鈣通量激動(dòng)劑及其方法
【專利說(shuō)明】鈣通量激動(dòng)劑及其方法
[0001]本申請(qǐng)要求于2012年11月13日提交的我們的共同未決的臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/725881的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域是藥物化合物的組合物和方法，特別是局部施用的鈣通量激動(dòng)劑的組合物和方法。
【背景技術(shù)】
[0003]多種鈣通量激動(dòng)劑是本領(lǐng)域已知的且具有非常不同的起源。例如，某些化合物作為離子載體起作用且通常通過(guò)將鈣離子輸入進(jìn)細(xì)胞中而升高細(xì)胞內(nèi)鈣水平，而其它化合物通過(guò)增加從細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存體(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體)的鈣分泌而升高細(xì)胞內(nèi)鈣水平。
[0004]在多種其它已知的離子載體中，卡西霉素(A23187)和離子霉素是在數(shù)十年前最初被描述為抗生素的天然產(chǎn)物(分別得自革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌Streptomyces chartreusensis和密團(tuán)鏈霉菌(SirejOconglobatus'))。更具體地，如在 US 3960667 和 US 3873693中所報(bào)道的，A23187和離子霉素表現(xiàn)出針對(duì)多種潛在微生物病原體的直接抗生素活性。不同于抑制微生物增殖(諸如細(xì)菌細(xì)胞壁合成或細(xì)菌核糖體功能)特有的生化途徑的經(jīng)典抗生素(例如，青霉素或四環(huán)素)，A23187和離子霉素屬于以相對(duì)較高的特異性結(jié)合作為底物的二價(jià)陽(yáng)離子的單獨(dú)一類抗生素化合物。例如，A23187結(jié)合親和力的特征在于Mn2+>Ca2+=Mg2+>Sr2+>Ba2+，而離子霉素結(jié)合親和力的特征在于Ca2+>Mg2+> Ba2+ >Sr2+。
[0005]另一方面，毒胡蘿卜內(nèi)酯(thapsigargin)是一種典型的ER促分泌劑，且可以被表征為倍半蔽內(nèi)酯。毒胡蘿卜內(nèi)酯分離自植物(毒胡蘿卜{Thapsia garganica))且作為各種肌質(zhì)網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ ATP酶(SERCA)的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑起作用。毒胡蘿卜內(nèi)酯:SERCA結(jié)合表現(xiàn)出在低皮摩爾范圍內(nèi)的親和常數(shù)，且對(duì)分裂中的細(xì)胞和非分裂的細(xì)胞具有毒性。在動(dòng)物中，與毒胡蘿卜內(nèi)酯的有限皮膚接觸可以導(dǎo)致炎癥，且慢性重復(fù)局部暴露可以導(dǎo)致非惡性的乳頭狀瘤形成(當(dāng)與強(qiáng)DNA損傷劑結(jié)合使用時(shí))。除了毒胡蘿卜內(nèi)酯(和結(jié)構(gòu)類似物如毒胡蘿卜辛(thapsigargicin)等)以外，其它SERCA抑制劑包括環(huán)匹阿尼酸(CPA)和2，5- 二叔丁基氫醌(DBHQ)。
[0006]由于以下幾個(gè)原因，難治的皮膚感染代表一個(gè)新出現(xiàn)的公共衛(wèi)生擔(dān)憂:所述原因包括不斷增長(zhǎng)的遭受慢性皮膚潰瘍的糖尿病患者的數(shù)目，抗生素抗性的微生物菌群(例如，甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(ayreiAs)或MRSA)的存在，和增加的壞死性筋膜炎(或“食肉細(xì)菌病”)的暴發(fā)頻率。除了細(xì)菌以外，許多真菌和病毒也可以造成皮膚的重大感染。盡管抗生素仍然是這些障礙中的許多障礙的最佳治療選擇，合乎需要的是，刺激患者自身的細(xì)胞和它們的有關(guān)功能以進(jìn)一步改善患者從進(jìn)行中的感染恢復(fù)，且可能甚至刺激針對(duì)討厭生物的長(zhǎng)期免疫以限制在以后遇到時(shí)的發(fā)病機(jī)制。
[0007]在高等生物中，包括皮膚在內(nèi)的上皮組織充當(dāng)針對(duì)基于病原體的損害、化學(xué)損害和物理?yè)p害的關(guān)鍵屏障。皮膚的表皮層包含角質(zhì)形成細(xì)胞、免疫細(xì)胞諸如朗格漢斯細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞、梅克爾細(xì)胞和黑素細(xì)胞。除了朗格漢斯細(xì)胞(其為負(fù)責(zé)疾病監(jiān)測(cè)的樹(shù)突細(xì)胞(DC)的一種亞型)以外，角質(zhì)形成細(xì)胞(其占總表皮群體的約95%)也通過(guò)它們的不同模式識(shí)別受體(諸如toll-樣受體(TLR)蛋白的成員、C-型凝集素受體(CLR)、炎性體等)的表達(dá)而充當(dāng)免疫哨兵。
[0008]它們的同源配體對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中的這些受體的活化會(huì)導(dǎo)致趨化因子(諸如白介素-8 (IL-8)、CCL2和CCL20，以募集其它免疫細(xì)胞)以及調(diào)節(jié)免疫的細(xì)胞因子(諸如TGF-β和IL-10)的釋放。在表皮下面，真皮包含更大種類的細(xì)胞類型，包括⑶4+ (Thl、Th2、Thl7等)和非經(jīng)典的(例如γ δ, ΝΚ-、等)T淋巴細(xì)胞的不同子集、多種抗原呈遞細(xì)胞(諸如巨噬細(xì)胞和真皮DC和漿細(xì)胞樣DC)、肥大細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，其中的許多表達(dá)上述的多種模式識(shí)別蛋白。這樣，表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞協(xié)作以防止微生物侵入或可能導(dǎo)致重大疾病的其它物理?yè)p害。
[0009]TLR蛋白(在人類中的TLR 1_10)是I型膜蛋白，其充當(dāng)與疾病和組織體內(nèi)穩(wěn)態(tài)有關(guān)的特定類別的配體的模式識(shí)別受體(PRR)，且因此同樣在多種免疫和非免疫細(xì)胞類型上表達(dá)。與所有受體一樣，TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由配體結(jié)合觸發(fā)，且可以將配體分組成病原體相關(guān)的分子模式(或ΡΑΜΡ)和疾病相關(guān)的分子模式(DAMP)。
[0010]識(shí)別TLR的PAMP包括細(xì)菌脂蛋白/脂肽、脂糖、鞭毛蛋白和未甲基化的CpG DNA、真菌細(xì)胞壁組分(例如酵母多糖)和病毒核酸(dsRNA、ssRNA和CpG DNA)，而DAMP直接衍生自宿主，可以在沒(méi)有感染存在下發(fā)生，且主要被TLR家族蛋白的僅2個(gè)成員(TLR2和/或TLR4)識(shí)別。
[0011]—旦被它們的適當(dāng)配體活化，TLR會(huì)開(kāi)始信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián)，該級(jí)聯(lián)用于限制感染/疾病的程度和觸發(fā)組織修復(fù)。就后者而言，TLR配體識(shí)別會(huì)導(dǎo)致抗微生物活性的上調(diào)，并造成多種免疫學(xué)參與者的活化/成熟以完成入侵病原體的破壞。例如，TLR活化可以導(dǎo)致活性氧(ROS)、抗微生物肽的釋放、以及先天細(xì)胞諸如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等中的吞噬功能的上調(diào)。除了它們?cè)趯?duì)抗疾病中的作用以外，TLR也涉入組織修復(fù)和再生，如在組織損傷(包括由化學(xué)試劑、輻射、外科手術(shù)和傳染性損傷誘發(fā)的那些)的不同模型中所證實(shí)的。
[0012]另一類模式識(shí)別受體由NOD-樣受體蛋白家族形成，且包括NODl和N0D2作為最突出的成員。NODl和N0D2是細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體，其在結(jié)構(gòu)上類似于植物的抗性蛋白，并通過(guò)識(shí)別分別含有D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸和胞壁?；牡募?xì)菌分子而介導(dǎo)先天性和獲得性免疫。在被它們各自的配體刺激以后，兩種NOD蛋白通過(guò)各自的識(shí)別結(jié)構(gòu)域與RIPK2相互作用，這最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF- K B的活化。
[0013]以前的表征完整皮膚對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子激動(dòng)劑(諸如蛋白激酶C激動(dòng)劑TPA/PMA或持續(xù)的鈣通量激動(dòng)劑如A23187、離子霉素或毒胡蘿卜內(nèi)酯)的局部施用的應(yīng)答的努力證實(shí)了一系列下游結(jié)果。例如，佛波醇酯TPA的局部施用會(huì)造成血管舒張、微血管滲透性改變、炎癥細(xì)胞募集和促炎癥因子從多種細(xì)胞類型的釋放。與PKC激動(dòng)劑不同，使用持續(xù)的鈣通量激動(dòng)劑(SCFA)的局部治療會(huì)導(dǎo)致皮膚炎癥和增殖過(guò)度。另一方面，在有相對(duì)較高量的鈣離子載體(離子霉素)存在下細(xì)胞向TLR配體(LPS)的暴露不會(huì)導(dǎo)致任何可測(cè)量的免疫刺激作用(Proc Natl Acad Sci USA.2012 年 7 月 10 日；109(28): 11282-7)。如在US 2012/0272700A1和US 2013/0183343A1中討論的，當(dāng)以相對(duì)較高的劑量個(gè)別地施用時(shí)，已知鈣離子載體和TLR配體會(huì)刺激分化或活化樹(shù)突細(xì)胞。
[0014]因此，盡管鈣通量激動(dòng)劑和/或TLR/N0D的配體的眾多組合物和應(yīng)用是本領(lǐng)域已知的，仍然需要提供會(huì)提供改善的免疫調(diào)節(jié)活性的組合物和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明主題涉及鈣通量激動(dòng)劑的多種組合物和方法，其中使用這些化合物來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)TLR-或NOD-介導(dǎo)的事件的免疫應(yīng)答，特別是協(xié)同地增加對(duì)TLR和/或NOD配體結(jié)合的應(yīng)答。值得注意的是，在鈣通量激動(dòng)劑以次優(yōu)濃度存在的情況下，觀察到就免疫刺激而言的協(xié)同效應(yīng)。
[0016]從不同的角度看，發(fā)明人預(yù)見(jiàn)到鈣通量激動(dòng)劑用于放大細(xì)胞內(nèi)Ca2+依賴性的TLR/N0D信號(hào)傳遞的用途。因此，且在其它合適的用途中，特別預(yù)見(jiàn)到的用途包括:預(yù)調(diào)節(jié)組織以允許增強(qiáng)的對(duì)TLR/N0D依賴性的刺激(例如，感染或損傷)的應(yīng)答，和/或用鈣通量激動(dòng)劑治療上皮的局部或其它感染以放大細(xì)胞內(nèi)Ca2+依賴性的TLR/N0D信號(hào)傳遞。結(jié)果，發(fā)明人也預(yù)見(jiàn)到局部藥用和化妝用組合物，其用于預(yù)防和/或治療皮膚感染和其它病癥(例如，糖尿病性潰瘍)以刺激傷口愈合和/或減少瘢痕形成。
[0017]在本發(fā)明主題的一個(gè)方面，發(fā)明人預(yù)見(jiàn)到鈣通量激動(dòng)劑用于增強(qiáng)免疫感受態(tài)細(xì)胞對(duì)模式識(shí)別受體的配體的免疫應(yīng)答的用途。例如，在鈣通量激動(dòng)劑是鈣離子載體的情況下，優(yōu)選的激動(dòng)劑包括離子霉素、卡西霉素、白僵菌素、鈣離子載體I1、鈣離子載體IV、鈣離子載體V和鈣離子載體VI，且在激動(dòng)劑是SERCA抑制劑的情況下，優(yōu)選的SERCA抑制劑包括DBHQ (2，5-二叔丁基氫醌)、毒胡蘿卜內(nèi)酯、釕紅、姜酚、蕈青霉素和環(huán)匹阿尼酸。在其它可觀察的現(xiàn)象中，通常通過(guò)增加的IL-8分泌和/或增加的NF- K B信號(hào)傳遞的活化來(lái)證實(shí)增強(qiáng)的免疫應(yīng)答，且優(yōu)選的是，在有配體存在下，特別是在以次優(yōu)濃度(就在沒(méi)有配體存在下鈣通量激動(dòng)劑的最大作用而言)使用鈣通量激動(dòng)劑的情況下，鈣通量激動(dòng)劑協(xié)同地增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
[0018]就合適的細(xì)胞而言，通常預(yù)見(jiàn)到，所述細(xì)胞是免疫感受態(tài)細(xì)胞，其優(yōu)選地存在于皮膚的表皮層或真皮層中。此外，免疫感受態(tài)細(xì)胞通常表達(dá)TLR受體和/或NOD受體作為模式識(shí)別受體。因而，配體通常包括PAMP和DAMP配體。
[0019]結(jié)果，發(fā)明人也預(yù)見(jiàn)到鈣通量激動(dòng)劑在制備局部施用以增強(qiáng)皮膚的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。在這樣的用途中，免疫應(yīng)答通常與免疫感受態(tài)細(xì)胞中(PAMP或DAMP)配體對(duì)模式識(shí)別受體的結(jié)合有關(guān)，且所述模式識(shí)別受體最通常是TLR受體或NOD受體。如上面所指出的，優(yōu)選的鈣通量激動(dòng)劑包括鈣離子載體(例如，離子霉素、卡西霉素、鈣離子載體I1、鈣離子載體IV、鈣離子載體V或鈣離子載體VI)和SERCA抑制劑(例如，2，5- 二叔丁基氫醌、毒胡蘿卜內(nèi)酯、釕紅、姜酚、蕈青霉素或環(huán)匹阿尼酸等)，和/或所述鈣通量激動(dòng)劑以這樣的濃度存在于藥物中:所述濃度使得所述激動(dòng)劑存在于有次優(yōu)濃度的配體存在的細(xì)胞中。
[0020]結(jié)果，和從不同的角度看，發(fā)明人也預(yù)見(jiàn)到鈣通量激動(dòng)劑在制備局部施用以增強(qiáng)皮膚的傷口愈合的藥物中的用途。在這樣的用途中，所述鈣通量激動(dòng)劑通常以有效地活化創(chuàng)傷中的細(xì)胞的NF-K B信號(hào)傳遞的量存在。在所述創(chuàng)傷被細(xì)菌病原體(通常表達(dá)或產(chǎn)生TLR受體和/或NOD受體的配體)感染的情況下，這樣的用途是特別有利的。
[0021]在本發(fā)明主題的另一個(gè)方面，發(fā)明人也預(yù)見(jiàn)到藥物組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體中的鈣通量激動(dòng)劑(例如，鈣離子載體或SERCA抑制劑)，其中所述藥物組合物被配制成用于局部施用至受損傷的或被感染的皮膚，且其中所述鈣通量激動(dòng)劑以這樣的量存在:在將所述制劑施用于受損傷的或被感染的皮膚以后，其增強(qiáng)受損傷的或被感染的皮膚中的免疫感受態(tài)細(xì)胞對(duì)模式識(shí)別受體的配體(例如，TLR受體或NOD受體)的免疫應(yīng)答。盡管這樣的藥物組合物可以配制例如為液體、噴霧劑或凝膠，也預(yù)見(jiàn)到所述藥物組合物被配制成用于經(jīng)由施加于受損傷的或被感染的皮膚的固