按照細胞傳代的步驟將MCF-7細胞處理到單細胞懸液，計數(shù)后每孔接種5X 103 個細胞于96孔板上，培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37°C，5% C02) 24h待細胞貼壁完全后棄去原培養(yǎng)基后加 藥，Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX 組，SWCNTs-HA-ss-DOX 組，D0X 組所加藥物濃度以 D0X 濃度呈一 系列梯度用不含血清的培養(yǎng)基配制而成，D0X的濃度梯度0, 0. 039, 0. 078, 0. 156, 0. 313, 0 .625, 1. 25, 2. 5, 5, 10 y g/ml，連有修飾后的單壁碳納米管的組設(shè)有808nm激光對照組，并 于加藥后一段時間照射808nm激光3min (功率2. 0)，繼續(xù)培養(yǎng)48h后取出培養(yǎng)板，每孔加 入50y 1預(yù)冷的50%三氯乙酸，終濃度為10%，靜置5min ;移至4°C冰箱中靜置lh，取出 用超純水洗5遍，室溫空氣中干燥完全后，每孔中加入1 %乙酸配制的SRB50 y 1，室溫下染 色20min，倒掉染液，用1 %乙酸洗5遍，除去孔中未結(jié)合的染料，室溫空氣干燥后用pH10. 5 的lOmmol/LTris堿液150 y 1溶解，在空氣加熱搖床中震蕩10min，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測 定各孔在515nm處的光吸收度值。計算抑制率（％) = (1-實驗組A/對照組A)X100%， 由此得出上述樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50)依次為：Gd/SWCNTs-HA-ss-D0X非熱療組， SWCNTs-HA-ss-DOX 非熱療組，D0X 組為 1. 008,0? 987,1. 626 y g/ml ;Gd/SWCNTs-HA-ss-D0X 熱療組，SWCNTs-HA-ss-DOX 熱療組：0? 5934,0? 6186 y g/ml。
[0075] 本發(fā)明Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX納米制劑對MCF-7細胞流式攝取試驗
[0076] 將實驗分為 SWCNT/FITC 組，HA-SWCNTs/FITC 組，SWCNTs-HA-ss-DOX 組，Gd/ SWCNTs-HA-ss-DOX組，另設(shè)有空白細胞組和純FITC組。其中FITC組所含F(xiàn)ITC濃度與其余 含F(xiàn)ITC組中含F(xiàn)ITC濃度一致。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞按照細胞傳代的步驟處理成單 細胞懸液，計數(shù)后鋪六孔板，每孔細胞數(shù)為3 X 105個/孔，培養(yǎng)箱（37°C，5 % C02)中培養(yǎng)24h 貼壁完全后，棄去培養(yǎng)基，加入用不含血清的培養(yǎng)基配制的藥，分別設(shè)置0. 5h，lh，2h，4h，6h 的時間段進行后期處理，藥液吸入對應(yīng)EP管中，PBS洗2遍，然后用0. 5ml的不含EDTA的 胰酶消化處理lmin，加入培養(yǎng)基lml，吸入對應(yīng)的EP管，lOOOrpm/lOmin離心后，棄上清留沉 淀，加入2mlPBS吹打均勾，lOOOrpm/lOmin離心后，棄上清留沉淀，加入0. 5mlPBS吹打均勾 后轉(zhuǎn)移到1. 5mlEP管中置于冰盒，等待流式上機檢測，測得對MCF-7的流式攝取量依次為： 35. 2%，89. 6%，95. 6%，96. 2% 〇
[0077] 本發(fā)明Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX納米制劑的藥效學(xué)試驗
[0078] 將10只雌性小鼠進行S-180肉瘤腹水培養(yǎng)，兩周后抽取腹水，用于小鼠實體瘤的 種植，當腫瘤的體積達到100mm 3以上時，腫瘤模型接種成功，將荷瘤小鼠隨機分為九組，每 組八只，分組情況如下：（1)空白組；（2)空白-激光組；（3)D0X組；（4)D0X-激光組；（5) SWCNT-HA-ss-D0X 組；（6) SWCNTs-HA-ss-DOX-激光組；（7) Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX 組；（8) Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX激光組。然后進行隔日給藥，給藥劑量按人鼠劑量換算為4mg/kg， 尾靜脈注射給藥。每天觀察小鼠的生存狀況并且稱體重量瘤體積（通過腫瘤體積（V)= AXB 2/2)，然后通過相對瘤體積進行R = V/^評價腫瘤的變化以^為給藥前一天瘤體積的 大?。┰u價腫瘤抗腫瘤活性。記錄的數(shù)據(jù)表明，給藥結(jié)束時和給藥前相比，各組瘤體積抑制 率依次為 〇? 〇l%、2. 09%、48. 09%、52. 50%、71. 27%、82. 97%、70. 14%、83. 17%。
[0079] 本發(fā)明Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX納米制劑的釓類造影劑的磁共振成像試驗
[0080] 將12只荷瘤小鼠隨機分成三組并標記，采取異氟烷吸入式麻醉，然后將小鼠 固定于固定板上用7. 0T小動物專用核磁共振儀進行平掃；三組荷瘤小鼠分別注射Gd/ SWCNTs-HA-ss-DOX、Gd/SWCNTs-C00H、Gd-DTPA，GcT注射量均為 0? 15mmol/Kg，注射成 功后于0h、0. 5h、lh、3h、6h、8h再次將小鼠固定于固定板上行各時間點掃描，三組小鼠 在注射不同的磁共振造影劑后進行增強掃描，三組小鼠在注射30min之后信號均增強， 但是Gd-DTPA組信號在0. 5h增強最大，lh信號明顯降低，隨后的時間點信號強度恢復(fù) 正常值；Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX組和Gd/SWCNTs-C00H組的信號強度隨時間延長增強，并 且Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX組信號為強度增強最大，明顯大于Gd/SWCNTs-C00H組。Gd/ SWCNTs-HA-ss-DOX表現(xiàn)出明顯的高弛豫效能和緩釋性能。
[0081] 試驗表明，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下突出的有益技術(shù)效果：
[0082] 1、本發(fā)明基于高濃度的生物還原性谷胱甘肽提供了腫瘤組織還原性微環(huán)境，選擇 含有二硫鍵的連接臂連接單壁碳納米管和抗腫瘤藥物，利用此觸發(fā)機制可以實現(xiàn)抗腫瘤制 劑在生物體內(nèi)快速、靶向釋放藥物和減少抗腫瘤藥物的毒副作用；
[0083] 2、本發(fā)明選用透明質(zhì)酸作為靶頭修飾后的單壁碳納米管進行載藥，所形成的載體 具有生物相容性好、載藥形式多樣、腫瘤靶向性好、熱療效果好等優(yōu)點；
[0084] 3、本發(fā)明所制備的抗腫瘤藥物制劑還具有應(yīng)用于臨床腫瘤診斷的前景，造影劑釓 負載于碳材料上使得腫瘤靶向性增強、弛豫效能增強、生物半衰期延長，結(jié)合抗腫瘤藥物的 治療可實現(xiàn)診斷與治療相結(jié)合的新型給藥體系，是診斷和治療腫瘤藥物上的創(chuàng)新，經(jīng)濟和 社會效益巨大。
【主權(quán)項】
1. 一種透明質(zhì)酸修飾單壁碳納米管制備診斷治療的還原敏感性藥物納米劑，其特征在 于，該傳遞體系由透明質(zhì)酸修飾后的單壁碳納米管通過3, 3' -二硫代二丙酸作為連接臂和 阿霉素相連，然后將三氯化釓吸附到單壁碳納米管上，再用表面活性劑分散形成用透明質(zhì) 酸修飾的單壁碳納米管，用于診斷治療的還原敏感性藥物的納米制劑；所述透明質(zhì)酸為分 子量大于等于600道爾頓且小于等于400 kd的低分子量透明質(zhì)酸；所述單壁碳納米管的長 度為1~3 y m、直徑為1~2nm ;所述連接臂為碳原子數(shù)2~12的3, 3' -二硫代二丙酸或 辛二酸；所述3, 3' -二硫代二丙酸中的二硫鍵具有還原敏感性，在腫瘤細胞高濃度的谷胱 甘肽作用下迅速斷裂釋放藥物。2. 權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸修飾單壁碳納米管制備診斷治療的還原敏感性藥物納 米劑的方法，其特征在于，由以下步驟實現(xiàn)： (1) 羧化碳管與氨化透明質(zhì)酸連接： 稱取25~75mg羧化碳管于15~45ml反應(yīng)溶劑的燒杯中，冰浴探超15~45min，成 羧化碳管溶液；稱取氨化透明質(zhì)酸60~120mg溶于5-15ml的溶劑中，成氨化透明質(zhì)酸溶 液；稱取EDC 120~240mg、NHS 80~160mg，用1~7ml溶劑渦旋溶解，加入到羧化碳管 溶液中，攪拌室溫反應(yīng)5~25min，成羧化碳管混合溶液；在氨化透明質(zhì)酸溶液中加入三乙 胺100~260 y 1，然后將氨化透明質(zhì)酸和三乙胺的混合溶液快速滴加至羧化碳管混合溶液 中，室溫反應(yīng)8~40h，加入3~4倍體積預(yù)冷的丙酮，冷卻析晶，過濾，丙酮洗滌沉淀，得沉 淀物，沉淀物用水復(fù)溶，透析2d，凍干； 所述的溶劑為水、甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺與水、或甲酰胺與水、或N，N-二甲基甲 酰胺與甲酰胺的混合溶劑； 所述的氨化透明質(zhì)酸是，將透明質(zhì)酸95-105mg、l-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二 亞胺鹽酸鹽254-264mg和N-羥基琥珀酰亞胺150-160mg，溶解在8-12ml的有機溶劑中， 室溫攪拌30 min，得反應(yīng)液，將反應(yīng)液緩慢滴入0.4-0. 6ml乙二胺的甲酰胺溶液中，冰浴 滴加lh，升至室溫反應(yīng)6-48h，加入50ml丙酮沉淀，抽濾，得沉淀物，沉淀物加水復(fù)溶，透析 2d，冷凍干燥，即得氨化透明質(zhì)酸，有機溶劑為甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜的 一種； (2) 制備 SWCNTs-HA-ss-COOH : 取500~1500mg碳原子數(shù)2~12的3, 3' -二硫代二丙酸或辛二酸為連接臂，溶解于 反應(yīng)溶劑中，EDC 500~1500mg、NHS 200~1000 mg分別渦旋溶解于反應(yīng)溶劑中，將上述 溶液混合攪拌活化5~25min，成活化溶液；將HA-SWCNTs 50~350mg超聲溶解，與活化溶 液混合，室溫條件下攪拌1~8h，所得產(chǎn)物通過丙酮冰浴析晶，過濾，收集沉淀，沉淀用水復(fù) 溶，透析2d，除去多余的3, 3' -二硫代二丙酸、EDC、NHS鹽，凍干，成SWCNTs-HA-ss-COOH，4°C 保存； 所述的反應(yīng)溶劑為水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺與水、或甲酰胺與水、或N，N-二 甲基甲酰胺與甲酰胺的混合溶劑； (3) SWCNTs-HA-ss-COOH 與 DOX 連接成 SWCNTs-HA-ss-DOX : 取1~8mg D0X.HCL溶解于500~1500 y 1的pH為7~10的PBS溶液中，成第一溶 液；稱取2~15mg的SWCNTs-HA-ss-COOH超聲溶解于200~800 y 1反應(yīng)溶劑，成第二溶 液，將兩種溶液混合在一起反應(yīng)1~4h，成混合液；取10~60mg鹽酸輕胺溶解于200~ 2000 y 1的pH為7~10的PBS溶液中，加入混合液中反應(yīng)0. 5~5h，得產(chǎn)物，產(chǎn)物用超純 水透析2d后，凍干，成SWCNTs-HA-ss-DOX ; 所述的反應(yīng)溶劑為二氯亞砜、或N，N-二甲基甲酰胺、或二氯亞砜與N，N-二甲基甲酰胺 的混合溶劑； (4) Gd的負載： 5~IOmg的SWCNTs-HA-ss-DOX加入到水中，在冰浴中超聲5~60min分散，離 心棄去未分散的沉淀，成單壁碳納米管混懸液；室溫磁力攪拌條件下將50~80mg的 GdCl3粉末溶于水中，滴加到分散均勻的單壁碳納米管混懸液中，產(chǎn)生絮狀沉淀，即成Gd/ SWCNTs-HA-ss-DOX； (5) 制備 Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX 藥物納米劑： 將步驟（4)含有絮狀