡的具有C57BL/6遺傳背景的雄性小鼠(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) 0
[0086]金黃色葡萄球菌皮膚傷口感染的小鼠模型:為了準(zhǔn)備動物用于傷口感染，使用#40剪切機(jī)將小鼠的后上背部和頸部的皮膚剃毛。接著，在真皮中做出3個平行的8 mm長全厚度解剖刀切口(第11號刀片)。用微量移液器給產(chǎn)生的創(chuàng)傷接種10 μ I金黃色葡萄球菌(2xlOsCFU/mL)。通過使用毫米尺子作為參照確定得自動物照片的總像素計數(shù)，量化總病灶大小(cm2)測量結(jié)果。
[0087]體片金黃色葡萄球菌細(xì)菌負(fù)荷的定量:為了確定體片細(xì)菌負(fù)荷，將被感染的小鼠在感染后第7天處死，并通過外科手術(shù)收獲病灶。將收獲的組織勻漿化，并在適當(dāng)?shù)墓腆w生長培養(yǎng)基上鋪板以后確定細(xì)菌計數(shù)。
[0088]抗細(xì)菌作用
與這些和以前的關(guān)于它們對金黃色葡萄球菌的固有抗生素活性的結(jié)果相一致，發(fā)明人證實了就甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)的直接抗生素活性而言的兩種離子載體的直接抗生素活性。如預(yù)期的，兩種離子載體在液體培養(yǎng)物測定中對MSSA具有活性，其中A23187是更有活性的化合物。令人感興趣的是，兩種化合物表現(xiàn)出對甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株的顯著抗生素活性。
[0089]例如，圖9A和9B的圖分別顯示了金黃色葡萄球菌對A23187和離子霉素的抗生素敏感性，且圖9C顯示了金黃色葡萄球菌對CPA的抗生素敏感性。從所述圖可以看出，兩種離子載體具有某種直接抗生素作用，但是，該作用顯著小于使用卡那霉素作為直接抗生素的對照。相反，圖10的圖描繪了 SERCA抑制劑毒胡蘿卜內(nèi)酯對金黃色葡萄球菌的直接抗生素作用的缺乏，甚至在高濃度。為了確定金黃色葡萄球菌的抗生素敏感性，將培養(yǎng)物在胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基(Cellgro)中培養(yǎng)過夜。在實驗開始之前使用得到的培養(yǎng)物接種新培養(yǎng)物以確保對數(shù)期生長。一旦細(xì)菌已經(jīng)達(dá)到對數(shù)期，將細(xì)菌稀釋至適當(dāng)?shù)?D_ ~0.05并轉(zhuǎn)移至24-孔板。加入目標(biāo)化合物，并將平板在搖動培養(yǎng)箱中在37°C溫育。在不同的時間點取出等分試樣，并使用B1Tek Synergy2微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(B1Tek，Winooski, VT)測量它們各自的0D_。對于其濁度受到目標(biāo)化合物的加入影響的孔，取出等分試樣并鋪板在胰蛋白酶大豆瓊脂(Cellgr0)上，并在37°C溫育過夜，并在次日計數(shù)。因而，應(yīng)當(dāng)理解，鈣通量激動劑通過間接作用在抗微生物治療中是有效的，最可能是由于增強(qiáng)的IL-8產(chǎn)生和增加的NF- κ B驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄。
[0090]此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，可以以預(yù)防性方式使用間接抗生素作用。例如，發(fā)明人證實，與未用毒胡蘿卜內(nèi)酯處理過的類似地成熟的細(xì)胞相比，前單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞處理過的毒胡蘿卜內(nèi)酯表現(xiàn)出更大的抗微生物活性(圖11)。簡而言之，將對數(shù)分裂的金黃色葡萄球菌沉淀(2000 X g離心10 min)，并用漢克氏緩沖的鹽溶液(Cellgro)洗滌3次。并行地，將分化(使用IuM視黃酸和IuM膽骨化醇，Sigma-Aldrich) 2天的、隨后用20 nM毒胡蘿卜內(nèi)酯或媒介物處理I天的THP-1細(xì)胞收集并在漢克氏緩沖的鹽溶液中洗滌。給分化細(xì)胞補(bǔ)充10%人血清(Innovative Research)，并在冰上冷凍30分鐘。30分鐘以后，在冰上加入金黃色葡萄球菌(10的Μ0Ι)保持另外20分鐘以使結(jié)合同步化。然后將試管在37°C溫育20分鐘。20分鐘以后，加入10U/mL溶葡萄球菌酶(Sigma-Aldrich)以消除未內(nèi)化的細(xì)菌