一種脾氨肽原液的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化制藥領(lǐng)域，具體涉及一種脾氨肽原液的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脾氨肽的主要成份來自新鮮哺乳動物脾臟中提取的多肽及核苷酸類物質(zhì)，其主要 用于治療細胞免疫功能低下、免疫缺陷和自身免疫功能紊亂性疾?。ǚ磸秃粑栏腥?、支氣 管炎、肺炎、哮喘、重癥帶狀皰疹及牛皮癬等）；用于惡性腫瘤病人放、化療及術(shù)后生活質(zhì)量， 降低各種原因引起的感冒、發(fā)燒或其它感染發(fā)生率。
[0003] 現(xiàn)有的脾氨肽提取方法通常為先將動物脾臟清洗絞碎、勻漿，然后通過透析或超 濾的方法提取脾氨肽有效組分，這種方法的缺點是提取率低，產(chǎn)品純度低，因為有害的大分 子和小分子不能有效去除，同時這種方法細胞破碎不完全，有效成分不能完全釋放。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本申請?zhí)峁┝艘环N快速、高純度、高活性脾氨肽原液的 制備方法。具體技術(shù)方案如下。
[0005] 本申請?zhí)峁┑囊环N脾氨肽原液的制備方法，主要包括如下步驟： 1) 取料、磨碎、勻漿：將新鮮的健康的動物脾臟去脂肪及締結(jié)組織，然后磨碎勻漿； 2) 速凍、融化：將步驟1)得到的勻漿液速凍，速凍完成的勻漿液放入恒溫箱至完全融 化；反復兩次； 3) 蛋白酶水解：向步驟2)得到的勻漿液中加入蛋白酶水解； 4) 高壓破碎：將步驟3)酶解后的溶液放入高壓細胞破碎機中破碎； 5) 核酸酶水解：將步驟4)破碎得到的溶液加入核酸酶水解； 6) 離心、超濾：將雙酶酶解后溶液放入冷凍離心機中離心，離心后取上清液進入超濾器 超濾； 7) 制備型高效液相色譜純化：將超濾后溶液進入制備型高效液相色譜純化，得到脾氨 肽原液。
[0006] 通過上述步驟制得的脾氨肽原液經(jīng)進一步的凍干/灌裝：即將高純度脾氨肽原液 凍干成脾氨肽凍干粉或直接灌裝成脾氨肽注射劑，凍干可保證脾氨肽有效成分活性的穩(wěn)定 性并延長保護期，由于本申請?zhí)峁┑钠彪脑杭兌雀呖梢灾苯庸嘌b為脾氨肽注射劑，方 便不同人群的使用。
[0007] 進一步地，上述方法中步驟2)所述速凍為將勻漿液放入旋動機速凍，即旋凍，溫度 為-25-30°C，時間為I. 5-3h ;步驟2)中所述融化的溫度為35-45°C。本申請通過旋動法 對勻漿液進行速凍因為此種方法冷凍速凍快，能達到速凍，有利于細胞破碎。
[0008] 進一步地，上述方法中步驟3)所述蛋白酶與勻漿液的重量配比為I :60-100,優(yōu)選 為 1 :80 ;酶解溫度 35-45°C ;PH 值為 7. 5-8. 0。
[0009] 進一步地，上述方法中，步驟4)所述高壓破碎的壓力為100-llOMpa，時間 0. 8-1. 5h。本申請采用高壓破碎是為了使細胞破碎完全的同時不破壞有效成分，而且適用 于大規(guī)模生產(chǎn)；現(xiàn)有技術(shù)常用的超聲波法破碎容易破壞有效成分因其容量小、易發(fā)熱，而且 不利于大規(guī)模生產(chǎn)，而溶菌酶法破碎率低成本高。
[0010] 進一步地，上述方法中，步驟5)所述核酸酶與破碎后溶液的重量配比為1 : 60-250,優(yōu)選為I :100 ;酶解溫度50-60°C ;PH6. 2-6. 8 ;時間2-3h。本申請采用核酸酶進一 步酶解其一是因為動物脾臟內(nèi)的一些大分子附著在細胞壁上，采用核酸分子有利于破壁； 其二脾氨肽分子吸附在細胞內(nèi)的核酸分子上，核酸酶水解核酸使核酸分子破壞，從而脾氨 肽分子得到有效的釋放。
[0011] 進一步地，上述方法中步驟6)所述離心機的轉(zhuǎn)速為轉(zhuǎn)速4000r/min，離心時間為 30min ;超濾截留分子量為10000。
[0012] 進一步地，上述方法中步驟7)所述高效液相色譜參數(shù)為：反相高效液相色譜 RP-HPLC，固定相苯烷基和氰基鍵合硅膠孔徑100萬，流動相為純化水和緩沖液，收集分子 量 2000-4000。
[0013] 本申請?zhí)峁┑姆椒ㄍㄟ^勻漿、旋凍、融、雙酶水解、高壓破碎、離心超濾等步驟得到 高純度高活性的脾氨肽原液，本申請?zhí)峁┑钠彪闹苽浞椒ㄏ鄬τ诂F(xiàn)有的方法具有如下優(yōu) 勢： 1) 細胞破壁完全，有效成分得到全面釋放； 2) 脾氨肽分子保持完整、沒有分子結(jié)構(gòu)變化； 3) 產(chǎn)品高純度、高活性、質(zhì)量均符合國家標準要求； 4) 沒有大分子（Mr > 5000物質(zhì)）和小分子（Mr < 1000物質(zhì)）有害物質(zhì)，可用作高活性 凍干粉和注射劑。
【附圖說明】
[0014] 圖1蛋白酶水解樣圖； 圖2核酸酶水解樣圖； 圖3 HPLC純化樣圖； 圖4制備型HPLC圖； 圖5為制備HPLC純化樣品紫外圖譜。
【具體實施方式】
[0015] 下面通過實施例來對本發(fā)明做進一步解釋說明。
[0016] 實施例1 脾氨肽口服凍干粉的制備方法： 1)取料，磨碎，旋動法速凍、融化：新鮮豬脾臟剪去脂肪及結(jié)締組織稱重，按稱量豬脾重 量加2倍純化水入膠體磨(膠體磨間隙：3 μ m)，時間5min，得到豬脾勻漿液；將磨碎后豬脾 勻漿液放入旋動機速凍，溫度_30°C，時間2h ;將速凍完成的豬脾勻漿液放入恒溫箱，溫度 設定38°C，直至速凍品完全融化；二次速凍：將融化完全的豬脾勻漿液再次放入旋動機中 速凍，溫度_30°C，時間2h ;二次融化：將二次速凍完成的豬脾勻漿液放入恒溫箱，溫度設定 38°C，直至速凍品完全融化； 2) 蛋白酶水解：豬脾勻漿液中放入蛋白酶，凈脾重量：蛋白酶重量=80:1 ;酶解溫度 40〇C ；PH7. 5-8. 0 ； 3) 高壓細胞破碎機再破碎：將酶解后溶液放入高壓細胞破碎機中破碎(分子直徑< 0 · 2 μ m)，壓力 lOOMpa，時間 I h ; 4) 核酸酶水解：將高壓細胞破碎后得到的溶液加入酵母磷酸二酯酶(核酸酶）水解，溶 液：酶=100:1 ;酶解溫度 55°C ;ΡΗ6· 2-6. 8 ; 5) 離心：將雙酶酶解后溶液放入冷凍離心機中離心，轉(zhuǎn)速4000r/min，時間30min ; 6) 超濾：離心后取上清液進入超濾器超濾，超濾膜的截留分子量10000 ; 7) 制備型高效液相色譜純化：將超濾后溶液進入制備型高效液相色譜純化，得到脾氨 肽原液；高效液相色譜參數(shù)(反相高效液相色譜RP-HPLC，固定相苯烷基和氰基鍵合硅膠孔 徑100萬，流動相為純化水和緩沖液，收集分子量2000-4000); 8) 純化后得到的高純度脾氨肽原液，測定光譜、多肽、核糖、分子量、活性； 9) 將高純度脾氨肽原液凍干成脾氨肽凍干粉。
[0017] 實施例2 脾氨肽口服凍干粉的制備方法：步驟同實施例1，不同的為： 步驟2)中凈脾重量：蛋白酶重量=100:1。
[0018] 實施例3 脾氨肽口服凍干粉的制備方法：步驟同實施例1，不同的為： 步驟2)中凈脾重量：蛋白酶重量=60:1。
[0019] 實施例4 脾氨肽口服凍干粉的制備方法：步驟同實施例1，不同的為： 步驟4)中所述溶液：酶=250:1。
[0020] 實施例5 脾氨肽注射劑的制備方法：步驟同實施例1，不同的為： 步驟9)為：將脾氨肽原液直接灌裝成脾氨肽注射劑。
[0021] 實施例6參數(shù)優(yōu)化及數(shù)據(jù)結(jié)果 1.首先通過高效液相色譜測定多肽和蛋白質(zhì)分子出峰時間，具體結(jié)果如表1 : 色譜測定參數(shù)：色譜柱：硅膠凝膠色譜柱（TSK-GET 2000 SffXL 300X7. 8mm 5ym 流動相：PB 0· lmol/L PH: 7. 0 內(nèi)含 0· 05 mol/L NaN3、0· lmol/L Na2SO4 檢測波長： 280nm，214nm ; 表1高效液相色譜測定多肽和蛋白質(zhì)分子出峰時間
【主權(quán)項】
1. 一種脾氨肽原液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 取料、磨碎、勻漿：將新鮮的健康的動物脾臟去脂肪及締結(jié)組織，然后磨碎勻漿； 2) 速凍、融化：將步驟1)得到的勻漿液速凍，速凍完成的勻漿液放入恒溫箱至完全融 化；反復兩次； 3) 蛋白酶水解：將步驟2)得到的勻漿液中加入蛋白酶水解； 4) 高壓破碎：將步驟3)酶解后的溶液放入高壓細胞破碎機中破碎； 5) 核酸酶水解：將步驟4)破碎得到的溶液加入核酸酶水解； 6) 離心、超濾：將雙酶酶解后溶液放入冷離心機中離心，離心后取上清液進入超濾器超 濾； 7) 制備型高效液相色譜純化：將超濾后溶液進入制備型高效液相色譜純化，得到脾氨 肽原液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述速凍為將勻漿液放入旋 動機速凍，溫度為-25-30°C，時間為I. 5-3h ;步驟2)所述的融化溫度為35-45°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)所述蛋白酶與勻漿液的重量 配比為I :60-100,優(yōu)選為1 :80 ;酶解溫度35-45°C ;PH值為7. 5-8. 0。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4)所述高壓破碎的壓力為 100-1 lOMpa，時間 0· 8-1. 5h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟5)所述核酸酶與破碎后溶液的 重量配比為I :60-250,優(yōu)選為I :100 ;酶解溫度50-60°C ;PH6. 2-6. 8 ;時間2-3h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟6)所述離心機的轉(zhuǎn)速為轉(zhuǎn)速 4000r/min，離心時間為30min ;超濾截留分子量為10000。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟7)所述高效液相色譜參數(shù)為： 反相高效液相色譜RP-HPLC，固定相苯烷基和氰基鍵合硅膠孔徑100萬，流動相為純化水和 緩沖液，收集分子量2000-4000。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脾氨肽口服原液的制備方法，通過磨碎、勻漿、旋凍、融、雙酶水解、高壓破碎、離心超濾等步驟得到高純度高活性的脾氨肽原液，本申請?zhí)峁┑钠彪闹苽浞椒ㄏ鄬τ诂F(xiàn)有的方法具有如下優(yōu)勢：細胞破壁完全，有效成分得到全面釋放；脾氨肽分子保持完整、沒有分子結(jié)構(gòu)變化；產(chǎn)品高純度、高活性、質(zhì)量均符合國家標準要求；沒有大分子和小分子有害物質(zhì)，可制作成高活性凍干粉或注射劑。
【IPC分類】A61K38-00, A61K35-26, A61P37-02, A61P37-04, A61K9-19
【公開號】CN104644672
【申請?zhí)枴緾N201510079165
【發(fā)明人】趙卿全
【申請人】大連百利天華制藥有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年2月13日