9%乙醇溶解，用25 y m濾膜濾去不溶物，然后經(jīng)過單分散 聚合硅膠層析柱吸附后，用水及濃度為99. 9%乙醇按梯度洗脫法洗脫純化，用紫外檢測(cè)器 在線檢測(cè)洗脫液紫外吸光度，檢測(cè)波長為203nm，收集主含人參皂苷Rd的洗脫液，回收溶媒 并濃縮、減壓干燥，即得。
[0050] 采用HPLC法測(cè)定，人參皂苷Rd含量為88 %。
[0051] 實(shí)施例5:本發(fā)明片劑
[0052] 取實(shí)施例1人參皂苷Rd，加入輔料微晶纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基淀粉鈉混合 均勻，用60%乙醇制軟材，過20目篩制粒，干燥，整粒，加入潤滑劑滑石粉、硬脂酸鎂混合均 勻，壓片，制成片劑。即得人參皂苷Rd片劑。
[0053] 采用HPLC法測(cè)定，人參皂苷Rd含量為75 %。
[0054] 實(shí)施例6 :本發(fā)明顆粒劑
[0055] 取實(shí)施例2人參皂苷Rd，加入輔料淀粉、蔗糖粉混合均勻，用60%乙醇制軟材，過 20目篩制粒，干燥，整粒，分裝，制成顆粒劑，即得人參皂苷Rd顆粒劑。
[0056] 采用HPLC法測(cè)定，人參皂苷Rd含量為95 %。
[0057] 實(shí)施例7 :本發(fā)明錠劑
[0058] 取實(shí)施例3人參皂苷Rd，加入粘結(jié)劑糯米粉、蜂蜜和少量的水，攪拌混合均勻，搓 條，分割，按規(guī)定重量及形狀搓捏成型，干燥，制得錠劑，即得人參皂苷Rd錠劑。
[0059] 采用HPLC法測(cè)定，人參皂苷Rd含量為58 %。
[0060] 實(shí)施例8 :本發(fā)明注射劑
[0061] 取實(shí)施例4人參皂苷Rd，用注射用水溶解，活性炭處理，過濾，灌封，冷凍干燥，制 得凍干注射粉針劑，即得人參阜苷Rd凍干粉劑。
[0062] 采用HPLC法測(cè)定，人參皂苷Rd含量為90 %。
[0063] 對(duì)比例1 :人參皂苷的制備（參考2010版《中國藥典》一部人參總皂苷的制法）
[0064] 1)取人參，切得厚片，加水煎煮二次，第一次2小時(shí)，第二次1. 5小時(shí)，煎濾濾過，合 并濾液，通過D101型大孔吸附樹脂柱，水洗脫至無色，再用60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗 脫液，濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 06-1. 08 (80°C )的清膏，干燥，粉碎，即得人參總皂苷。
[0065] 藥效實(shí)驗(yàn)：
[0066] 1人參皂苷Rd對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活力的影響
[0067] 1. 1實(shí)驗(yàn)材料
[0068] 實(shí)驗(yàn)藥物：本發(fā)明實(shí)施例4
[0069] 細(xì)胞及試劑：小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2 (北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)）；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、 胎牛血清（Gibco, USA) ;T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，96孔、48孔、12孔細(xì)胞培養(yǎng)板（corning);-氧化 氮檢測(cè)試劑盒（碧云天）；Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, Japan，簡稱 CCK-8) ;LPS (碧云 天）
[0070] 儀器設(shè)備：C02恒溫培養(yǎng)箱（THERMO, F0RMA3111型，美國）；倒置相差顯微鏡 (Nikon，TE200,日本）；低溫高速離心機(jī)（BECKMAN，64R型，美國）；定量PCR儀（ABI，7500 型，美國）；DU-800 紫外分光光度計(jì)（DNA/Protein Analyzer，BECKMAN，美國）；PCR1000〇
[0071] 1.2實(shí)驗(yàn)分組
[0072] 實(shí)驗(yàn)1組：本發(fā)明實(shí)施例4人參皂苷Rd0. 01g/L ;
[0073] 實(shí)驗(yàn)2組：本發(fā)明實(shí)施例4人參皂苷Rd0. 001g/L ;
[0074] 實(shí)驗(yàn)3組：本發(fā)明實(shí)施例4人參皂苷Rd0. 0001g/L ;
[0075] 對(duì)照組：培養(yǎng)過程不加本發(fā)明人參皂苷Rd。
[0076]1. 3實(shí)驗(yàn)方法
[0077] 在BV-2細(xì)胞中分別加入實(shí)驗(yàn)1 一 3組人參皂苷Rd培養(yǎng)24h后，棄去上清液，加入 CCK-8,繼續(xù)孵育0. 5h，于450nm波長處測(cè)定吸光度。
[0078]1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1
[0079] 表1人參皂苷Rd對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活力的影響
[0080]
[0081] 表1結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)1 一 3組與對(duì)照組相比，組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明本發(fā)明對(duì) 小膠質(zhì)細(xì)胞活力無影響，不引起小膠質(zhì)細(xì)胞死亡，沒有神經(jīng)毒性。
[0082] 2人參皂苷Rd對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)的影響
[0083] 2. 1實(shí)驗(yàn)材料
[0084] 本發(fā)明實(shí)施例4人參皂苷Rd、對(duì)比例1人參皂苷。
[0085] 2. 2實(shí)驗(yàn)分組
[0086] 實(shí)驗(yàn)1組：本發(fā)明實(shí)施例4人參皂苷Rd 0.0 lg/L加LPS ;
[0087] 實(shí)驗(yàn)2組：本發(fā)明實(shí)施例4人參皂苷Rd 0. 00lg/L加LPS ;
[0088] 實(shí)驗(yàn)3組：本發(fā)明實(shí)施例4人參皂苷Rd 0. 000lg/L加LPS ;
[0089] 實(shí)驗(yàn)4組：對(duì)比例1人參皂苷0. 01g/L加LPS ;
[0090] 實(shí)驗(yàn)5組：對(duì)比例1人參皂苷0. 00lg/L加LPS ;
[0091] 實(shí)驗(yàn)6組：對(duì)比例1人參皂苷0? 0001g/L加LPS ;
[0092] 正常對(duì)照組；
[0093] LPS 組。
[0094] 2. 3實(shí)驗(yàn)方法
[0095] 完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2及原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞。調(diào) 整細(xì)胞濃度為1 X 105/mL，接種到48孔培養(yǎng)板內(nèi)過夜，按實(shí)驗(yàn)分組加入本發(fā)明實(shí)施例4人參 皂苷Rd及對(duì)比例1人參皂苷，終濃度分別為0. 01g/L，0. 001g/L，0. 0001g/L，預(yù)孵育0. 5h， 然后加入內(nèi)毒素（LPS，終濃度0. 1 y g/mL)進(jìn)行刺激。用Greiss法檢測(cè)NO的濃度。
[0096] 2. 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
[0097] 表2對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)的影響
[0098]
[0099] 注：與LPS組相比，*P〈0. 01 ;與同等濃度的人參皂苷相比，#P〈0. 01。
[0100] 表2結(jié)果顯示：本發(fā)明實(shí)驗(yàn)1-5組與LPS組相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；本發(fā)明實(shí) 驗(yàn)1-3組與實(shí)驗(yàn)4-6組相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明在達(dá)到一定濃度后人參皂苷及人 參皂苷Rd干預(yù)能明顯抑制LPS引起的神經(jīng)毒性物質(zhì)NO釋放。同時(shí)表明，同等濃度條件下， 人參皂苷Rd比人參皂苷效果更為顯著。
[0101] 3 討論
[0102] 在研宄中發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力無影響，不引起小膠質(zhì)細(xì)胞死亡，沒有神 經(jīng)毒性。在達(dá)到一定濃度后，人參皂苷Rd干預(yù)能明顯抑制LPS引起的神經(jīng)毒性物質(zhì)NO釋 放。提示本發(fā)明對(duì)多發(fā)性硬化、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、艾滋病癡呆癥、瘋牛病等疾病有 較佳的治療效果，對(duì)于臨床治療小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)疾病藥物的開發(fā)研宄及臨床治療都具有參 考意乂。
[0103] 總體實(shí)驗(yàn)效果顯示，本發(fā)明可有效治療小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)疾病，實(shí)驗(yàn)中藥物用量 0? 01g/L、0. 001g/L、0. 0001g/L分別相當(dāng)于臨床治療時(shí)人體用量的100mg/kg、10mg/kg、 lmg/kg治療效果，最優(yōu)為用量0. 01g/L，藥效結(jié)果提示，在人參皂苷Rd含量為80%以上、治 療用量為l-l〇〇mg/kg時(shí)，人參皂苷Rd能顯示出顯著的治療小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)疾病效果。
[0104] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、【具體實(shí)施方式】及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描 述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見 的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的 范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人參皂苷Rd在制備預(yù)防和/或治療小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)疾病藥物的新用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，所述人參皂苷Rd純度不低于80%。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述用途，其特征在于所述人參皂苷Rd通過以下步驟制備而得： 1) 取三七或人參藥材加水或體積百分比濃度為25~96%的乙醇提取，將提取液回收乙 醇，得二七提取液； 2) 三七或人參提取液脫脂后，經(jīng)D型大孔樹脂純化后，濃縮，減壓干燥，制成干燥品； 3) 干燥品加體積百分比濃度為95.0%以上的乙醇溶解，濾去不溶物，然后經(jīng)過單分 散聚合硅膠層析柱吸附洗脫純化，用紫外檢測(cè)器在線檢測(cè)洗脫液紫外吸光度，檢測(cè)波長為 203nm，收集主含人參皂苷Rd的洗脫液，回收溶媒并濃縮、減壓干燥，即得。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述用途，其特征在于：所述步驟1)中所得三七或人參提取液含固 形物5 - 25%。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述用途，其特征在于：所述的步驟2)經(jīng)D型大孔樹脂純化時(shí)，用 水：95%乙醇按梯度洗脫法洗去除Rd外的三醇苷類成分以及多數(shù)二醇苷類成分，再單獨(dú)以 70~95%乙醇液洗脫以人參皂苷Rd為主的皂苷類成分，收集洗脫液并脫色后，回收溶媒。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述用途，其特征在于：所述的步驟3)濾去不溶物是采用1~50 y m 濾膜過濾。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述用途，其特征在于：所述的步驟3)經(jīng)單分散聚合硅膠層析柱吸 附后，洗脫純化是用水：體積百分比濃度為95. 0%~99. 9%乙醇按梯度洗脫法洗脫純化。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述用途，其特征在于：所述的紫外檢測(cè)器在線檢測(cè)采用的檢測(cè)波 長為203nm。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，其特征在于：其中所述藥物每日劑量以人參皂苷Rd計(jì)為 1~100 mg/kg 體重。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)疾病包括多發(fā)性硬 化、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、艾滋病癡呆癥、瘋牛病。11. 人參皂苷Rd與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體配合制成在制備治療和/或預(yù)防小膠質(zhì)細(xì)胞 介導(dǎo)疾病藥物方面的新用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及人參皂苷Rd在制備治療小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)疾病藥物的新用途，特別是人參皂苷Rd在制備治療多發(fā)性硬化、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、艾滋病癡呆癥、瘋牛病等疾病藥物的新用途。
【IPC分類】A61P21/00, A61P43/00, A61K31/704, A61P25/28
【公開號(hào)】CN104958307
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510391793
【發(fā)明人】許淑清, 王少峽, 黃宇聲, 胡利民, 李釗文, 郭虹, 劉冠萍, 孟凡英, 鄭志遠(yuǎn), 張栩顏
【申請(qǐng)人】廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司
【公開日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2015年7月7日