治療性結(jié)核分枝桿菌dna疫苗及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及DNA疫苗領(lǐng)域，具體地說，涉及一種治療性結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗及其 制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的嚴(yán)重 危害人類健康的傳染性疾病?？ń槊纾˙acille Calmette Guerin, BCG)是目前唯一上市用 于預(yù)防結(jié)核病的疫苗，自1921年發(fā)現(xiàn)以來一直受到人們的關(guān)注，主要應(yīng)用于兒童期結(jié)核病 的預(yù)防。但是，卡介苗的保護效率隨時間的推移而逐漸降低，而且對于不同地區(qū)，不同人群， 其保護率從0到80%不等。研究表明，目前正在使用的卡介苗菌株都缺乏在致病結(jié)核桿菌 和牛型結(jié)核分枝桿菌中存在的編碼某些有保護性免疫效應(yīng)的DNA片段。WHO已于1995年宣 布BCG不是預(yù)防結(jié)核病的有效疫苗。
[0003] 20世紀(jì)40年代后，多種抗結(jié)核藥物（異煙肼、鏈霉素、利福平、乙氨丁醇等）相繼 出現(xiàn)，給結(jié)核病的治療帶來曙光。但是，服用這些藥物具有較多副作用，并且長期服用會導(dǎo) 致結(jié)核分枝桿菌出現(xiàn)耐藥突變，使抗結(jié)核藥物的治療效果大大降低。此外，伴隨人類免疫缺 陷病毒（HIV)合并結(jié)核病，以及移民等社會問題的出現(xiàn)，使結(jié)核病疫情"死灰復(fù)燃"。據(jù)世界 衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO) 2014年TB報告，全球每年大約有900萬新增 結(jié)核病患者，150萬人死于結(jié)核病，其中36萬人同時感染HIV ;我國是僅次于印度的結(jié)核病 第二大流行國家，年發(fā)病人數(shù)達(dá)120萬。鑒于結(jié)核病發(fā)生的嚴(yán)重態(tài)勢，加強結(jié)核病的防治工 作，探索結(jié)核病的早期診斷及研發(fā)有效預(yù)防和治療結(jié)核病的生物制劑，已成為當(dāng)前全球關(guān) 注的課題。
[0004] 目前國內(nèi)外結(jié)核病疫苗的研究進(jìn)展主要在預(yù)防兒童、成人感染結(jié)核；預(yù)防潛伏期 結(jié)核向活動性結(jié)核的發(fā)展；以及施行BCG初免-蛋白加強的策略；同時也注意到研究結(jié)核 病治療性核酸疫苗（nucleic acid vaccine)的緊迫性。目前研究的結(jié)核病疫苗主要有重組 卡介苗、蛋白多肽疫苗、活載體疫苗和核酸疫苗等，已經(jīng)有幾種重組疫苗產(chǎn)品進(jìn)入了臨床試 驗階段。其中核酸DNA疫苗是世界矚目的防治傳染病的研究新熱點。與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA 疫苗有諸多優(yōu)點，尤其是它可誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)，使其在抗細(xì)胞內(nèi)感染中獨具優(yōu)勢。它將 編碼外源性抗原蛋白的基因表達(dá)載體直接導(dǎo)入機體，通過宿主細(xì)胞攝取外源DNA，進(jìn)入核內(nèi) 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，然后在胞質(zhì)中翻譯，翻譯產(chǎn)物進(jìn)一步與MHC-I類分子結(jié)合，提呈至細(xì)胞表面，被 CD8+T細(xì)胞識別，產(chǎn)生較強的CTL細(xì)胞免疫反應(yīng)。同時，有一部分短肽可進(jìn)入溶酶體/核內(nèi) 體與MHC-II類分子結(jié)合，被⑶4+T細(xì)胞識別，產(chǎn)生⑶4+T細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。⑶4+T細(xì) 胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答偏向Thl，產(chǎn)生高水平的IFN- γ，并刺激產(chǎn)生IgG2同種型抗體，有效殺死 寄生于巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種新型的治療性結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗及其制備方法與 應(yīng)用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種治療性結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗，所述 DNA疫苗由5'端帶有人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)信號肽的Ag85a-ESAT6 融合基因插入PVAXl載體后得到。
[0007] 進(jìn)一步地，所述Ag85a_ESAT6融合基因的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示。
[0008] 進(jìn)一步地，所述信號肽的核苷酸序列為：
[0009] 5' -GGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTG CAGCATCTCT-3'。
[0010] 進(jìn)一步地，所述Ag85a-ESAT6融合基因由Ag85a基因和ESAT6基因通過linker序 列連接，所述Linker的核苷酸序列為：
[0011] 5，-ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCC-3，。
[0012] 進(jìn)一步地，帶有信號肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入載體pVAXl的啟動子pCMV下 游，并在融合基因起始處引入KOZAK序列，其氨基酸序列為：ANNATGG。
[0013] 進(jìn)一步地，所述融合基因利用內(nèi)切酶BamHI和XbaI通過雙酶切插入載體。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種治療性結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗的制備方法，所述方法包括如 下步驟：
[0015] 1)提取結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的總DNA作為模板，利用引物85a-Fl/85a-Rl 和ESAT6-F1/ESAT6-R1分別擴增得到結(jié)核分枝桿菌Ag85a和ESAT6的編碼基因；構(gòu)建含人 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子信號肽的Ag85a和ESAT6重組質(zhì)粒；
[0016] 所述信號肽的核苷酸序列為：
[0017] 5' -GGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTG CAGCATCTCT-3'。
[0018] 2)再分別以含信號肽的Ag85a和ESAT6重組質(zhì)粒為模板，利用引物RH-85a-Fl/ RH-85a-Rl 和 RH-ESAT6-F1/RH-ESAT6-R1 擴增得到帶有 Linker 的 Ag85a 和 ESAT6 的 DNA 片 段，所述 Linker 的核苷酸序列為：5' -ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCC-3' ；
[0019] 3)通過重疊PCR方法獲得5'端帶有信號肽的Ag85a-ESAT6融合基因；
[0020] 4)利用內(nèi)切酶BamHI和XbaI將上述帶有信號肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入 pVAXl載體的啟動子pCMV下游，得到治療性結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗。
[0021] 其中：
[0022] 所述步驟1)中引物的核苷酸序列如下：
[0023] 85a-Fl ：
[0024] 5' -CGGGATCCAGGATGGGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTG GGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTCAG CTTGTTGACAGGGTT-3' ；
[0025] 85a-Rl ：
[0026] 5, -GGTCTAGACTAGGCGCCCTGGGGCGC-3,；
[0027] ESAT6-F1 ：
[0028] 5, -CGGGATCCAGGATGGCAGAGCAGCAGTGGAATTTC-3,；
[0029] ESAT6-R1 ：
[0030] 5, -GGTCTAGACTACTGCAGCGCGTTGTTCAGC-3，。
[0031] 所述步驟2)中引物的核苷酸序列如下：
[0032] RH-85a-Fl ：
[0033] 5, -CGGGATCCAGGATGGGG CTGCAGAG-3,；
[0034] RH-85a-Rl ：
[0035] 5, -ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCCGGCGCCCTGGGGCG C-3,；
[0036] RH-ESAT6-F1 ：
[0037] 5' -GGGTCAGGAGGCGGGGGTTCGTGTATGACAGAGCAGCA GTGGAATTTC-3' ；
[0038] RH-ESAT6-R1 ：
[0039] 5, -GGTCTAGACTACTGCAGCGCGTTGTTCAGC-3，。
[0040] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供了所述DNA疫苗在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。
[0041] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0042] 本發(fā)明提供的治療性結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗，一方面，使用細(xì)胞因子GM-CSF信號 肽，提高抗原蛋白的分泌，增強其免疫效果。另一方面，本發(fā)明將兩個抗原編碼基因融合構(gòu) 建的雙基因疫苗能達(dá)到用一種載體表達(dá)兩種不同抗原的目的。在選取兩種具有協(xié)同增效 作用的優(yōu)勢抗原作為融合基因疫苗的抗原最為重要。利用各種結(jié)核桿菌保護性抗原的編 碼核酸（基因）疫苗預(yù)防或治療結(jié)核感染的動物實驗已有許多成功報道。ESAT6(Early secreted antigenic target 6_kD protein),是從結(jié)核桿菌短期培養(yǎng)濾液中純化分離出的 一種低分子量分泌性蛋白，具有較強的細(xì)胞免疫活性，在抗結(jié)核感染的免疫記憶應(yīng)答中起 重要作用。ESAT6基因在90 %以上非致病性分枝桿菌菌株和BCG中缺乏，也可作為診斷是否 感染致病性結(jié)核分枝桿菌的特異診斷分子；結(jié)核桿菌Ag85復(fù)合物是結(jié)核分枝桿菌和BCG的 主要分泌性蛋白，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv株中，Ag85約占分泌蛋白的30 %，由Ag85A、Ag85B 和Ag85C組成，分子量為30KD-32KD。其中Ag85A和Ag85B，是結(jié)核桿菌重要的保護性抗原。 Ag85a不僅能刺激機體產(chǎn)生體液免疫，還能激發(fā)較強Thl型細(xì)胞免疫，引起CD8+T細(xì)胞增殖 和IL-2及IFN-γ等細(xì)胞因子水平的上升。本發(fā)明將Ag85a與ESAT6融合，在編碼區(qū)前面 插入GM-CSF信號肽以提高分泌蛋白表達(dá)，在融合區(qū)采用韌性linker肽3 (GS4)連接，采用 美國FDA批準(zhǔn)的唯一用于臨床試驗的DNA疫苗載體pVAXl，利用基因重組技術(shù)構(gòu)建融合基因 結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗，從而為臨床提供一種新的結(jié)核病治療手段。
【附圖說明】
[0043] 圖1為Ag85a F1/R1擴增產(chǎn)物電