Cxcl13癌蛋白及其靶向藥物在腫瘤方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種癌蛋白CXCL13 (chemokine (C-X-C motif)ligand 13)及其靶向藥物在治療腫瘤及相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌已經(jīng)成為全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，根據(jù)組織學(xué)類型不同，肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。肺癌發(fā)病與關(guān)鍵基因的功能異常、信號通路的異?；罨?、腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。肺癌發(fā)生的危險因素主要包括氡、石棉等的暴露、遺傳因素、環(huán)境暴露與吸煙等，吸煙以及被動吸煙是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的主要因素。約87%的肺癌可歸因為煙草暴露。然而，近幾十年，伴隨著中國經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，空氣污染問題愈發(fā)突出。全國范圍內(nèi)爆發(fā)了嚴(yán)重的霧霾，尤其是北京、天津、石家莊等大城市持續(xù)籠罩在霧霾中，并連續(xù)出現(xiàn)PM2.5嚴(yán)重超標(biāo)。與此同時，呼吸道相關(guān)疾病患病率直線上升，肺癌的發(fā)病率顯著升高。中國衛(wèi)生部調(diào)查結(jié)果顯示，在20世紀(jì)70年代，中國肺癌病人平均每10萬人當(dāng)中有5.47人死亡(其中，男性為每10萬病人7.17人，女性為每10萬病人3.69人)，在當(dāng)時所有致死癌癥中排名第五，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐美國家的肺癌死亡率(美國，每10萬病人30.3人；蘇格蘭，每10萬病人46.6人)。然而，2004-2005年的第三次全國人口調(diào)查報告顯示，肺癌一躍成為所有腫瘤中致死率最高的癌癥。平均每10萬人中30.83人，其中男性為每10萬病人41.34人，女性為每10萬病人19.84人。僅僅三十年間，無論是總體死亡率還是男女死亡率都提高了 6倍，而且還在快速增長中。因此環(huán)境致癌物暴露在肺癌發(fā)生中發(fā)揮越來越重要的作用。但到目前為止環(huán)境污染及吸煙引發(fā)的肺癌發(fā)病機(jī)理仍不清楚，因此發(fā)現(xiàn)促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展的癌蛋白并開發(fā)相應(yīng)的靶向藥物，在腫瘤治療中具有關(guān)鍵作用。
[0003]煙草及環(huán)境污染物中含有多種致癌物質(zhì)，其中有20中致癌物和肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。苯并(a)芘(BaP)是其中最主要的、含量最高的、致癌性最強(qiáng)的一種致癌物質(zhì)。BaP可以活化AKT信號通路，使得NF-K B、Bcl-2等下游蛋白磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖；也可以在細(xì)胞內(nèi)形成DNA加和物，導(dǎo)致基因突變(K-Ras、TH53)、DNA甲基化、染色體缺失等，也可誘導(dǎo)炎癥相關(guān)的一些趨化因子及其受體(IL-10，CCLl、CXCLl、CXCL5、TNF-a、IL-1 β、IL_6以及IL-8)的改變。因此，與肺癌尤其是空氣污染及吸煙誘發(fā)肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的趨化因子將成為肺癌治療的新靶標(biāo)。
[0004]趨化因子(Chemokine)是一類由生長因子、炎性細(xì)胞因子或致病原刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的能引起白細(xì)胞定向迀移的趨化性細(xì)胞因子，通過與細(xì)胞表面的G蛋白跨膜受體相互作用介導(dǎo)細(xì)胞的趨化性和定向轉(zhuǎn)移。趨化因子家族是一類小分子蛋白，分子量為8-14KD，根據(jù)其氨基末端半胱氨酸的位置，數(shù)量以及排列方式，趨化因子被分為四大類:CXC趨化性細(xì)胞因子、C趨化性細(xì)胞因子、CC趨化性細(xì)胞因子和CX3C趨化性細(xì)胞因子。迄今為止，已經(jīng)克隆出超過50多種趨化因子和至少18中趨化因子受體，這些趨化因子受體屬于G蛋白偶聯(lián)家族，具有7次跨膜疏水區(qū)，除了 CXCR5、CXCR4、CCR6、CXCR6、CX3CR1和CCR9之外，其他趨化因子受體均與兩種以上的趨化因子相互作用。趨化因子的主要功能是在不同的免疫反應(yīng)中激活和趨化白細(xì)胞，但是越來越多的研究表明趨化因子以及相應(yīng)的受體在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用。其中CXCR4已經(jīng)被確立為多種腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物，CXCL12-CXCR4在各種腫瘤尤其是乳腺癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。但是，截止目前，趨化因子在肺癌中的表達(dá)情況及其與肺癌的關(guān)系并不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一種腫瘤靶向藥物的制備方法，這種藥物能夠有效治療相應(yīng)的腫瘤。
[0006]發(fā)明人利用趨化因子及其受體信號通路相關(guān)的RT2-PCRArray,對來自中國多環(huán)芳烴污染嚴(yán)重的肺癌高發(fā)地區(qū)的8個病人的癌及癌旁組織進(jìn)行分析，首次發(fā)現(xiàn)了一系列差異表達(dá)的趨化因子(IL-1F5，IL-1F9，MIF, SPPl，CCL7，CCL26，CXCL6，CXCL9，CXCL14，IL-1 α，IL-5，TNF-a，CCL4，CCL17，CCL18，CCL21，CCL23，CXCLl，CXCL2，CXCL3，CXCL5)，尤其是趨化因子CXCL13顯著高表達(dá)。并通過real-time PCR、ELISA及免疫組化在201例肺癌病人標(biāo)本中進(jìn)行驗證。同時還發(fā)現(xiàn)CXCL13的高表達(dá)與肺癌病人的生存預(yù)后負(fù)相關(guān)。
[0007]進(jìn)一步，發(fā)明人以多環(huán)芳烴主要致癌物苯并芘(BaP)誘導(dǎo)小鼠肺癌模型為研究對象，發(fā)現(xiàn)CXCL13在上述腫瘤中高表達(dá)。CT是目前檢測肺癌的重要方法。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，CXCL13的升高早于CT可檢測到肺癌的時間，說明CXCL13可用于肺癌的早期診斷。CXCL13基因敲除小鼠也能顯著抑制BaP誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生，抗炎藥物地塞米松也能通過抑制CXCL13的表達(dá)從而延緩肺癌的發(fā)生。
[0008]最終，發(fā)明人利用CXCL13不同肽段作為免疫原免疫小鼠，篩選得到了具有中和活性的抗CXCL13單克隆抗體。且該單克隆抗體可以通過抑制p-AKT、p-ERK及EMT信號通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長及侵襲轉(zhuǎn)移達(dá)到抗腫瘤效果。
[0009]一方面，本發(fā)明提供了 CXCL13作為一種新的癌蛋白與腫瘤病人的預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)的分子標(biāo)記。所述腫瘤為肺癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、腦瘤、皮膚癌。同時也預(yù)測其適用于CXCL13高表達(dá)的慢性阻塞性肺疾病、肺氣腫及心血管疾病。
[0010]另一方面，本發(fā)明提供了抗CXCL13單克隆抗體在制備肺癌診斷、預(yù)防、治療與CXCL13高表達(dá)相關(guān)的腫瘤及其他相關(guān)疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明證明了抗CXCL13單克隆抗體可以通過抑制p-AKT、p-ERK及EMT信號通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長及侵襲轉(zhuǎn)移達(dá)到抗腫瘤效果。所述腫瘤為肺癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、腦瘤、皮膚癌。同時也預(yù)測其適用于CXCL13高表達(dá)的慢性阻塞性肺疾病、肺氣腫及心血管疾病。
[0011]再一方面，本發(fā)明提供了一種篩選CXCL13靶向藥物的方法，該方法為利用CXCL13不同肽段作為免疫原免疫小鼠，篩選具有中和活性的抗CXCL13單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個篩選方法的實(shí)例如下:
[0012]①抗原的制備:
[0013]多肽合成及偶聯(lián)(PRGNGCPRKEIIVWKKNKSIV,CVQESSVFIPRRFID)
[0014]②免疫及ELISA檢測:
[0015]2條多肽分別免疫4只BALB/C雌性小鼠；
[0016]陽性血清ELISA檢測，效價>10000 ；
[0017]③融合及細(xì)胞株篩選:
[0018]取效價最高的小鼠做融合實(shí)驗；
[0019]從1000個單克隆細(xì)胞株中篩選陽性克隆；
[0020]將篩選的陽性細(xì)胞上清做針對肽段的Western blot/ELISA檢測；
[0021]④抗體純化及檢測:
[0022]ProteinA/G 親和純化；
[0023]⑤功能篩選
[0024]Western blot/Transwell實(shí)驗驗證抗體是否具有中和活性。
[0025]本發(fā)明測試結(jié)果表明，抗CXCL13單克隆抗體可以通過抑制p-AKT、p_ERK及EMT信號通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長及侵襲轉(zhuǎn)移而達(dá)到良好的抗腫瘤效果。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于制備腫瘤靶向藥物的方法，包括:
[0027]篩選能夠有效降低CXCL13癌蛋白高表達(dá)或中和CXCL13癌蛋白活性的抗體，利用所述抗體制備相應(yīng)的腫瘤靶向藥物。
[0028]通過將所述抗體與適當(dāng)?shù)妮o劑混合，上述腫瘤靶向藥物可以被制成片劑、針劑等任何合適形式的藥劑。
[0029]上述腫瘤可以為肺癌、宮