6. 2 (C-2 ")，132.8(C-5' )，133.0(C-3")，143.4(C-3，），153.0(C-4' )，156.6(C-9)，160.9(C-5)，163 .5 (C-7), 184. 3 (C-4) 〇
[0099] 實(shí)施例4 :化合物1-11的雌激素活性實(shí)驗(yàn)
[0100] 試劑：DMEM/F-12,HEPES,nophenolred為Gibco?公司生產(chǎn)，；貨號(hào)為 11039-021 規(guī)格為500ml/瓶；
[0101] 活性碳吸附胎牛血清FBS為Biolnd公司生產(chǎn)，貨號(hào)為04-201-1A，規(guī)格為500ml/ 瓶；
[0102] penicillinstreptomycinsolution為hyclone公司生產(chǎn)，貨號(hào)為SV30010 規(guī)格 為 100ml/ 瓶；
[0103] FBS為Hyclone公司生產(chǎn)貨號(hào)：SH30084. 03E規(guī)格 500ml;
[0104] ERaAntibody(F-10)為SantaCruz公司生產(chǎn)貨號(hào)：sc_8002 規(guī)格 200ug/ml;
[0105] DonkeyAnti-MouseIgGH&L(AlexaF丨U〇r?488)為abeam公司生產(chǎn)貨號(hào)： abl50105 500ug；
[0106]Hochest33342 為SIGMA公司生產(chǎn)貨號(hào)：14533 ;
[0107] 他莫昔芬為Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)貨號(hào)：T5648_1G
[0108]PBS由KH2P04，Na2HP04，NaCl，KCl粉末用超純水配制，粉末均為Sigma公司生產(chǎn)；
[0109]DMS0為索來(lái)寶公司生產(chǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別，貨號(hào)：D8371規(guī)格50ml/瓶；
[0110] 4%多聚甲醛為索萊寶公司生產(chǎn)，貨號(hào)：P1110規(guī)格500ml/瓶；
[0111]TritonX-100為索萊寶公司生產(chǎn)貨號(hào)T8200規(guī)格100ml/瓶；
[0112] Tween-20為索萊寶公司生產(chǎn)貨號(hào)：T8220規(guī)格100ml;
[0113]儀器：HighScreeningAssay(Operetta)在PerkinElmer公司購(gòu)買(mǎi)；
[0114]C02培養(yǎng)箱IL-161HI為STIK公司生產(chǎn)；
[0115] 可調(diào)速可定時(shí)漩渦混合器（SI-T256)
[0116] 電熱式恒溫水浴鍋為天津歐諾儀器公司生產(chǎn)；
[0117] 移液槍為Eppendorf公司生產(chǎn)；
[0118] 尼康ECLIPSETi-U倒置生物顯微鏡
[0119] 1. 6R臺(tái)式多用離心機(jī)為T(mén)hermo公司生產(chǎn)；
[0120] 制水機(jī)為美國(guó)密理博Milli-QCentury超純水系統(tǒng)，型號(hào)為 Milli-QAcademic,Milli-QGrandient,Milli-QBiocel,Milli-QSynthesis；
[0121] 4°C海爾冰箱；
[0122] -20 °C海爾冰箱；
[0123] 樣品配制：用稱(chēng)取的樣品質(zhì)量m除以該樣品的相對(duì)分子質(zhì)量M，得到該樣品的物質(zhì) 的量n，然后加入10*n體積的DMS0,得到KTmol/L的初始濃度。取10ul體積的KTmol/L的 藥物，用DMS0稀釋至100ul，得到濃度為10_2m〇l/L濃度的藥物，以此類(lèi)推，稀釋至10_4m〇l/ L，分裝為10ul每管，-20°C保存。
[0124] 采用間接免疫熒光的方法篩選能夠選擇性激活雌激素受體入核的化合物。
[0125]1、細(xì)胞及其培養(yǎng)
[0126]MCF-7 細(xì)胞（ATCC? Number:HTB-22?)購(gòu)自ATCC并由本室傳代培養(yǎng)；MCF-7 細(xì) 胞在37°C，5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用10%FBS/DMEM(4500mg/LD-葡萄糖、L-谷氨酰和 110mg/L丙酮酸鈉，100U/ml青霉素，100yg/ml鏈霉素）培養(yǎng)。
[0127] 2、核迀移實(shí)驗(yàn)步驟
[0128] 在37°C，5% 0)2的條件下，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中使用含有10%活性炭吸附的胎牛血清 和1 %雙抗的無(wú)酚紅DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞。72h后，細(xì)胞密度為80%左右，將 細(xì)胞按7000/孔的密度鋪于96孔黑板中，中間60孔為實(shí)驗(yàn)孔，每孔中加入含1 %活性炭吸 附的血清及1 %雙抗的無(wú)酚紅DMEM/F12培養(yǎng)液100ul，周?chē)子胠OOmlPBS填充，培養(yǎng)過(guò)夜， 待細(xì)胞完全貼壁。用無(wú)酚紅DMEM/F12培基稀釋藥品（藥品是用DMS0稀釋至10_4M，分裝保 存于-20°C冰箱）至10_7M。96孔板中實(shí)驗(yàn)孔每孔100ul濃度10_7M的藥物溶液，陽(yáng)性藥為 他莫昔芬，空白對(duì)照加入含有1%。DMS0的無(wú)酚紅DMEM/F12培養(yǎng)基，每種藥物設(shè)三個(gè)復(fù)孔。 給藥完成后，在37°C，5%C02的條件下孵育半小時(shí)，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞半小時(shí)（室 溫）。用PBS洗細(xì)胞三遍，每孔200ul，每遍一分鐘。加入0. 2%的TritonX-100打孔半小 時(shí)（室溫），用PBS洗細(xì)胞三遍，每孔200ul，每遍一分鐘。加入5 %的胎牛血清（Hyclone小 牛血清，用PBS稀釋?zhuān)┓忾]2小時(shí)（室溫），加入一抗（0? 01 %Tween-20+O. 5%Hyclone胎 牛血清+1%-抗+PBS，一抗為ERa)，4°C孵育過(guò)夜，PBST(PBS+O. 05 %Tween-20)洗細(xì)胞三 遍，每孔200ul，每遍5分鐘，然后再用PBS洗三遍，每孔200ul，每遍一分鐘。避光加入二 抗（0?01 %Tween-20+O. 5%Hyclone胎牛血清+萬(wàn)分之一的Hochest+二百分之一的二抗 +PBS，二抗為Alex488，），室溫孵育兩小時(shí)。PBST(PBS+0. 05%Tween-20)洗細(xì)胞三遍，每孔 200ul,每遍5分鐘，然后再用PBS洗三遍，每孔200ul,每遍一分鐘，最后孔內(nèi)加入lOOulPBS 上高內(nèi)涵。高內(nèi)涵拍照完成后，用高內(nèi)涵自動(dòng)處理數(shù)據(jù)，即得核內(nèi)的熒光值比細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的熒 光值，取三個(gè)空的平均值。用Graphpad作圖，SPSS處理數(shù)據(jù)，確定藥物組與空白組對(duì)比是 否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示：
[0129] 表2化合物1-11對(duì)雌激素受體a的激活作用結(jié)果
[0131]
[0132]
[0133]
[0134] *p〈0. 05, **p〈0. 01，***p〈0. 001
[0135]從上述的活性實(shí)驗(yàn)可以看出，從淫羊藿中分離出的化合物1-11能夠與雌激素受 體ERa結(jié)合，提高其轉(zhuǎn)錄活性，證實(shí)了化合物1-11具有雌激素樣作用。因此，可用于防治 更年期綜合征、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、乳腺癌、子宮癌、前列腺癌和結(jié)腸癌，且其藥理作用在心 血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域得到擴(kuò)展。
[0136]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡在 本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍 內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
(I)
1. 通式（I)的化合物在制備用于治療和/或預(yù)防雌激素相關(guān)性疾病的藥物中的用 途；其中，&、R2、R3、R4、馬各自獨(dú)立的代表-H、-OH、-OCIR6、&各自獨(dú)立的代表-H、-OH、-OCH3、) 或R6、R7及與分別與R6、R7相連的碳原子形成氧雜五元環(huán)。
2. 如權(quán)利要求1所述通式（I)的化合物的用途，其中，R6代表-H、-OH每R7代表-OH或-OCH3，或R6、R7及與分別與R6、&相連的碳 原子形成2-(1-羥基-1-甲基-乙基）-2, 3-二氫呋喃環(huán)。
3. 如權(quán)利要求1或2所述通式（I)的化合物的用途，其中，所述雌激素相關(guān)性疾病 為：由雌激素水平低于正常水平而引起的疾病。
4. 如權(quán)利要求3所述通式（I)的化合物的用途，其中，所述由雌激素水平低于正常水 平而引起的疾病包括：女性更年期綜合征、前列腺癌、骨質(zhì)疏松癥和心血管疾病。
5. 如權(quán)利要求1或2所述通式（I)的化合物的用途，其中，所述雌激素相關(guān)性疾病 為：由雌激素水平高于正常水平而引起的疾病。
6. 如權(quán)利要求5所述通式（I)的化合物的用途，其中，所述由雌激素水平高于正常水 平而引起的疾病，包括：乳腺增生、子宮肌瘤。 7?通式（I)的化合物，其中，札代表-R2、馬各自獨(dú)立的代表-OH;R4代表-H、-OH或R7代 H 表-OH或-〇CH3。
8. 如權(quán)利要求7所述的化合物，其中， R2與R3相同，代表-0H;D在札代 彳情況下，R4代表-H或 R5代表-H或t i H i ;R6代表-H或-OH;R7代表-OH或-OCH3; 在^代表_H的情況下，R4代表-OH;R5代表。 R7代表-OH; :i j ， ;在札代表 的情況下，R4代表_H;R5代彳 R6代表-OH;R7代表-OH。 . I 丨；
9. 如權(quán)利要求7或8所述的化合物，其選自下列各化合物：
10.-種包含如權(quán)利要求7-9所述的通式（I)的化合物的淫羊藿提取物。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明實(shí)施例提供了如通式(Ⅰ)的化合物在制備用于治療和/或預(yù)防雌激素相關(guān)性疾病的藥物中的用途；本發(fā)明實(shí)施例還提供了通式(Ⅰ)的化合物及包含通式(Ⅰ)的化合物的淫羊藿提取物。
【IPC分類(lèi)】A61K31/7048, A61P35/00, C07D311/30, C07D407/04, A61P9/10, A61P9/00, A61K36/296, C07H17/07, A61P15/00, A61K31/352
【公開(kāi)號(hào)】CN104940188
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510352865
【發(fā)明人】高秀梅, 王彧, 苗琳, 朱彥, 王雪妮, 劉二偉, 韓立峰, 張祎, 王虹
【申請(qǐng)人】天津中醫(yī)藥大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年6月24日