專利名稱：用于改善動脈粥樣硬化的口服給藥的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
相關(guān)申請的交叉參考本申請是2001年6月29日申請的USSN 09/896,841的部分繼續(xù)申請，而后者是2000年8月24日申請的USSN 09/645,454的部分繼續(xù)申請，這兩者以其整體作為參考文獻在本文中引用用于所有目的。
對于由聯(lián)邦政府贊助的研究和開發(fā)所做出的發(fā)明的權(quán)利聲明本工作由美國公共衛(wèi)生部和國家心，肺和血液研究所撥款HL30568和HL34343資助。美國政府擁有明確的對本發(fā)明的權(quán)利。
本發(fā)明涉及動脈粥樣硬化領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及可口服用藥且改善動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的一類肽的鑒定。
背景技術(shù)：
心血管疾病特別是在美國和西歐國家中是發(fā)病率和死亡率的主要原因。在心血管疾病的形成中涉及的一些病原性因素包括對該疾病的遺傳誘因，性別，諸如吸煙和飲食的生活方式因素，年齡，高血壓，和高脂血癥，包括高膽固醇血癥。其中一些因素，特別是高脂血癥和高膽固醇血癥(血液膽固醇濃度高)提供了與動脈粥樣硬化相關(guān)的重要風險因素。
膽固醇在血液中以游離狀態(tài)和脂蛋白顆粒內(nèi)的酯化膽固醇存在，通常稱為乳糜微粒，極低密度脂蛋白(VLDL)，低密度脂蛋白(LDL)，和高密度脂蛋白(HDL)。血液中的總膽固醇濃度受下列因素影響(1)從消化道吸收的膽固醇，(2)從諸如糖類，蛋白質(zhì)，脂肪和乙醇的飲食成分合成的膽固醇，和(3)由組織，特別是肝臟從血液中除去膽固醇并隨后將膽固醇轉(zhuǎn)變成膽汁酸，類固醇激素，和膽汁膽固醇。
血液膽固醇濃度的維持受遺傳和環(huán)境因素影響。遺傳因素包括膽固醇生物合成中的限速酶濃度，肝臟中低密度脂蛋白的受體濃度，膽固醇膽汁酸轉(zhuǎn)化的限速酶濃度，脂蛋白的合成和分泌速率及人的性別。影響人類血液膽固醇濃度的環(huán)境因素包括飲食結(jié)構(gòu)，吸煙影響，身體活動，和各種藥物的使用。飲食變量包括脂肪的含量和類型(飽和的和多不飽和脂肪酸)，膽固醇的含量，纖維的含量和類型，也許還有諸如維生素C和D的維生素和諸如鈣的無機物的含量。
流行病學研究表明高密度脂蛋白(HDL)和載脂蛋白(apo)A-I水平與動脈粥樣硬化結(jié)果的發(fā)生反相關(guān)(Wilson等(1988)Arteriosclerosis 8737-741)。給喂養(yǎng)致動脈粥樣化食物的兔子注射HDL顯示出抑制動脈粥樣硬化病灶形成(Badimon等(1990)J.Clin.Invest.851234-1241)。
人apo A-I由于其抗致動脈粥樣化特性而成為了被深入研究的主題。包括apo A-I的可交換的載脂蛋白具有脂締合結(jié)構(gòu)域(Brouillette和Anantharamaiah(1995)Biochim.Biophys.Acta 1256103-129；Segrest等(1974)FEBS Lett.38247-253)。假定Apo A-I具有8個串聯(lián)重復的22mer序列，其中大多數(shù)具有形成A型兩親性螺旋結(jié)構(gòu)的潛力(Segrest等(1974)FEBSLett.38247-253)。A型兩親性螺旋的特征包括具有在極性-非極性界面的帶正電荷的殘基和在極性面中央帶負電荷的殘基(Segrest等(1974)FEBS Lett.38247-253；Segrest等(1990)ProteinsStructure，F(xiàn)unction，and Genetics 8103-117)。已表明Apo A-I與磷脂強烈締合形成復合物并啟動富含膽固醇的細胞中的膽固醇流出。apo A-I血清水平的傳遞和維持有效減輕動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀至今仍證明是難以捉摸的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了新的肽，其施用可減輕動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀。具體地說，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是包含一種A型兩親性螺旋的肽當用“D”氨基酸殘基制成和/或具有保護的氨基和羧基末端時可通過口服施用給生物體，容易被吸收并傳遞到血清，且有效減輕動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了改善動脈粥樣硬化癥狀的肽，其中該肽的長度范圍從大約10個到大約30個氨基酸，包含至少一個A型兩親性螺旋，包含至少一個“D”氨基酸殘基，防止磷脂被氧化劑氧化，且不是D-18A肽(例如，具有全部D型氨基酸殘基的D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F(SEQ ID NO1))。在特別優(yōu)選的實施方案中，該肽還包含偶聯(lián)到氨基和/或羧基末端的保護基團。優(yōu)選的保護基團包括，但不限于乙?；?，酰胺，3到20個碳原子的烷基，F(xiàn)moc，t-boc，9-芴乙?；?，1-芴羧基，9-芴羧基，9-芴酮-1-羧基，芐氧基羰基，呫噸基(Xan)，三苯甲基(Trt)，4-甲基三苯甲基(Mtt)，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)，4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰(Mtr)，1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基(Mts)，4，4二甲氧基二苯甲基(Mbh)，甲苯磺?；?Tos)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc)，4-甲芐基(MeBzl)，4-甲氧基芐基(MeOBzl)，芐氧基(BzlO)，芐基(Bzl)，苯甲?；?Bz)，3-硝基-2-吡啶磺酰基(3-nitro-2-pyridinesulphenyl，Npys)，1-(4，4-二甲基(dimentyl)-2，6-二偶氮亞環(huán)己基)乙基(Dde)，2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)，2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)，2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)，芐氧基甲基(Bom)，t-丁氧基羰基(Boc)，環(huán)己氧基(cHxO)，t-丁氧基甲基(Bum)，t-丁氧基(tBuO)，t-丁基(tBu)，乙酰基(Ac)，和三氟乙酰基(TFA)。在某些特別優(yōu)選的實施方案中，該肽還包含與氨基末端偶聯(lián)的第一保護基團和與羧基末端偶聯(lián)的第二保護基團。特別優(yōu)選的肽密切模擬人或小鼠apo A-I的A型兩親性螺旋。在某些實施方案中，優(yōu)選的肽包含與由編碼人或小鼠apo A-I的A型兩親性螺旋的外顯子編碼的多肽有大于大約50％的氨基酸序列同一性。在某些優(yōu)選的實施方案中，至少大約10％，優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少大約30％，也更優(yōu)選至少大約50％，甚至更優(yōu)選至少大約75％，且最優(yōu)選至少90％和甚至100％的對映體氨基酸是“D”氨基酸。該肽可與可藥用賦形劑(例如，適合于給哺乳動物口服用藥的賦形劑)結(jié)合。
在某些特別優(yōu)選的實施方案中，該肽包含一個或多個下列氨基酸序列D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO2)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO3)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO4)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO5)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO6)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO7)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO8)，
D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO9)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO10)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO11)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO12)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO13)，E-W-L-K-L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO14)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO15)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO16)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO17)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO18)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO19)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO20)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO21)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO22)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO23)，A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO24)，A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO25)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO26)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO27)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO28)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO29)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO30)，K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-(SEQ ID NO31)，L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO32)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO33)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO34)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO35)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO36)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO37)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO38)，D-W-L-K-A-L-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO39)，
D-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO40)，D-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO41)，E-W-L-K-A-L-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO42)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO43)，E-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO44)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO45)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO46)，E-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO47)，D-F-L-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W-(SEQ ID NO48)，E-F-L-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W-(SEQ ID NO49)，D-F-W-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W-(SEQ ID NO50)，E-F-W-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W-(SEQ ID NO51)，D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-(SEQ ID NO52)，D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO53)，E-K-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-(SEQ ID NO54)，E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO55)，D-W-L-K-A-F-V-D-K-F-A-E-K-F-K-E-A-Y-(SEQ ID NO56)，E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO57)，D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO58)，E-W-L-K-A-F-V-Y-E-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO59)，D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO60)，E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO61)，D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO62)，E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO63)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO64)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO65)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO66)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO67)，D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO68)，E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO69)，D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO70)，
E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO71)，D-W-L-R-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO72)，E-W-L-R-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO73)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO74)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO75)，D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO76)，E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO77)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F(SEQ ID NO78)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F(SEQ ID NO79)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F(SEQ ID NO80)，D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-P-D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-L-K-E-A-F(SEQ ID NO81)，D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-P-D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L(SEQ ID NO82)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F(SEQ ID NO83)，D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F(SEQ ID NO84)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F(SEQ ID NO85)，上述序列的截短形式，上述序列的多聚體組合(例如，優(yōu)選的范圍從二聚體到三聚體，四聚體，5聚體，8聚體或10聚體)，上述序列的保守取代，和/或含有氨基酸類似物的上述序列。該序列的對映體氨基酸優(yōu)選包含至少一個“D”氨基酸。在某些優(yōu)選的實施方案中，至少50％，更優(yōu)選至少75％，且最優(yōu)選至少90％和甚至100％的對映體氨基酸是本文所述的“D”氨基酸。該肽也可包括與氨基或羧基末端偶聯(lián)的保護基團(例如，酰胺，乙酰基，丙烯基(propeonyl)，和3到20個碳原子的烷基，等)。在某些實施方案中，與羧基末端偶聯(lián)的保護基團是酰胺。在某些實施方案中，與氨基末端偶聯(lián)的保護基團是乙酰基，丙烯基，或3到20個碳的烷基。某些肽同時包含羧基和氨基末端的保護基團。在一個這種實施方案中，氨基末端保護基團是選自乙?；?，丙烯基和3到20個碳的烷基的保護基團；羧基末端保護基團是酰胺。
在某些實施方案中，肽是防止磷脂被選自諸如過氧化氫，13(S)-HPODE，15(S)-HPETE，HPODE，HPETE，HODE，或HETE的脂類的氧化劑氧化的肽。磷脂可以是選自1-棕櫚酰-2-花生四烯酰(arachidonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PAPC)，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SAPC))，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SAPE)的磷脂。因此該肽防止形成諸如氧化的1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(Ox-PAPC)，1-棕櫚酰-2-氧代戊?；?oxovaleroyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(POVPC)，1-棕櫚酰-2-戊二酰(glutaroyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PGPC)，1-棕櫚酰-2-環(huán)氧異前列腺烷(epoxyisoprostane)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PEIPC)，氧化的1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(Ox-SAPC)，1-硬脂酰-2-氧代戊?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SOVPC)，1-硬脂酰-2-戊二酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SGPC)，1-硬脂酰-2-環(huán)氧異前列腺烷-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SEIPC)，氧化的1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(Ox-SAPE)，1-硬脂酰-2-氧代戊?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SOVPE)，1-硬脂酰-2-戊二酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SGPE)，和1-硬脂酰-2-環(huán)氧異前列腺烷-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SEIPE)等脂類。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了改善動脈粥樣硬化癥狀的適合于口服給藥的組合物。該組合物包含一種肽，該肽是含有一個A型兩親性螺旋的人apo A-I肽或其片斷，或人apo A-I肽的類似物，其中所述的肽具有連接在氨基末端的第一保護基團和連接在羧基末端的第二保護基團且其中所述的肽還包含多個D氨基酸殘基。保護基團包括，但不限于本文所述的保護基團。在某些實施方案中，肽中包含的超過半數(shù)，更優(yōu)選超過80％，且最優(yōu)選超過90％或甚至全部對映體氨基酸是D氨基酸。組合物可進一步包含可藥用賦形劑(例如，適合于口服用藥的賦形劑或適合于注射的賦形劑)。優(yōu)選的肽能夠防止磷脂[例如，1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PAPC)，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SAPC)，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SAPE)]被氧化劑(例如，過氧化氫，13(S)-HPODE，15(S)-HPETE，HPODE，HPETE，HODE，和HETE)氧化。因此該肽防止形成氧化的1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基基-3-磷酸膽堿(Ox-PAPC)，1-棕櫚酰-2-氧代戊酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(POVPC)，1-棕櫚酰-2-戊二酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PGPC)，1-棕櫚酰-2-環(huán)氧異前列腺烷-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PEIPC)，氧化的1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(Ox-SAPC)，1-硬脂酰-2-氧代戊?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SOVPC)，1-硬脂酰-2-戊二酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SGPC)，1-硬脂酰-2-環(huán)氧異前列腺烷-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SEIPC)，氧化的1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(Ox-SAPE)，1-硬脂酰-2-氧代戊?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SOVPE)，1-硬脂酰-2-戊二酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SGPE)，和1-硬脂酰-2-環(huán)氧異前列腺烷-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SEI PE)。
本發(fā)明還提供了改善動脈粥樣硬化癥狀的方法。該方法包含給生物體(例如，人或非人哺乳動物)施用一種或多種本文所述的肽。在特別優(yōu)選的實施方案中，該肽包含多個“D”氨基酸和/或按本文所述被保護。該肽優(yōu)選給生物體口服用藥且生物體優(yōu)選是診斷為具有動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀或存在該風險的生物體。在某些實施方案中，該肽作為分離的肽或與本文所述的藥物學賦形劑組合供應。優(yōu)選以足以改善動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀和/或有效減少動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀發(fā)生的可能性的劑量用藥。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了改善動脈粥樣硬化癥狀的試劑盒。優(yōu)選的試劑盒包括含有一個或多個本文所述肽的容器。肽優(yōu)選包含多個“D”氨基酸和/或按本文所述被保護。在某些實施方案中，該試劑盒可任選還包括可藥用賦形劑和/或該肽與可藥用賦形劑組合(例如，為單劑制劑形式)供應。以單劑制劑的形式供應肽的優(yōu)選試劑盒用于口服給藥。該試劑盒還任選包括教導將所述的肽用于改善動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀和/或減少動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀發(fā)生的可能性的說明材料。
在某些實施方案中，本發(fā)明排除了在美國專利4,643,988和/或在Garber等(1992)Arteriosclerosis and Thrombosis，12886-894中公開的任何一種或多種肽。在某些實施方案中，本發(fā)明排除了在美國專利4,643,988和/或在Garber等(1992)中公開的任何一種或多種合成肽，其所有對映體氨基酸是L氨基酸或D氨基酸并且這些肽是封閉基團。在某些實施方案中，本發(fā)明排除了具有通式A1-B1-B2-C1-D-B3-B4-A2-C2-B5-B6-A3-C3-B7-C4-A4-B8-B9(SEQ ID NO87)的肽，其中A1，A2，A3和A4是獨立的天冬氨酸或谷氨酸，或其同系物或類似物；B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8和B9是獨立的色氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，纈氨酸或α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物；C1，C2，C3和C4是獨立的賴氨酸或精氨酸，且D是絲氨酸，蘇氨酸，丙氨酸，甘氨酸，組氨酸，或其同系物或類似物；前提是，當A1和A2是天冬氨酸，A3和A4是谷氨酸，B2和B9是亮氨酸，B3和B7是苯丙氨酸，B4是酪氨酸，B5是纈氨酸，B6，B8，和D是丙氨酸，且C1，C2，C3和C4是賴氨酸時，B1不是色氨酸。
定義術(shù)語“多肽”，“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的多聚體。該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應于天然存在的氨基酸的人工化學類似物的氨基酸多聚體，以及適用于天然存在的氨基酸的多聚體。
術(shù)語“A型兩親性螺旋”是指帶正電荷的殘基位于極性-非極性界面且?guī)ж撾姾傻臍埢挥跇O性面的中心形成產(chǎn)生極性和非極性面分離的α-螺旋的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(參見，例如，Segrest等(1990)ProteinsStructure，F(xiàn)unction，andGenetics 8103-117)。
術(shù)語“改善”當用于“改善動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀”時是指減小，預防，或消除動脈粥樣硬化和/或相關(guān)病變特征性的一種或多種癥狀。這種減小包括，但不限于氧化磷脂的減少或消除，動脈粥樣硬化斑的形成和破裂的減少，心臟發(fā)病、痙攣性疼痛(angina)、或中風(stroke)等的臨床事件的減少，高血壓的緩解，炎癥性蛋白質(zhì)生物合成的減少，血漿膽固醇的減少等。
術(shù)語“對映體氨基酸”是指能以至少兩種形式存在的氨基酸，所述兩種形式互為不能重疊的鏡像。大多數(shù)氨基酸(除甘氨酸外)是對映體且以所謂的L-型(L氨基酸)或D-型(D氨基酸)存在。大多數(shù)天然存在的氨基酸是“L”氨基酸。術(shù)語“D氨基酸”和“L氨基酸”用于指氨基酸的絕對構(gòu)型，而不是平面偏振光(plane-polarized light)的具體旋轉(zhuǎn)方向。本文的用法與本領(lǐng)域的技術(shù)人員的標準用法一致。
術(shù)語“保護基團”是指一種化學基團，當連接到氨基酸的官能團(例如，側(cè)鏈，α氨基，α羧基，等)上時封閉或屏蔽該官能團的特性。優(yōu)選的氨基末端保護基團包括，但不限于乙酰基，或氨基基團。其它氨基末端保護基團包括，但不限于在脂肪酸中的烷基鏈，丙烯基，甲?；?。優(yōu)選的羧基末端保護基團包括，但不限于形成酰胺或酯的基團。
短語“保護磷脂，使其不被氧化劑氧化”是指化合物減小磷脂在與氧化劑(例如，過氧化氫，13-(S)-HPODE，15-(S)-HPETE，HPODE，HPETE，HODE，HETE等)接觸時的氧化速率的能力(或產(chǎn)生的氧化磷脂的量)。
術(shù)語“低密度脂蛋白”或“LDL”按照本領(lǐng)域技術(shù)人員的通常用法定義。一般來說，LDL是指通過超速離心分離時在密度范圍d＝1.019到d＝1.063發(fā)現(xiàn)的脂蛋白復合物。
術(shù)語“高密度脂蛋白”或“HDL”按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員的通常用法定義。一般來說，“NDL”是指通過超速離心分離時在密度范圍d＝1.063到d＝1.21發(fā)現(xiàn)的脂蛋白復合物。
術(shù)語“I組HDL”是指使氧化型脂類(例如，在低密度脂蛋白中的氧化型脂類)還原或防止氧化型脂類被氧化劑氧化的高密度脂蛋白或其成分(例如，apo A-I，對氧磷酶，血小板活化因子乙酰水解酶(acetylhydrolase)等)。
術(shù)語“II組HDL”是指保護脂類不被氧化或修復(例如，還原)氧化型脂類的活性降低或無活性的HDL。
術(shù)語“HDL成分”是指包含高密度脂蛋白(HDL)的成分(例如，分子)。對能保護脂類不被氧化或被修復(例如，使氧化型脂類還原)的HDL進行的分析也包括對表現(xiàn)所述活性的HDL成分(例如，apo A-I，對氧磷酶，血小板活化因子乙?；饷傅?進行的分析。
術(shù)語“人apo A-I肽”是指全長人apo A-I肽或其含有A型兩親性螺旋的片斷或結(jié)構(gòu)域。
本文使用的“單核細胞反應”是指具有與動脈粥樣硬化斑形成相關(guān)的“炎癥性反應”特征的單核細胞活性。單核細胞反應的特征在于單核細胞附著到血管壁的細胞(例如，血管內(nèi)皮的細胞)上，和/或趨化進入內(nèi)皮下空間，和/或單核細胞分化成巨噬細胞。
術(shù)語“無改變”當指氧化的磷脂的量時是指沒有可檢測到的改變，更優(yōu)選沒有統(tǒng)計學上顯著的改變(例如，至少以85％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，且最優(yōu)選至少以98％或99％的可信度水平)。沒有可檢測的改變也可指這樣的試驗，其中氧化磷脂水平改變，但不比缺乏本文所述的蛋白質(zhì)或參照其它陽性或陰性對照時更大。
本文使用下列縮寫PAPCL-α-1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿；POVPC1-棕櫚酰-2-(5-氧代戊酰基(oxovaleryl))-sn-甘油基-3-磷酸膽堿；PGPC1-棕櫚酰-2-戊二酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿；PEIPC1-棕櫚酰-2-(5，6-環(huán)氧異前列腺烷E2)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿；ChC18:2:膽固醇亞油酸酯；ChC18:2-OOH:膽固醇亞油酸酯氫過氧化物；DMPC1，2-雙十四烷酰-rac-甘油基-3-磷酸膽堿；PON對氧磷酶；HPF標準化高能場(Standardried high powerfield)；PAPCL-α-1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿POVPC1-棕櫚酰-2-(5-氧代戊?；?-sn-甘油基-3-磷酸膽堿；PGPC1-棕櫚酰-2-戊二酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿；PEIPC1-棕櫚酰-2-(5，6-環(huán)氧異前列腺烷E2)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿；PON對氧磷酶；BL/6C57BL/6J；C3HC3H/HeJ。
術(shù)語“保守取代”用于蛋白質(zhì)或肽時是指基本上不改變分子的活性(特異性(例如，對脂蛋白而言))或結(jié)合親和力(例如，對脂類或脂蛋白而言)的氨基酸取代。典型的保守氨基酸取代涉及一個氨基酸被具有相似化學特性(例如，電荷或疏水性)的另一氨基酸取代。下面6組中每組所含氨基酸互為典型的保守取代1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
涉及兩個或多個核酸或多肽序列的術(shù)語“相同”或“同一性”百分數(shù)是指當使用下列一種序列比較算法或通過肉眼觀察測量進行最大對應的比較和排列時，兩個或多個序列或亞序列是相同的或具有指定百分數(shù)的氨基酸殘基或核苷酸是相同的。對于本發(fā)明的肽，序列同一性在該肽的全長上測定。
對于序列比較，一般以一個序列充當參照序列，待測序列與它進行比較。當使用序列比較算法時，將待測和參照序列輸入計算機，如果需要，可指定亞序列坐標，并指定序列算法程序參數(shù)。然后序列比較算法按照指定的程序參數(shù)計算待測序列相對于參照序列的序列相同性百分數(shù)。
通過，例如Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法，Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性序列對比算法，Pearson & Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444的相似性檢索方法，這些算法的計算機化操作(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，Wisconsin遺傳性軟件包，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通過肉眼檢查(一般參見Ausubel等，出處同上)可進行比較時的最佳序列排列。
一個有用的算法的例子是PILEUP。PILEUP使用漸進的，逐對的序列對比實現(xiàn)一組相關(guān)序列的多序列對比以顯示其親緣關(guān)系和序列相同性百分數(shù)。它也繪制顯示聚類親緣的樹或樹狀圖用于實現(xiàn)序列對比。PILEUP使用Feng & Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35351-360的漸進式序列對比方法的簡化形式。所用的方法相似于Higgins & Sharp(1989)CABIOS 5151-153所述的方法。該程序可對比多達300個序列，每個序列最大長度為5,000個核苷酸或氨基酸。多序列對比方法以逐對對比兩個最相似的序列開始，產(chǎn)生兩個對比序列的一簇。然后將該簇與下一個最相關(guān)的序列或?qū)Ρ刃蛄写剡M行對比。通過兩個單序列的逐對對比的簡單延伸對比兩個序列簇。通過一系列漸進式逐對的對比實現(xiàn)最終的序列對比。通過指定具體序列和其序列比較區(qū)域的氨基酸或核苷酸坐標和通過指定程序參數(shù)運行該程序。例如，使用下列參數(shù)默認空位加權(quán)(default gap weight)(3.00)，默認空位長度加權(quán)(0.10)，和加權(quán)的末端間隔可比較參照序列與其它待測序列以測定序列相同性百分數(shù)關(guān)系。
適合于測定序列相同性和序列相似性百分數(shù)的算法的另一例子是BLAST算法，它在Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410中描述。進行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。該算法包括通過鑒定查詢序列中的短字串(word)長度W首先鑒定高記分序列對(HSPs)，當與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字串進行序列對比時它符合或滿足一些正值的閾值得分T。T稱為鄰近字串得分閾值(Altschul等，出處同上)。這些起始的鄰近字串命中充當起動搜索發(fā)現(xiàn)包含它們的更長HSP的種子(seed)。然后字串命中沿各序列的兩個方向延伸到可增加累積的序列對比得分的盡可能遠處。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(匹配殘基對的獎分；通常＞0)和N(錯配殘基的罰分；通常＜0)計算累積得分。對于氨基酸序列，使用記分矩陣計算累積得分。當累積序列對比得分從其最大達到值下降至定量X；由于累積一個或多個記負分的殘基對比導致累積記分趨于零或以下；或者到達任一序列的末端時停止在各個方向上的字串命中延伸。BLAST算法參數(shù)W，T，和X決定了序列對比的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用的默認字串長度(W)為11，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，且比較兩條鏈。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認字串長度(W)為3，期望值(E)為10，以及BLOSUM62記分矩陣(參見Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)。
除了計算序列同一性百分數(shù)外，BLAST算法也進行兩個序列之間的相似性的統(tǒng)計學分析(參見，例如，Karlin & Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5787)。以BLAST算法進行的一種相似性測量法是最小總概率(P(N))，它提供了概率的指標，其中兩個核苷酸或氨基酸序列之間的匹配隨機出現(xiàn)。例如，在待測核酸與參照核酸的比較中如果最小總概率不超過大約0.1，更優(yōu)選不超過大約0.01，且最優(yōu)選不超過大約0.001，那么認為該核酸與參照序列相似。
術(shù)語“D-18A肽”是指具有序列D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F(SEQ ID NO1)的肽，其中全部對映體氨基酸是D型氨基酸。
本發(fā)明包括項1.一種改善動脈粥樣硬化癥狀的肽，其中所述的肽包含如下所述的一種氨基酸序列長度范圍從大約10個到大約30個氨基酸；包含至少一個A型兩親性螺旋；包含至少一個“D”氨基酸殘基；保護磷脂，使其不被氧化劑氧化；和不是D-18A肽。
項2.項1的肽，其中所述的肽還包含保護基團。
項3.項1的肽，其中所述的肽還包含偶聯(lián)到氨基或羧基末端的保護基團。
項4.項2的肽，其中所述的保護基團是選自乙?；０?，3到20個碳原子的烷基，F(xiàn)moc，t-boc，9-芴乙?；?，1-芴羧基，9-芴羧基，9-芴酮-1-羧基，芐氧基羰基，呫噸基(Xan)，三苯甲基(Trt)，4-甲基三苯甲基(Mtt)，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)，4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺?；?Mtr)，1，3，5-三甲基苯-2-磺?；?Mts)，4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)，甲苯磺?；?Tos)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc)，4-甲芐基(MeBzl)，4-甲氧基芐基(MeOBzl)，芐氧基(BzlO)，芐基(Bzl)，苯甲酰基(Bz)，3-硝基-2-吡啶磺酰基(Npys)，1-(4，4-二甲基-2，6-二偶氮亞環(huán)己基)乙基(Dde)，2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)，2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)，2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)，芐氧基甲基(Bom)，t-丁氧基羰基(Boc)，環(huán)己氧基(cHxO)，t-丁氧基甲基(Bum)，t-丁氧基(tBuO)，t-丁基(tBu)，乙酰基(Ac)，苯甲酰基，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基或三氟乙?；?TFA)。
項5.項1的肽，其中所述的肽還包含偶聯(lián)到氨基末端的第一保護基團和偶聯(lián)到羧基末端的第二保護基團。
項6.項1的肽，其中所有的對映體氨基酸是“D”氨基酸。
項7.項1的肽，其中所述的肽與人或小鼠apo A-I具有高于大約50％的氨基酸序列同一性。
項8.項1的肽，其中所述的肽與可藥用賦形劑混合。
項9.項1的肽，其中所述的肽與適合于給哺乳動物口服給藥的可藥用賦形劑混合。
項10.項1的肽，其中所述的肽包含選自下列一組的序列D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO2)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO3)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO4)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO5)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO6)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO7)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO8)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO9)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO10)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO11)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO12)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO13)，E-W-L-K-L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO14)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO15)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO16)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO17)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO18)，
E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO19)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO20)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO21)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO22)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO23)，A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO24)，A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO25)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO26)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO27)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO28)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO29)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO30)，K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-(SEQ ID NO31)，L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO32)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO33)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO34)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO35)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO36)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO37)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO38)，D-W-L-K-A-L-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO39)，D-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO40)，D-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO41)，E-W-L-K-A-L-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO42)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO43)，E-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO44)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO45)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO46)，E-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO47)，D-F-L-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W-(SEQ ID NO48)，E-F-L-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W-(SEQ ID NO49)，
D-F-W-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W-(SEQ ID NO50)，E-F-W-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W-(SEQ ID NO51)，D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-(SEQ ID NO52)，D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO53)，E-K-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-(SEQ ID NO54)，E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO55)，D-W-L-K-A-F-V-D-K-F-A-E-K-F-K-E-A-Y-(SEQ ID NO56)，E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO57)，D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO58)，E-W-L-K-A-F-V-Y-E-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO59)，D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO60)，E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO61)，D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO62)，E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO63)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO64)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO65)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO66)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO67)，D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO68)，E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO69)，D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO70)，E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO71)，D-W-L-R-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO72)，E-W-L-R-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO73)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO74)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO75)，D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO76)，E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO77)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F(SEQ ID NO78)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F(SEQ ID NO79)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F(SEQ ID NO80)，D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-P-D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-L-K-E-A-F(SEQ ID NO81)，D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-P-D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L(SEQ ID NO82)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F(SEQ ID NO83)，D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F(SEQ ID NO84)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F(SEQ ID NO85)。
項11.項1的肽，其中所述的肽包含SEQ ID NO5(F4)的氨基酸序列。
項12.項10或11的肽，其中所有的對映體氨基酸是“D”氨基酸。
項13.項10或11的肽，其中所述的肽還包含偶聯(lián)到氨基或羧基末端的保護基團。
項14.項13的肽，其中所述的肽包含偶聯(lián)到氨基末端的保護基團且所述的氨基末端保護基團選自苯甲?；?，乙酰基，丙烯基，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基，或3到20個碳原子的烷基。
項15.項13的肽，其中所述的肽包含偶聯(lián)到羧基末端的保護基團且所述的羧基末端保護基團是酰胺。
項16.項10的肽，其中所述的肽還包含偶聯(lián)到氨基末端的第一保護基團和偶聯(lián)到羧基末端的第二保護基團。
項17.項16的肽，其中所述的肽還包含偶聯(lián)到氨基末端的第一保護基團，其中所述的保護基團選自苯甲酰基，乙酰基，丙烯基，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基，或3到20個碳的烷基；和偶聯(lián)到羧基末端的第二保護基團且所述的羧基末端保護基團是酰胺。
項18.項16的肽，其中所有的對映體氨基酸是“D”氨基酸。
項19.項1的肽，其中所述的氧化劑選自過氧化氫，13(S)-HPODE，15(S)-HPETE，HPODE，HPETE，HODE，或HETE。
項20.項1的肽，其中所述的磷脂選自1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PAPC)，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SAPC))，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SAPE)。
項21.一種適合于口服給藥改善動脈粥樣硬化的癥狀的組合物，其中所述組合物包含下述肽，它是人apo A-I肽或人apo A-I肽的類似物，其中所述的肽具有連接到氨基末端的第一保護基團和連接到羧基末端的第二保護基團，且其中所述的肽包含多個D氨基酸殘基。
項22.項21的組合物，其中所述的第一保護基團和所述的第二保護基團獨立地選自乙?；?，酰胺，3到20個碳原子的烷基，F(xiàn)moc，t-boc，9-芴乙酰基，1-芴羧基，9-芴羧基，9-芴酮-1-羧基，芐氧基羰基，呫噸基(Xan)，三苯甲基(Trt)，4-甲基三苯甲基(Mtt)，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)，4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺?；?Mtr)，1，3，5-三甲基苯-2-磺?；?Mts)，4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)，甲苯磺?；?Tos)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基(Pmc)，4-甲芐基(MeBzl)，4-甲氧基芐基(MeOBzl)，芐氧基(BzlO)，芐基(Bzl)，苯甲?；?Bz)，3-硝基-2-吡啶磺?；?Npys)，1-(4，4-二甲基-2，6-二偶氮亞環(huán)己基)乙基(Dde)，2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)，2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)，2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)，芐氧基甲基(Bom)，t-丁氧基羰基(Boc)，環(huán)己氧基(cHxO)，t-丁氧基甲基(Bum)，t-丁氧基(tBuO)，t-丁基(tBu)，乙?；?Ac)，苯甲?；?，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基或三氟乙?；?TFA)。
項23.項21的組合物，其中所述的第一保護基團是乙?；?br> 項24.項21的組合物，其中所述的第二保護基團是酰胺。
項25.項21的組合物，其中所述的肽中包含的一半以上的對映體氨基酸是D氨基酸。
項26.項21的組合物，其中所述的肽中包含的所有對映體氨基酸是D氨基酸。
項27.項21的組合物，其中所述的組合物還包含可藥用賦形劑。
項28.項27的組合物，其中所述的賦形劑是適合于口服給藥的賦形劑。
項29.項27的組合物，其中所述的賦形劑是適合于注射的賦形劑。
項30.項21的組合物，其中所述的肽防止磷脂被氧化劑氧化。
項31.項30的組合物，其中所述的氧化劑選自過氧化氫，13(S)-HPODE，15(S)-HPETE，HPODE，HPETE，HODE，或HETE。
項32.項30的組合物，其中所述的磷脂選自1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PAPC)，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SAPC)，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SAPE)。
項33.如下肽或肽的多聯(lián)體在制備改善哺乳動物中的動脈粥樣硬化癥狀的藥物中的用途長度范圍從大約10個到大約30個氨基酸；包含至少一個A型兩親性螺旋；包含至少一個“D”氨基酸殘基；保護磷脂，使其不被氧化劑氧化；和不是D-18A肽。
項34.項33的用途，其中所述的施用包含口服施用所述的肽。
項35.項33的用途，其中所述的哺乳動物是診斷為具有動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的哺乳動物。
項36.項33的用途，其中所述的生物體是診斷為具有動脈粥樣硬化風險的哺乳動物。
項37.項33的用途，其中所述的哺乳動物是人類。
項38.項33的用途，其中所述的哺乳動物是非人哺乳動物。
項39.項33的用途，其中所述的肽還包含偶聯(lián)到氨基或羧基末端的保護基團。
項40.項39的用途，其中所述的保護基團選自乙酰基，酰胺，3到20個碳原子的烷基，F(xiàn)moc，t-boc，9-芴乙?；?，1-芴羧基，9-芴羧基，9-芴酮-1-羧基，芐氧基羰基，呫噸基(Xan)，三苯甲基(Trt)，4-甲基三苯甲基(Mtt)，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)，4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺?；?Mtr)，1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基(Mts)，4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)，甲苯磺酰基(Tos)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc)，4-甲芐基(MeBzl)，4-甲氧基芐基(MeOBzl)，芐氧基(BzlO)，芐基(Bzl)，苯甲酰基(Bz)，3-硝基-2-吡啶磺?；?Npys)，1-(4，4-二甲基-2，6-二偶氮亞環(huán)己基)乙基(Dde)，2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)，2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)，2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)，芐氧基甲基(Bom)，t-丁氧基羰基(Boc)，環(huán)己氧基(cHxO)，t-丁氧基甲基(Bum)，t-丁氧基(tBuO)，t-丁基(tBu)，乙酰基(Ac)，苯甲?；?，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基或三氟乙?；?TFA)。
項41.項33的用途，其中所述的肽還包含偶聯(lián)到氨基末端的第一保護基團和偶聯(lián)到羧基末端的第二保護基團。
項42.項33的用途，其中所述的肽與人或小鼠apo A-I具有高于大約50％的氨基酸序列相同性。
項43.項33的用途，其中所述的肽與一種藥理學賦形劑混合。
項44.項33的用途，其中所述的肽與適合于給哺乳動物口服給藥的藥理學賦形劑混合。
項45.項33的用途，其中所述的肽包含選自如下一組的氨基酸序列D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO2)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO3)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO4)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO5)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO6)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO7)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO8)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO9)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO10)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO11)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO12)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO13)，E-W-L-K-L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO14)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO15)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO16)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO17)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO18)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO19)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO20)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO21)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO22)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO23)，
A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO24)，A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO25)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO26)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO27)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO28)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO29)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO30)，K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-(SEQ ID NO31)，L-F-Y-E-K-V-I-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO32)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO33)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO34)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO35)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO36)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO37)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO38)，D-W-L-K-A-L-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO39)，D-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO40)，D-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO41)，E-W-L-K-A-L-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO42)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO43)，E-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO44)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO45)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO46)，E-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO47)，D-F-L-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W-(SEQ ID NO48)，E-F-L-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W-(SEQ ID NO49)，D-F-W-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W-(SEQ ID NO50)，E-F-W-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W-(SEQ ID NO51)，D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-(SEQ ID NO52)，D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO53)，E-K-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-(SEQ ID NO54)，
E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO55)，D-W-L-K-A-F-V-D-K-F-A-E-K-F-K-E-A-Y-(SEQ ID NO56)，E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO57)，D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO58)，E-W-L-K-A-F-V-Y-E-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO59)，D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO60)，E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO61)，D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO62)，E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO63)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO64)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO65)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO66)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO67)，D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO68)，E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO69)，D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO70)，E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO71)，D-W-L-R-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO72)，E-W-L-R-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO73)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO74)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO75)，D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO76)，E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO77)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F(SEQ ID NO78)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F(SEQ ID NO79)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F(SEQ ID NO80)，D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-P-D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-L-K-E-A-F(SEQ ID NO81)，
D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-P-D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L(SEQ ID NO82)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F(SEQ ID NO83)，D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F(SEQ ID NO84)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F(SEQ ID NO85)。
項46.項45的用途，其中該肽包含的所有對映體氨基酸是D氨基酸。
項47.項45的用途，其中所述的肽還包含偶聯(lián)到氨基或羧基末端的保護基團。
項48.項47的用途，其中所述的保護基團選自乙?；琻的范圍從1到20的CH3-(CH2)n-CO-，或酰胺。
項49.項47的用途，其中所述肽還包含偶聯(lián)到氨基末端的第一保護基團和偶聯(lián)到羧基末端的第二保護基團。
項50.項33的用途，其中所述的氧化劑選自過氧化氫，13(S)-HPODE，15(S)-HPETE，HPODE，HPETE，HODE，或HETE。
項51.項33的用途，其中所述的磷脂選自1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PAPC)，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SAPC))，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SAPE)。
項52.一種組合物在制備給生物體口服施用的改善動脈粥樣硬化癥狀的藥物中的用途，該組合物包含下述肽，其是人apo A-I肽或人apo A-I肽的類似物，其中所述的肽具有連接到氨基末端的第一保護基團和連接到羧基末端的第二保護基團，且其中所述的肽包含多個D氨基酸殘基。
項53.項52的用途，其中所述的第一保護基團和所述的第二保護基團獨立地選自乙?；?，n的范圍從3到20的CH3-(CH2)n-CO-，或酰胺。
項54.項52的用途，其中所述的第一保護基團是乙?；?br> 項55.項52的用途，其中所述的第二保護基團是酰胺。
項56.項52的用途，其中所述的組合物還包含可藥用賦形劑。
項57.項60的用途，其中所述的賦形劑是適合于口服給藥的賦形劑。
項58.項52的用途，其中所述的肽防止磷脂被氧化劑氧化。
項59.項58的用途，其中所述的氧化劑選自過氧化氫，13(S)-HPODE，15(S)-HPETE，HPODE，HPETE，HODE，或HETE。
項60.項58的用途，其中所述的磷脂選自1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PAPC)，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(SAPC))，1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(SAPE)。
項61.一種改善動脈粥樣硬化癥狀的試劑盒，所述的試劑盒包括含有如下的一種肽的容器長度范圍從大約10個到大約30個氨基酸；包含至少一個A型兩親性螺旋；包含至少一個“D”氨基酸殘基；保護磷脂，使其不被氧化劑氧化；和不是D-18A肽。
項62.項61的試劑盒，其中所述的肽包含具有選自如下一組氨基酸序列的肽D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO2)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO3)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO4)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO5)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO6)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO7)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO8)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO9)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO10)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO11)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO12)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO13)，E-W-L-K-L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO14)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO15)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO16)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO17)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO18)，
E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO19)，E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO20)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO21)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO22)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO23)，A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO24)，A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO25)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO26)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO27)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO28)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO29)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO30)，K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-(SEQ ID NO31)，L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO32)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO33)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO34)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO35)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO36)，A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO37)，A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO38)，D-W-L-K-A-L-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO39)，D-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO40)，D-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO41)，E-W-L-K-A-L-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO42)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO43)，E-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO44)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO45)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO46)，E-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO47)，D-F-L-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W-(SEQ ID NO48)，E-F-L-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W-(SEQ ID NO49)，
D-F-W-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W-(SEQ ID NO50)，E-F-W-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W-(SEQ ID NO51)，D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-(SEQ ID NO52)，D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO53)，E-K-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-(SEQ ID NO54)，E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO55)，D-W-L-K-A-F-V-D-K-F-A-E-K-F-K-E-A-Y-(SEQ ID NO56)，E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO57)，D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO58)，E-W-L-K-A-F-V-Y-E-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO59)，D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO60)，E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO61)，D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO62)，E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO63)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO64)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO65)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO66)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO67)，D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO68)，E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO69)，D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO70)，E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO71)，D-W-L-R-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO72)，E-W-L-R-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO73)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO74)，E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO75)，D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO76)，E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO77)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F(SEQ ID NO78)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F(SEQ ID NO79)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F(SEQ ID NO8O)，D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-P-D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-L-K-E-A-F(SEQ ID NO81)，D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-P-D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L(SEQ ID NO82)，D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F(SEQ ID NO83)，D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F(SEQ ID NO84)，D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F(SEQ ID NO85)。
項63.項61的試劑盒，其中所述的肽包含的所有對映體氨基酸是D氨基酸。
項64.項61的試劑盒，其中所述的肽在單劑制劑中與可藥用賦形劑組合。
項65.項64的試劑盒，其中所述的單劑制劑用于口服給藥。
項66.項61的試劑盒，還包含教導使用所述的肽改善動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的教導性材料。
項67.一種改善動脈粥樣硬化癥狀的試劑盒，所述的試劑盒包含一種容器，該容器中含有適用于口服給藥改善動脈粥樣硬化癥狀的組合物，其中所述的組合物包含下述肽，其是人apo A-I肽或人apo A-I肽的類似物，其中所述的肽具有連接到氨基末端的第一保護基團和連接到羧基末端的第二保護基團且其中所述的肽包含多個D氨基酸殘基。
項68.項67的試劑盒，其中所述的肽在單劑制劑中與可藥用賦形劑組合。
項69.項67的試劑盒，還包含教導使用所述的肽改善動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的教導性材料。
項70.項1到20任一項的多肽在制備在哺乳動物中減輕或防止與炎癥的急性期反應相關(guān)的冠狀動脈并發(fā)癥的藥物中的用途，其中所述的冠狀動脈并發(fā)癥是一種動脈粥樣硬化癥狀，所述藥物的使用方法中包含給具有所述急性期反應，或者處于所述急性期反應風險中的哺乳動物施用權(quán)利要求1到20任一項的多肽的步驟。
項71.項70的用途，其中該藥物的給藥是通過選自下組的途徑完成口服給藥，鼻腔給藥，直腸給藥，腹膜內(nèi)注射，和血管內(nèi)注射，皮下注射，經(jīng)皮給藥和肌肉內(nèi)注射。
項72.項70的用途，其中所述的多肽與相同多肽的全L-型組合給藥。
項73.項70的用途，其中所述的多肽作為在可藥用賦形劑中的單元制劑的形式來供應。
項74.項70的用途，其中所述的急性期反應是與復發(fā)性炎癥疾病相關(guān)的炎癥反應。
項75.項71的用途，其中所述的急性期反應與選自下組的疾病相關(guān)麻風病，結(jié)核，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，風濕性多肌痛，結(jié)節(jié)性多動脈炎，硬皮病，自發(fā)性肺纖維變性，慢性阻塞性肺疾病，阿爾茨海默氏病和AIDS，風濕性多肌痛，結(jié)節(jié)性多動脈炎，硬皮病，自發(fā)性肺纖維變性，慢性阻塞性肺疾病，阿爾茨海默氏病，AIDS，冠狀動脈鈣化，鈣化性主動脈狹窄，骨質(zhì)疏松癥，和類風濕性關(guān)節(jié)炎。
項76.項70的用途，其中所述的急性期反應是與選自下組的病癥相關(guān)的炎癥反應細菌感染，病毒感染，真菌感染，器官移植，創(chuàng)傷，植入修復術(shù)，寄生蟲感染，膿毒癥，內(nèi)毒素休克綜合征和生物膜形成。
項77.項1到20任一項的多肽在制備在哺乳動物中減輕或防止與炎癥的急性期反應相關(guān)的冠狀動脈并發(fā)癥的藥物中的用途，其中所述的冠狀動脈并發(fā)癥是動脈粥樣硬化癥狀，其中該藥物的使用方法中包含測定所述的哺乳動物中指示急性期反應或急性期反應重大風險的急性期蛋白(APP)水平；和給顯示出指示急性期反應的急性期蛋白(APP)水平的哺乳動物施用權(quán)利要求1到20任一項的多肽的步驟。
項78.項77的用途，其中所述的急性期蛋白(APP)是選自下組的陽性APR血清淀粉樣蛋白A，C-反應蛋白，血清淀粉樣蛋白P成分，C2補體蛋白，C3補體蛋白，C4補體蛋白，C5補體蛋白，C9補體蛋白，B補體蛋白，C1抑制劑，C4結(jié)合蛋白，纖維蛋白原，von Willebrand因子，α1-抗胰蛋白酶，α1-抗胰凝乳蛋白酶，α2抗纖溶酶，肝素輔因子II，纖溶酶原激活物抑制劑I，肝珠蛋白，血紅素結(jié)合蛋白，血漿銅藍蛋白，錳超氧化物歧化酶，α1-酸性糖蛋白，血加氧酶，甘露糖結(jié)合蛋白，白細胞蛋白I，脂蛋白(a)，和脂多糖結(jié)合蛋白。
項79.項77的用途，其中所述的急性期蛋白(APP)是選自下組的陰性APR白蛋白，前白蛋白，運鐵蛋白，apoAI，apoAII，α2-HS糖蛋白，中間-α-胰蛋白酶抑制劑，富含組氨酸的糖蛋白。


圖1的A，B，C，和D圖顯示了14C-D-5F與ApoE無效(null)小鼠中的血液成分的締合。用14C氨基酸標記的ApoA-I模擬肽D-5F經(jīng)口腔管飼法施用給apo E缺陷型小鼠(n＝5)或與其血漿體外溫育。管飼法后6小時收集禁食血液(fasting food)并測定14C與血液，血漿，和脂蛋白的締合。
圖2A和2B顯示了口服施用的D肽是有效的。將ApoA-I模擬肽D-5F和L-5F(每只動物施用100μg)通過口腔管飼法施用給LDL受體無效小鼠(n＝5)。6小時后收集血液，通過凝膠過濾(FPLC)分離LDL和HDL并通過測定產(chǎn)生的單核細胞趨化性活性在動脈管壁模型系統(tǒng)中檢查HDL的保護能力(圖2A)和LDL對氧化的抗性(圖2B)?？梢?，D-5F而不是L-5F給予HDL明顯更大的保護性且在施用D-5F后LDL變得對氧化有高度抗性。
圖3A和3B顯示了管飼法后D與L肽的血漿濃度。ApoA-I模擬肽D-4F(圖3B)和L-4F(圖3B)用125I標記且通過口腔管飼法施用給LDL受體無效小鼠(n＝4)。3小時后收集血液，通過FPLC分級分離血漿并在洗脫級分中測定放射性。低于15％的L肽作為完整的18體(18mer)洗脫而超過70％的D-4F是完整的。這些研究證實D肽與L肽相比對體內(nèi)降解的抗性明顯更強。
圖4顯示了在處理的小鼠中沒有抗D-4F的抗體。每天用5mg肽處理，6周后(下圖)在LDL受體無效小鼠血漿中沒有檢測到抗D-4F的抗體(白色沉淀線)。陽性對照(上圖)表明在小鼠血漿中存在apoA-I的沉淀線。上圖中央兔抗ApoA-I，周圍D4-F小鼠的血漿。下圖中央用D-4F處理的LDL R-/-小鼠的血漿，周圍0至80μg的純D-4F肽。
圖5顯示了，接受西方人飲食的LDL受體無效小鼠的主動脈根中，脂肪紋病灶的發(fā)生率。LDL受體無效小鼠組按照西方人類型的飲食并口服給予載體(對照)(n＝9)或肽D-4F(n＝6)，每天兩次共6周。隨后處死小鼠，固定主動脈弓并切片，定量脂肪紋病灶。接受D-4F的小鼠病灶面積減少81％(p＜0.01)。
圖6的A，B，和C圖顯示了腹膜內(nèi)注射后，肽5F或apo A-I的血漿分布。人apo A-I，小鼠apo A-I，和肽5F用125I標記并經(jīng)腹膜內(nèi)途徑注射進C57BL/6小鼠中，所述小鼠已飼喂了致動脈粥樣化飲食達至少3周。在表3所述的動力學研究期間取樣。通過CLiP方法分析代表性樣品，并收集級分用于測定放射性。洗脫體積僅以柱泵速率為基礎(chǔ)；忽略由酶試劑泵產(chǎn)生的體積。所顯示的數(shù)據(jù)是膽固醇(以任意單位表示的500nm處的吸光度；實線)和放射性(每分鐘的計數(shù)；虛線)。各圖分別是A人apo A-I(注射后1小時)；B小鼠apo A-I(1小時)，C5F(1.5小時)。
圖7的A和B圖顯示了小鼠脂蛋白與人動脈壁細胞的相互作用。從小鼠血漿通過FPLC分離LDL和HDL，所述小鼠飼喂了致動脈粥樣化飲食，并注射了載體(PBS)或肽5F，20μg/只小鼠/天。所述共培養(yǎng)物不添加物質(zhì)進行處理(沒加入)，或者添加以下物質(zhì)進行處理200μg/ml LDL蛋白的人LDL(hLDL)，或200μg/ml小鼠LDL(MoLDL)，或200μg/ml人LDL+350μg/mlHDL蛋白的人HDL(hHDL)或300μg/ml小鼠HDL(MoHDL)。共培養(yǎng)物與上述添加物在10％的脂蛋白缺陷型血清(LPDS)存在下37℃溫育8小時。收集上清并分析Auerbach脂類氫過氧化物等價物(equivalents)(A圖)。然后洗滌共培養(yǎng)物并與無血清或LPDS的新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng)8小時。收集條件培養(yǎng)基并分析單核細胞趨化活性(B圖)。兩圖均包含無細胞空白(無細胞空白)用于比較。
圖8顯示了平均病灶橫切面的面積。顯示的數(shù)據(jù)代表各動物的平均病灶橫切面面積(○)和平均值±用誤差條表示的各組中所有動物的SEM(●)?？s寫PBS，飼喂致動脈粥樣化飲食并每天注射200μl磷酸鹽緩沖溶液的小鼠；5F，飼喂致動脈粥樣化飲食并每天注射在200μlPBS中的20μg 5F的小鼠；MoAI，飼喂致動脈粥樣化飲食并每天注射在200μl PBS中的50μg小鼠apoA-I的小鼠。*＝以雙尾(two-tailed)t-檢驗測定的p＜0.002。使用等級方差的單向分析也顯示有顯著差異(p＜0.001)。
圖9顯示了apo A-I肽模擬物的D和L型異構(gòu)體都防止由體外適度氧化的LDL誘導的單核細胞趨化活性。單一培養(yǎng)基(有LDL，無細胞或者有細胞，無LDL)，250μg/ml來自正常受試者的對照LDL(LDL)，和LDL加350μg/ml來自正常受試者的對照HDL(+HDL)。用對照LDL與不同量(在橫坐標上表示的微克數(shù))的D-2F，或L-2F(左側(cè)的第三組，2F)或者D-37-pA或L-37pA(右側(cè)的最后一組，37pA)之一一起溫育其它共培養(yǎng)物。數(shù)據(jù)代表從一式四份共培養(yǎng)物獲得的平均值±SD值。HDL或加入肽的值都與單一LDL(左側(cè)第一組)有以p＜0.01水平的顯著差異。
圖10A和10B顯示了飼喂本發(fā)明的ApoA-1肽模擬物的小鼠導致紅細胞對體外裂解有抗性。圖10A和10B顯示了在18小時(圖10A)和48小時(圖10B)時體外紅細胞裂解試驗的結(jié)果。星號表示接受載體的動物與接受肽的動物之間的紅細胞裂解存在顯著差異(p＜0001)。
圖11顯示了飼喂本發(fā)明的ApoA-1模擬物D肽的小鼠導致循環(huán)的LDL抗氧化。LDL受體缺陷型小鼠組(n＝3)通過管飼法施用D-肽或鹽水載體。每只動物給予100μl鹽水，100μg/100μl的肽D-2F或肽D-37pA。17小時后在中度麻醉下從眼眶后靜脈竇收集血液。通過FPLC從血漿分離LDL。動脈壁細胞的共培養(yǎng)物用單一培養(yǎng)基(無添加)，來自正常受試者的對照LDL(LDL)，LDL加來自正常受試者的對照HDL(+HDL)溫育。其它共培養(yǎng)物用經(jīng)過鹽水(鹽水LDL)，D-2F(D-2F LDL)或D-37pA肽(D-37pA LDL)管飼法后獲得的鼠LDL溫育。在10％LPDS存在下在37℃溫育共培養(yǎng)物4小時。然后棄去上清，洗滌共培養(yǎng)物并用無血清或LPDS的培養(yǎng)基再培養(yǎng)4小時。收集條件培養(yǎng)基并分析單核細胞趨化活性。值是一式四份共培養(yǎng)物的平均值±SD。星號指示p＜0.001。
圖12顯示了比較來自通過管飼法給予D-型和L-型肽的小鼠的脂蛋白的趨化性試驗的結(jié)果。
圖13A顯示了比較對照HDL和來自通過管飼法給予D-肽的小鼠的HDL的趨化性試驗的結(jié)果。圖13B顯示了比較來自通過管飼法給予D-肽的小鼠的LDL和VLDL/IDL的趨化性試驗的結(jié)果。
圖14A和14B顯示了2F的電泳，指示其自我締合。圖14A2F的SDSPAGE(18％)。泳道1顯示了分子量標準，泳道2顯示了相應于2F的帶(分子量是2242)，遷移略低于最低的分子量標準(3.5-2.5kDa)。圖14B非變性PAGE(4-12％)，顯示了指示溶液中自我締合的100μg/ml(泳道2)和250μg/ml(泳道1)2F的遷移率。泳道3顯示了高分子量標準的遷移率。
圖15顯示了肽的同源系列穩(wěn)定DiPoPE雙分子層的破壞性(hex-phase)轉(zhuǎn)變。DiPoPE的TH轉(zhuǎn)變是添加肽級分的摩爾數(shù)的函數(shù)。以37°/小時的熱掃描率通過DSC測量?！?F；○3F3；■4F；□5F；6F；▲7F；△apo A-I。
圖16相對直角光散射監(jiān)測的EPC MLVs被肽的同源系列的溶解是時間的函數(shù)。顯示了各同源肽的代表性的EPC MLV澄清曲線。使用等克分子濃度的肽和EPC(105μM)。激發(fā)和發(fā)射波長均為400nm。Triton X-100在1mM的終濃度下達到完全溶解。-●-EPC；-○-2F；-■-3F3，-□-3F14，-▲-4F；-△-5F；--6F；--7F；-◇-人apo A-I；-◆-TritonX-100。
圖17顯示了同源肽的LCAT激活能力。直方圖表示LCAT被F-肽的激活。使用EPC-膽固醇的單層小泡測量LCAT的活性且該活性表示為與apoA-I活性相比的百分數(shù)，其中apo A-I的活性設(shè)定為100％。每個值代表一式三份的平均值。使用的肽濃度是20μg/ml。
圖18顯示了LDL-誘導的單核細胞趨化性被肽的同源系列抑制。向10％LPDS存在下8小時的人動脈壁細胞共培養(yǎng)物中加入單一的LDL或用人HDL或肽的同源系列培養(yǎng)的LDL。棄去上清且用無血清或LPDS的培養(yǎng)基洗滌共培養(yǎng)物。然后收集條件培養(yǎng)基并分析單核細胞趨化活性。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM值(每種情況下n＝9)。通過用LDL逐對比較，除3F肽外的所有肽明顯更有效(至少p＜0.001，用‘’或‘*’表示)。通過單向(one-way)ANOVA分析所有肽之間的比較。星號表示肽4F，5F和6F比同系物2F和7F明顯更有效(以Duckett比較p＜0.05)。方括號表示在這三個肽中抑制LDL-誘導的趨化性的能力無顯著差異。
圖19顯示了流感A感染在感染兩天后引起肝臟氧化的磷脂增加。按Van Lenten等(2001)Circulation，1032283-2288所述用一定劑量的流感A病毒經(jīng)鼻內(nèi)感染接受常規(guī)飲食的C57BL/6小鼠以便不使產(chǎn)生病毒血癥。感染0，2，3，5，7，和9天后取出肝臟并通過ESI-MS測定氧化的磷脂含量。
圖20顯示了D-4F在流感A感染后防止對氧磷酶活性的下降。圖19所述的一些小鼠每天用20μg的D-4F腹膜內(nèi)注射，其它用磷酸鹽緩沖液(PBS)注射。在感染后0，2，7，和9天時的血漿中測量對氧磷酶活性(PON)。
圖21顯示了D-4F在流感A病毒感染的小鼠主動脈中防止氧化磷脂的誘導。圖19所述的一些小鼠每天用20μg的D-4F腹膜內(nèi)注射，其它用磷酸鹽緩沖液(PBS)注射。在感染后0，2，7，和9天時收獲小鼠主動脈并通過ESI-MS測量氧化的磷脂含量。
圖22A到22C顯示口服用藥后，D-4F而不是L-4F在LDL受體無效小鼠循環(huán)中保持完整且增強HDL防止LDL被人動脈壁細胞氧化的能力且減少LDL誘導的單核細胞趨化活性。圖22A肽L-4F和D-4F使用碘珠(Iodo-bead)試劑放射性標記并經(jīng)過口腔管飼法施用給LDL受體無效小鼠(每只動物100μl鹽水含100μg未標記的肽加上每μg肽比活為11×106cpm的125I-標記的肽，n＝3)。4小時后收集血液，分離血漿，去脂化并按參考文獻12所述通過反相HPLC分析。B和C組肽L-4F和D-4F(每只動物在100μl鹽水中含100μg)經(jīng)口腔管飼法施用給LDL受體缺陷型小鼠(n＝5)。6小時后收集血液，通過凝膠過濾(FPLC)分離血漿HDL和LDL并在共培養(yǎng)物中檢查。圖22B顯示了小鼠和人HDL防止對照人LDL(hLDL)被人動脈壁細胞氧化和抑制LDL-誘導的單核細胞趨化活性的能力。將200μg蛋白質(zhì)/ml的人LDL與350μg蛋白質(zhì)/ml的人HDL(hHDL)或來自接受鹽水(鹽水Rx)或L-4F(L-4FRx)或D-4F(D-4F Rx)的小鼠的100μg膽固醇/ml的小鼠HDL(mHDL)一起加入人動脈壁細胞共培養(yǎng)物中并按本文所述測定單核細胞趨化活性。圖22C顯示了小鼠LDL誘導單核細胞趨化活性的能力。B組中左側(cè)顯示了試驗對照。右側(cè)，從接受鹽水(鹽水Rx)或L-4F(L-4F Rx)或D-4F(D-4F Rx)的小鼠中分離小鼠LDL(mLDL)并以100μg膽固醇/ml加入無HDL的動脈壁細胞共培養(yǎng)物中且測定單核細胞趨化活性。數(shù)值是在兩個獨立的實驗中4個孔的平均值±SD。
圖23顯示了口服施用D-4F顯著減少接受西方人飲食的LDL受體無效小鼠中的病灶。LDL受體無效小鼠組安置西方人飲食且通過口腔管飼法供應，100μl單一鹽水(鹽水)，n＝4只動物，或100μl無D-4F的脂質(zhì)體(脂質(zhì)體)，n＝5只動物，或在100μl脂質(zhì)體中的2.5mg D-4F肽(脂質(zhì)體中的D-4F)，n＝6只動物，每天兩次共6周。小鼠放血并隨后處死，固定主動脈根，切片并定量脂肪紋病灶中的油紅O染色程度。
圖24顯示了口腔施用D-4F顯著減少接受常規(guī)飲食的apo E無效小鼠中的病灶。在4周齡時，將D-4F加入一些apo E無效小鼠的飲水中以產(chǎn)生1mg/ml D-4F的濃度(n＝4只小鼠)，D-4F以2mg/ml的濃度加入另一組小鼠的飲水中(n＝4只小鼠)，第三組小鼠的飲水中不加肽(n＝5只小鼠)。所有小鼠每天消耗大約2.5ml水使得一組不接受肽(水)，第二組接受2.5mg D-4F/只小鼠/天(2.5mg D-4F)及第三組接受5.0mg D-4F/只小鼠/天(5.0mg D-4F)。所有小鼠繼續(xù)接受常規(guī)飲食5周，此時給小鼠放血并隨后處死，固定主動脈根，切片并定量脂肪紋病灶中的油紅O染色程度。
具體實施例方式
I.動脈粥樣硬化癥狀的減輕。
本發(fā)明涉及的發(fā)現(xiàn)是設(shè)計成模擬A型兩親性螺旋基序(Segrest等(1990)ProteinsStructure，F(xiàn)unction，and Genetics 8103-117)的合成肽能與磷脂締合且表現(xiàn)出相似于人apo-A-I的許多生物學特性。具體地說，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是當使用D氨基酸制備該肽時，肽表現(xiàn)出血清半壽期顯著提高，且特別是當氨基和/或羧基末端被封閉時，甚至可口服給藥。
此外，本發(fā)明令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是該D-型肽保留相應的L-型肽的生物學活性。使用該D-型肽的動物體內(nèi)研究顯示出有效的口服傳遞，血清半壽期提高，且具有減輕或預防/抑制動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的能力。
我們發(fā)現(xiàn)正常的HDL抑制在適度氧化的LDL形成中的3個步驟。在這些研究中(參見，申請日為2000年3月31目的共同未決申請USSN09/541,468)我們證實用apo A-I或apo A-I模擬肽(37pA)體外處理人LDL從包括HPODE和HPETE的LDL中去掉了種子(seeding)分子。這些種子分子對于人動脈壁細胞的共培養(yǎng)物能氧化LDL和對于LDL誘導動脈壁細胞產(chǎn)生單核細胞趨化性活性是必需的。我們也證實了將apo A-I注射進小鼠或輸入人體后，從注射/輸入apo A-I后的小鼠或人類志愿者分離的LDL對于人動脈壁細胞的氧化有抗性且在動脈壁細胞共培養(yǎng)物中不能誘導單核細胞趨化性活性。
本發(fā)明的D肽的保護性功能在圖1到5中說明。圖1，A，B，C，和D組顯示了14C-D-5F與ApoE無效小鼠的血液成分的締合。本文還證實來自飼喂致動脈粥樣化飲食并注射了PBS的小鼠的HDL不能抑制人LDL的氧化且不能抑制人動脈壁共培養(yǎng)物中LDL-誘導的單核細胞趨化性活性。相反，來自飼喂致動脈粥樣化飲食并每天注射本文所述肽的小鼠的HDL在抑制人LDL的氧化和防止共培養(yǎng)物中LDL-誘導的單核細胞趨化性活性中與正常人HDL一樣有效(圖2A和2B)。另外，從飼喂致動脈粥樣化飲食并每天注射PBS的小鼠獲取的LDL比從飼喂相同飲食但每天注射20μg肽5F的小鼠獲取的LDL更容易被氧化且更容易誘導單核細胞趨化性活性。D肽不會表現(xiàn)出免疫原性(圖4)。
人動脈壁細胞對來自飼喂致動脈粥樣化飲食并注射根據(jù)本發(fā)明的肽的小鼠的HDL和LDL的體外反應與該肽在體內(nèi)顯示出的保護性作用一致。盡管總膽固醇，LDL-膽固醇，IDL+VLDL-膽固醇，和較低HDL膽固醇與總膽固醇的百分數(shù)水平相似，但飼喂致動脈粥樣化飲食和注射肽的動物具有明顯較低的病灶得分(圖5)。因此本發(fā)明的肽防止在飼喂致動脈粥樣化飲食的小鼠中動脈粥樣硬化病灶的惡化。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了改善和/或預防動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的方法。該方法優(yōu)選包括給生物體，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人施用一種或多種本發(fā)明的肽(或該肽的模擬物)。該肽可按本文所述，按照包括，但不限于注射，栓劑，鼻噴霧，定時釋放移植物，經(jīng)皮貼劑(transdermal pad)等的許多標準方法中的任一種給藥。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，該肽經(jīng)口服給藥(例如，作為糖漿，膠囊，或片劑)。
所述方法包含本發(fā)明的單個多肽的給藥或兩個或多個不同多肽的給藥。多肽可作為單體或二聚體，寡聚體或多聚體形式供應。在某些實施方案中，多聚體形式可包括締合的單體(例如，通過離子鍵或疏水鍵連接)，而某些其它多聚體形式包含共價連接的單體(直接連接或通過接頭連接)。
盡管本發(fā)明用對于在人體中的用途進行了描述，但是它也適用于動物，例如獸醫(yī)用途。因此優(yōu)選的生物體包括，但不限于人類，非人靈長類，犬，馬，貓，豬，有蹄類，largomorphs，等。
本發(fā)明的方法不限于表現(xiàn)出動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀(例如，高血壓，蝕斑形成和破裂，諸如心臟發(fā)病、痙攣性疼痛、或發(fā)作等臨床事件的減少，高水平的血漿膽固醇，高水平的低密度脂蛋白，高水平的極低密度脂蛋白，或炎癥性蛋白質(zhì)等)的人或非人動物，而且可用于預防性情況。因此，可將本發(fā)明的肽(或其模擬物)施用給生物體以預防動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的發(fā)生/形成。在這種情況下特別優(yōu)選的受試者是表現(xiàn)出動脈粥樣硬化的一種或多種風險因素(例如，家族病史，高血壓，肥胖，高酒精消費，吸煙，高血液膽固醇，高血液甘油三酯，血液LDL，VLDL，IDL升高，或低HDL，糖尿病，或糖尿病的家族病史，高血脂，心臟發(fā)病，痙攣性疼痛或發(fā)作，等)的受試者。
除了本發(fā)明的抑制動脈粥樣硬化的肽的使用方法外，本發(fā)明還提供了肽本身，配制成特別是用于口服傳遞的藥品的肽，和用于治療和/或預防動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的試劑盒。
II.與急性炎癥反應相關(guān)的動脈粥樣硬化癥狀的減輕。
本發(fā)明的抑制動脈粥樣硬化的肽也用于許多其它情況。具體地說，我們觀察到心血管并發(fā)癥(例如，動脈粥樣硬化，發(fā)作，等)經(jīng)常與急性期的炎癥反應的發(fā)作相伴或在其之后。該急性狀態(tài)的炎癥反應通常與復發(fā)性炎癥疾病(例如，麻風病，肺結(jié)核，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，和類風濕性關(guān)節(jié)炎)，病毒感染(例如，流感)，細菌感染，真菌感染，器官移植，傷口或其它外傷，移植修復術(shù)，生物膜等相關(guān)。
本發(fā)明的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是施用本文所述的一種或多種肽可減少或防止在急性期反應期間或之后形成氧化磷脂，從而減輕或消除與該狀況相關(guān)的心血管并發(fā)癥。
因此，例如，我們證實了流感感染的后果是HDL中對氧磷酶和血小板活化的乙酰水解酶活性減少。不受具體理論的限制，我們相信，作為這些HDL酶活性損失的結(jié)果及作為急性期反應期間前體氧化劑(prooxidant)蛋白與HDL的締合結(jié)果，HDL不再能夠防止LDL氧化且不再能夠防止LDL-誘導產(chǎn)生內(nèi)皮細胞的單核細胞趨化活性。
我們觀察到在用流感A病毒感染后每天注射極低劑量的本發(fā)明多肽(例如，給小鼠20微克)的受試者中，對氧磷酶水平不下降且不產(chǎn)生超過背景的有生物學活性的氧化磷脂。這表明可將D-4F(和/或本發(fā)明的其它肽)施用給(例如，通過口服或注射)在流感感染或可產(chǎn)生急性期炎癥反應的其它事件(例如，由于病毒感染，細菌感染，外傷，移植，各種自身免疫疾病狀況等)期間已知具有冠狀動脈疾病的患者且因此我們可通過這種短期處理防止與產(chǎn)生該炎癥狀況的病變相關(guān)的心臟發(fā)病和發(fā)作的發(fā)病率增加。
因此，在某些實施方案中，本發(fā)明包含將本發(fā)明的一種或多種肽施用給處于急性炎癥反應風險中，或經(jīng)受該反應和/或處于動脈粥樣硬化癥狀風險中或經(jīng)受該癥狀的受試者。
因此，例如，可給具有冠狀動脈疾病或處于該疾病風險中的人在流感季節(jié)預防性施用本發(fā)明的多肽?；加袕桶l(fā)性炎癥癥狀，例如，類風濕性關(guān)節(jié)炎，各種自身免疫疾病等的人(或動物)可用本發(fā)明的多肽治療以減輕或防止動脈粥樣硬化或發(fā)作的形成?；加型鈧?，急性損傷，組織移植等的人(或動物)可用本發(fā)明的多肽治療以減輕動脈粥樣硬化或發(fā)作的形成。
在某些情況下，該方法需要診斷急性炎癥反應的發(fā)生或其風險。急性炎癥反應一般涉及肝臟中代謝和基因調(diào)控的改變。它是一個動態(tài)的體內(nèi)平衡過程，除了免疫，心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，它涉及身體的所有主要系統(tǒng)。正常情況下，急性期反應僅持續(xù)幾天；然而，在慢性或復發(fā)性炎癥的情況中，急性期反應的一些癥狀異常持續(xù)可引起與該疾病相伴的下面組織的損傷，且也可導致其它并發(fā)癥，例如，心血管疾病或諸如淀粉樣變性的蛋白質(zhì)沉積疾病。
急性期反應的一個重要方面是肝臟生物合成情況的根本性改變。在正常情況下，肝臟以穩(wěn)定狀態(tài)的濃度合成特征性范圍的血漿蛋白。這些蛋白質(zhì)中許多具有重要功能且在炎癥刺激后在急性期反應期間需要更高血漿水平的這些急性期反應物(APRs)或急性期蛋白(APPs)。盡管大多數(shù)APRs通過肝細胞合成，但是有些通過包括單核細胞，內(nèi)皮細胞，成纖維細胞和脂肪細胞的其它細胞類型產(chǎn)生。大多數(shù)APRs被誘導到超過正常水平的50％和幾倍之間。相反，主要APRs可增加到超過正常水平的1000-倍。這組蛋白包括血清淀粉樣蛋白A(SAA)和任一種人體C-反應性蛋白(CRP)或其在小鼠中的同系物，血清淀粉樣蛋白P成分(SAP)。所謂的陰性APRs在急性期反應期間的血漿濃度減少以便允許肝臟合成誘導型APRs的能力增加。
在某些實施方案中，急性期反應，或其風險通過測量一種或多種APPs來評估。測量該標志物是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，且存在提供該測量的商業(yè)公司(例如，Cardiotech Services，Louisville，KY可測量AGP)。
III.與冠狀動脈鈣化和骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的癥狀或狀況的減輕。
我們還鑒定了氧化脂類是冠狀動脈鈣化和骨質(zhì)疏松癥的原因。而且，不受具體理論的限制，我們相信在鈣化性主動脈狹窄的發(fā)病機理中涉及相同的機制。
因此，在某些實施方案中，本發(fā)明包含使用本文所述的肽以抑制或預防諸如風濕性多肌痛，結(jié)節(jié)性多動脈炎，硬皮病，自發(fā)性肺纖維變性，慢性阻塞性肺疾病，阿爾茨海默氏病，AIDS，冠狀動脈鈣化，鈣化性主動脈狹窄，骨質(zhì)疏松癥等的疾病的癥狀。
IV.優(yōu)選的肽及其制備優(yōu)選的肽本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是A型肽能夠減輕動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀。A型肽的特征在于形成產(chǎn)生極性和非極性殘基分離的α-螺旋，從而形成帶正電荷的殘基位于極性-非極性界面和帶負電荷的殘基位于極性面中央的極性和非極性面(參見，例如，Anantharamaiah(1986)Meth.Enzymol，128626-668)。注意到apo A-I的第4個外顯子折疊成3.667個殘基/轉(zhuǎn)角時產(chǎn)生A型兩親性螺旋結(jié)構(gòu)。
一個特別優(yōu)選的A型肽稱為18A(參見，表1，也參見Anantharamaiah(1986)Meth.Enzymol，128626-668)，它按本文所述修飾以產(chǎn)生可口服用藥且在抑制或預防動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀中非常有效的肽。不受具體理論的限制，相信本發(fā)明的肽可能通過獲得減輕LDL氧化的種子分子在體內(nèi)起作用。
我們確定增加18A疏水表面的Phe殘基數(shù)目，理論上可增加脂類親和力，如Palgunachari等(1996)Arteriosclerosis，Thrombosis，& Vascular Biology16328-338所述的計算法測定的那樣。理論上，用Phe經(jīng)系統(tǒng)性取代18A非極性表面的殘基可產(chǎn)生6種肽。增加2，3，和4個Phe的肽理論上的脂親和力(λ)值分別為13，14和15個單位。然而，如果Phe數(shù)目從4增加到5個，則數(shù)值1將激增4個單位(到19λ單位)。增加6或7個Phe會產(chǎn)生不太顯著的增加(分別到20和21λ單位)。因此，我們選擇增加5個Phe(且因此該肽命名為5F)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，將氨基末端殘基乙?；覍Ⅳ然┒藲埢０坊忾]5F肽。
該新型A型肽類似物5F抑制動脈粥樣硬化易感性小鼠中的病灶形成。使用根據(jù)Levine等(Levine等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9012040-12044)的研究的肽劑量比較該新型肽類似物5F與小鼠apo A-I(MoA-I)在這些小鼠中抑制飲食誘導的動脈粥樣硬化中的效力。
也產(chǎn)生了許多其它A型肽且表現(xiàn)出變化的但程度顯著的在減輕動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀中的效力。表1列出了許多這類肽。
表1.用于本發(fā)明的優(yōu)選肽




1接頭用下畫線標示。
盡管表1的各個肽表示為乙?；Ｗo氨基末端且酰胺基保護羧基末端，但是這些保護基團的任一個或兩個可以去掉和/或用本文所述的另一保護基團取代。在特別優(yōu)選的實施方案中，該肽包含一個或多個本文所述的D-型氨基酸。在某些實施方案中，表1的肽的每個氨基酸(例如，每個對映體氨基酸)是D-型氨基酸。
還應注意到表1并非完全包括的。使用本文提供的教導，可按常規(guī)產(chǎn)生其它合適的肽(例如，通過保守的或半保守的取代(例如D被E取代)，延長，缺失等)。因此，例如，一個實施方案利用SEQ ID Nos2-20和39-85鑒定的肽中的任意一個或多個的截短形式。因此，例如，SEQ ID NO21表示包含含有一個或多個D氨基酸的18A C-末端的14個氨基酸的肽，而SEQID NOS22-38表示其它的截短形式。更長的肽也是合適的。這種更長的肽可全部形成A型兩親性螺旋，或者A型兩親性螺旋(或多個螺旋)可形成肽的一個或多個結(jié)構(gòu)域。另外，本發(fā)明包含肽的多聚體形式。因此，例如，表1中所示的肽可偶聯(lián)在一起(用一個或多個插入的氨基酸直接或者通過接頭(例如，碳接頭，或一個或多個氨基酸)偶聯(lián))。舉例性的多聚體肽包括18A-Pro-18A和優(yōu)選包含一個或多個D氨基酸，更優(yōu)選每個氨基酸是本文所述的D氨基酸和/或具有一個或兩個保護末端的SEQ ID NOs79-85的肽。
本發(fā)明的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，當A型肽(例如，如表1所示)摻入D氨基酸時，它們保留其活性，且能夠口服給藥。另外，這種口服給藥導致相當有效的吸收和顯著的血清半壽期，從而提供了減輕動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的有效方法。
使用本文提供的教導，技術(shù)人員可按常規(guī)修飾所示的A型肽以產(chǎn)生本發(fā)明的其它合適的A型肽。例如，可對已有的氨基酸做出常規(guī)保守的或半保守的取代(例如，E取代D)。使用Palgunachari等(1996)Arteriosclerosis，Thrombosis，& Vasculavr Biology 16328-338所述的計算方法可推測各種取代對所得肽的脂親和力的影響。在保留A型α-螺旋結(jié)構(gòu)的前提下該肽可被加長或縮短。另外，可做出取代導致所得的肽更相似于受試者物種內(nèi)源性產(chǎn)生的肽。
在某些實施方案中，本發(fā)明的肽包含美國專利號4,643,988所述肽的“D”型形式，更優(yōu)選具有一個或兩個末端偶聯(lián)到保護基團上的“D”型形式。
該肽包括具有通式A1-B1-B2-C1-D-B3-B4-A2-C2-B5-B6-A3-C3-B7-C4-A4-B8-B9(SEQ ID NO86)的肽，其中A1，A2，A3和A4獨立地是天冬氨酸或谷氨酸，或其同系物或類似物；B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8和B9獨立地是色氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，纈氨酸或α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物；C1，C2，C3和C4獨立地是賴氨酸或精氨酸，且D是絲氨酸，蘇氨酸，丙氨酸，甘氨酸，組氨酸，或其同系物或類似物；前提是，當A1和A2是天冬氨酸，A3和A4是谷氨酸，B2和B9是亮氨酸，B3和B7是苯丙氨酸，B4是酪氨酸，B5是纈氨酸，B6，B8，和D是丙氨酸，且C1，C2，C3和C4是賴氨酸時，B1不是色氨酸，其中至少一個對映體氨基酸是“D”型氨基酸。優(yōu)選至少50％的對映體氨基酸是“D”型，更優(yōu)選至少80％的對映體氨基酸是“D”型，且最優(yōu)選至少90％或甚至全部的對映體氨基酸是“D”型氨基酸。
盡管在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的肽利用了天然存在的氨基酸或天然存在的氨基酸的D型形式，但是也包括用非天然存在的氨基酸(例如，甲硫氨酸亞砜，甲硫氨酸甲基锍，正亮氨酸，ε-氨基己酸，4-氨基丁酸(4-aminobutanoic acid)，四氫異喹啉-3-羧酸，8-氨基辛酸，4-氨基丁酸，Lys(N(ε)-三氟乙酰)，α-氨基異丁酸，等)取代。
除了本文所述的A型肽外，本文還包含肽模擬物。肽類似物在制藥工業(yè)中常用作具有類似于模板肽的特性的非肽類藥品。這些類型的非肽類化合物稱為“肽模擬物”或“模擬肽”(Fauchere(1986)Adv.Drug Res.1529；Veber和Freidinger(1985)TINS第392頁；和Evans等(1987)J.Med.Chem.301229)且通常借助于計算機化的分子模擬形成?？墒褂媒Y(jié)構(gòu)上相似于治療上有用的肽的肽模擬物產(chǎn)生相當?shù)闹委熁蝾A防效果。
一般來說，肽模擬物在結(jié)構(gòu)上相似于模板多肽(即，本文所述的5F)，但具有一個或多個肽鍵任選被選自-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH＝CH-(順式和反式)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-，-CH2SO-等的鍵按本領(lǐng)域已知的方法取代，該方法在下列參考文獻中進一步描述Spatola(1983)第267頁，見Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins，B.Weinstein，編輯，Marcel Dekker，New York，；Spatola(1983)Vega Data 1(3)Peptide Backbone Modifications.(綜述)；Morley(1980)Trends Pharm Sci第463-468頁(綜述)；Hudson等(1979)Int JPept Prot Res 14177-185(-CH2NH-，CH2CH2-)；Spatola等(1986)Life Sci 381243-1249(-CH2-S)；Hann，(1982)J Chem SocPerkin Trans I 307-314(-CH-CH-，順式和反式)；Almquist等(1980)J Med Chem.231392-1398(-COCH2-)；Jennings-White等(1982)Tetrahedron Lett.232533(-COCH2-)；Szelke，M.等，歐洲申請EP 45665(1982)CA9739405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay等(1983)Tetrahedron Lett 244401-4404(-C(OH)CH2-)；和Hruby(1982)Life Sci.，31189-199(-CH2-S-))。
特別優(yōu)選的非肽鍵是-CH2NH-。該肽模擬物相對于多肽的實施方案具有明顯的優(yōu)勢，包括，例如生產(chǎn)更經(jīng)濟，化學穩(wěn)定性更高，藥理學特性增強(半壽期，吸收，效力，功效，等)，抗原性降低等。
另外，通過本領(lǐng)域已知的方法(Rizo和Gierasch(1992)Ann.Rev.Biochem.61387)；例如，通過添加能形成分子內(nèi)二硫鍵以環(huán)化該肽的內(nèi)部半胱氨酸殘基可產(chǎn)生包含共有序列或基本上相同的共有序列變異的本文所述肽的循環(huán)取代或束縛肽(包括環(huán)化肽)。
肽的制備本發(fā)明中所用的肽使用標準化學肽合成技術(shù)化學合成，或特別是如果肽不包含“D”氨基酸殘基，則通過重組表達。如果多肽是重組表達的，可在給生物體以唯一D型形式提供一種或多種氨基酸的環(huán)境中培養(yǎng)宿主生物(例如，細菌，植物，真菌細胞，等)。然后重組表達的肽在該系統(tǒng)中摻入這些D氨基酸。
在優(yōu)選的實施方案中，以任意的本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的許多液相或固相肽合成技術(shù)化學合成該肽。固相合成是化學合成本發(fā)明的多肽的優(yōu)選方法，其中序列的C-端氨基酸附著到不溶性支持物上，隨后在序列上依次添加剩下的氨基酸。固相合成技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的且其描述參見，例如，Barany和Merrifield(1963)Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284頁，見The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology.Vol.2Special Methodsin Peptide Synthesis，Part A.；Merrifield等(1963)J.Am.Chem.Soc.，852149-2156，和Stewart等(1984)Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，PierceChem.Co.，Rockford，III。
在最優(yōu)選的實施方案中，使用二苯甲基胺樹脂(benzhyderylamineresin)(Beckman Bioproducts，0.59mmol的NH2/每克樹脂)作為固相支持物通過固相肽合成程序合成該肽。COOH末端氨基酸(例如，t-丁基羰基-Phe)通過4-(甲氧基)苯乙?；街焦滔嘀С治锷稀Ｋ潜瘸Ｒ?guī)苯甲基酯鍵更穩(wěn)定的鍵，但是仍然可通過氫化裂解完成的肽。使用甲酸作為氫供體的傳遞氫化可用于該目的。用于肽合成和合成肽的分析的詳細方案在附上Anantharamaiah等(1985)J.Biol.Chem.，260(16)10248-10255的小型增刊中描述。
應注意到在肽的化學合成中，特別是包含D氨基酸的肽，合成通常產(chǎn)生除了所需全長產(chǎn)物外的許多截短的肽。純化過程(例如，HPLC)一般導致?lián)p失大量的全長產(chǎn)物。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是，在D肽(例如，D-4)的合成中，為了防止在純化最長形式中的損失，可以透析并使用混合物，從而排除了最后的HPLC純化。該混合物損失大約50％效價的高純度產(chǎn)物(例如，每份重量的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)，但是該混合物含有大約6倍以上的肽且因此有更大的總活性。
D-型氨基酸通過在化學合成中簡單地使用D-型衍生氨基酸殘基在肽的一個或多個位置摻入D-氨基酸。用于固相肽合成的D-型殘基可從許多供應商(參見，例如，Advanced Chem Tech，Louisville；Nova Biochem，San Diego；Sigma，StLouis；Bachem Califormia Inc.，Torrance，等)以商業(yè)途徑獲得。D-型氨基酸可在所需肽的任何位置摻入。因此，例如，在一個實施方案中，該肽可包含單個D-氨基酸，而在其它實施方案中，該肽包含至少兩個，一般至少3個，更常見至少4個，最常見至少5個，優(yōu)選至少6個，更優(yōu)選至少7個且最優(yōu)選至少8個D氨基酸。在特別優(yōu)選的實施方案中，基本上每隔(對映體)一個氨基酸是D-型氨基酸。在某些實施方案中，至少90％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的對映體氨基酸是D-型氨基酸。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，基本上每個對映體氨基酸是D-型氨基酸。
保護基團在某些實施方案中，組成型氨基酸和/或末端氨基酸上的一個或多個R-基團用保護基團封閉。不受具體理論的約束，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明的試驗肽的封閉，特別是氨基和/或羧基末端的封閉極大地改進了口服傳遞且顯著提高了血清半壽期。
許多保護基團適用于該目的。該基團包括，但不限于乙?；０坊?，和具有乙?；耐榛彝榛貏e優(yōu)選用于N-末端保護，酰胺基優(yōu)選用于羧基末端保護。在某些特別優(yōu)選的實施方案中，保護基團包括，但不限于諸如在脂肪酸中的烷基鏈，丙烯基(propeonyl)，甲?；捌渌?。特別優(yōu)選的羧基保護基團包括形成酰胺，酯，和醚形成的保護基團。在一個優(yōu)選的實施方案中，乙酰基用于保護氨基末端且酰胺基用于保護羧基末端。這些保護基團增強了肽形成螺旋的傾向。某些特別優(yōu)選的保護基團包括各種長度的烷基基團，例如，具有通式CH3-(CH2)n-CO-的基團，其中n范圍是從大約1到大約20，優(yōu)選從大約1到大約16或18，更優(yōu)選從大約3到大約13，且最優(yōu)選從大約3到大約10。
在某些特別優(yōu)選的實施方案中，保護基團包括，但不限于諸如在脂肪酸中的烷基鏈，丙烯基，甲?；?，及其它。特別優(yōu)選的羧基保護基團包括形成酰胺，酯，和醚形成的保護基團。在一個優(yōu)選的實施方案中，乙酰基用于保護氨基末端且酰胺基用于保護羧基末端。這些保護基團增強了肽形成螺旋的傾向。某些特別優(yōu)選的封閉基團包括各種長度的烷基基團，例如，具有通式CH3-(CH2)n-CO-的基團，其中n范圍是從大約3到大約20，優(yōu)選從大約3到大約16，更優(yōu)選從大約3到大約13，且最優(yōu)選從大約3到大約10。
其它保護基團包括，但不限于Fmoc，t-丁氧基羰基(t-BOC)，9-芴乙?；?，1-芴羧基，9-芴羧基，9-芴酮-1-羧基，芐氧基羰基，呫噸基(Xan)，三苯甲基(Trt)，4-甲基三苯甲基(Mtt)，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)，4-甲氧基-2，3，6三甲基-苯磺?；?Mtr)，1，3，5-三甲基苯-2-磺?；?Mts)，4，4二甲氧基二苯甲基(Mbh)，甲苯磺?；?Tos)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基(Pmc)，4-甲芐基(MeBzl)，4-甲氧基芐基(MeOBzl)，芐氧基(BzlO)，芐基(Bzl)，苯甲酰基(Bz)，3-硝基-2-吡啶磺酰基(Npys)，1-(4，4-二甲基-2，6-二偶氮亞環(huán)己基)乙基(Dde)，2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)，2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)，2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)，芐氧基甲基(Bom)，環(huán)己氧基(cHxO)，t-丁氧基甲基(Bum)，t-丁氧基(tBuO)，t-丁基(tBu)，乙?；?Ac)，和三氟乙?；?TFA)。
保護/封閉(block)基團是技術(shù)人員所熟知的，類似于將該基團偶聯(lián)到本發(fā)明的肽包含的合適殘基上的方法(參見，例如Greene等，(1991)ProtectiveGroups in.Organic Synthesis，第二版，John Wiley & Sons，Inc.Somerset，N.J.)。在一個優(yōu)選的實施方案中，例如，合成期間當肽在樹脂上時使用醋酸酐實現(xiàn)乙?；Ｍㄟ^選擇合適的合成樹脂可實現(xiàn)酰胺保護。在該實施例中本文所述的肽合成期間，使用rink酰胺樹脂。合成完成后，在諸如Asp和Glu的酸性雙官能氨基酸和堿性氨基酸Lys上的半固定保護基團和Tyr的羥基都同時被去掉。使用酸處理從該樹脂釋放的肽表現(xiàn)出n-末端被乙?；Ｗo，羧基被NH2保護，同時去掉了所有其它保護基團。
V.增強肽吸收本發(fā)明令人驚奇的發(fā)現(xiàn)還有當所有L氨基酸肽(例如，具有本發(fā)明的肽的序列的不同形式)與D-型(即，本發(fā)明的肽)結(jié)合給藥時，D-型肽的吸收增加。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明包含在本發(fā)明的方法中使用D-型和L-型肽的組合。D-型肽和L-型肽可具有不同的氨基酸序列，但是，在優(yōu)選的實施方案中，它們都具有本文所述的肽的氨基酸序列，在更優(yōu)選的實施方案中，它們具有相同的氨基酸序列。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)還有本發(fā)明的A型兩親性螺旋肽的多聯(lián)體(concatamer)在減輕動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀中也是有效的。包含單體的多聯(lián)體可直接偶聯(lián)在一起或由接頭連接。在某些實施方案中，接頭是氨基酸接頭(例如，脯氨酸)，或肽接頭(例如，Gly4Ser3)。在某些實施方案中，多聯(lián)體是2聚體，更優(yōu)選3聚體，甚至更優(yōu)選4聚體，且最優(yōu)選5聚體，8聚體或10聚體。
VI.藥物制劑為了實現(xiàn)本發(fā)明的方法，可將本發(fā)明的一種或多種肽或肽模擬物施用給，例如，診斷為具有動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀，或處于動脈粥樣硬化風險中的個體。肽或肽模擬物可以“天然”形式，或者如果需要，以鹽，酯，酰胺，前藥，衍生物等的形式給藥，前提是該鹽，酯，酰胺，前藥或衍生物是藥理學上合適的，即在該方法中有效?；钚栽噭┑柠}，酯，酰胺，前藥和其它衍生物可使用合成有機化學領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標準方法制備，該方法由，例如，March(1992)A dvanced Organic Chemistry；Reactions，Mechanisms and Structure，第4版，N.Y.Wiley-Interscience描述。
例如，使用一般涉及與合適的酸反應的常規(guī)方法從游離堿制備酸加成鹽。一般來說，該藥品的堿性形式溶于諸如甲醇或乙醇的極性有機溶劑中并向其中加入酸。所得的鹽可沉淀或者可通過加入極性較低的溶劑從溶液中制備出來。制備酸加成鹽的合適的酸包括有機酸，例如乙酸，丙酸，乙醇酸，丙酮酸，草酸，蘋果酸，丙二酸，琥珀酸，馬來酸，延胡索酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，肉桂酸，杏仁酸，甲磺酸，乙磺酸，對-甲苯磺酸，水楊酸等，以及無機酸，例如，鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等。通過用合適的堿處理可將酸加成鹽轉(zhuǎn)變成游離堿。特別優(yōu)選的本文的活性試劑的酸加成鹽是鹵化鹽，例如可使用鹽酸或氫溴酸制備的鹵化鹽。相反，肽或模擬物的堿性鹽的制備可使用諸如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，氫氧化鈣，三甲胺等的藥學上可接受的堿以相似的方式制備。特別優(yōu)選的堿性鹽包括諸如鈉鹽的堿金屬鹽，和銅鹽。
酯的制備一般涉及可能存在于藥品分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的羥基和/或羧基基團的功能發(fā)揮。酯一般是游離醇基團的?；〈苌?，即來自通式為RCOOH的羧酸的半分子，其中R是烷基，優(yōu)選是低級烷基。如果需要，通過使用常規(guī)氫解或水解程序可將酯恢復成游離酸。
使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的或在相關(guān)文獻中所述的技術(shù)也可制備酰胺和前藥。例如，使用合適的胺反應物可從酯制備酰胺，或者它們可通過與氨水或低級烷基胺反應從酸酐或鹽酸制備。前藥一般通過半分子的共價連接制備，該連接產(chǎn)生在被個體的代謝系統(tǒng)修飾前無治療活性的化合物。
本文鑒定的肽或模擬物可用于腸胃外，體表，口服，鼻腔(或者吸入)，直腸，或局部給藥，例如通過氣溶膠或者經(jīng)過皮膚給藥，用于預防和/或治療動脈粥樣硬化和/或其癥狀。藥用組合物可根據(jù)給藥方法以各種單位劑量形式給藥。合適的單位劑量形式包括，但不限于粉劑，片劑，丸劑，膠囊，錠劑，栓劑，貼劑，鼻腔噴霧劑，注射劑，植入的持久釋放制劑，脂復合物等。
本發(fā)明的肽和/或肽模擬物一般與可藥用載體(賦形劑)組合以形成藥物學組合物?？伤幱幂d體可含有用于例如，穩(wěn)定該組合物或增加或減少活性試劑吸收的一種或多種生理學上可接受的化合物。生理學上可接受的化合物可包括，例如，諸如葡萄糖，蔗糖，或葡聚糖的糖類，諸如抗壞血酸或谷胱甘肽的抗氧化劑，螯合劑，低分子量蛋白，諸如脂類的保護和吸收增強劑，減少活性試劑清除或水解的成分，或賦形劑或其它穩(wěn)定劑和/或緩沖液。
其它生理學上可接受的化合物包括潤濕劑，乳化劑，分散劑或?qū)τ诜乐刮⑸锷L或作用特別有用的保護劑。各種保護劑是熟知的且包括，例如，苯酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預料到包括生理學上可接受的化合物的可藥用載體的選擇取決于，例如，活性試劑的給藥途徑和活性試劑的具體生理-化學特性。
賦形劑優(yōu)選是無菌的且一般不含不良物質(zhì)。這些組合物可通過常規(guī)的熟知滅菌技術(shù)進行滅菌。
在治療性應用中，將本發(fā)明的組合物以足以治愈或至少部分防止或阻止該疾病和/或其并發(fā)癥的量施用給患有動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀或有動脈粥樣硬化風險的患者。足以實現(xiàn)該目的的量定義為“治療有效量”。對該用途有效的量取決于該疾病的嚴重性和患者的總體健康狀態(tài)。組合物的單次或多次給藥可依賴于患者需要和耐受的劑量和頻率進行給藥。在任一情況中，組合物應提供足夠量的本發(fā)明的制劑的活性劑以有效治療患者(改善一種或多種癥狀)。
肽或模擬物的濃度可大范圍變化，且可以主要根據(jù)液體體積，粘度，體重等按照選定的和患者需要的具體給藥方式做出選擇。然而，選定的濃度一般提供范圍從大約0.1或1mg/kg/天到大約50mg/kg/天且有時更高的劑量。典型的劑量范圍從大約3mg/kg/天到大約3.5mg/kg/天，優(yōu)選從大約3.5mg/kg/天到大約7.2mg/kg/天，更優(yōu)選從大約7.2mg/kg/天到大約11.0mg/kg/天，且最優(yōu)選從大約11.0mg/kg/天到大約15.0mg/kg/天。在某些優(yōu)選的實施方案中，劑量范圍從大約10mg/kg/天到大約50mg/kg/天?？深A料到該劑量可變化以優(yōu)化對特定受試者和受試者群體的治療方案。
在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的肽或肽模擬物可按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的標準方法口服(例如，經(jīng)過片劑)或者作為注射劑給藥。在另一優(yōu)選的實施方案中，該肽也可以使用常規(guī)經(jīng)皮膚的藥物傳遞系統(tǒng)，即經(jīng)皮膚的“貼劑”通過皮膚傳遞，其中活性劑一般包含在用作藥物傳遞裝置以固定在皮膚上的層狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。在該結(jié)構(gòu)中，藥物組合物一般包含在上面襯背層下面的一層，或“儲存庫”中?？深A料到本文中的術(shù)語“儲存庫”是指最終可傳遞到皮膚表面的“活性成分”的總量。因此，例如，“儲存庫”可包括粘連在貼劑襯背層上，或者在本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任一種不同的基質(zhì)制劑上的活性成分。貼劑可含有單個儲存庫，或者可含有多個儲存庫。
在一個實施方案中，儲存庫包含用于在藥物傳遞期間將系統(tǒng)粘貼到皮膚上的可藥用接觸粘連材料的聚合體基質(zhì)。合適的皮膚接觸粘貼材料的例子包括，但不限于，聚乙烯，聚硅氧烷，聚異丁烯，聚丙烯酸酯，聚氨酯等。另外，包含藥物的儲存庫與皮膚接觸粘合劑作為分開的不同層存在，且粘合劑在儲存庫下面，在這種情況下，儲存庫可以是上述的聚合體基質(zhì)，或者可以是液態(tài)或水凝膠儲存庫，或者可采用一些其它形式。用作該裝置的上表面的這些層中的襯背層優(yōu)選用作“貼劑”的主要結(jié)構(gòu)元件且賦予該裝置更大的彈性。選擇用于襯背層的材料優(yōu)選對于活性劑和存在的任意其它物質(zhì)基本上不滲透。
用于體表藥物傳遞的其它優(yōu)選的制劑包括，但不限于軟膏和乳膏。軟膏是半固態(tài)制品，一般以凡士林或其它石油衍生物為基礎(chǔ)。含有選定活性劑的乳膏一般是粘性液體或半固態(tài)乳劑，通常是水包油或油包水型。乳膏基質(zhì)一般是可水洗的且含有油相，乳化劑和水相。油相有時也稱為“內(nèi)部”相，一般由凡士林和諸如鯨蠟基或硬脂酰基醇的脂肪醇組成；盡管不是必然的，但水相通常在體積上超過油相，且一般含有潤濕劑。乳膏制劑中的乳化劑一般是非離子的，陰離子的，陽離子的或兩性表面活性劑。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預料到的，使用的特定軟膏或乳膏基質(zhì)是提供最佳藥物傳遞的基質(zhì)。與其它載體或媒介物一樣，軟膏基質(zhì)應是惰性的，穩(wěn)定的，無刺激的和不致敏的。
不同于一般的肽制劑，含有D-型氨基酸的本發(fā)明的肽甚至可以通過口服給藥，不需防止被胃酸等蛋白水解。盡管如此，在某些實施方案中，通過使用保護性賦形劑可增強肽傳遞。通過用導致其抗酸性和酶水解的成分絡(luò)合該多肽或者通過在諸如脂質(zhì)體的適當抗性載體中包裝該多肽一般可實現(xiàn)這點。保護用于口服傳遞的多肽的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見，例如，美國專利5,391,377描述的用于口服傳遞治療劑的脂類組合物)。
通過使用持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的“包裝”系統(tǒng)可維持血清半壽期的升高。這種持續(xù)釋放系統(tǒng)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。在一個優(yōu)選的實施方案中，用于蛋白質(zhì)和肽的ProLease可生物降解的微球體傳遞系統(tǒng)(Tracy(1998)Biotechnol.Prog.14108；Johnson等(1996)，NatureMed.2795；Herbert(1998)，Pharmaceut.Res.15，357)，是由在聚合體基質(zhì)中含有蛋白質(zhì)的可生物降解的聚合體微球體組成的干粉，它可作為含有或不含其它試劑的干燥制劑混合。
ProLease微球體的構(gòu)建方法被特別設(shè)計成達到較高的蛋白包裝效率，同時維持蛋白質(zhì)的完整性。該方法由下列步驟組成(i)通過噴霧凍干含穩(wěn)定賦形劑的藥品溶液從大量蛋白質(zhì)制備凍干的蛋白質(zhì)顆粒，(ii)制備藥物聚合體懸液隨后通過音波處理或勻漿減小藥品顆粒大小，(iii)通過霧化進液氮產(chǎn)生冷凍的藥物聚合體微球體，(iv)用乙醇提取聚合體溶劑，和(v)過濾并真空干燥以產(chǎn)生最終的干粉產(chǎn)物。所得的粉末含有固體形式的蛋白質(zhì)，它是均勻的且穩(wěn)固分散在多孔聚合體顆粒內(nèi)。該方法中最常用的聚合體，即poly(lactide-co-glycolide)(PLG)，是生物相容性的和可生物降解的。
包裝可在低溫(例如，-40℃)下完成。包裝期間，蛋白質(zhì)維持不含水的固態(tài)，從而最小化水誘導的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，防止包含水作為反應物的蛋白質(zhì)降解反應，避免出現(xiàn)使蛋白質(zhì)遭受變性的有機-水界面。一個優(yōu)選的方法使用的溶劑對于大多數(shù)蛋白質(zhì)是不溶的，因此產(chǎn)生較高的包裝效率(例如，大于95％)。
在另一實施方案中，溶液中的一種或多種成分作為“濃縮物”供應，例如在易于稀釋的貯存容器(例如，以預定的(premeasured)容積)中，或在易于加入一定體積水的可溶性膠囊中。
上述制劑和給藥方法是說明性的而不是限制性的?？深A料到使用本文提供的教導可容易地設(shè)計其它合適的制劑和給藥方式。
VII.基于脂類的制劑在某些實施方案中，本發(fā)明的肽與一種或多種脂類結(jié)合給藥。脂類可作為防止和/或增強肽的運輸/吸收的賦形劑進行配制或者它們可分開給藥。
不受具體理論的限制，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是施用(例如，口服施用)某些磷脂可顯著增加HDL/LDL比率。另外，相信某些中等長度的磷脂通過不同于在一般脂類運輸中涉及的方法進行運輸。因此，某些中等長度的磷脂與本發(fā)明的肽共同給藥提供了許多優(yōu)勢它們防止磷脂消化或水解，它們改進肽的吸收，且它們改進HDL/LDL比率。
脂類可形成包裝本發(fā)明的多肽的脂質(zhì)體和/或它們可與該多肽簡單絡(luò)合/混合。制備脂質(zhì)體和包裝試劑的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Martin和Papahadjopoulos(1982)J.Biol.Chem.，257286-288；Papahadjopoulos等(1991)Proc.Natl.Acad Sci.USA，8811460-11464；Huang等(1992)Cancer Res.，526774-6781；Lasic等(1992)FEBS Lett.，312255-258.，等)。
用于這些方法的優(yōu)選磷脂具有在sn-1和sn-2位置有從大約4個碳到大約24個碳范圍的脂肪酸。在某些優(yōu)選的實施方案中，脂肪酸是飽和的。在其它優(yōu)選的實施方案中，脂肪酸可以是不飽和的。表2中列舉了各種優(yōu)選的脂肪酸。
表2用于D肽給藥的優(yōu)選磷脂的sn-1和/或sn-2位置中優(yōu)選的脂肪酸


在這些位置中的脂肪酸可以相同或不同。特別優(yōu)選的磷脂在sn-3位置具有磷酸膽堿。
VIII.其它藥物學活性劑其它藥物學活性劑可與主要活性劑，例如本發(fā)明的肽一起傳遞。在一個實施方案中，該試劑包括，但不限于減小動脈粥樣硬化事件和/或其并發(fā)癥的風險的試劑。該試劑包括，但不限于β阻斷劑，β阻斷劑與thiazide利尿劑的組合，抑制素，阿斯匹林，ace抑制劑，ace受體抑制劑(ARBs)，等。
合適的β阻斷劑包括，但不限于心臟選擇性(選擇性β1阻斷劑)，例如，醋丁洛爾(SectralTM)，氨酰心安(TenorminTM)，倍他洛爾(KerloneTM)，比索洛爾(bisoprolol)(ZebetaTM)，美托洛爾(LopressorTM)，等。合適的非選擇性阻斷劑(同等阻斷β1和β2)包括，但不限于卡替洛爾(CartrolTM)，納多洛爾(CorgardTM)，噴布洛爾(LevatolTM)，吲哚洛爾(ViskenTM)，普萘洛爾(InderalTM)，噻嗎洛爾(BlockadrenTM)，拉貝洛爾(NormodyneTM，TrandateTM)，等。
合適的β阻斷劑thiazide利尿劑組合包括，但不限于Lopressor HCT，ZIAC，Tenoretic，Corzide，Timolide，Inderal LA 40/25，Inderide，Normozide，等。
合適的抑制素包括，但不限于pravastatin(Pravachol/Bristol-MyersSquibb)，simvastatin(Zocor/Merck)，lovastatin(Mevacor/merck)，等。
合適的ace抑制劑包括，但不限于卡托普利(例如，Squibb的CapotenTM)，benazepril(例如，Novartis的LotensinTM)，enalapril(例如，Merck的VasotecTM)，fosinopril(例如，Bristol-Myers的MonoprilTM)，lisinopril(例如，Merck的PrinivilTM或Astra-Zeneca的ZestrilTM)，quinapril(例如，Parke Davis的AccuprilTM)，ramipril(例如，Hoechst Marion Roussel，King Pharmaceuticals的AltaceTM)，imidapril，perindopril erbumine(例如，Rhone-Polenc Rorer的AceonTM)，trandolapril(例如，Knoll Pharmaceutical的MavikTM)，等。合適的ARBS(Ace受體阻斷劑)包括但不限于losartan(例如，Merck的CozaarTM)，irbesartan(例如，Sanofi的AvaproTM)，candesartan(例如，Astra Merck的AtacandTM)，valsartan(例如，Novartis的DiovanTM)，等。
IX.改善動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的試劑盒在另一實施方案中，本發(fā)明提供了用于改善動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀或用于預防性治療具有動脈粥樣硬化風險的受試者(人或動物)的試劑盒。該試劑盒優(yōu)選包括包含本發(fā)明的一個或多個肽或肽模擬物的容器。肽或肽模擬物可以單劑制劑(例如，栓劑，片劑，caplet，貼劑，等)供應和/或任選與一種或多種可藥用賦形劑組合。
該試劑盒任選還包含用于治療心臟病和/或動脈粥樣硬化的一種或多種其它試劑。該試劑包括，但不限于，β阻斷劑，血管舒張劑，阿斯匹林，抑制素，ace抑制劑或ace受體抑制劑(ARBs)等，例如如上所述。
另外，該試劑盒任選包括為實施該方法或使用本發(fā)明的“治療劑”或“預防劑”提供指導(即，方案)的標簽和/或說明性材料。優(yōu)選的說明性材料可描述本發(fā)明的一種或多種多肽減輕動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀和/或在有動脈粥樣硬化風險的個體中防止一種或多種該癥狀的發(fā)作或增強的用途。說明性材料也可任選教導優(yōu)選的劑量/治療方案，計數(shù)器指示等。
盡管說明性材料一般包含書面的或打印的材料，但是它們不限于這些。本發(fā)明還包含能儲存這些說明并將它們傳達給最終用戶的任何介質(zhì)。該介質(zhì)包括，但不限于電子儲存媒體(例如，磁盤，磁帶，盒式磁帶機，芯片)，光學媒體(例如，CD ROM)，等。該媒體可包括提供該說明性材料的因特網(wǎng)網(wǎng)址。
實施例下面的實施例用于舉例說明，但不是用于限制所要保護的發(fā)明。
實施例1一些合成的A型肽類似物已表現(xiàn)出模擬體外人apo A-I的許多特性。在該實施例中，一種兩親性增強的新型肽(5F)通過以20μg/天，腹膜內(nèi)注射共16周給予飼喂致動脈粥樣化飲食的C57BL/6J小鼠。給其它小鼠提供小鼠apo A-I(MoAI)(50μg/天)或磷酸鹽緩沖液(PBS)注射作為對照。除了接受5F或MoAI的小鼠以總膽固醇的百分數(shù)計算時具有較低的高密度脂蛋白(HDL)-膽固醇處理組和對照組之間總血漿膽固醇水平和脂蛋白分布情況沒有顯著差異。觀察到注射物沒有毒性或產(chǎn)生其抗體。當LDL來自用5F注射的動物且提供給體外人動脈壁細胞時，比來自對照的LDL產(chǎn)生較少的脂類氫過氧化物和較少的LDL-誘導的趨化活性。另外，當HDL來自用5F注射的小鼠且與人LDL一起提供給體外人動脈壁細胞時，形成明顯更少的脂類氫過氧化物且具有明顯更小的LDL-誘導的單核細胞趨化活性。接受肽5F的小鼠與接受PBS的小鼠相比具有明顯更小的主動脈動脈粥樣硬化病灶面積。接受MoAI的小鼠中的病灶面積相似于PBS-注射的動物。我們推斷5F在動脈粥樣硬化的預防和治療中具有潛力。
材料和方法肽肽5F(Ac-18A[Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys PheLys Glu Phe Phe]-NH2)通過固相肽合成法合成(參見，例如，Anantharamaiah和Garber(1996)Meth.Enzymol.263267-282；Palgunachari等(1996)Arteriosclerosis，Thrombosis，& Vascular Biology 16328-338)。通過分析HPLC和離子-噴射質(zhì)譜法可確定眾多的合成肽。該肽可用蒸餾水透析且用前凍干。
MoAI從C57BL/6J小鼠的血漿中分離(EDTA血漿從Harlan Bioproductsfor Science，Indianapolis，IN購買)。MoAI使用大小-排阻結(jié)合反相柱層析分離。簡單的說，通過加入KBr將血漿密度調(diào)到1.21g/ml，4℃下以50,000rpm離心24小時(Ti70離心機；Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)。收集上部級分，用水透析以去掉KBr，凍干并脫脂(delipidated)。沉淀溶于Gn:DTT:Tris溶液(3M鹽酸胍，1mM二硫蘇糖醇，和10mM Tris；pH＝8.0)，然后使用截留值12,000MW的透析管用相同溶液透析以便從樣品中去掉許多apo A-II和C載脂蛋白。然后用水透析該樣品并凍干。沉淀溶于新鮮的Gn:DTT:Tris溶液中，通過大小排阻柱色譜法分離蛋白質(zhì)，使用以bulkphase Superose 12(PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)填充并用Gn:DTT:Tris溶液平衡的XK26/100柱(2.6X 100cm)。流速為0.5ml/分鐘，且收集2.5ml級分。通過SDS-PAGE分析相應于apo A-I峰的級分，并通過制備型C-18反相HPLC(Anantharamaiah和Garber(1996)Meth.Enzymol.263267-282)進一步純化。
小鼠使用雌性C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)進行所有實驗。購買6周齡小鼠，且用8周齡的小鼠開始飲食研究。在周轉(zhuǎn)(turnover)研究中使用重20到22克的小鼠。所有動物研究經(jīng)過預期評論并得到伯明翰的亞拉巴馬州大學的動物保護和使用委員會組織的許可。
動力學研究5F肽，MoAI，和人apo A-I通過Bilheimer等(1972)Biochim.Biophys.Acta260212-221的方法用125I標記。小鼠安置修改的Thomas-Hartroft致動脈粥樣化飲食(#TD88051；Teklad，Madison，WI)共4周，此時開始每天腹膜內(nèi)注射溶于200μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中的肽或蛋白質(zhì)。用MoAI或人apo A-I注射的動物每只動物接受50μg；用5F注射的動物接受20μg。動物不禁食以用于動力學研究且在注射15，30，和45分鐘，及1，1.5，2，3，4，6，8，12，和24小時后在甲苯噻嗪氯胺酮麻醉下從眼眶后靜脈竇獲取血液樣品。每只動物在不同的時間點提供3份血液樣品(均在眼眶后且輪換眼睛)，在每個時間點收集至少3個樣品(來自不同動物)。樣品收集進肝素處理的毛細管中，然后放入微量離心管中；離心分離血漿。每個樣品取兩份10μl等分試樣用于放射性測定，每個樣品使用γ計數(shù)(Cobra；Packard Instruments，Downers Grove，IL)10分鐘?？傃獫{體積計算為體重的4.2％。各樣品以總血漿中注射的CPM的百分數(shù)表示。游離的125I通過三氯乙酸(TCA)沉淀法(每10μl血漿樣品1ml的10％TCA)測定。使用所有數(shù)據(jù)點，而不是在各時間點的平均值進行動力學模型適配(PKAnalyst，MicroMath Scientific Software，Salt Lake City，UT)。
用于病灶研究的注射方案和樣品收集獲取6周齡的小鼠，除了不接受處理的陰性對照組為10只外，隨機分成20只的組，并給予標準嚙齒類食物。在8周齡時，處理組安置修改的Thomas-Hartroft致動脈粥樣化飲食(#TD88051；Teklad，Madison，WI)，并開始注射。食物在4℃下貯存并在生產(chǎn)日后不超過3個月內(nèi)使用以最小化脂類的氧化。每天腹膜內(nèi)注射動物共16周，包括周末和假日。每組20只小鼠每天接受200μl PBS(作為陽性對照)，或在200μl PBS中的20μg5F，或在200μl PBS中的50μg MoAI的注射。
制備凍干的5F肽裝入小瓶中，每瓶包含足夠用于一天注射的肽。5F肽在PBS中凍干，并溶于在注射當天高壓滅菌的Milli-Q水(Millipore Corp.，Bedford，MA)中。所有組的注射體積維持在每天200μl/只小鼠。
在研究開始(給食前)和在收獲器官時在麻醉狀態(tài)下通過眼眶后取血獲取血液樣品。在研究結(jié)束(第16周)時，在最后一次取血時，切除心臟和肝臟。心臟保持在0.9％的鹽水溶液中大約1小時以清除血液并允許心肌舒張。然后將它們固定在磷酸鹽緩沖的4％甲醛中至少1周直到切片。取出肝臟并稱重。
組織學評估按照有一些修改的Paigen等的方法(Paigen等(1990)Arteriosclerosis 10316-323)進行組織學評估。簡單的說，將心臟固定在磷酸鹽緩沖的甲醛溶液中至少一周。取出心臟的小于2/3部分后，剩余組織在OCT培養(yǎng)基(Tissue-Tek，Miles Inc.，Elkhart，IN)中冷凍并在-20℃低溫控制器中切片。交替的20μm切片保存在玻片上，并觀察主動脈根的起始處。然后收集另外600μm的切片，或者直到主動脈橫切面為圓形且瓣膜尖不再明顯。玻片用油紅O染色，且用蘇木精復染。通過圖像分析(SigmaScan Pro，SPSS Scientific，Chicago，IL)在連續(xù)的80μm部分玻片中測量染色病灶的橫切面面積，在超過400μm長度(5張玻片)的各主動脈竇上測定平均病灶面積以提供最大平均病灶面積。
共培養(yǎng)物，單核細胞的分離，脂蛋白的分離，脂類氫過氧化物的測定，和單核細胞趨化活性人動脈壁細胞的共培養(yǎng)物，單核細胞分離，從正常人供體的血漿通過超速離心，或者從小鼠血漿通過FPLC分離脂蛋白，和測定脂類氫過氧化物及單核細胞趨化活性均按照標準方法進行。所有人類受試者的參與都經(jīng)過了由UCLA人類受試者保護委員會許可的告知同意。在共培養(yǎng)物中試驗小鼠脂蛋白的方案也按如下進行簡單的說，從飼喂致動脈粥樣化飲食并用載體(PBS)，或用肽5F以20μg/小鼠/天注射的小鼠的小鼠血漿通過FPLC分離LDL和HDL。用人LDL以200μg/ml LDL蛋白質(zhì)，或小鼠LDL以200μg/ml或用200μg/ml的人LDL+350μg/mlHDL蛋白的人HDL，或小鼠HDL以300μg/ml或用單獨的小鼠HDL以300μg/ml處理共培養(yǎng)物。在10％脂蛋白不足的血清(LPDS)存在下在37℃下使用或者不使用上述加入培養(yǎng)該共培養(yǎng)物8小時。收集上清并分析Auerbach脂類氫過氧化物等價物。然后洗滌共培養(yǎng)物并用無血清或LPDS的新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng)8小時。收集條件培養(yǎng)基并分析單核細胞趨化活性。
化學和分析方法-柱上膽固醇脂蛋白的分布情況(CLiP)-使用我們最近開發(fā)的CLiP方法(Garber等(2000)J.Lipid Res.411020-1026)測量血漿膽固醇脂蛋白分布情況。簡單的說，使用單一Superose6(Pharmacia，Piscataway NJ)柱分析5到10μl血漿。在最靠近柱的下部，通過三通閥(mixing tee)導入膽固醇試劑，且洗脫液試劑混合物進入柱后反應旋管中。洗脫液混合物的膽固醇含量在500nm處通過分光光度法檢測，將數(shù)據(jù)點收集進計算機。所得的分布情況分解成組分峰并使用PeakFit(SPSSScience，Chicago，IL)分析相對面積；通過與對照樣品的已知值比較測定總膽固醇和各組分峰的絕對膽固醇值。在某些情況下，收集級分以測定放射性分布。CLiP方法允許分析單個小鼠的樣品，避免使用合并樣品。
抗體檢測-為了測定每天的肽注射是否在小鼠中誘發(fā)任何免疫反應，可用收集器官時(每天注射共16周后)從小鼠獲取的血漿進行間接ELISA滴定(Engvall(1980)Meth.Enzymol.70419-439)。平板用注射肽或MoAI(10μg/ml)覆蓋。將平板溫育過夜。通過用含有0.05％Tween 20的硼酸鹽緩沖液(pH 8.2)徹底洗滌后，用緩沖液(在硼酸鹽緩沖液中的0.1％明膠和0.1％BSA)封閉1小時，200μl稀釋的小鼠血漿(1∶100稀釋)樣品用硼酸鹽緩沖液按1∶1系列稀釋。然后向各孔中加入抗小鼠IgG(0.1g/ml)的生物素標記的山羊抗體并用SA-HRP(鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶)處理平板1小時，用ABTS和過氧化物作為底物顯色。每次加入抗原/抗體后在室溫下溫育平板過夜，用含有0.05％Tween 20的硼酸鹽緩沖液(pH 8.2)徹底洗滌，并在下次加入前用緩沖液(在硼酸鹽緩沖液中的0.1％明膠和0.1％BSA)封閉1小時。
統(tǒng)計學方法通過雙尾t-檢驗或方差的單向分析(其中數(shù)據(jù)正態(tài)分布)，或者通過等級方差的的單向分析(SigmaStat；SPSS Science，Chicago，IL)比較處理組。假定輸入和輸出速率不相等通過適配第一級單室動力學模型(PKAnalyst；MicroMath Scientific Software，Salt Lake City，UT)分析肽或蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的動力學。
結(jié)果動力學研究腹膜內(nèi)注射后肽5F和人的及小鼠的apo A-I從小鼠血漿中清除的動力學在表3中概括。
表3.動力學實驗的適配(fitted)數(shù)據(jù)概括

所示的數(shù)據(jù)表示假定輸入和輸出速率不相等時第一級單室動力學模型(PKAnalyst；MicroMath Scientific Software，Salt Lake City，UT)的適配數(shù)據(jù)結(jié)果。縮寫T1/2從血漿中清除的時間的一半；血漿Max.％在峰值水平時總血漿中發(fā)現(xiàn)的注射劑量的百分數(shù)；r2動力學模型的適配統(tǒng)計學合適度。
人和小鼠apo A-I與5F肽相比具有更長的清除時間。人apo A-I和5F比小鼠apo A-I達到峰值血漿水平需要更長的時間，盡管達到的峰值水平一般相似(人apo A-I比其它材料達到更高的峰值水平)。以柱層析法對血漿樣品的分析證實肽5F和apoA-I(人和小鼠的)與血漿脂蛋白，特別是與在HDL-大小區(qū)域的顆粒締合(圖6)。注射5F 1.5小時后肽放射性的HDL∶VLDL比率為4.19±0.58(n＝3，p＜0.05)。注射5F 5小時后發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果(6.44±1.10，p＜0.02)。開始注射的肽以TCA沉淀有不超過3％的游離125I。然而，注射1.5小時后，作為總洗脫放射性百分數(shù)的血漿中游離的125I的放射性對于5F明顯更高，為26.9±9.4％，且在5小時時為34.4±4.8％，反應了脂蛋白和締合脂蛋白的肽的預期清除率。從1.5到5小時間游離碘的放射性的增加速率比從注射到1.5小時之間小，可能表明肽在腹腔中大量開始降解。
接受常規(guī)食物(chow)或致動脈粥樣化飲食的存活率和總體形態(tài)只有三只小鼠在延續(xù)飲食研究過程期間死于未說明的原因。其中兩只動物已經(jīng)接受MoAI，一只接受5F肽。收集器官時，在各組之間沒有觀察到總體形態(tài)的區(qū)別。在飼喂致動脈粥樣化飲食的所有動物中肝臟增大，但各組之間肝臟重量或作為體重百分數(shù)的肝臟重量都沒有差別(表4)。接受致動脈粥樣化飲食的所有動物(包括注射PBS的動物)比飼喂常規(guī)食物的對照體重更低(表4)。
表4.處理后的體重和肝臟重量


顯示的數(shù)據(jù)是器官收獲時(處理16周后)獲取的重量平均值±SEM。飼喂常規(guī)食物的動物沒有接受注射。其它小鼠按方法部分所述維持致動脈粥樣化飲食。PBS組每天接受200μl磷酸鹽緩沖液的腹膜內(nèi)注射。5F組每天接受在200μl PBS中的20μg 5F的腹膜內(nèi)注射且MoAI組每天接受在200μl PBS中的50μg MoAI。
*與5F相比p＜0.05；雙尾t-檢驗。
抗原性在16周的注射期間結(jié)束時獲取的血液樣品中檢測抗肽的抗體的存在。沒有檢測到抗肽5F或抗MoAI的抗體(數(shù)據(jù)未顯示)。用未注射進動物組的肽或蛋白質(zhì)覆蓋的ELISA平板進行的交叉實驗產(chǎn)生的結(jié)果基本上相同于在直接測定抗體的存在時的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
脂蛋白和載脂蛋白的特征鑒定通過CliP方法測定的總的和脂蛋白膽固醇的值在表3中提供?？偰懝檀贾档木_度通過人工膽固醇試驗(膽固醇1000；Sigma，St.Louis，MO)證實(數(shù)據(jù)未顯示)?？梢娫谔幚斫M之間在總的或脂蛋白-部分(fraction)的膽固醇水平上沒有顯著差異。然而，當脂蛋白部分表示為總膽固醇的百分數(shù)時(表5)，5F組和MoAI組與PBS組相比包含明顯更低百分數(shù)的HDL-膽固醇。
表5接受常規(guī)食物或致動脈粥樣化飲食16周后總的和脂蛋白膽固醇的水平(mg/dl和總膽固醇百分數(shù))。


數(shù)據(jù)表示為平均值mg/dl±SEM且在括號中表示為總膽固醇的百分數(shù)?？s寫VLDL，極低密度脂蛋白；IDL，中等密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白；HDL，高密度脂蛋白；TC，總膽固醇；MoAI，小鼠apo A-I；PBS，磷酸鹽緩沖液。飼喂常規(guī)食物的動物不接受注射。其它小鼠按方法部分所述維持致動脈粥樣化飲食。PBS組每天接受200μlPBS的腹膜內(nèi)注射。5F組每天接受在200μlPBS中的20μg 5F的腹膜內(nèi)注射且MoAI組每天接受在200μl PBS中的50μgMoA-I。動物數(shù)目如表4所示。
*以雙尾t-檢驗與PBS相比p＜0.05或更低。
小鼠脂蛋白與人動脈壁細胞的相互作用我們最近發(fā)現(xiàn)正常HDL抑制在適度氧化的LDL形成中的3個步驟。在這些研究中(參見，中請日為2000年3月31日的共同未決申請USSN09/541,468)，我們證實用apo A-I或者apo A-I模擬肽(37pA)體外處理人LDL可從包括HPODE和HPETE的LDL中去掉種子分子。這些種子分子是人動脈壁細胞的共培養(yǎng)物能夠氧化LDL和LDL誘導動脈壁細胞產(chǎn)生單核細胞趨化活性所必需的。我們還證實了將apo A-I注射進小鼠或者輸注入人體后，從注射/輸注apo A-I后的小鼠或人類志愿者分離的LDL對人動脈壁細胞的氧化有抗性且在動脈壁細胞共培養(yǎng)物中不誘導單核細胞趨化活性。圖7證實了來自在本試驗中飼喂致動脈粥樣化飲食且注射PBS的小鼠的HDL不能抑制人LDL的氧化(圖7A)且在人動脈壁細胞共培養(yǎng)物中不能抑制LDL-誘導的單核細胞趨化活性(圖7B)。相反，來自飼喂致動脈粥樣化飲食且每天注射肽5F的小鼠的HDL在抑制人LDL氧化和防止共培養(yǎng)物中LDL-誘導的單核細胞趨化活性上與正常人HDL一樣有效。圖7還顯示了來自飼喂致動脈粥樣化飲食且每天注射PBS的小鼠的LDL比來自飼喂相同飲食但每天注射20μg肽5F的小鼠的LDL更易于氧化且更易于誘導單核細胞趨化活性。在用任一脂蛋白處理的動脈壁細胞中未注意到有細胞毒性(數(shù)據(jù)未顯示)。在三個獨立實驗的三個中均觀察到相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
病灶形成圖8中提供了平均的病灶橫切面面積。正如預期，在接受正常小鼠食物的組中沒有觀察到病灶(數(shù)據(jù)未顯示)。正如以前的報道(Paigen等(1990)Arteriosclerosis 10316-323)，在接受致動脈粥樣化飲食的所有組中觀察到病灶面積的顯著變化。然而，注射5F的動物比注射PBS的動物具有明顯更低的平均病灶面積，不論通過雙尾t-檢驗分析(p＜0.002)還是通過等級方差的單向分析(p＜0.001；根據(jù)平均病灶面積的非正態(tài)分布測定)。注射MoAI與注射PBS相比沒有產(chǎn)生病灶面積的差別，且病灶面積與注射5F的動物相比通過t-檢驗(p＜0.002)和通過等級方差的單向分析(p＜0.001)都明顯更大。
討論我們以前證實設(shè)計成模擬A型兩親性螺旋基序的合成肽能夠與磷脂締合，且表現(xiàn)出相似于人apo A-I(3，8，10，14，15，20)的許多生物學特性。我們還顯示了當這些肽在動物中通過靜脈內(nèi)給藥時，發(fā)現(xiàn)它們與血漿脂蛋白(11)締合。該試驗設(shè)計成解釋這樣的一種假說，即理論上脂親和力增強的新肽5F具有抗-致動脈粥樣化特性。
本文提供的研究證實了肽5F在腹膜內(nèi)注射后進入血漿且達到大致比得上MoAI，但小于人apo A-I的血漿水平(表3和圖6)。5F的血漿清除半壽期比腹膜注射后的小鼠或人apo A-I更短。注射后，在HDL區(qū)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的5F(圖6)，盡管事實上接受致動脈粥樣化飲食的多數(shù)循環(huán)膽固醇在VLDL-，IDL-，和LDL-大小的區(qū)域。
血漿膽固醇水平和分布在接受致動脈粥樣化飲食的注射組中無顯著差異(表5)。然而，當脂蛋白部分表示為總膽固醇的百分數(shù)時(表5)，與PBS組相比5F和MoAI組中的HDL膽固醇包含顯著更低的百分數(shù)。
正常HDL抑制適度氧化的LDL形成中的3個步驟。我們證實用apo A-I或者apo A-I模擬肽體外處理人LDL可從包括HPODE和HPETE的LDL中去掉種子分子。這些種子分子是人動脈壁細胞的共培養(yǎng)物能夠氧化LDL和LDL誘導動脈壁細胞產(chǎn)生單核細胞趨化活性所必需的(參見，申請日為2000年3月31日的共同未決申請USSN 09/541,468)。我們還證實了將apo A-I注射進小鼠或者輸注入人體后，從注射/輸注apo A-I后的小鼠或人類志愿者分離的LDL對人動脈壁細胞的氧化有抗性且在動脈壁細胞共培養(yǎng)物中不誘導單核細胞趨化活性。在本試驗中，來自飼喂致動脈粥樣化飲食且注射PBS的小鼠的HDL不能抑制人LDL的氧化(圖7A)且在人動脈壁細胞共培養(yǎng)物中不能抑制LDL-誘導的單核細胞趨化活性(圖7B)。完全相反的是，發(fā)現(xiàn)來自飼喂相同致動脈粥樣化飲食但注射肽5F的小鼠的HDL在抑制人LDL氧化和防止共培養(yǎng)物中LDL-誘導的單核細胞趨化活性上與正常人FHDL一樣有效(圖7)。來自飼喂致動脈粥樣化飲食且注射5F的小鼠的LDL比來自飼喂相同飲食但注射PBS的小鼠的LDL較少易于氧化且誘導較少的單核細胞趨化活性(圖7)?？赡?F與循環(huán)中的LDL相互作用(在與HDL締合之前或者之后)并以與相關(guān)肽37pA體外所述(申請日為2000年3月31日的共同未決申請USSN 09/541,468)相似的方式去掉LDL氧化和LDL-誘導單核細胞趨化活性所必需的種子分子。
人動脈壁細胞與來自飼喂致動脈粥樣化飲食且注射肽5F的小鼠的HDL和LDL的體外反應與體內(nèi)5F的保護作用一致。盡管作為總膽固醇百分數(shù)的總膽固醇，LDL膽固醇，IDL+VLDL-膽固醇，和較低HDL-膽固醇的水平相似，但是飼喂致動脈粥樣化飲食且注射5F的動物具有明顯更低的病灶得分(圖8)。這些結(jié)果在某種程度上類似于Shah等(Shah等(1998)Circulation 97780-785)的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)盡管高膽固醇血癥持續(xù)，但是apoA-IMilano防止apo E-缺陷型小鼠中的動脈粥樣硬化病灶惡化。
人apo A-I已經(jīng)成功用于防止/減輕動物中的動脈粥樣硬化(Wilson等(1988)Arteriosclerosis 8737-741；Rubin等(1991)Nature 353265-267；Paszty等(1994)J.Clin.Invest.94899-903；Plump等(1994)Proc.Natl.Acad Sci.USA919607-9611；Shah等(1998)Circulation 97780-785)但是在這些試驗中以每天50μg的劑量注射MoAI卻不能的原因還不清楚。已表明MoAI不能形成與人apo A-I一樣穩(wěn)定的蛋白質(zhì):脂類復合物(Gong等(1994)Biochim.Biophys.Acta 1213335-342)。也表明小鼠HDL比人HDL更容易被鹽酸胍變性(Gong等(1994)Biochim.Biophys.Acta 1213335-342)，這表明兩親性螺旋肽可能從小鼠HDL取代MoAI比從人HDL取代人apo A-I更容易。這些差別可以或者并不能解釋為什么MoAI在該試驗中不能顯著減少病灶。也可能是在我們采用的條件下需要更高劑量的MoAI。無論如何，5F肽在這些條件下高度有效但MoAI沒有。
在注射操作結(jié)束時對血漿的ELISA分析表明對5F肽不形成抗體。這點并不意外，因為已經(jīng)表明脂類締合的肽不產(chǎn)生抗體，可能是因為這些肽以防止誘導免疫反應所必需的表位暴露的方式結(jié)合脂類(Muranishi(1997)J.Pharm.Soc.Japan 117394-404；Fricker和Drewer(1996)J Peptide Sci.2195-211)。
我們以前的研究表明表達比本試驗中使用的肽理論上具有較低脂親和力的A型兩親性螺旋肽(37pA)的轉(zhuǎn)基因小鼠對動脈粥樣硬化具有抗性(Garber等(1997)Circulation 96I-490)。當前的研究表明肽5F對于闡明動脈粥樣化形成中涉及的機理具有更大的潛力且也具有治療性潛力。
實施例2D肽的效力本實施例證實了本發(fā)明的D肽的效力。用單獨的培養(yǎng)基(有LDL，無細胞或有細胞，無LDL)，250μg/ml來自正常受試者的對照LDL(LDL)和LDL加350μg/ml的來自正常受試者的對照HDL(+HDL)溫育人主動脈壁共培養(yǎng)物。用對照LDL與各種量(橫坐標上所示的微克數(shù))的D-2F，或L-2F(左側(cè)第三組，2F)或者D-37-pA或L-37pA(右側(cè)最后一組，37pA)之一一起溫育其它共培養(yǎng)物。該數(shù)據(jù)代表從一式四份共培養(yǎng)物中獲得的值的平均值±SD。HDL或加入肽的值與單獨的LDL(左側(cè)第一組)均有以p＜0.01水平的顯著差異。
共培養(yǎng)物在10％LPDS存在下在37℃中溫育4小時以產(chǎn)生適度氧化的LDL。然后棄去上清，洗滌共培養(yǎng)物并用無血清或LPDS的培養(yǎng)基再培養(yǎng)4小時。收集該條件培養(yǎng)基并分析單核細胞趨化活性。如圖9所示，用D肽體外處理LDL可防止它們被動脈壁細胞氧化。
圖10證實給小鼠提供D肽可導致其紅血細胞對溶血有抗性(由于氧化的一種表現(xiàn)，因為它可用維生素E來防止，數(shù)據(jù)未顯示)。通常用作動脈粥樣硬化病灶形成的動物模型的LDL受體缺陷型小鼠組(n＝3)通過管飼法施用D-肽或鹽水載體。每只動物施用100μl鹽水，100μg/100μl肽D-2F或肽D-37pA。在輕度麻醉17n和48小時后從眼眶后靜脈竇收集血液。離心分離紅細胞，用PBS稀釋到10％血細胞比容并輕輕混合在37℃下溫育。在時間點t＝0，2，6和18小時時取出等分試樣，細胞沉淀離心下來并測定由釋放的血紅蛋白產(chǎn)生的光密度。
圖11證實通過管飼法給小鼠施用D肽并然后分離其LDL導致以單核細胞趨化性生物測定法測量時LDL對動脈壁細胞氧化有抗性。
另一實驗證實D-肽可從胃部吸收并導致LDL不能在我們的人動脈壁細胞共培養(yǎng)物模型中誘導單核細胞趨化活性而2F的L-肽不具有該特性。鹽水或者從D氨基酸或從L氨基酸合成的2F之一通過管飼法滴注進小鼠胃中(通過導管在胃部滴注)。管飼法后給小鼠抽血并分離其LDL且加入人動脈壁細胞共培養(yǎng)物中。D-肽通過管飼法給藥時保護LDL，其證據(jù)是從接受D-2F肽(D2FLDL)(從D氨基酸合成)的小鼠獲取的LDL誘導的單核細胞趨化性減小，而從接受L-2F(從天然L氨基酸合成)(L2FLDL)的小鼠獲取的LDL容易誘導單核細胞趨化性(見圖12)。
從L氨基酸合成的2F體外呈遞給LDL時與從D氨基酸合成的2F一樣有效(見圖9)。因此，在通過管飼法體內(nèi)給予該肽的實驗中在該結(jié)果上的差異表明從D氨基酸合成的2F可能從胃部被完整吸收而從天然L氨基酸合成的2F肽可能在胃部在消化過程中和/或在血漿中被降解，正如我們所假定的情況。在其它試驗中我們未發(fā)現(xiàn)抗D-2F肽的抗體形成的證據(jù)。
圖13A和圖13B是來自通過管飼法給LDL受體敲除的小鼠提供50微克D-5F的實驗的兩張圖。在1.5，3或6小時后給動物抽血并分離其HDL，LDL，和VLDL/IDL。如圖所示，管飼法1.5小時后獲取的HDL不能防止對照(cont.)LDL修飾，但是管飼法3小時后和略少于6小時后獲取的HDL在防止LDL-誘導的人動脈壁細胞產(chǎn)生的單核細胞趨化活性上與對照HDL一樣(圖13A)。在另一圖(圖13B)中，通過管飼法施用50微克D-5F 1.5，3，或6小時后分離小鼠LDL和VLDL/IDL。在左側(cè)一組中，向不含或含有對照HDL的人動脈壁細胞中加入對照LDL并測量動脈壁細胞產(chǎn)生的單核細胞趨化活性。在中間一組中，將管飼法給予50微克D-5F 1.5，3或6小時后獲取的小鼠LDL加入動脈壁細胞中。結(jié)果表明3小時和6小時后，LDL誘導明顯更小的單核細胞趨化活性。在圖的右側(cè)，加入脂蛋白的VLDL/IDL級分(V/ILDL)且如圖所示在3小時的時間點誘導明顯更小的單核細胞趨化活性。
實施例3增加疏水性對A型兩親性螺旋肽的物理-化學和生物學特性的影響縮寫目錄Ac2O，醋酸酐；apo A-I，載脂蛋白A-I；BSA，牛血清白蛋白；CAD，冠狀動脈疾?。籆D，圓二色性；DMPC，雙肉豆蔻?；?dimyristoyl)磷脂酰膽堿；DiPoPE，雙(16∶1)棕櫚油?；字Ｒ掖及罚籇SC，示差掃描量熱法；EDTA，乙二胺四乙酸；EPC，卵磷脂酰膽堿；FMOC，氟代甲氧基羰基；Gdn HCl，鹽酸胍；HAEC，人主動脈內(nèi)皮細胞；HASMC，人主動脈平滑肌細胞；HBTU，2-(H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(2-(H-benzotriazole-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)；HDL，高密度脂蛋白；HPLC，高效液相色譜法；LCAT，卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶；MCP-1，單核細胞趨化蛋白-1；M-CSF，巨噬細胞集落刺激因子；MLV，多層泡囊；NMM，N-甲基嗎啉；PBS，磷酸鹽緩沖液；PIPES，哌嗪-N，N′-雙[2-乙磺酸]；RP-HPLC，反相高效液相色譜法；TFA，三氟乙酸。
摘要我們最近表明兩親性增強的A型兩親性肽5F防止小鼠發(fā)生飲食誘導的動脈粥樣硬化。我們現(xiàn)在通過用苯丙氨酸系統(tǒng)取代已有的非極性氨基酸檢查了包括5F的一系列同源的A型兩親性肽的疏水性增加對與動脈粥樣硬化抑制相關(guān)的物理和功能特性的影響?；谛蛄蠥c-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-NH2(SEQ ID NO1，Ac-18A-NH2或2F)的肽是3F3(Ac-F318A-NH2)，3F14(Ac-F1418A-NH2)，4F(Ac-F3，1418A-NH2)，5F(Ac-F11，14，1718A-NH2)，6F(Ac-F10，11，14，1718A-NH2)和7F(Ac-F3，10，11，14，1718A-NH2)。對水溶性，HPLC滯留時間，穿透進卵PC單分子層的排出壓力和卵PC溶解速率的測量揭示肽4F和5F之間的疏水性突然增加；伴隨著與磷脂締合的能力增加。肽6F和7F效果較差，表明在這些肽中啟動脂類相互作用的疏水性增強受到限制。盡管脂親和力顯著增加，這些肽在激活血漿酶，即卵磷脂:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)中比apoA-I效果更差，其中5F激活LCAT最佳(apoA-I的80％)。肽4F，5F和6F在抑制LDL-誘導的單核細胞趨化活性中同樣有潛力。這些研究表明肽-肽和肽-脂類相互作用之間的適當平衡是兩親性肽最佳生物學活性所必需的。這些研究提供了設(shè)計動脈粥樣硬化抑制潛力增強的小apoA-I-模擬物的基本原理。
引言高密度脂蛋白(HDL)和載脂蛋白A-I(apo A-I)，即HDL的主要蛋白質(zhì)成分的血漿水平與冠狀動脈疾病(CAD)反相關(guān)(Sprecher等(1993)Arterioscler.Thromb.13495-504；Philips等(1993)Circulation 882762-2770)。人apo A-I是一個243殘基的蛋白質(zhì)，含有8個22殘基的兩親性螺旋重復，已表明其中大多數(shù)具有A型基序(Segrest等(1990)Proteins 8103-117；Anantharamaiah等(1993)第109-142頁，見The Amphipathic Helix(Epand，R.M.編輯)，CRCPress，Boca Raton，F(xiàn)L)。A型兩親性螺旋具有特征性電荷分布；它們在α螺旋的極性/非極性邊界具有帶正電荷的氨基酸簇且在極性面中央具有帶負電荷的殘基(Segrest等(1990)Proteins 8103-117；Anantharamaiah等(1993)第109-142，見The Amphipathic Helix(Epand，R.M.，編輯)，CRC Press，BocaRaton，F(xiàn)L；Segrest等(1992)J.Lipid Res.33141-166)。這種特有的二級結(jié)構(gòu)基序推定為負責apo A-I的脂類締合特性(Segrest等(1990)Proteins 8103-117)。用A型兩親性螺旋的合成類似物進行的許多研究支持這一觀點(Segrest等(1994)Adv.Prot.Chem.，45303-369；Brouillette和Anantharamaiah(1995)Biochim.Biophys.Acta 1256103-129)。最近，我們以單體和串聯(lián)二聚體形式合成了在人apo A-I中存在的各個推斷的22殘基的螺旋且表明N-和C-末端兩親性螺旋具有最大脂類締合能力(Mishra等(1998)Biochemistry 3710313-10324)。apo A-I外顯子4(第44-243殘基)的X-射線晶體結(jié)構(gòu)和分子模型研究表明完整的apo A-I的自我締合狀態(tài)是脂類締合所必需的(Borhani等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9412291-12296；Segrest等(2000)Current Opin.Lipidol.11105-115)。在該模型中，apo A-I的兩個分子通過單體互相之間的相互作用以頭尾相連的二聚體形式排列以穩(wěn)定apo A-I的脂類締合結(jié)構(gòu)。
實驗證據(jù)表明apo A-I和HDL防止冠狀動脈疾病的效果可能是由于其在“逆向膽固醇運輸”中的作用(Fielding和Fielding(1995)J.Lipid Res.36211-228；Glomset(1968)J.Lipid Res.9155-167)。逆向膽固醇運輸是涉及HDL/apo A-I的三個步驟的總稱，a)膽固醇從xx細胞流出(Johnson等(1991)Biochim.Biophys.Acta.1085273-298；Oram和Yokoyama(1996)J.Lipid Res.372473-2491)，b)HDL-締合的膽固醇被LCAT酯化(Fielding等(1972)Biochem.Biophys.Res.Comm.461493-1498；Jonas(1991)Biochim.Biophys.Acta 1084205-220)和c)膽固醇酯經(jīng)受體介導的傳遞進入肝臟(Kreiger(1999)Ann Rev.Biochem.68523-558)。體內(nèi)研究表明人apo A-I和A型合成兩親性螺旋肽通過獨立于逆向膽固醇運輸?shù)臋C制抑制動脈粥樣硬化而不改變血漿膽固醇水平(Shah等(1998)Circulation 97780-785)。最近，我們建議抑制LDL-誘導的對動脈壁細胞的單核細胞趨化性已表明是apo A-I和HDL在預防動脈粥樣硬化中所起的另一主要作用(Navab等(2000)J.LipidRes.411481-1494；Navab等(2000)J.Lipid Res.411495-1508)。
已表明模擬人apo A-I特性的肽，即18A已經(jīng)顯示出具有LCAT激活(Anantharamaiah等(1990)Arteriosclerosis 1095-105；Epand等(1987)J.Biol.Chem.2629389-9396)和膽固醇排出能力(Davidson等(1994)J.Biol.Chem.26922975-22982；Yancey等(1995)Biochemistry，347955-7965)。已表明中和18A的末端電荷形成的Ac-18A-NH2增強了其脂類親和力和生物學活性(Yancey等(1995)Biochemistry，347955-7965；Venkatachalapathi等(1993)ProteinsStructure，F(xiàn)unction and Genetics.15349-359)。對該“親本”分子18A的氨基酸序列已做了一些修飾以嘗試改進其apo A-I模擬特性(Brouillette和Anantharamaiah(1995)Biochim.Biophys.Acta 1256103-1291；Mishra等(1994)J.Biol.Chem.2697185-7191；Mishra等(1995)J.Biol.Chem.2701602-1611)。我們早期的研究(Brouillette和Anantharamaiah(1995)Biochim.Biophys.Acta 1256103-1291；Epand等(1987)J.Biol.Chem.2629389-9396)表明該肽疏水性的增大增強了其脂類親和力和apo A-I-模擬特性。已表明一種合成肽5F，即兩親性增強的Ac-18A-NH2的類似物抑制小鼠中飲食誘導的動脈粥樣硬化(參見，例如，實施例1和2)。然而，肽2F在C57BL6小鼠中不能顯著抑制飲食誘導的病灶形成(Garber等(1999)Circulation 100I538)。對18A二聚體肽的研究表明肽-肽締合增強則減小肽:脂締合(Mishra等(1995)J.Biol.Chem.2701602-1611)。為了測定對脂類締合和apo A-I-模擬特性有正效果的增大18A肽脂親和力的最大程度，我們設(shè)計了一系列同源肽，其中通過用Phe取代非極性面上的諸如Leu和Ala的疏水氨基酸而系統(tǒng)地增加Phe殘基。按照Wimley和White的實驗測定的疏水性等級(Wimley和White(1996)Nature Struc.Biol.3842-848)，某種意義上Trp和Phe是疏水性最大的氨基酸，它們表現(xiàn)出最大分區(qū)的水相膜。我們選擇使用Phe增強肽的疏水性，因為它在膜活性肽中是最抗酸性的疏水氨基酸且包含Phe的肽比包含Trp的肽更容易合成。研究了疏水性增強對物理和脂類締合特性，及諸如LCAT激活和抑制LDL-誘導的趨化活性的影響。
實驗方法肽合成使用自動固相合成器(PS3 Protein Technologies，Woburn，MA)通過固相方法合成該肽。在HBTU和NMM存在下將FMOC氨基酸偶聯(lián)到rink酰胺樹脂
，(Peninsula Laboratories，Inc.Belmont，CA)上，并用醋酸酐在N-末端乙?；?。在苯甲醚(1％)，巰基乙醇(0.1％)和色氨酸(占肽樹脂重量的20％)存在下使用在二氯甲烷中的70％TFA將肽從固相支持物上裂解下來并在VYDAC C-4(22mm×25cm，顆粒大小10μm)反相HPLC(RP-HPLC)柱上使用在66分鐘內(nèi)在含有0.1％TFA的水中從25％到58％乙腈的梯度以4.8ml/分鐘的流速純化。使用C18柱(VYDAC，4.6mm×25cm，5μm)和在33分鐘內(nèi)從25％到58％的線型乙腈-水(在0.1％TFA存在下)梯度通過分析RP-HPLC和通過質(zhì)譜分析檢驗肽的純度。
圓二色性按Mishra等(1994)J.Biol.Chem.2697185-7191所述在AVIV 62DS分光偏振計上記錄CD光譜。簡單的說，使用0.1cm光程長度的比色皿獲得光譜并在25℃下從260nm到190nm對每個nm進行測量。通過添加4次掃描，基線校正和使平滑對所有的CD光譜進行信號平均。在PBS，pH 7.4中的肽溶液以11μM的濃度使用。肽-DMPC復合物(1∶20mol∶mol)用于測定脂類結(jié)合對這些肽螺旋度的影響。通過將適當體積的肽溶液加入DMPC多層泡囊中制備這些復合物。DMPC多層泡囊制備如下將已知量的脂類溶于乙醇中且在稀薄氮氣流下通過緩慢蒸發(fā)去掉溶劑。通過將脂膜在真空中貯存過夜去掉殘留溶劑。將適當體積的PBS，pH 7.4加入稀薄脂膜中以產(chǎn)生所需最終濃度的DMPC。通過加入所需體積的肽溶液以達到脂類與肽的摩爾比為20∶1來制備脂類-肽復合物。由于這些肽的可溶性差，使用11μM的肽濃度。使用下面公式計算222nm下的平均剩余橢圓率(mean residue ellipticity)，[θ]MRE(deg.cm2.dmol-1)[θ]MRE＝MRW[θ]/10cl其中，MRW是肽的平均剩余重量，θ是觀察到的橢圓率度數(shù)，c是以g/ml表示的肽濃度，1是以厘米表示的比色皿光程長度。肽的螺旋度百分數(shù)按Morrisett等(1973)Biochemistry，121290-1299所述的下列公式估計％α螺旋度＝([θ]222+3,000)/(36,000+3,000)其中，[θ]222是222nm處的平均剩余橢圓率。
示差掃描量熱法使用Microcal MC-2掃描量熱器(MicroCal，Inc.，Amherst，MA)以對DMPC為20℃h-1，DiPoPE為37℃h-1的掃描率，使用Mishra等(1994)J.Biol.Chem.2697185-7191所述的方法進行DSC研究。將已知量的磷脂溶于氯仿中。對于一組樣品，將肽溶于甲醇中并加入在氯仿/甲醇中的DiPoPE溶液(2∶1，v∶v)中。對于純的脂類樣品和脂類及肽的有機溶液兩者，在緩慢氮氣流下去掉溶劑。在真空中去掉剩余溶劑。將單獨的緩沖液(對于DMPC為PBS，pH7.4，或者對于DiPoPE為20mM PIPES，1mM EDTA，150mM NaCl和0.002％NaN3，pH7.4)或者在緩沖液中達到特定脂類/肽摩爾比的已知濃度的肽溶液加入干膜中并通過在室溫下旋轉(zhuǎn)30分鐘進行水合。對于DMPC，在60分鐘內(nèi)連續(xù)掃描4次。獲取掃描之間的平衡時間。使用MicroCal Inc.，Amherst，MA，and Origin，version 5.0提供的軟件分析DSC熱分析圖。
表面壓力測量單分子層排出壓力測量提供了肽對脂-水界面的親和力；按照Phillips和Krebs(Phillips和Krebs(1986)Methods Enzymol.128387-403；Ibdah等(1989)Biochim.Biophys.Acta 1004300-308)的方法。卵磷脂酰膽堿(EPC)的不溶性單分子層在Teflon盤中的氣-水界面上室溫下展開以產(chǎn)生5-45dyn/cm范圍的起始表面壓力(πi)。將在含有1.5M Gdn.HCl的PBS中的肽溶液小心注射進下層相(subphase)中以產(chǎn)生50μg/dL的終濃度。在下層相中稀釋Gdn.HCl以達到≤1mM的終濃度以便允許肽復性。持續(xù)攪拌下層相并記錄EPC單分子層表面壓力的增加(Δπ)直到獲得穩(wěn)定狀態(tài)的值。通過外推π1對Δπ的線型回歸配合Δπ＝0dyn/cm計算肽不再穿透進EYPC單分子層的起始表面壓力值(πi)，即排出壓力(πe)。
直角光散射測量在EPC多層囊泡(MLV)溶解后使用SLM 8000C光子計數(shù)熒光分光光度計按(Mishra等(1994)J.Biol.Chem.2697185-7191)所述通過直角光散射測定這些肽與卵磷脂酰膽堿的締合。通過在氮氣中蒸發(fā)EPC(Avanti Polar，AL)溶液并用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)水合脂膜制備EPC MLVs。含有105μM EPC和等摩爾量肽的樣品在25℃下維持并連續(xù)攪拌。監(jiān)測濁度的澄清30分鐘。通過加入Triton X-100達到lmM的終濃度實現(xiàn)EPC囊泡的完全溶解。
卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)的純化通過略有修改的Albers等(1986)Methods Enzymol.129763-783的方法從新鮮的正常血脂(normolipidemic)的血漿分離LCAT。將血漿密度調(diào)節(jié)到1.21g/ml且以175,000g離心24小時。對含有LCAT的級分進行Affi-Gel Blue層析，隨后進行DE-52層析。使用在Tris緩沖液(10mM，pH 7.6)中的75到200mM NaCl梯度從DE-52柱洗脫LCAT。SDS-PAGE表明該酶的純度超過90％且無人apo A-I污染。
LCAT活性試驗通過在Branson 250超聲波儀中超聲處理含微量7α-3H膽固醇的卵PC/膽固醇(90∶20mol/mol)12分鐘以獲得小單層囊泡來制備底物。底物(50μl)與5μg肽或人apo A-I及50μl的BSA(40μg/ml)37℃下溫育1小時。使總體積達到150μl。溫育1小時后，加入100μl的LCAT并在37℃下溫育1小時，通過在硅條上點樣10μl結(jié)束反應。通過在己烷∶氯仿(2∶1v/v)混合物中的硅條薄層層析法分離膽固醇和膽固醇酯。通過將TLC平板浸入3％醋酸銅，8％磷酸緩沖液中并加熱可觀察膽固醇和膽固醇油酸酯標準品。標準品的位置用于將硅條分割成兩半且在Packard Tri Carb 4530中在閃爍液中計數(shù)兩部分。所有反應以一式三份進行。肽對LCAT的激活表示為apo A-I總激活的百分數(shù)。
電泳使用Laemmli(1970)Nature 227680-685的方法進行非變性的和SDS-PAGE。使用Premade Novex凝膠且用考馬斯藍染色凝膠以鑒定蛋白質(zhì)帶。
LDL-誘導的單核細胞趨化活性按Navab等(Navab等(1991)J.Clin.Invest.882039-2046；Navab等(1977)J.Clin.Invest.992005-2019)所述進行人動脈壁細胞的共培養(yǎng)，單核細胞分離，以超速離心從正常人供體血漿或通過FPLC從小鼠血漿分離脂蛋白，并測定脂類氫過氧化物和單核細胞趨化活性。簡單的說，用Havel等(Havel等(1955)J.Clin.Invest.431345-1353)的方法從人血漿分離LDL和HDL。人主動脈內(nèi)皮細胞(HAEC)和平滑肌細胞(HASMC)按Navab等(1991)J.Clin.Invest.882039-2046所述分離。用0.1％明膠在37℃下處理微量滴定板過夜。以1×105個細胞/cm2的匯合密度加入HASMC。培養(yǎng)細胞2天，此時它們覆蓋孔的全部表面并產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)。隨后以2×105個細胞/cm2加入HAEC并使其生長，在2天中形成匯合HAEC的全部單層。在所有實驗中，使用的HAEC和自體HASMC(來自相同供體)具有4到6代的傳代水平。按Fogelman等(1988)J.Lipid Res.291243-1247所述從正常供體的血液分離單核細胞。共培養(yǎng)物用天然LDL(250μg蛋白質(zhì)/ml)或存在HDL(350μg蛋白質(zhì)/ml)或肽處理8小時。然后洗滌共培養(yǎng)物并用培養(yǎng)基199再培養(yǎng)8小時。按Navab等(1997)J Clin Invest，992005-2019所述測定所得共培養(yǎng)物上清的單核細胞趨化活性。
結(jié)果肽的分析表6顯示了合成的各種18A類似物的序列。在位置6和18(靠近界面Lys殘基)具有兩個Phe殘基的肽Ac-18A-NH2稱為2F。合成兩個3F肽，3F3或3F14，其中在位置3和14(均存在于非極性面的中央)的Leu分別被Phe取代。肽4F在非極性面中央具有兩個Phe殘基，它是取代兩個中央Leu殘基的結(jié)果。肽(3F到7F)上的取代在表6中顯示。隨著Phe殘基數(shù)目的增加，非極性面上每個殘基的理論疏水性從2F肽的2.05增加到7F的3.15。
表6修飾Ac-18A-NH2以增強疏水性

1基礎(chǔ)序列18A DWLKAFYDKVAEKLKEAF(SEQ ID NO2)2疏水性表示為每個非極性面上的殘基的疏水性。
3理論脂親和力按(Palgunachari等(1996)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16328-338)所示計算。
使用水(含有0.1％三氟乙酸)和乙腈(含有0.1％三氟乙酸)通過反相(RP)-HPLC在制備型Vydac C4柱上純化肽。使用在含有0.1％TFA的水中的25％-58％乙腈梯度在分析型Vydac C18柱上測定肽的純度和滯留時間。還通過質(zhì)譜法證實這些肽的純度。質(zhì)量與計算的分子量一致。肽的滯留時間在表7中列出。盡管3F肽和4F與2F相比Phe殘基增加，但是這些肽在C18柱上的滯留時間沒有很大區(qū)別(～22分鐘)。5F，6F和7F明顯在滯留時間上突然增加(～26分鐘)。隨著Phe殘基數(shù)目的增加，這些肽在PBS中的可溶性下降。從表7可見，2F，3F3，3F14和4F的溶解度(1.25到1.4mg/ml)明顯比5F，6F和7F(0.03到0.1mg/ml)更高。
表7.F-肽的物理特性

1以質(zhì)譜法測定的質(zhì)量與理論上計算的分子量非常接近。
2滯留時間是使用在33分鐘內(nèi)在含有0.1％TFA水中的25％-58％的乙腈梯度從Vydac C18柱獲得洗脫肽的時間。
3溶解度在PBS中測定。
4這些測量值的重復性是±1dyn/cm通過非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測這些兩親性肽的自我締合。圖14顯示了2F在變性SDS(圖14A)和非變性(圖14B)凝膠上的遷移率。2F的分子量是2242且可見在SDS凝膠(圖14A)上作為單條帶，以略低于最低分子量標準(3.5-2.5kDa)遷移。然而，在非變性條件下它以濃度依賴型方式形成聚集體，如圖14B所示。在較低濃度(100μg/ml)時，它形成2種大小的聚集體，而在更高濃度(250μg/ml)時，僅觀察到較大的聚集體(圖14B)。試驗的所有其它肽也表現(xiàn)出在非變性條件下聚集，這表明該肽具有強烈的自我締合傾向。
圓二色性通過圓二色性分光術(shù)測定肽的二級結(jié)構(gòu)。表8顯示了在PBS中和在DMPC存在下肽的螺旋度百分數(shù)。在PBS中，同源性2F，4F，5F，6F和7F比3F3和3F14具有更高的螺旋度百分數(shù)(表8)。由于5F，6F和7F在PBS中少量可溶，因此使用11μM的肽(在該濃度下它們?nèi)靠扇?進行CD研究。肽2F表現(xiàn)出55％的螺旋度，比得上溶液中的5F。6F和7F螺旋度略高(分別為67％和58％)，而4F略低(45％)。兩個3F肽螺旋度低得多(≈20％)。然而，與DMPC結(jié)合顯著增加了除6F外的所有肽的螺旋度(表8)。在脂類環(huán)境中，2F，5F和7F顯示出高螺旋含量(68％到76％)。盡管肽3F3和3F14在PBS中具有極小的螺旋含量，但是在脂類環(huán)境中螺旋度顯著增加，3F3從大約22％增加到42％，3F14從19％增加到55％。肽6F和4F的螺旋度在脂類存在下沒有顯著改變。然而，這些肽比肽2F和5F具有更小的螺旋度。CD結(jié)果表明隨著Phe取代的增加，肽的螺旋度沒有系統(tǒng)改變；肽2F和5F在溶液中且在磷脂存在下表現(xiàn)出最大螺旋度。
表8.F-肽在水和脂環(huán)境中的螺旋度

1使用11μM的肽溶液。使用的肽∶DMPC比率為1∶20(mol/mol)。進行3次測量且得到±10％的誤差。
用DMPC和DiPoPE的DSC研究使用100∶1脂類/肽摩爾比的肽-脂類混合物通過DSC試驗這些18A類似物對DMPC多層囊泡的解鏈轉(zhuǎn)變的影響。表9顯示了在存在和沒有肽的條件下DMPC解鏈轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)變溫度和焓。純的脂類在13℃經(jīng)歷預轉(zhuǎn)變(pretransition)且在23℃經(jīng)歷主鏈解鏈轉(zhuǎn)變。向DMPC中加入肽導致凝膠向液-晶態(tài)轉(zhuǎn)變增寬和轉(zhuǎn)變焓降低(表9)。在任一肽存在下未見預轉(zhuǎn)變。在試驗的肽中，2F，3F3，5F，和6F將轉(zhuǎn)變焓減少到最大程度(表9)。沒有肽能將轉(zhuǎn)變溫度改變超過0.2℃。
表9.F-肽對DMPC解鏈轉(zhuǎn)變參數(shù)的影響

使用的DMPC/肽比率是100∶1(mol/mol)。使用的DMPC濃度是1.5mM。TCM是發(fā)生解鏈轉(zhuǎn)變時的溫度。ΔHCM是轉(zhuǎn)變焓，ΔT1/2是轉(zhuǎn)變最大值一半的寬度。
雙分子層轉(zhuǎn)變成六角形相的轉(zhuǎn)變溫度(TH)用于評價肽對磷脂內(nèi)部彎曲特性(intrinsic curvature properties)的影響(Epand(1998)Biochim.Biophys.Acta，1376353-368)。以前顯示2F升高DiPoPE的TH(Tytler等(1993)J.Biol.Chem.26822112-22118)。在當前的研究中，我們以兩種方式制備了肽-脂類混合物。一種通過將有機溶劑中的肽加入有機溶劑中的脂類中，接著將該物質(zhì)沉積為膜并隨后與緩沖液水合。在另一方法中，在各自分別水合后混合肽和脂類。如果混合物在DSC分析前達到平衡，則最初如何混合肽和脂類都可以。然而，當肽以高濃度摻入脂膜時可能在脂中有更多的肽，膜系統(tǒng)可能平衡緩慢。一般來說，來自兩種樣品制備方法的結(jié)果是相似的(未表示)，但是對于將肽加入由脂類和肽組成的膜中的樣品，TH的轉(zhuǎn)變傾向于更大。顯示了各種肽和apo A-I的TH隨肽級分mol數(shù)的變化(圖15)。對于2F和5F觀察到TH的線型增加而4F表現(xiàn)更類似于apo A-I，其中觀察到肽濃度越低，增加越迅速。另一方面，兩個3F類似物以及6F和7F不明顯影響TH。
肽與磷脂單分子層的相互作用單分子層排出壓力πe是肽不再能夠穿透EPC單分子層時的表面壓力。πe值反映了肽的理論脂親和力。F肽的排出壓力隨Phe殘基數(shù)目的增加而增大(表7)。這里研究的所有肽比apo A-I和親本肽18A具有更高的排出壓力。πe值從2F到4F逐漸增加(38到40dyn/cm)。它在對37pA，即一種被脯氨酸打斷的18A的串聯(lián)重復可見的范圍內(nèi)。5F，6F和7F的排出壓力值顯著增加(40到45dyn/cm)。顯然以排出壓力測定時5F，6F和7F同系物具有相似的與EPC單分子層相互作用的能力。令人感興趣的是表7列出的F-肽的HPLC滯留時間和單分子層排出壓力顯示出平行的傾向，在4F和5F之間突然增加。
直角光散射如圖16所見，與不能澄清EPC MLVs的apo A-I不同，所有的肽均能澄清EPC MLVs。兩個同源3F肽在澄清EPC MLVs中效力最小。同源性肽2F，5F，6F和7F都將EPC MLVs澄清到相似的程度。肽4F在澄清EPC MLVs中最有效，具有相似于Triton X-100的活性。對于同系物4F，EPC MLVs的濁度清除50％的時間也最短。肽7F花費最長的時間完成50％的清除；這是由于有～300秒的起始延遲期(圖16)。這很可能是由于需要自我締合的7F分子在與EPC MLVs相互作用并溶解它們之前解離。同源性2F，5F和6F表現(xiàn)出的清除速率較慢也可能是由于這些肽的自我締合更高。
血漿酶LCAT的激活通過測量LCAT與作為底物的卵PC-膽固醇囊泡反應的起始速率測定這些肽激活血漿酶LCAT的能力(圖17)。LCAT激活相對于認為是100％的apo A-I表示。20μg/ml肽和apo A-I對LCAT的激活在圖4中表示。在該濃度下，apo A-I激活LCAT比任一肽都更好。然而，在這里試驗的肽中，5F是最好的激活劑(為apo A-I的80％)。對于涉及的LCAT激活，3F3和3F14具有相似的激活能力。因此，它們以一條線段表示(圖17)。
LDL-誘導的單核細胞趨化活性當LDL與人動脈壁共培養(yǎng)物系統(tǒng)溫育時，它陷入內(nèi)皮下空間并被氧化以產(chǎn)生有生物學活性的脂類。這些脂類誘導單核細胞趨化性。因此，共培養(yǎng)物單核細胞趨化性是用于生物學活性脂類形成的一個完全確定的測定法。已經(jīng)表明趨化性的抑制與負責單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)(Navab等(2000)J.Lipid Res.411481-1494；Navab等(2000)J.Lipid Res.411495-1508)和分化因子巨噬細胞集落-刺激因子(M-CSF)分泌的“種子分子”的除去直接相關(guān)。圖18顯示了與肽溫育后的LDL表現(xiàn)出不同的效果，其中同系物4F，5F和6F最能降低LDL的趨化特性。肽3F與2F和7F相比基本上無效，而后者比4F，5F和6F效力更低。
討論A型兩親性螺旋肽類似物的疏水性增強對其物理-化學和脂類結(jié)合特性的影響本文中研究的肽是親本肽18A的同系物。在非極性面上的每個殘基計算的疏水性(按照修改的GES等級(Palgunachari等(1996)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16328-338))隨Phe殘基數(shù)目的增加而增強。這種疏水性的增強(表6)反映了理論脂親和力，Λ(出處同上)。然而，Λ值從2F到4F逐漸增大(從13.03到14.59)，且該值從14.59(對于4F)突然增大到5F的19.07。5F之后對于6F和7F的值又觀察到Λ的逐漸增大(表6)。這是由于用Phe取代Ac-18A-NH2中位置3和14的Leu導致非極性面的疏水性略有增強，因此兩個3F類似物和4F的Λ值略有增加。然而，在同源性5F，6F和7F中，除了Leu取代成Phe外，11和17位的Ala也被Phe取代，導致Λ值顯著增大(表6)。因為Ala疏水性比Leu更小且Leu疏水性比Phe更小。Ala取代成Phe導致與Leu取代成Phe相比所得的肽的疏水性和理論脂親和力改變更大。
這些肽在C18反相HPLC柱上的滯留時間，可溶性及其穿透EPC單分子層的能力均表現(xiàn)出相似于在理論脂親和力值中所見的傾向(表7)。肽2F，3F3，3F14和4F的滯留時間接近相同(21-22分鐘)且明顯少于包含第二組的5F，6F和7F(26-27分鐘)。肽2F到4F的水溶性比少量可溶的同系物5F到7F明顯更高(表7)。從2F到4F觀察到排出壓力的逐漸增大，之后有一個從40dyn/cm到45dyn/cm的突然增大。肽5F，6F和7F的排出壓力互相之間沒有很大差別但明顯高于apo A-I(表7)。親本肽18A(30dyn/cm)和甚至18A的二聚體，37pA(40dyn/cm)在穿透進鋪展在氣-水界面的卵PC-單分子層中也明顯效力更小。根據(jù)上述物理特性，F(xiàn)肽可分成兩組I組是2F，3F3，3F14，4F；II組是肽5F，6F和7F。
CD數(shù)據(jù)(表8)表示在DMPC存在下所有肽的螺旋度百分數(shù)值增大，表明所有的肽均與脂類締合。這些肽與DMPC的結(jié)合似乎相似于DSC所示(表9)。然而，這些肽對DiPoPE雙分子層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定的影響不同。4F和5F似乎與DiPoPE相互作用更好，因為它們似乎是比其它肽更好的穩(wěn)定劑。
盡管apo A-I不能澄清EPC MLVs，但是所有的肽類似物都能澄清，只不過澄清到不同的程度。在易溶于水緩沖液且表現(xiàn)出單分子層排出壓力值范圍為38-40dyn/cm的I組肽(2F，3F類似物和4F)中，4F表現(xiàn)出最有效且在試驗的肽∶脂比率下表現(xiàn)出與Triton X-100相似的動力學(圖16)。盡管肽2F和3F的單分子層排出壓力相似，但是3F同系物在澄清EPC MLVs中最慢。3F同系物降低EPC澄清能力的原因現(xiàn)在還不清楚。不易溶于水緩沖液且具有表面壓力值45dyn/cm的II組肽(5F，6F和7F)溶解EPC MLVs相當緩慢。這些結(jié)果與肽聚合體必需解離然后與EPC相互作用一致。4F的高反應性可用這樣的事實解釋，即其疏水性最佳，因此有利于自我締合的疏水肽∶肽相互作用不能防止肽∶脂相互作用。
疏水性增強對LCAT激活的影響LCAT的激活是一個復雜的過程且不僅依賴于脂親和力，而且依賴于兩親性螺旋蛋白與酶LCAT的相互作用(Jonas(2000)Biochim.Biophys.Acta1529245-256)。與此一致，發(fā)現(xiàn)同源性肽激活LCAT的能力有所不同。肽5F顯示出最大LCAT-激活能力，與表7中研究的物理特性一致，其中可見包括在卵PC-水界面的排出壓力值從4F到5F突然增加。肽6F和7F不如5F一樣有效的事實可解釋為肽∶肽相互作用增強(由這些肽的低水溶性反映出來)不允許肽∶脂或肽∶LCAT相互作用。這些結(jié)果與我們以前用18A二聚體肽的觀察結(jié)果一致，其中二聚體18A-18A(36A)肽的自我締合增強與18A-Pro-18A肽相比降低了其與脂類相互作用的能力(Jonas(2000)Biochim.Biophys.Acta 1529245-256)。盡管將肽對LCAT的激活與apo A-I進行了比較，應注意apo A-I和肽與底物的相互作用不同，因為它們與EPC都具有不同的反應性(圖16)。Chung等獲得了相似的觀察結(jié)果，他們顯示了合成肽18A-Pro-18A和apo A-I與EPC的相互作用不同(Chung等(1985)J.Biol.Chem.26010256-10262)。
非極性面疏水性增強對LDL-誘導的單核細胞趨化性的影響根據(jù)我們的報道(Navab等(2000)J.Lipid Res.411481-1494；Navab等(2000)J.Lipid Res.411495-1508)，由于去掉“種子分子”依賴于肽的兩親性，我們檢查了這些肽抑制LDL-誘導的單核細胞趨化性的能力。在該試驗中，根據(jù)方差的單向分析，100μg/ml水平的肽4F，5F和6F表現(xiàn)出顯著的和相似的對LDL-誘導的趨化性的抑制。盡管同源性2F由于尚不清楚的原因表現(xiàn)出一定的抑制活性，但是肽類似物3F與單獨的LDL相比顯示出無抑制。這些結(jié)果與肽3F不能去掉脂類氫過氧化物(結(jié)果未顯示)且澄清EPC MLVs的能力降低的事實一致。肽7F比肽4F，5F和6F效力顯著更小(P＜0.001)。7F的能力降低又可解釋為肽的自我締合增強，正如在EPC MLV澄清試驗中所見，它降低了其與脂類相互作用的能力。這些結(jié)果又證實了肽的疏水性貢獻與自我締合之間存在的微妙平衡可精密地影響apo A-I-模擬特性。
體內(nèi)施用具有增強的LCAT激活能力和增強的去掉“種子分子”的能力的肽5F可防止小鼠飲食-誘導的動脈粥樣硬化。相反，施用在LCAT激活能力方面相似于4F，但在從LDL去掉“種子分子”方面比4F和5F效力更低的2F在C57BL6小鼠中不能顯著抑制飲食誘導的病灶形成(施用PBS的對照小鼠的平均病灶面積14.7±1.8μm2×10-3與施用2F的小鼠的13.2±1.7μm2×10-3相當，n＝15)。因此在該小鼠模型中，LDL-誘導的單核細胞趨化性的抑制比LCAT激活更具有致動脈粥樣化抗性。由于肽2F和4F在激活LCAT上相似，且4F和5F在去掉LDL的“種子分子”上相似，因此肽4F可用作在不同動脈粥樣硬化敏感性小鼠模型中區(qū)別LCAT激活與LDL-誘導的單核細胞趨化性的抑制的重要性的試劑。如果LDL-誘導的趨化性的抑制比LCAT-激活能力更重要，那么4F應當是用作動脈粥樣硬化抑制劑的更好的肽，因為該肽比肽5F，6F和7F肽更可溶。
實施例4肽D-4F在急性炎癥反應中維持對氧磷酶水平且抑制氧化的磷脂生產(chǎn)我們觀察到在小鼠中鼻內(nèi)滴注流感A病毒引起HDL的抗炎癥特性的時間依賴型喪失在接種7到9天后達到最大值。選擇的劑量是不會引起病毒血癥的劑量，因此改變不是直接由病毒引起而是由于對病毒感染的宿主系統(tǒng)反應誘導的炎癥狀態(tài)引起。該反應是先天性免疫系統(tǒng)的一部分且稱為急性期反應或急相反應。
一個后果是流感感染后在小鼠的HDL中對氧磷酶和血小板激活的乙酰水解酶活性減小。由于這些HDL酶活性的損失且也由于急性期反應期間氧化劑前體蛋白與HDL的締合，HDL不再能夠防止LDL氧化且不再能夠防止LDL-誘導的由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的單核細胞趨化活性。正常HDL能夠防止LDL-誘導的由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的單核細胞趨化活性，因為正常HDL含有足夠的對氧磷酶和血小板激活的乙酰水解酶活性以破壞有生物學活性的氧化磷脂。
在本實施例中，我們證實了在流感A感染后的早期(2天)，感染的小鼠肝臟產(chǎn)生這些氧化的磷脂(圖19)且后來(感染后7到9天)這些有生物學活性的氧化磷脂出現(xiàn)在小鼠主動脈中。然而，如果用流感A病毒感染后小鼠每天注射20微克D-4F，則對氧磷酶水平不下降(圖20)且不產(chǎn)生超過背景的有生物學活性的氧化磷脂(圖21)。
這些數(shù)據(jù)表明D-4F(和/或本發(fā)明的其它肽)在流感感染或者可產(chǎn)生急性期炎癥反應的其它事件(例如，由于病毒感染，細菌感染，外傷，移植，各種自體免疫狀態(tài)等)期間通過口服或者通過注射給予已知具有冠狀動脈疾病的患者且因此我們可通過這種短期治療防止與產(chǎn)生該炎癥狀態(tài)的病變相關(guān)的心臟病和發(fā)作的發(fā)生率增加。
實施例5口服施用D-氨基酸合成的Apo A-I模擬肽顯著減少小鼠的動脈粥樣硬化從D或L氨基酸合成的Apo A-I模擬肽在體外防止低密度脂蛋白(LDL)被動脈壁細胞氧化上均有效。然而，當給LDL受體無效小鼠口服給予該肽，并分離其HDL且檢測其防止LDL體外氧化的能力時，只有從D-氨基酸合成的肽有效。從D-氨基酸合成的肽在循環(huán)中穩(wěn)定且在與高密度脂蛋白(HDL)締合的級分中發(fā)現(xiàn)。從L氨基酸合成的肽迅速降解且在尿中排出。當稱為D-4F的從D-氨基酸合成的肽每天兩次口服施用給接受西方飲食的LDL受體無效小鼠時，病灶減少79％。當加入apo E無效小鼠的飲水中時，D-4F將病灶減少84％以上。我們推定口服施用從D-氨基酸合成的apo A-I模擬肽對于預防和治療動脈粥樣硬化和由氧化脂類引起的其它慢性炎癥性疾病有用。
背景HDL-膽固醇濃度與動脈粥樣硬化冠狀動脈疾病的風險反相關(guān)(Miller和Miller(1975)Lancet，116-19)。輸注(Badimon等(1990)J Clin Invest，851234-1241)或轉(zhuǎn)基因表達(Plump等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，919607-9611)apo A-I時，已表明HDL的主要載脂蛋白防止動物模型中的動脈粥樣硬化。apo A-I防止動脈粥樣硬化形成的機制假定為包括逆向膽固醇運輸(Shah等(2001)Circulation，1033047-3050)和氧化LDL所需的低水平的氧化脂類“種子分子”的除去(Navab等(2000)J Lipid Res.411481-1494；Navab等(2000)J Lipid Res，411495-1508；Navab等(2001)Arterioslcer Thromb VascBiol.21481-488)。A型兩親性螺旋肽類似物表現(xiàn)出模擬包括除去LDL氧化所需的“種子分子”的apoA-I的一些體外特性(Navab等(2000)J Lipid Res.411481-1494；Navab等(2000)J Lipid Res，411495-1508)。最近已表明A型兩親性螺旋肽的腹膜內(nèi)給藥可防止小鼠飲食誘導的動脈粥樣硬化而不改變其血漿膽固醇水平(Garber等(2001)J Lipid Res，42545-552)。病灶的減少與HDL抑制體外LDL氧化的能力顯著提高相關(guān)(出處同上)。至今，apo A-I或apo A-I模擬肽用作藥物的主要限制是需要腸胃外途徑給藥。
諸如蛋白酶的哺乳動物酶識別從L-氨基酸合成的肽和蛋白質(zhì)，但很少識別從D-氨基酸合成的肽和蛋白質(zhì)。這里我們證實了從D-氨基酸合成的apoA-I模擬肽的特定制劑可口服給藥并顯著抑制小鼠的動脈粥樣硬化。
方法小鼠C57BL/6J背景的雌性LDL受體失效或apo E無效小鼠從JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME購買。LDL受體無效小鼠在Purina食物(RalstonPurina Co.)上維持直到它們的年齡為4周，此時轉(zhuǎn)換成西方飲食(Teklad，Madison，WI，diet #88137)共6周。apo E無效小鼠在整個研究過程中在Purina食物上維持。LDL受體無效小鼠在

所示的期間內(nèi)通過胃管飼法每天兩次接受試驗肽或載體對照。在4周齡時，將試驗肽以

所示的濃度加入一些apo E無效小鼠的飲水中且apo E無效小鼠繼續(xù)接受常規(guī)食物的飲食。
按照UCLA動物研究委員會批準的方法在麻醉狀態(tài)下從眼眶后靜脈叢對小鼠抽血。按以前所述9測量動脈粥樣硬化病灶。
脂蛋白從人類志愿者得到告知同意后和從上述小鼠血液按(Navab等(2000)JLipid Res.411481-1494，和本文實施例)所述分離LDL和HDL。
共培養(yǎng)物，LDL的細胞氧化，單核細胞分離，和單核細胞趨化性試驗按以前所述(出處同上)分離和培養(yǎng)人主動脈內(nèi)皮和平滑肌細胞。按所述方法(出處同上)測定在HDL存在和沒有的條件下LDL的細胞氧化。人血液單核細胞在得到告知同意后分離且按以前所述5測定單核細胞趨化性。
apo A-I模擬肽的合成和制備Apo A-I模擬肽按以前所述11合成，除了在一些情況下肽中的各氨基酸是氨基酸的D-立體異構(gòu)體。肽以序列Ac-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-NH2(SEQ IDNO1)(Ac-18A-NH2或2F)為基礎(chǔ)。2F或具有一級氨基酸序列Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2(SEQ ID NO5，也稱為4F)的2F的類似物用于本文報道的研究。從L-氨基酸合成的肽用L命名(例如L-4F)，從D-氨基酸合成的肽用D命名(例如，D-4F)。在某些情況下按照廠商的建議使用IODO-BEAD試劑(Pierce，Rockford，IL)對肽進行碘標記。由L-α-1-棕櫚酰-2-油?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)與有和沒有D-4F組成的脂質(zhì)體按廠商建議制備。來自小鼠血漿的完整肽的提取和檢測按Garber等(1992)Arterioscler Thromb.12886-894所述，使用反相HPLC進行。
其它方法脂蛋白的蛋白質(zhì)(Navab等(2000)J Lipid Res.411481-1494)和膽固醇(Van Lenten等(2001)Circulation，1032283-2288)含量和統(tǒng)計學分析按VanLenten等(2001)Circulation，1032283-2288所述進行，顯著性定義為P＜0.05。
結(jié)果在體外，L-2F和D-2F都能夠同等地抑制LDL氧化和LDL-誘導的在人動脈壁細胞共培養(yǎng)物中的單核細胞趨化活性(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，在體內(nèi)，如圖22A所示，口服給藥后，只有D-4F在循環(huán)中保持完整且能夠增強HDL的保護能力(圖22B)并降低LDL-誘導的單核細胞趨化活性(圖22C)?？诜┯?25I-L-4F或125I-D-4F后2小時，給予L-4F的小鼠尿的放射性比給予D-4F的小鼠尿大約高15倍(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖23證實了通過管飼法每天兩次施用D-4F在接受西方飲食的LDL受體無效小鼠中動脈粥樣硬化病灶減少79％。在接受D-4F和接受單獨的脂質(zhì)體或單獨的鹽水的LDL受體無效小鼠中總血漿膽固醇水平?jīng)]有顯著差異。D-4F組的總膽固醇為761±69mg/dl，脂質(zhì)體組為677±52mg/dl，鹽水組為699±31。平均HDL-膽固醇水平在D-4F組的73±8.7mg/dl比脂質(zhì)體組的65.9±9.2和鹽水組的67.1±6.3略高，但是這些差別沒有達到統(tǒng)計學上顯著的程度。
圖24證實了在其飲水中給予D-4F的apo E無效小鼠病灶減少84％以上且小鼠給予2.5mg/天/只小鼠或者5.0mg/天/只小鼠沒有顯著差異。不接受肽，或者接受2.5mg D-4F/只小鼠/天或者5.0mg D-4F/只小鼠/天的apo E無效小鼠之間消耗的水量(2.5ml/天/只小鼠)沒有顯著差異，在三組中apo E無效小鼠在體重，心臟重，或者肝臟重方面沒有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，血漿總膽固醇濃度在接受D-4F的apo E無效小鼠中沒有顯著差異(接受無肽的水的小鼠為478±149mg/dl，以2.5mg/只小鼠/天接受D-4F的小鼠為534±12.3mg/dl，以5.0mg/只小鼠/天接受D-4F的小鼠為579±4.6mg/dl)。平均HDL-膽固醇在接受D-4F的小鼠中略有增加但是沒有達到統(tǒng)計學上顯著的差異(接受無肽的水的小鼠為32.2±7mg/dl，以2.5mg/只小鼠/天接受D-4F的小鼠為38.7±5，且以5.0mg/只小鼠/天接受D-4F的小鼠為43.4±6mg/dl)。
討論至今為止，apo A-I和apo A-I模擬肽用作藥品受到需要腸胃外給藥的限制。在本研究中發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化病灶顯著減少，盡管總血漿膽固醇沒有顯著變化。盡管在接受D-4F的小鼠中HDL-膽固醇水平傾向于略高，但是沒有達到統(tǒng)計學上顯著的程度。這里提供的試驗表明口服施用從D-氨基酸合成的apo A-I模擬肽可用于預防和治療動脈粥樣硬化和由氧化脂類引起的其它慢性炎癥性疾病。
應明白本文所述的實施例和實施方案僅用于舉例說明的目的，在其教導下本領(lǐng)域的技術(shù)人員可提出各種修改或變化，它們應包含在本申請實質(zhì)和范圍以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引證的所有出版物，專利，和專利申請以其整體作為參考文獻在此引用以便用于所有目的。
序列表<110>加利福尼亞大學董事會(The Regcnts of the University of California)<120>用于改善動脈粥樣硬化的口服給藥的肽<130>407T-911220PC<150>US 09/896,841<151>2001-06-29<150>US 09/645,454<151>2000-08-24<160>87<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>1Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe<210>2<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>2Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe<210>3<211>18
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<223>合成或重組的A型肽<400>4Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Ala Phe<210>5<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成或重組的A型肽
<400>6Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Phe Phe<210>7<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成或重組的A型肽<400>11Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Phe Phe<210>12<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
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<400>13Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Phe Phe<210>14<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>14Glu Trp Leu Lys Leu Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Ala Phe<210>15<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成或重組的A型肽<400>29Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Leu Lys Glu Phe Phe1 5 10<210>30<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>30Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu Phe Phe1 5 10<210>31<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成或重組的A型肽<400>56Asp Trp Leu Lys Ala Phe Val Asp Lys Phe Ala Glu Lys Phe Lys Glu
1 5 10 15Ala Tyr<210>57<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>57Glu Lys Trp Lys Ala Val Tyr Glu Lys Phe Ala Glu Ala Phe Lys Glu1 5 10 15Phe Leu<210>58<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>58Asp Trp Leu Lys Ala Phe Val Tyr Asp Lys Val Phe Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Phe Phe<210>59<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
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Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Arg Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe<210>64<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>64Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Arg Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe<210>65<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成或重組的A型肽<400>66Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Arg Glu1 5 10 15Ala Phe<210>67
<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>67Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Ala Glu Lys Leu Arg Glu1 5 10 15Ala Phe<210>68<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>68Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr A sp Arg Val Ala Glu Arg Leu Lys Glu1 510 15Ala Phe<210>69<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>69Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Arg Val Ala Glu Arg Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe<210>70<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽
<400>70Asp Trp Leu Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Arg Glu1 5 10 15Ala Phe<210>71<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成或重組的A型肽<400>73Glu Trp Leu Arg Ala Phe Tyr Glu Arg Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe
<210>74<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>74Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Arg Leu Arg Glu1 5 10 15Ala Phe<210>75<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>75Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Ala Glu Arg Leu Arg Glu1 5 10 15Ala Phe<210>76<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>76Asp Trp Leu Arg Ala Phe Tyr Asp Lys yal Ala Glu Arg Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe<210>77<211>18<212>PRT<213>人工的
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<223>合成或重組的A型肽<400>77Glu Trp Leu Arg Ala Phe Tyr Glu Lys Val Ala Glu Arg Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe<210>78<211>37<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>78Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe Pro Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys20 25 30Leu Lys Glu Ala Phe35<210>79<211>37<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>79Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Phe Phe Pro Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys20 25 30Leu Lys Glu Phe Phe35<210>80<211>37<212>PRT
<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>80Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe Pro Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys20 25 30Leu Lys Glu Ala Phe35<210>81<211>37<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>81Asp Lys Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Trp Ala Lys Glu1 5 10 15Ala Phe Pro Asp Lys Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Trp20 25 30Leu Lys Glu Ala Phe35<210>82<211>37<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>82Asp Lys Trp Lys Ala Val Tyr Asp Lys Phe Ala Glu Ala Phe Lys Glu1 5 10 15Phe Leu Pro Asp Lys Trp Lys Ala Val Tyr Asp Lys Phe Ala Glu Ala20 25 30Phe Lys Glu Phe Leu
35<210>83<211>37<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>83Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Ala Phe Pro Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys20 25 30Phe Lys Glu Ala Phe35<210>84<211>37<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>84Asp Trp Leu Lys Ala Phe Val Tyr Asp Lys Val Phe Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Phe Phe Pro Asp Trp Leu Lys Ala Phe Val Tyr Asp Lys Val Phe Lys20 25 30Leu Lys Glu Phe Phe35<210>85<211>37<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<400>85Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Phe Ala Glu Lys Phe Lys Glu
1 5 10 15Phe Phe Pro Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Phe Ala Glu Lys20 25 30Phe Lvs Glu Phe Phe35<210>86<211>18<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成或重組的A型肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa是天冬氨酸或谷氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(3)<223>Xaa是色氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>Xaa是賴氨酸或精氨酸<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>Xaa是絲氨酸，蘇氨酸，丙氨酸，甘氨酸，組氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(7)<223>Xaa是色氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>Xaa是天冬氨酸或谷氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)<223>Xaa是賴氨酸或精氨酸<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(11)<223>Xaa是色氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>Xaa是天冬氨酸或谷氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>Xaa是絲氨酸，蘇氨酸，丙氨酸，甘氨酸，組氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>Xaa是色氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>Xaa是絲氨酸，蘇氨酸，丙氨酸，甘氨酸，組氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>Xaa是天冬氨酸或谷氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(18)<223>Xaa是色氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物<400>86Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa<210>87<211>18<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>合成或重組的A型肽<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa是天冬氨酸或谷氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>Xaa是天冬氨酸或谷氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>Xaa是天冬氨酸或谷氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>Xaa是天冬氨酸或谷氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(3)<223>Xaa是色氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，或α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(7)<223>Xaa是色氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，或α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(11)<223>Xaa是色氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，或α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>Xaa是色氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，或α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(18)
<223>Xaa是色氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，或α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>Xaa是賴氨酸或精氨酸<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>Xaa是賴氨酸或精氨酸<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>Xaa是賴氨酸或精氨酸<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>Xaa是賴氨酸或精氨酸<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>Xaa是絲氨酸，蘇氨酸，丙氨酸，甘氨酸，組氨酸，或其同系物或類似物<400>87Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa
權(quán)利要求
1.一種適合于口服給藥改善動脈粥樣硬化的癥狀的組合物，其中所述組合物包含下述肽，它是人apo A-I肽或人apo A-I肽的類似物，其中所述的肽具有連接到氨基末端的第一保護基團和連接到羧基末端的第二保護基團，且其中所述的肽包含多個D氨基酸殘基。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的第一保護基團和所述的第二保護基團獨立地選自乙?；?，酰胺，3到20個碳原子的烷基，F(xiàn)moc，t-boc，9-芴乙?；?，1-芴羧基，9-芴羧基，9-芴酮-1-羧基，芐氧基羰基，呫噸基(Xan)，三苯甲基(Trt)，4-甲基三苯甲基(Mtt)，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)，4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)，1，3，5-三甲基苯-2-磺?；?Mts)，4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)，甲苯磺?；?Tos)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc)，4-甲芐基(MeBzl)，4-甲氧基芐基(MeOBzl)，芐氧基(BzlO)，芐基(Bzl)，苯甲?；?Bz)，3-硝基-2-吡啶磺?；?Npys)，1-(4，4-二甲基-2，6-二偶氮亞環(huán)己基)乙基(Dde)，2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)，2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)，2-溴芐氧基羰基(2-Br-Z)，芐氧基甲基(Bom)，t-丁氧基羰基(Boc)，環(huán)己氧基(cHxO)，t-丁氧基甲基(Bum)，t-丁氧基(tBuO)，t-丁基(tBu)，乙酰基(Ac)，苯甲?；?，芐酯基，丙基，丁基，戊基，己基或三氟乙?；?TFA)。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的第一保護基團是乙?；?。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的第二保護基團是酰胺。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的肽中包含的一半以上的對映體氨基酸是D氨基酸。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的肽中包含的所有對映體氨基酸是D氨基酸。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的組合物還包含可藥用賦形劑。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的肽防止磷脂被氧化劑氧化。
9.權(quán)利要求1的組合物在制備給生物體口服施用的改善動脈粥樣硬化癥狀的藥物中的用途。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述的第一保護基團和所述的第二保護基團獨立地選自乙?；?，n的范圍從3到20的CH3-(CH2)n-CO-，或酰胺。
全文摘要
本發(fā)明提供了改善動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的新型肽(見圖23)。該肽包含至少一個A型兩親性螺旋和至少一個D－氨基酸。該肽是高度穩(wěn)定的且容易通過口服途徑給藥。
文檔編號A61P31/04GK1911439SQ200610100670
公開日2007年2月14日 申請日期2001年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月24日
發(fā)明者艾倫·M·福格爾曼, 加塔達哈里·M·阿南薩拉梅亞, 默罕穆德·納瓦布 申請人:加利福尼亞大學董事會