生物膜、具有生物膜性的閉合結(jié)構(gòu)或細(xì)胞區(qū)室作為基因轉(zhuǎn)染試劑或者基因治療試劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)和高分子材料領(lǐng)域，具體涉及到由天然來源和/或自組裝得 到的生物膜及具有生物膜性的閉合結(jié)構(gòu)和細(xì)胞區(qū)室作為基因轉(zhuǎn)染試劑或者基因治療試劑 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物膜（biomembranes)或生物性膜（biological membranes)是細(xì)胞、細(xì)胞器和 其環(huán)境接界的所有膜結(jié)構(gòu)的總稱，起著劃分和分隔細(xì)胞和細(xì)胞器的作用，也是與細(xì)胞內(nèi)通 訊有關(guān)的重要部位。生物中除某些病毒外，都具有生物膜。真核細(xì)胞除質(zhì)膜(又稱細(xì)胞膜） 外，還有分隔各種細(xì)胞器的膜系統(tǒng)，包括核膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體膜、高爾基體膜、 葉綠體膜、液泡、過氧化酶體膜等。
[0003] 生物膜形態(tài)上都呈脂質(zhì)雙分子層（lipid bilayer)的片層結(jié)構(gòu)，其組成成分主要 是脂質(zhì)，另有少量的蛋白質(zhì)和糖類。生物膜的這種脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，使其具有以下功能： 調(diào)節(jié)和控制物質(zhì)進(jìn)出、細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器間物質(zhì)的包裝和運(yùn)輸、為某些試劑和信號物質(zhì)提 供特定的運(yùn)輸通路、以及通過形成細(xì)胞內(nèi)的區(qū)室（cellular compartment)來提供物質(zhì)儲存 的空間。
[0004] 生物膜的組分繁多，分離純化的難度較大，因此早年為便于研究，往往采用單一或 幾種脂質(zhì)組成的各種人工膜結(jié)構(gòu)：單分子層膜、累積膜、脂質(zhì)體、平板雙分子層脂膜等，另 外，也可將蛋白質(zhì)嵌入后組成重建膜，這些膜結(jié)構(gòu)泛稱"人工膜"。人工膜已在實(shí)際中得到應(yīng) 用，如從海水等溶液相中高效地分離和濃縮物質(zhì)、用作腎臟病患者的透析膜以及用于臨床 診斷和治療等，近些年利用脂質(zhì)體可以和細(xì)胞膜融合等特點(diǎn)制備脂質(zhì)體載體藥物是人工膜 的另一項比較大的拓展。
[0005] 但是，包括脂質(zhì)體在內(nèi)的這些人工膜，均具有在體外易氧化、滲漏、儲存性不好；在 體內(nèi)易被一些酶類物質(zhì)降解和巨噬細(xì)胞吞噬而不能到達(dá)靶組織發(fā)揮有效作用等缺點(diǎn)，這些 都限制了其作為載體的應(yīng)用。另一方面，人工合成物質(zhì)的添加，使得人工膜作為高分子材料 植入人體不可避免的會使機(jī)體產(chǎn)生排異，使用受限。
[0006] 在地球上出現(xiàn)有生命物質(zhì)和它由簡單到復(fù)雜的長期演化過程中，生物膜的出現(xiàn)是 一次飛躍，生物膜經(jīng)過億萬年的進(jìn)化才具有今天這般的精細(xì)結(jié)構(gòu)和精妙的功能活動機(jī)制， 其本身具有兩個最大的特性，即膜的流動性和膜的不對稱性。膜的流動性是指生物膜處于 不斷的運(yùn)動狀態(tài)，這使得膜中的脂質(zhì)分子不斷的交換位置，它是保證膜具有胞吞、胞吐、物 質(zhì)傳遞、細(xì)胞融合等功能的重要條件。不過也正是因為這種膜流動性導(dǎo)致膜的不斷變形，使 得組分相對天然生物膜較簡單的人工膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定等因素，導(dǎo)致脂質(zhì)體在內(nèi)的人工 膜作為載體穩(wěn)定性和儲存性差，包裹物易泄漏。此外，生物膜可分為近胞質(zhì)面和非胞質(zhì)面內(nèi) 外兩層，生物膜內(nèi)外二層的組分和結(jié)構(gòu)有很大差異，這種差異稱為生物膜的不對稱性，正是 這種膜的不對稱性對膜的排序、細(xì)胞融合、分子間識別產(chǎn)生重要的影響，而這種不對稱性是 人工膜完全沒辦法具有的。
[0007] 另一方面，生命是物質(zhì)存在的最高形式，生命所具有的最基本的特征是：通過新陳 代謝而實(shí)現(xiàn)自我調(diào)控、自我復(fù)制和自我裝配。自組裝（self-assembly)為系統(tǒng)之構(gòu)成元 素，指在不受人類外力之介入下，自行聚集、組織成規(guī)則結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。自組裝是各種復(fù)雜生 物結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)，與生命現(xiàn)象密不可分，生物膜是生物體給人們提供的自組裝研究的天 然模型。
[0008] 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指DNA片段被轉(zhuǎn)入特定生物中，與其本身的基因組進(jìn)行重組，再從 重組體中進(jìn)行數(shù)代的人工選育，從而獲得具有穩(wěn)定表現(xiàn)特定的遺傳性狀的個體。一方面該 技術(shù)可以使重組生物增加人們所期望的新性狀，培育出新品種；另一方面，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)不 僅是研究轉(zhuǎn)基因和基因表達(dá)的重要工具，而且是目前基因治療的關(guān)鍵步驟。理想的基因轉(zhuǎn) 染試劑應(yīng)該具有如下特點(diǎn)：高效轉(zhuǎn)染、安全、低細(xì)胞毒性、方法簡單、省時、經(jīng)濟(jì)。但是，現(xiàn)在 常用的轉(zhuǎn)染試劑不是轉(zhuǎn)染效率太低就是細(xì)胞毒性太大，因此，亟需尋找一種新的既能高效 轉(zhuǎn)染又能降低細(xì)胞毒性的轉(zhuǎn)染試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服目前尚存在應(yīng)用缺陷的人工膜的不足之處，本發(fā)明的第一個目的是提供 天然來源和/或自組裝技術(shù)得到的生物膜、具有生物膜性的閉合結(jié)構(gòu)或細(xì)胞區(qū)室作為基因 轉(zhuǎn)染試劑或者基因治療試劑的應(yīng)用。本發(fā)明和第二個目的是提供一種基因轉(zhuǎn)染試劑或者基 因治療試劑組合物。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案： 生物膜、具有生物膜性的閉合結(jié)構(gòu)或細(xì)胞區(qū)室作為基因轉(zhuǎn)染試劑或者基因治療試劑的 應(yīng)用，該生物膜、具有生物膜性的閉合結(jié)構(gòu)或細(xì)胞區(qū)室為天然來源和/或自組裝技術(shù)得到， 生物來源為動物、植物或微生物，所得到的生物膜是完整的或者是片段的，形態(tài)上為呈脂質(zhì) 雙分子層結(jié)構(gòu)，其組成成分主要是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，另有少量糖類通過共價鍵結(jié)合在脂質(zhì)或 蛋白質(zhì)上。
[0011] 作為優(yōu)選，所述的生物膜、具有生物膜性的閉合結(jié)構(gòu)或細(xì)胞區(qū)室，粒徑從IOnm到 幾十微米。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的生物膜、具有生物膜性的閉合結(jié)構(gòu)或細(xì)胞區(qū)室的形狀包括球狀、 囊泡狀、桿狀、螺旋狀的單層或者多層、多室的多種形態(tài)結(jié)構(gòu)。
[0013] 作為優(yōu)選，所述的生物膜包括質(zhì)膜、核膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體膜、高爾基 體膜、葉綠體膜和液泡和過氧化酶體膜一種或多種。
[0014] 作為優(yōu)選，所述的細(xì)胞區(qū)室是指一般的細(xì)胞器；作為再優(yōu)選，所述的細(xì)胞區(qū)室為線 粒體、葉綠體、過氧化物酶體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、高爾基體及囊泡和微管的一種或多 種。
[0015] 作為優(yōu)選，所述的應(yīng)用包括基因的膜內(nèi)包裹、膜內(nèi)包裹、表面吸附、表面交聯(lián)、膜間 嵌鑲和膜內(nèi)包裹加靶向。
[0016] 為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案： 一種基因轉(zhuǎn)染試劑或者基因治療試劑組合物，該組合物包括基因和生物膜、具有生物 膜性的閉合結(jié)構(gòu)或細(xì)胞區(qū)室，使用量為1~99%。
[0017] 作為優(yōu)選，使用量為10~80%。
[0018] 作為優(yōu)選，所述的基因包括從特定生物體基因組中提取得到的所需要的目的DNA/ RNA片段、人工合成指定序列的DNA/RNA片段中的一種或多種。
[0019] 上述任--個技術(shù)方案所述的生物膜、具有生物膜性的閉合結(jié)構(gòu)或細(xì)胞區(qū)室的制 備方法，該方法包括以下的步驟： 1) 獲得生物細(xì)胞； 2) 將步驟1)所述的細(xì)胞在其適宜的環(huán)境下大量培養(yǎng)； 3) 獲得步驟2)所述的細(xì)胞的裂解液，并通過差速離心法、密度梯度離心法和雙相萃取 法方法，各種方法單獨(dú)使用或者兩兩組合或者三者聯(lián)合使用提取所需生物膜、具有生物膜 性的閉合結(jié)構(gòu)和細(xì)胞區(qū)室。
[0020] 作為優(yōu)選，所述的差速離心提取方法包括以下的步驟： ① 將細(xì)胞裂解液以15, 000~30, OOOXg，10~30min，1~6°C條件下高速離心，棄沉淀，收 集上清液； ② 上清液以100, 〇〇〇~200, 000Xg，30~90min，1~6°C條件下超速離心，棄上清，收集沉 淀，即為所需提取的生物膜、具有生物膜性的閉合結(jié)構(gòu)或細(xì)胞區(qū)室，沉淀用含15~30%甘油 的PBS/生理鹽水重懸保存。
[0021] 作為優(yōu)選，所述的密度梯度離心提取方法包括以下的步驟： ① 將細(xì)胞裂解液沉淀后重新懸浮，重懸液加入到不同濃度的蔗糖溶液中，以 150, 000~300, 000Xg，60~90min，1~6°C條件下超速離心，收集所需層； ② 收集到的液體以100, 〇〇〇~200, 000Xg，30~90min，1~6°C條件下超速離心，棄上清， 收集沉淀，即為所需提取的生物膜、具有生物膜性的閉合結(jié)構(gòu)或細(xì)胞區(qū)室，沉淀用含15~30% 甘油的PBS/生理鹽水重懸保存。
[0022] 作為再優(yōu)選，所述的步驟①蔗糖溶液的質(zhì)量百分比濃度范圍為10~70% ;作為優(yōu) 選，所述的步驟①蔗糖溶液的不同質(zhì)量百分比濃度為10%、20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、 65%、70%。
[0023] 作為優(yōu)選，所述的雙相萃取方法包括以下的特征： ① 配置葡聚糖/聚乙二醇的水雙相混合物，于分液漏斗中混合均勻，4°C靜置過夜分 層，小心分離上下層，制成新鮮的上相和下相； ② 將細(xì)胞裂解液沉淀后重新懸浮并加入到水雙相混合物中，上下輕輕顛倒30~40次混 合均勻； ③ 以2,000~4. 000Xg，5~10min，4°C條件下離心，取上相和下相繼續(xù)進(jìn)入兩相系統(tǒng)，分 離三次后合并上相，稀釋5倍后，在60, 000~100. 000 X g，30~90min，4°C條件下離心，收集沉 淀，即為所需提取的生物膜、具有生物膜性的閉合結(jié)構(gòu)或細(xì)胞區(qū)室，沉淀用含15~30%甘油 的PBS/生理鹽水重懸保存。
[0024] 作為再優(yōu)選，所述的雙相為葡聚糖/聚乙二醇的雙相混合物。
[0025] 作為再優(yōu)選，所述的雙相包括水雙相或、有機(jī)雙相、水相溶液和有機(jī)相溶液，所述 溶劑選自水、乙腈、丙酮、四氫呋喃、甲醇、乙醇、丙醇的任一種或其組合。
[0026] 上述的生物膜、具有生物膜性的閉合結(jié)構(gòu)或細(xì)胞區(qū)室也可以通過自組裝制備方法 制得，該方法包括上述各個技術(shù)方案所述的制備方法，并將步驟3)獲得的生物膜、具有生物 膜性的閉合結(jié)構(gòu)和細(xì)胞區(qū)室的材料以干燥膜的形式覆蓋在容器的壁上，然后緩慢注入水或 者緩沖溶液，并輕微的或劇烈的振動，自組裝獲得所需的生物膜