miR590的用途及其相關(guān)藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及miR590的用途及其相關(guān)藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]腎臟是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最重要的器官之一，在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用，其主要功能體現(xiàn)為排泄體內(nèi)廢棄物、維持體內(nèi)電解質(zhì)平衡以及分泌EPO等功能。因此腎臟功能一旦受到損傷，超過自身的代償，機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)一系列生理病理功能紊亂，直至最終導(dǎo)致腎臟功能的衰竭。在絕大多數(shù)腎臟疾病中，腎臟的纖維化幾乎是存在于所有腎臟疾病過程中。其特征性的表現(xiàn)主要是過多的細(xì)胞外基質(zhì)沉積在細(xì)胞與細(xì)胞之間，從而影響著腎小球和腎小管的纖維化或硬化。對(duì)于纖維化這一病理過程，目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者都傾向于認(rèn)同的一種觀點(diǎn)是上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(即EMT)在腎臟纖維化的過程中發(fā)揮著重要作用，而阻止EMT的過程對(duì)腎臟纖維化的防治可能具有重要臨床價(jià)值。然而有哪些分子在EMT過程中起重要作用還不完全清楚。隨著小分子microrna的發(fā)現(xiàn)及其機(jī)理的闡明，研究者發(fā)現(xiàn)一大批microrna分子參與了 EMT過程。
[0003]miRNAs是一類分子大小大約為22_25nt大小的小的非編碼RNA序列，其主要作用是通過結(jié)合靶基因3’UTR從而影響靶基因mRNA的降解或翻譯。自1993年首次發(fā)現(xiàn)這類小分子RNA以來(lái)，對(duì)于miRNA的研究呈現(xiàn)暴發(fā)式增長(zhǎng)。在腎臟研究領(lǐng)域關(guān)于miRNA的研究主要是基于條件性敲除Drosa或Dicer的小鼠模型。通過該技術(shù)人們發(fā)現(xiàn)miRNAs在生物體的各種生理病理過程中都發(fā)揮著作用，像胚胎的發(fā)育、分化，細(xì)胞的增值凋亡、代謝，腫瘤的迀移等。而miRNA在腎臟纖維化相關(guān)的病理過程的研究還處在起步階段，許多相關(guān)的分子事件還沒有完全闡明。
[0004]TGF β R2是TGF β信號(hào)通路中一個(gè)比較關(guān)鍵的分子。其作為細(xì)胞膜受體與TGF β Rl形成異二聚體接受外界的信號(hào)刺激從而激活TGF β /SMAD信號(hào)通路。TGF β /SMAD信號(hào)通路參與生物體內(nèi)的各種生理病理過程，其中就包括ΕΜΤ。之前有研究表明TGFi3 R2可以作為一個(gè)EMT的促進(jìn)因子在各種生理病理過程中發(fā)揮著作用，其上游的調(diào)控子是miR655。
[0005]而miR590在腎纖維化中的功能尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供了 miR590基因在腎臟組織的纖維化過程中的作用。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008]本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的miR590基因在制備或篩選腎臟纖維化治療藥物或制劑中的用途。
[0009]所述將分離的miR590基因用于制備或篩選腎臟纖維化治療藥物或制劑包括兩方面的內(nèi)容:其一，將miR590基因作為藥物或制劑的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腎臟纖維化治療藥物或制劑；其二，將miR590基因作為藥物或制劑的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腎臟纖維化治療藥物或制劑。
[0010]所述將miR590基因作為藥物或制劑的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腎臟纖維化治療藥物或制劑具體是指:將miR590基因作為藥物或制劑作用的靶標(biāo)，來(lái)研制針對(duì)腎臟纖維化細(xì)胞的藥物或制劑，從而提高腎臟纖維化細(xì)胞內(nèi)miR590基因的表達(dá)水平。
[0011]所述將miR590基因作為藥物或制劑的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腎臟纖維化治療藥物或制劑具體是指具體是指:將miR590基因作為藥物或制劑作用的靶標(biāo)，對(duì)藥物或制劑進(jìn)行篩選，以找到可以促進(jìn)miR590基因表達(dá)的藥物作為腎臟纖維化治療備選藥物。諸如基因、抗體藥物，小分子藥物等可將miR590基因及其蛋白作為作用對(duì)象。例如，本發(fā)明通過在腎纖維化細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.l-miR590來(lái)過表達(dá)miR590。
[0012]進(jìn)一步地，所述藥物或制劑通過促進(jìn)miR590表達(dá)水平來(lái)起到治療腎臟纖維化的作用。
[0013]進(jìn)一步地，所述藥物或制劑通過過表達(dá)miR590來(lái)起到治療腎臟纖維化的作用。
[0014]進(jìn)一步地，所述miR590通過抑制腎臟纖維化過程中的EMT過程來(lái)起到治療腎臟纖維化的作用。
[0015]所述EMT過程是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。
[0016]進(jìn)一步地，所述miR590通過靶向作用于TGF β R2而起到抑制EMT過程的作用。
[0017]優(yōu)選地，所述miR590通過與TGFP R2 3’ UTR結(jié)合而靶向作用于TGFP R2。
[0018]優(yōu)選地，所述miR590通過抑制TGF β R2表達(dá)水平而起到抑制EMT通路的作用。
[0019]本發(fā)明的第二方面，提供了一種腎臟纖維化治療藥物或制劑，所述藥物或制劑通過分離的miR590基因制備或篩選獲得，所述藥物或制劑含有有效量的過表達(dá)miR590的藥效成分。
[0020]所述腎臟纖維化治療藥物或制劑包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學(xué)藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0021]所述核酸包括但不限于:反義寡核苷酸、雙鏈RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi)切酶III制備的小干擾RNA(esiRNA)或者短發(fā)夾RNA(shRNA)。
[0022]所述藥物或制劑的施用量為足夠提高miR590基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠提高miR590蛋白的表達(dá)或活性的劑量。以使miR590基因的表達(dá)維持在能夠抑制EMT過程的水平。
[0023]本發(fā)明的第三方面提供了一種分離的miR590基因在制備腎臟纖維化診斷藥物或制劑中的用途。
[0024]所述將miR590基因用于制備腎臟纖維化診斷藥物或制劑，是指將miR590基因表達(dá)產(chǎn)物作為一項(xiàng)腎臟纖維化診斷指標(biāo)應(yīng)用于腎臟纖維化診斷藥物或制劑的制備。
[0025]研究發(fā)現(xiàn):miR590基因在腎臟纖維化細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于正常腎臟細(xì)胞。提示miR590基因可能在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；miR590基因的表達(dá)水平可能成為腎臟纖維化傷診斷的標(biāo)志。
[0026]本發(fā)明的第四方面，提供了一種腎臟纖維化診斷試劑盒，所述試劑盒包括:特異性擴(kuò)增miR590轉(zhuǎn)錄本的引物或特異性抗miR590的抗體。
[0027]本發(fā)明的有益效果在于:
[0028]本發(fā)明首次揭示了腎臟在纖維化過程的確存在明顯的EMT現(xiàn)象并伴隨著miR590的下調(diào)，另一方面我們通過生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)TGF0R2可能是miR590的潛在靶基因。在體外的雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)本發(fā)明證實(shí)了 miR590與TGF β R2存在相互作用的可能，且采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在人近端小管上皮細(xì)胞(即HK2)向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中過表達(dá)miR590會(huì)導(dǎo)致TGF β R2表達(dá)的下調(diào)，并且抑制其EMT過程。而后通過siRNA干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGF β R2的下調(diào)對(duì)ΗΚ2細(xì)胞的EMT的影響與過表達(dá)miR590相同。在細(xì)胞中過表達(dá)TGF β R2時(shí)，ΗΚ2細(xì)胞EMT現(xiàn)象可以部分被被逆轉(zhuǎn)，這一系列數(shù)據(jù)說明miR590影響HK2細(xì)胞的上皮間質(zhì)化進(jìn)程可能通過TGF β R2起作用，進(jìn)而參與纖維化進(jìn)程。
【附圖說明】
[0029]圖1:miR590保守性分析示意圖。
[0030]圖2:TGF0R2 3，UTR保守性分析示意圖。
[0031]圖3:在HK2細(xì)胞中用TGFBl誘導(dǎo)的EMT。
[0032]圖4:在mRNA水平體內(nèi)外EMT模型的驗(yàn)證。
[0033]圖5:在蛋白水平體外EMT模型的驗(yàn)證。
[0034]圖6:miR590在體內(nèi)外的EMT模型中表達(dá)水平下降。
[0035]圖7:腎臟纖維化模型的組織學(xué)驗(yàn)證。
[0036]圖8:在蛋白水平體外EMT模型的驗(yàn)證。
[0037]圖9:miR590過表達(dá)效率驗(yàn)證。
[0038]圖10:miR590 對(duì) HK2 細(xì)胞 EMT 影響(mRNA)。
[0039]圖 11:miR590 對(duì) HK2 細(xì)胞 EMT 影響(protein)。
[0040]圖 12:miR590 對(duì) HK2 細(xì)胞 EMT 影響(protein)。
[0041]圖13:miR590對(duì)TGF β R2 3，UTR作用位點(diǎn)分析示意圖。
[0042]圖14:miR590 對(duì) TGF β R2 3，UTR 作用實(shí)驗(yàn)。
[0043]圖15:蛋白水平miR590對(duì)TGFP R2影響。
[0044]圖16:siRNA干擾技術(shù)沉默TGF β R2效率。
[0045]圖17:siRNA 沉默 TGFBR2 對(duì) ΗΚ2 細(xì)胞 EMT 影響(mRNA)。
[0046]圖18:siRNA沉默TGF β R2對(duì)ΗΚ2細(xì)胞EMT影響(蛋白水平)。
[0047]圖19:過表達(dá)TGF β R2對(duì)ΗΚ2細(xì)胞EMT影響。
【具體實(shí)施方式】
[0048]本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)miR590在EMT體外模型和體內(nèi)模型中都呈下降趨勢(shì)。接著，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)且過表達(dá)miR590可以有效抑制上皮細(xì)胞marker基因的表達(dá)及促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞marker基因上調(diào)。其所涉及的下游關(guān)鍵分子是TGFP R2，因?yàn)閙iR590可以影響TGF β R2的表達(dá)從而影響ΕΜΤ。
[0049]以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的【具體實(shí)施方式】加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0050]在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。
[0051]當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
[0052]除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技