泳圖；其中，1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000(2000bp、 1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，下同），2為Ag85a的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，片段大小約為 1080bp。
[0044] 圖2為Esat6Fl/Rl擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；其中，1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000, 2和3為 ESAT6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，片段大小約為220bp。
[0045] 圖3為Ag85a_ESAT6融合基因第一次（左）和第二次PCR(右）產(chǎn)物電泳圖；其 中，左圖中，1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000, 2和3為ESAT6第一次擴(kuò)增產(chǎn)物，大小約為240bp ; 4和5為Ag85a第一次擴(kuò)增產(chǎn)物，大小約為IlOObp ;右圖中，1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000, 2 和3為ESAT6和Ag85a融合PCR產(chǎn)物，大小約為1300bp。
[0046] 圖4為Ag85a/pVAXl重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果；其中，1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000,2 和3為Ag85a/pVAXl重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果，酶切后載體片段大小約為2900bp，目的基因 Ag85a 大小約為1080bp。
[0047] 圖5為Ag85a_ESAT6融合基因/pVAXl重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果；其中，1為DNA分 子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000, 2和3為Ag85a-ESAT6/pVAXl重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果，酶切后載體大小約為 2900bp，目的基因 Ag85a-ESAT6 大小約為 1300bp。
[0048] 圖6為Western Blot檢測結(jié)果；其中，1為無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染空白對照組，2為不含信號 肽Ag85a-ESAT6融合基因轉(zhuǎn)染組，3為含信號肽Ag85a-ESAT6融合基因轉(zhuǎn)染組。
[0049] 圖7為各組ELISP0T斑點(diǎn)計數(shù)結(jié)果。
[0050] 圖8為各組ELISP0T斑點(diǎn)直觀圖；其中a:陰性對照孔；b: PHA陽性對照 孔；(3:生理鹽水組；(1:卡介苗 ；6^885&454了6(1(^8);6^885&454了6(2(^ 8); e:Ag85a_ESAT6(50 μ g)。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0052] 實(shí)施例1治療性結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗及其制備方法
[0053] 一、實(shí)驗(yàn)材料
[0054] 1.菌株
[0055] E. coli DH5a，為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0056] 結(jié)核分枝桿菌株H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株，由廣州市胸科醫(yī)院譚守勇教授提供，已于121°C，5 分鐘高溫滅活。
[0057] 2.真核表達(dá)載體
[0058] pVAXl 購自 Invitrogen 公司。
[0059] 3.試劑盒
[0060] 細(xì)菌DNA提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒， DP302)。
[0061] 質(zhì)粒（小量）提取試劑盒（Takara miniBEST Plasmid Purification kit ver 4. 0, Code No. 9760)。
[0062] 膠回收試劑盒（Takara MinBEST Agarose Gel Extraction kit Ver3. 0, D823A)。
[0063] 4.酶類：pfu DNA 聚合酶（天根）、BamHI (Takara), XbaI (Takara)、T4DNA 連接酶 (Takara)〇
[0064] 5. -般試劑
[0065] 瓊脂糖、DNA Marker (Takara)、Gelred?染料（BI0TIUM)、甘油、Kana 抗生素 (MDbio. Inc)。
[0066] 6.培養(yǎng)基、緩沖液
[0067] I) LB 培養(yǎng)基（IL)
[0068]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種治療性結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗由5'端帶有人粒細(xì) 胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子信號肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入pVAXl載體后得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于， 所述Ag85a_ESAT6融合基因的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA疫苗，其特征在于，所述信號肽的核苷酸序列為： 5' -GGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCT-3'。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA疫苗，其特征在于，所述Ag85a-ESAT6融合基因由Ag85a 基因和ESAT6基因通過linker序列連接，所述Linker的核苷酸序列為： 5' -ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCC-3'。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA疫苗，其特征在于，帶有信號肽的Ag85a-ESAT6融合基因 插入載體PVAXl的啟動子pCMV下游，并在融合基因起始處引入KOZAK序列，其氨基酸序列 為：ANNATGG。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA疫苗，其特征在于，所述融合基因利用內(nèi)切酶BamHI和 XbaI通過雙酶切插入載體。
7.-種治療性結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步 驟： 1)提取結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的總DNA作為模板，利用引物85a-Fl/85a-Rl和 ESAT6-F1/ESAT6-R1分別擴(kuò)增得到結(jié)核分枝桿菌Ag85a和ESAT6的編碼基因；構(gòu)建含人粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子信號肽的Ag85a和ESAT6重組質(zhì)粒； 所述信號肽的核苷酸序列為： 5' -GGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCT-3'。 2)再分別以含信號肽的Ag85a和ESAT6重組質(zhì)粒為模板，利用引物RH-85a-Fl/ RH-85a-Rl和RH-ESAT6-F1/RH-ESAT6-R1擴(kuò)增得到帶有Linker的Ag85a和ESAT6的DNA片 段，所述Linker的核苷酸序列為：5' -ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCC-3' ； 3)通過重疊PCR方法獲得5'端帶有信號肽的Ag85a-ESAT6融合基因； 4)利用內(nèi)切酶BamHI和XbaI將上述帶有信號肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入pVAXl 載體的啟動子PCMV下游，得到治療性結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中引物的核苷酸序列如下： 85a-Fl ： -CGGGATCCAGGATGGGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTCAGCTTGT TGACAGGGTT-3,； 85a-Rl ： 5' -GGTCTAGACTAGGCGCCCTGGGGCGC-3' ； ESAT6-F1 ： 5' -CGGGATCCAGGATGGCAGAGCAGCAGTGGAATTTC-3' ； ESAT6-R1 ： 5' -GGTCTAGACTACTGCAGCGCGTTGTTCAGC-3'。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中引物的核苷酸序列如下： RH-85a-Fl ： 5'-CGGGATCCAGGATGGGGCTGCAGAG-3' ； RH-85a-Rl： 5' -ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCCGGCGCCCTGGGGCGC-3' ； RH-ESAT6-F1 ： 5' -GGGTCAGGAGGCGGGGGTTCGTGTATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTC-3' ；RH-ESAT6-R1 ： 5' -GGTCTAGACTACTGCAGCGCGTTGTTCAGC-3'。
10.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的DNA疫苗在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)和DNA疫苗領(lǐng)域，具體提供一種治療性結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗、及其制備方法及與應(yīng)用。治療性結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗(簡稱TB DNA疫苗)為含有編碼外源免疫保護(hù)性抗原蛋白Ag85a-ESAT6的融合基因表達(dá)載體，其由5’端帶有人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)信號肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入pVAX1載體后得到。所述信號肽能夠提高抗原蛋白的分泌，增強(qiáng)其免疫效果。本發(fā)明利用基因重組技術(shù)構(gòu)建包含多個免疫保護(hù)性抗原的融合基因結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗，通過在體電脈沖技術(shù)(in vivo electroporation,EP)將DNA疫苗注射小鼠雙側(cè)脛前肌，可誘導(dǎo)針對結(jié)核抗原分泌高水平IFNγ的Th1型免疫應(yīng)答和特異性殺傷應(yīng)答，是一種可預(yù)防和治療結(jié)核病的疫苗。
【IPC分類】A61P31-06, A61K48-00, A61K39-00
【公開號】CN104689343
【申請?zhí)枴緾N201510140710
【發(fā)明人】饒桂榮, 陳光明, 楊富強(qiáng), 張換敬
【申請人】中國人民解放軍第四五八醫(yī)院
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月27日