netrin-1蛋白在制備用于腫瘤治療的藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用，特別涉及netrin-1蛋白在制備用 于腫瘤治療的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰導(dǎo)管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma，PDAC)是最致命的腫瘤之一， 在所有的胰腺腫瘤中，胰導(dǎo)管腺癌占到了 95%以上的比例。胰導(dǎo)管腺癌病例在發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù) 就已經(jīng)是晚期腫瘤或者已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移，僅有不足20%的患者能夠獲得手術(shù)治療的機(jī) 會(huì)，總體的中位生存期不足1年。目前對(duì)于胰腺癌的發(fā)病機(jī)制了解甚少，這也限制了針對(duì)性 的治療方案和藥物的開發(fā)。近年來，對(duì)于胰腺癌的分子水平的表達(dá)變化以及基因突變，基因 組上SNP的大規(guī)模分析方興未艾，隨著多種腫瘤模式生物，異體移植模型的應(yīng)用，對(duì)于胰腺 癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)分子機(jī)制的研究也有了長足的進(jìn)步。多種胰導(dǎo)管腺癌相關(guān)的基因突變，如 KRAS，p53,⑶KN2A，轉(zhuǎn)化生長因子受體（TGFI3)在患者病理組織內(nèi)被檢出，這提示了相應(yīng)分 子對(duì)于胰腺導(dǎo)管腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性?；虮磉_(dá)譜的分析則提供了更加廣泛跟胰腺癌 發(fā)生發(fā)展過程息息相關(guān)分子的表達(dá)變化情況。病理組織的表達(dá)芯片分析揭示了多達(dá)數(shù)百個(gè) 存在明顯的表達(dá)變化的基因，包括MAPK、hedgehog、Notch在內(nèi)的多個(gè)信號(hào)通路也被觀察到 了表達(dá)和磷酸化水平的變化。這些變化向我們展示了胰導(dǎo)管腺癌發(fā)生發(fā)展中潛在的調(diào)控過 程，并給新的藥物靶標(biāo)和治療途徑的探索提供了參考。
[0003] 最新的研究提示了軸突引導(dǎo)通路與胰腺癌的相關(guān)性。netrin-1分子作為軸突引導(dǎo) 過程中的重要分子，通過受體DCC，Neogenin，UNC5家族成員等分子介導(dǎo)了軸突沿netrin-1 濃度梯度的生長和排斥作用。除了參與神經(jīng)系統(tǒng)的軸突導(dǎo)向以外，netrin-1也在上皮組織 來源器官的早期形成和分支發(fā)生過程中，發(fā)揮重要的功能，通過與受體相互結(jié)合，介導(dǎo)上皮 組織的粘附和迀移等過程，從而構(gòu)建器官的正常形態(tài)和功能。此外，其受體是自身參與細(xì)胞 凋亡過程的"依賴型受體"，所以netrin-1與腫瘤的相關(guān)性很早就得到了相當(dāng)?shù)年P(guān)注，其受 體DCC以及UNC5家族部分成員（UNC5A，5B，5C)可以在配體netrin-1缺失時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 過程而在存在netrin-1結(jié)合時(shí)抑制凋亡維持細(xì)胞的生存。netrin-1還參與到p53通路的 調(diào)控過程，P53可以作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)UNC5B的表達(dá)，從而通過該依賴型受體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 過程，netrin-1與UNC5B的結(jié)合則可以阻斷p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。
[0004] ITGB4和Integrin 0 4是同一種蛋白，只不過ITGB4表示基因，而Integrin 0 4 表示蛋白。Integrins 0 4在腫瘤研究較多，但是在PDAC中功能的研究相對(duì)較少。Integrin 0 4在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào)，如乳腺癌，膀胱癌，結(jié)直腸癌和胰腺癌等。并且Integrin 04表達(dá)越高，臨床預(yù)后越差。Integrin (64主要從以下幾方面參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展： 穩(wěn)定細(xì)胞之間的黏附，促進(jìn)腫瘤迀移和侵襲，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，和促進(jìn)腫瘤血管的發(fā)生。 Integrin (64可以調(diào)節(jié)細(xì)胞連接半橋粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。其下游主要與integrin連接激酶 相結(jié)合，向細(xì)胞核內(nèi)傳遞信號(hào)。另外，Integrin 0 4可以與酪氨酸激酶受體相結(jié)合，如EGFR、 ERBB2、Met和Ron。酪氨酸激酶的激活可以使Integrin P 4激活，導(dǎo)致半橋粒的解聚，促進(jìn) 細(xì)胞迀移。
[0005] 早在 2003 年，Mayra Yebra 等第一次證明 Integrin a 3 0 1 和 Integrin a 6 0 4 是netrin-1的受體，參與胰腺細(xì)胞中netrin-1介導(dǎo)的細(xì)胞黏附和迀移。
[0006] 細(xì)胞迀移和侵襲是腫瘤細(xì)胞的重要特征。在PDAC細(xì)胞中，過表達(dá)Integrin 0 4可 以促進(jìn)EMT，進(jìn)而促進(jìn)PDAC細(xì)胞的迀移和侵襲。提示Integrin與PDAC的迀移和侵襲相關(guān)。 過表達(dá)Integrins可以激活轉(zhuǎn)錄因子AP1，進(jìn)而增加MMP9的表達(dá)水平。目前為止，只有為數(shù) 不多的幾篇報(bào)道研究netrin-1在PDAC發(fā)生發(fā)展中的作用，只是在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)netrin-1 可以促進(jìn)PDAC的發(fā)生發(fā)展，但缺乏動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)。而且netrin-1在PDAC中的作用受體， 下游信號(hào)通路，以及netrin-1所調(diào)節(jié)的效應(yīng)基因等問題都鮮有研究。對(duì)于netrin-1在腫 瘤診斷、預(yù)防和治療中的應(yīng)用，特別是對(duì)胰導(dǎo)管腺癌診斷、預(yù)防和治療中的應(yīng)用目前更是鮮 有研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 與之前研究的結(jié)果相反，申請(qǐng)人的研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)netrin-1可以抑制PDAC細(xì)胞 的3D生長，并且在動(dòng)物移植瘤實(shí)驗(yàn)中也得到了相似的結(jié)論：netrin-l可以抑制PDAC細(xì)胞 的成瘤。另外，我們?cè)诜肿铀缴显敿?xì)闡述了 netrin-1抑制PDAC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，這 可以為PDAC的藥物篩選以及藥物靶點(diǎn)的鑒定提供參考。
[0008] 本發(fā)明一方面提供一條完整的UNC5B信號(hào)通路，其披露了 netrin-1通過與UNC5B 結(jié)合激活下游信號(hào)通路進(jìn)而抑制ITGB4的表達(dá)，通過integrin P 4蛋白表達(dá)水平的降低來 抑制腫瘤生長。其中所述信號(hào)通路包括以下蛋白：UNC5B、netrin-1、integrin 0 4、FAK、 pp2a、Mek2、Erkl/2、C-Jun0
[0009] 本發(fā)明另一方面提供netrin-1蛋白在制備用于腫瘤治療的藥物中的用途。優(yōu)選 地，本發(fā)明提供netrin-1蛋白在用于制備抑制腫瘤集落形成的藥物中的用途。
[0010] 在還一方面，本發(fā)明提供檢測netrin-1蛋白表達(dá)的試劑在制備腫瘤診斷試劑盒 中的用途。
[0011] 優(yōu)選地，所述試劑為netrin-1蛋白的抗體。優(yōu)選地，所述腫瘤為胰腺癌，更優(yōu)選為 胰腺導(dǎo)管癌，最優(yōu)選為I/II期胰導(dǎo)管腺癌。優(yōu)選地，當(dāng)檢測netrin-1表達(dá)降低時(shí)，則提示 具有患有腫瘤的尚風(fēng)險(xiǎn)。
[0012] 本發(fā)明還提供含有編碼netrin-1蛋白的核酸的載體在制備用于腫瘤治療的藥物 中的用途。優(yōu)選地，所述載體為過表達(dá)netrin-1蛋白的載體。優(yōu)選地，所述藥物為抑制腫 瘤集落形成的藥物。所述藥物還可用于降低腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)組分的黏附能力。
[0013] 在另一方面，本發(fā)明還提供integrin 0 4蛋白在制備用于腫瘤治療的藥物中的用 途。
[0014] 本發(fā)明還提供用于抑制integrin (64蛋白表達(dá)的試劑在制備用于腫瘤治療的藥 物中的用途，所述試劑為用于對(duì)ITGB4進(jìn)行RNAi干擾的序列，其序列如SEQ ID N0:5-6所 示。所述序列通過RNAi抑制ITGB4基因的表達(dá)，從而抑制integrin (64蛋白表達(dá)。優(yōu)選 地，所述載體為ITGB4的RNAi載體，更優(yōu)選為pSIREN-ITGB4RNAi載體。
[0015] 在又一方面，本發(fā)明還提供UNC5B蛋白在制備用于腫瘤治療的藥物中的用途。
[0016] 本發(fā)明還提供用于抑制UNC5B蛋白表達(dá)的試劑在制備用于腫瘤治療的藥物中的 用途，所述試劑用于對(duì)UNC5B進(jìn)行RNAi干擾的序列，其序列如SEQ ID NO: 1-4所示。所述序 列通過RNAi抑制UNC5B基因的表達(dá)，從而抑制UNC5B蛋白表達(dá)。優(yōu)選地，所述試劑為UNC5B 的RNAi載體，更優(yōu)選為pSIREN-UNC5B RNAi載體。
[0017] 優(yōu)選地，所述腫瘤選自胰腺癌，更優(yōu)選為胰導(dǎo)管腺癌。
[0018] 本發(fā)明還提供一種用于治療和/或抑制腫瘤的藥物組合物，其包含netrin-1蛋白 或含有編碼netrin-l蛋白核酸的載體、以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體，所述腫瘤 優(yōu)選為胰腺癌，更優(yōu)選為胰腺導(dǎo)管腺癌。
[0019] 在本發(fā)明所述的用于治療和/或抑制腫瘤的藥物組合物中，netrin-l有效測試濃 度為 0_50ng/mL，優(yōu)選為 10、20、30、40、50ng/mL，更優(yōu)選為 10 或 20ng/mL，最優(yōu)選為 20ng/ mL，所述濃度為20ng/mL的netrin-l具有意想不到的治療效果。
[0020] 優(yōu)選地，所述藥物組合物包含過表達(dá)netrin-l蛋白的載體。
[0021] 優(yōu)選地，上述所有藥物為抑制腫瘤集落形成的藥物。
[0022] 本發(fā)明還提供UNC5B信號(hào)通路蛋白在制備用于腫瘤治療的藥物中的用途，其中所 述UNC5B信號(hào)通路蛋白選自UNC5B、netrin_l和integrin 0 4。
[0023] 優(yōu)選地，所述蛋白為UNC5B。
[0024] 優(yōu)選地，所述蛋白為netrin-l。
[0025] 優(yōu)選地，所述蛋白為integrin0 4。
[0026] 優(yōu)選地，所述藥物為抑制腫瘤集落形成的藥物。
[0027] 本發(fā)明還提供檢測UNC5B信號(hào)通路蛋白表達(dá)的試劑在制備腫瘤診斷試劑盒中的 用途，優(yōu)選地，所述試劑為抗netrin-l的抗體。
[0028] 本發(fā)明還提供分離的核酸，其是用于對(duì)UNC5B信號(hào)通路蛋白進(jìn)行RNAi干擾的序 列。
[0029] 優(yōu)選地，所述核酸為SEQ ID NO: 1-4所示的UNC5B的RNAi干擾序列。
[0030] 優(yōu)選地，所述核酸為SEQ ID NO:5-6所示的ITGB4的RNAi干擾序列。
[0031] 本發(fā)明還提供所述核酸在制備用于腫瘤治療的藥物中的用途，其中所述腫瘤選自 胰腺癌，更優(yōu)選為胰導(dǎo)管腺癌。
[0032] 本發(fā)明還提供包含所述核酸序列的載體。
[0033] 本發(fā)明提供所述編碼UNC5B信號(hào)通路蛋白的核酸。
[0034] 本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼netrin-l的核酸，其中核酸為如Genbank的序列 NM_004822. 2 所示的 mRNA。
[0035] 本發(fā)明還提供含有編碼UNC5B信號(hào)通路蛋白核酸的載體在制備用于腫瘤治療的 藥物中的用途。
[0036] 優(yōu)選地，所述核酸為編碼netrin-l的核酸。
[0037] 本發(fā)明所述的腫瘤選自胰腺癌，更優(yōu)選為胰導(dǎo)管腺癌。
[0038] 在另一方面，本發(fā)明還提供用于治療和/或抑制腫瘤的藥物組合物，其含有根據(jù) 本發(fā)明的UNC5B信號(hào)通路蛋白、編碼所述蛋白的核酸、或含有所述核酸的載體，以及一種或 多種藥用賦形劑或藥用載體，所述腫瘤優(yōu)選為胰腺癌，更優(yōu)選為胰腺導(dǎo)管癌。
[0039] 優(yōu)選地，所述藥物組合物包含UNC5B的RNAi載體，更優(yōu)選為pSIREN-UNC5B RNAi 載體。
[0040] 優(yōu)選地，所述藥物組合物包含ITGB4的RNAi載體，更優(yōu)選為pSIREN-ITGB4RNAi載 體。
[0041] 本發(fā)明還提供試劑在制備腫瘤診斷試劑盒中的用途，其中所述試劑用于檢測所述 UNC5B信號(hào)通路蛋白或編碼所述蛋白的核酸序列的表達(dá)，所述腫瘤優(yōu)選為胰腺癌，更優(yōu)選為 胰腺導(dǎo)管癌，最優(yōu)選為I/II期胰導(dǎo)管腺癌。
[0042] 本發(fā)明首次在動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)上證實(shí)了 UNC5B信號(hào)通路蛋白，如UNC5B、netrin-l 和integrin (64在腫瘤治療中的前景。并首次公開了 netrin-1在抑制腫瘤的信號(hào)通路 上的作用受體、下游信號(hào)通路、以及netrin-1所調(diào)節(jié)的效應(yīng)基因等。本發(fā)明首次證明過表 達(dá)netrin-1可以抑制胰導(dǎo)管腺癌生長，以及證明在在動(dòng)物移植瘤實(shí)驗(yàn)中通過抑制UNC5B或 integrin (64的表達(dá)也可以抑制胰導(dǎo)管腺癌生長。本發(fā)明的公布對(duì)于預(yù)防、診斷和治療胰 導(dǎo)管腺癌以及開發(fā)治療胰導(dǎo)管腺癌的藥物具有積極意義。
【附圖說明】
[0043] 圖IA至1D，圖IA表示構(gòu)建過表達(dá)netrin-1逆轉(zhuǎn)錄病毒所使用的pMSCV載體。載 體全長約6. 5kb，載體上包括一個(gè)5' LTR啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可以轉(zhuǎn)錄下游的W+病毒包裝 信號(hào)以及插入到多克隆位點(diǎn)（MCS)的目的基因，所述多克隆位點(diǎn)如圖IB所示。該載體含真 核篩選基因Neo和原核篩選基因氨芐抗性基因。圖IC表示構(gòu)建RNAi干擾用逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體所使用的RNAi-ready pSIREN-RetroQ載體。載體全長約6. 4kb，包含了 U6病毒啟動(dòng) 子及其下游的shRNA插入位點(diǎn)。其他組件還包括CMV啟動(dòng)子和下游的W+病毒包裝信號(hào)， PGK啟動(dòng)子啟動(dòng)的嘌呤霉素抗性基因以及在細(xì)菌中表達(dá)的氨芐抗性基因。圖ID顯示下游的 shRNA插入位點(diǎn)（BamHI，EcoRI粘性末端）。
[0044] 圖2表示構(gòu)建netrin-1過表達(dá)的MiaPaCaII細(xì)胞系。Westernblot顯示，感染 逆轉(zhuǎn)錄病毒的MiapacaII細(xì)胞成功過表達(dá)netrin-1蛋白。
[0045] 圖3A和圖3B，圖3A表示過表達(dá)和未過表達(dá)netrin-1的Miapaca II細(xì)胞系在雞 胚胎絨毛尿囊膜上成瘤能力的比較。過表達(dá)netrin-1的Miapaca II細(xì)胞在雞胚胎絨毛尿 囊膜（CAM)上的成瘤能力顯著下降。bar = Imm?圖3B表示過表達(dá)netrin-1的Miapaca II細(xì)胞降低其在雞胚胎絨毛尿囊膜上腫瘤形成的面積。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示過表達(dá)netrin-1的 Miapaca II細(xì)胞在雞胚胎絨毛尿囊膜（CAM)上形成的腫瘤面積（N = 12)顯著低于未過表 達(dá)netrin-1的Miapaca II細(xì)胞形成的腫瘤面積（N = 7)。
[0046] 圖4A至4D，其中圖4A至圖4C表示過表達(dá)netrin-1顯著降低Miapaca II細(xì)胞 在聯(lián)合重癥免疫缺陷小鼠（SCID-biege mouse)移植瘤的成瘤能力，圖4A表示netrin-1+ 的Miapaca II細(xì)胞在聯(lián)合重癥免疫缺陷小鼠中的成瘤能力；圖4B表示netrin-1-的 Miapaca II細(xì)胞在聯(lián)合重癥免疫缺陷小鼠中的成瘤能力；圖4C表示同時(shí)移植netrin-1+和 netrin-1-的Miapaca II細(xì)胞在聯(lián)合重癥免疫缺陷小鼠中的成瘤能力。每組腫瘤細(xì)胞接種 量為5X106細(xì)胞。Bar = Icm?圖4D表示過表達(dá)netrin-1降低Miapaca II細(xì)胞在聯(lián)合重 癥免疫缺陷小鼠形成的腫瘤的相對(duì)重量。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示過表達(dá)netrin-1的Miapaca II細(xì) 胞在聯(lián)合重癥免疫缺陷小鼠形成的腫瘤的相對(duì)重量（N= 10)顯著低于未過表達(dá)netrin-1 的Miapaca II細(xì)胞形成的腫瘤的相對(duì)重量（N = 11)。
[0047] 圖5A和圖5B，其中圖5A表示過表達(dá)/未過表達(dá)netrin-1降低MiapacaII細(xì)胞 在裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤的生長曲線。將處于對(duì)數(shù)生長期的netrin-1過表達(dá)細(xì)胞（N=10)和對(duì)照組（N=10)按照5X106個(gè)細(xì)胞/裸鼠接種到雄性裸鼠皮下，令其生長28天，每兩天 測量細(xì)胞長成的腫瘤的大小。圖5B表示netrin-1顯著地降低MiapacaII細(xì)胞在Matrigel 中的3D