4-硫-5-噻吩基尿苷在抗黑色素腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及4-硫-5-噻吩基尿苷的新用途，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性黑素瘤是由皮膚和其他器官黑素細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤。皮膚黑素瘤表現(xiàn)為色素性皮損在數(shù)月或數(shù)年中發(fā)生明顯改變。雖其發(fā)病率低，但其惡性度高，轉(zhuǎn)移發(fā)生早，死亡率高，因此早期診斷、早期治療很重要。惡性黑素瘤大多發(fā)生于成人，巨大性先天性色素痣繼發(fā)癌變的病例多見于兒童。黑色素腫瘤是常見的發(fā)生于多發(fā)生于皮膚或接近皮膚的黏膜，也見于軟腦膜和脈絡(luò)膜。近年來，我國黑色素腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。如何有效控制及治療黑色素腫瘤是一個(gè)比較熱門的課題，早期惡性黑色素瘤的治療以手術(shù)切除為主，晚期轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療尚缺乏有效的治療手段。
[0003]含有巰基的嘧啶環(huán)系列化合物具有抗癌活性和免疫增強(qiáng)作用，硫原子較氧原子的外層電子的不同，硫原子的3p電子受原子核的束縛比氧原子的2p電子小，離域后與大環(huán)上的電子共軛，使共軛效應(yīng)增強(qiáng)；硫原子上的電子可通過3p — 3d躍迀，硫原子3p軌道的電子比氧原子中2p軌道的電子的能級(jí)高，而硫原子的3d軌道能級(jí)比羰基C = O的2 *軌道提高不多，故硫羰基C = S的3p — 3d躍迀所需能量小，有利于3p電子的激發(fā)，含有硫羰基的核苷類化合物嘧其4-位羰基氧被硫取代后吸光度變大，最大吸收峰紅移，對光及其敏感。噻吩作為重要的含硫五元雜環(huán)化合物，尤其在抗癌方面，其噻吩衍生物同樣具有良好的生物活性。近期文獻(xiàn)報(bào)道，噻吩環(huán)作為苯環(huán)的生物電子等排體，比苯基同系物具有更好的治療效果，顯示出具有較高的合成價(jià)值。噻吩為富電子芳環(huán)，電荷密度大于苯環(huán)，在生物體內(nèi)更易發(fā)生JT-JT相互作用，而且噻吩中的硫原子具有一定的親核性，易與親電性的受體發(fā)生相互作用或與金屬或金屬離子配位，正因如此，我們把含有巰基的嘧啶環(huán)系列化合物和噻吩環(huán)的特點(diǎn)結(jié)和到同一個(gè)化合物中，即將噻吩環(huán)應(yīng)用于藥物合成中與藥效團(tuán)相連所得的新化合物，可望改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，降低藥物的毒副作用，增強(qiáng)藥物靶向性，提高治療指數(shù)。研宄含有噻吩環(huán)的硫堿基的核苷酸衍生物抗腫瘤方面具有非常重要的意義。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中已報(bào)道的4-硫-5-噻吩基尿苷有多種藥理作用，其中，關(guān)于癌癥的治療用途中尚未有其關(guān)于黑色素腫瘤的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種4-硫-5-噻吩基尿苷的新用途。
[0006]本發(fā)明提供4-硫-5-噻吩基尿苷在制備治療黑色素腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0007]所述的4-硫-5-噻吩基尿苷可阻斷黑色素腫瘤細(xì)胞A375細(xì)胞的有絲分裂抑制其增生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
[0008]所述的4-硫-5-噻吩基尿苷對腫瘤細(xì)胞的作用有較強(qiáng)特異性。
[0009]由構(gòu)效關(guān)系研宄表明，對5-取代胸苷的類似物，在堿基C-5位上具有吸電子基或能與雜環(huán)共軛的基團(tuán)時(shí)，形成波長較長核苷類化合物，由于不同結(jié)構(gòu)的含有硫羰基的核苷類化合物展現(xiàn)了不同的生理活性，這類化合物都具有較高的生物活性。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:4_硫-5-噻吩基尿苷對人黑色素腫瘤細(xì)胞A375作用可阻止細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增生的作用。4-硫-5-噻吩基尿苷對正常人成纖維細(xì)胞其敏感性低于腫瘤細(xì)胞，這說明4-硫-5-噻吩基尿苷的抗腫瘤作用具有強(qiáng)特異性，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，在人體黑色素腫瘤治療方面有很好的應(yīng)用前景。
[0011]本發(fā)明通過4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷的藥理實(shí)驗(yàn)對其應(yīng)用進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0012]圖1為4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷的分子結(jié)構(gòu)；
[0013]圖2為4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷的紫外譜圖；
[0014]圖3為不同濃度4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷處理人黑色素腫瘤細(xì)胞抑制作用；
[0015]圖4為不同濃度4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷和5-氟尿嘧啶(5-FU)對人黑色素腫瘤細(xì)胞抑制作用；
[0016]圖5為不同濃度的4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)；
[0017]圖6為4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷對A375細(xì)胞周期的影響；
[0018]圖7為不同濃度4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷處理小鼠黑色素腫瘤細(xì)胞抑制作用；
[0019]圖8為不同濃度4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷處理成纖維細(xì)胞MTT摻入實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0021]如無特殊說明，本發(fā)明所涉及試劑均市售可得，以下實(shí)施例優(yōu)選采用:碘化丙啶、醋酸購自于sigma公司；三氯乙酸購自上海生工生物公司；Trypsin，MTT購自于生工生物公司；雙三苯基磷二氯化鈀，2-(三丁基錫烷基)噻吩和尿嘧啶核苷等試劑均為市售品；人黑色素腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)375細(xì)胞和小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F1均購自南京凱基生物公司；DMSO購自上海生工生物有限公司，用于藥品的溶解。
[0022]如無特殊說明，所用設(shè)備均為常規(guī)選擇，本發(fā)明所用設(shè)備包括:薄層色譜用硅膠GF254為青島海洋化工廠產(chǎn)品；凈化工作臺(tái)為蘇州凈化公司產(chǎn)品，水套式CO2孵育箱由美國shellab公司制造；微孔板分光光度計(jì)為上海元析儀器有限公司制造，流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；熔點(diǎn)用X-4數(shù)顯型熔點(diǎn)儀測定(鞏義市英峪予華儀器廠)，溫度未校正；IR測定用Nicolet 550智能傅立葉紅外光譜儀(賽默飛世爾科技)；紫外-可見分光光度計(jì)為JASC0-UV560 ;核磁共振光譜儀，NMR用BrukerAC P400型核磁共振儀測定。
[0023]本發(fā)明所制備的4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷采用申請?zhí)枮?01310374980.7，發(fā)明名稱為:含硫尿苷抗癌藥物和中間體及合成方法的專利申請文件中涉及的制備方法制備所得。
[0024]實(shí)施例1 4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對人黑色素腫瘤細(xì)胞(A375)和小鼠黑色素腫瘤細(xì)胞(B16-F1)的增殖抑制試驗(yàn)
[0025]1.細(xì)胞培養(yǎng)
[0026]將B16-F1和A375分別用含10 % (V/V)熱滅活胎牛血清和抗生素(青霉素)100yg/ml，鏈霉素100 μ g/ml的DMHM和RPMI1640培養(yǎng)液中，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。根據(jù)細(xì)胞密度，每2-3天換新鮮培養(yǎng)基一次。B16-F1和A375均為貼壁生長的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞傳代用0.25%的胰蛋白酶消化，按1:3-4的比例擴(kuò)增。
[0027]2.細(xì)胞增生率測定(MTT實(shí)驗(yàn))
[0028]取對數(shù)生長期細(xì)胞，將B16-F1和A375分別接種于平底96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ I，含I X 14個(gè)細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁，孵育培養(yǎng)24h后，設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，37°C,5% CO 2培養(yǎng)過夜。次日分別用DMEM和RPMI1640完全培養(yǎng)液稀釋4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷藥物，濃度為藥物終濃度的2倍，然后將稀釋的藥物加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ 1，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔。
[0029]對照孔只加100 μ I細(xì)胞培養(yǎng)液。加藥后，各孔總體積為200 μ 1，4硫尿苷的藥物終濃度分別為100 μ Μ，200 μ Μ，300 μ Μ，400 μ Μ，500 μ Μ。加藥后，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，向各孔加入20 μ I MTT溶液(5mg/ml，PBS稀釋)。培養(yǎng)結(jié)束后，輕輕甩棄各孔培養(yǎng)液，并將培養(yǎng)板倒扣于紙巾輕拍數(shù)次，以去除各孔殘留液體。然后向每孔加入100 μ IDMSO溶液以溶解細(xì)胞內(nèi)沉淀的MTT代謝產(chǎn)物，用微孔板分光光度計(jì)測定波長570ηΜ的吸光度(OD)。細(xì)胞增生率=(各藥物處理孔OD值/對照孔OD值)XlOO %。
[0030]試驗(yàn)結(jié)果如下:
[0031](1)4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷對A375的生長具有抑制作用
[0032]4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷是一種新合成的化合物，它對腫瘤細(xì)胞的作用尚無報(bào)道，因此首先通過MTT摻入實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量的4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷對A375的影響。用劑量范圍在100-500uM的4-硫-5- (2-噻吩基)尿苷處理A375，48小時(shí)后檢測MTT代謝產(chǎn)物。圖3為用藥物濃度處理A37548小時(shí)，通過MTT摻入實(shí)驗(yàn)測定各組細(xì)胞的OD值并計(jì)算細(xì)胞增生率。如圖所示，與未加藥物的對照組比較，4-硫-5-(2-噻吩基)尿苷在10uM/L濃度時(shí)對A375細(xì)胞的增