6] 5.柱分離：選用AB-8大孔樹脂為填充材料，裝柱，以抗肝癌中藥有效部位組合物 1號上樣，分別以3倍柱體積的水、15%乙醇、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇進行洗脫并收 集洗脫液。將15%醇洗脫和30%醇洗脫部分合并，得抗肝癌中藥有效部位組合物2號，將 60%醇洗脫、95%醇洗脫部分和步驟4下低溫避光保存的離心渣合并，得抗肝癌中藥有效 部位組合物3號。
[0037] 實施例2 :實施例1的活性實驗
[0038] 在本實施例中，通過實驗證明了抗肝癌中藥有效部位組合物1號、2號和3號在抗 肝癌方面均具有良好的效果，以2號和3號效果較好。
[0039] 1材料與方法
[0040] I. 1受試藥品
[0041] 名稱：抗肝癌中藥有效部位組合物1號、2號和3號。
[0042] L 2細胞株：
[0043] HSC-T6 細胞株。
[0044] L 3主要試劑
[0045] 糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT)、二甲基 亞砜（DMSO)和胰蛋白酶均購自美國Sigma公司。
[0046] L 4實驗方法
[0047] 1. 4. 1細胞培養(yǎng)
[0048] 將HSC-T6細胞株復蘇后接種于含體積分數(shù)10%的胎牛血清。青霉素、鏈霉素各 為100U/mL，谷氨酰胺濃度為0. 3g/L，用2. 38g/L H印es調高糖DMEM培養(yǎng)液的pH至6. 8,置 37°C、飽和濕度、體積分數(shù)5 % C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞生長至鋪滿瓶底60 %面積時，用 2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA消化30s至Imin后以1:2傳代，24h換液，72h再次傳代。
[0049] 1. 4. 2三個樣品對HSC-T6細胞半數(shù)抑制濃度測定
[0050] 將傳代的HSC-T6以I. 0 X 105/mL的密度0,1mL接種于96孔板中，置37°C、飽和濕 度、體積分數(shù)5% (1)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后將抗肝癌中藥有效部位組合物1號、2號和3號 分別以400、200、100、50、25. 0、12. 5、6. 25g/L藥物濃度，按0,1mL/孔加入培養(yǎng)孔，各組均設 6個復孔。加藥后48h，輕輕吸去上清，其后用MTT法，在酶標儀測定吸光度（OD)值（490nm) 并取其均數(shù)，計算細胞增殖抑制率Φ增殖抑制（％) = (D空白對照組-D實驗組）/D空白 對照組X 100%，采用Logit法計算抗肝癌中藥有效部位組合物1號、2號和3號對HSC-T6 細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50) :IC50 = Antilog[(50-BV(A-B) XC+LgC]，其中 A :>50%抑制 率；B :〈50%抑制率；C = Lg>50%的濃度-Lg〈50%的濃度。
[0051] 2.結果
[0052] 藥物作用48h，抗肝癌中藥有效部位組合物1號、2號和3號的IC50濃度分別為 128. 173、90· 734、7L 003mg/mL，實驗數(shù)據(jù)見表 1。
[0053] 3.結論
[0054] 在IC50范圍內(nèi)，抗肝癌中藥有效部位組合物1號、2號和3號對肝星狀細胞 (HSC-T6)增殖均有較好的抑制作用，以抗肝癌中藥有效部位組合物2號和3號作用較為顯 著。
[0055] 表1抗肝癌中藥有效部位組合物1號、2號和3號對肝星狀細胞（HSC-T6)增殖的 影響
【主權項】
1. 一種抗肝癌的中藥有效部位組合物的制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 原料藥配制：按如下重量百分比的組分進行配制：葉下珠5-30%，苦參5-20%，溪 黃草5-30%，三七4-10 %，丹參5-25%，桃仁4-15%，柴胡4-10 %，女貞子5-25 %，旱連草 5-25 %，太子參 2-25 %，甘草 2-10 % ; (2) 制備方法：采用壓差式提取與多級膜分離濃縮組合提取，最后用柱分離精制。
2. 根據(jù)權利要求1所述的抗肝癌的中藥有效部位組合物的制備方法，其特征在于，步 驟（2)所述壓差式提取是指使用壓差式提取器進行提取，所述壓差式提取器是指專利號為 200420102481. 9的中國實用新型專利所記載的壓差式提取器。
3. 根據(jù)權利要求1所述的抗肝癌的中藥有效部位組合物的制備方法，其特征在于，所 述多級膜分離濃縮是指微濾與反滲透的組合。
4. 根據(jù)權利要求1所述的抗肝癌的中藥有效部位組合物的制備方法，其特征在于，所 述柱分離精制是指吸附樹脂柱分離。
5. 根據(jù)權利要求1所述的抗肝癌的中藥有效部位組合物的制備方法，其特征在于，包 括如下步驟： (1) 將原料藥切段，粉碎，加入5~15倍重量50%的乙醇，勻漿，離心，得到離心液和離心 澄，離心渣再用5~15倍重量50%的乙醇，攪拌，離心，得到離心液和離心澄，棄去離心澄，合 并兩次離心液； (2) 將步驟（1)制得的離心液依次經(jīng)500nm無機陶瓷膜微濾，然后先反滲透濃縮至相 當于每升濃縮液中含〇. 8~1. 2kg原料藥，再回收乙醇并真空濃縮成相當于每升浸膏中含 I. 5~2kg原料藥的濃縮液； (3) 將步驟（2)所得濃縮液離心得到離心液和離心渣，離心渣加純水洗3遍并分別離 心，將所有離心清液合并濃縮即得到抗肝癌中藥有效部位組合物1號，實驗結束后所剩下 的離心渣置〇~l〇°C下低溫避光保存； (4) 以步驟（3)所得的抗肝癌中藥有效部位組合物1號作為待純化材料，利用中等極性 大孔樹脂裝柱并對抗肝癌中藥有效部位組合物1號進行吸附，然后依次用水、15%乙醇、30% 乙醇、60%乙醇和95%乙醇進行洗脫并收集洗脫液； (5) 將15%醇洗脫和30%醇洗脫部分合并，得抗肝癌中藥有效部位組合物2號，將60% 醇洗脫、95%醇洗脫部分和步驟（3)低溫避光保存的離心渣合并，得抗肝癌中藥有效部位組 合物3號。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗肝癌的中藥有效部位組合物的制備方法，包括如下步驟：（1）原料藥配制：按如下重量百分比的組分進行配制：葉下珠5-30％，苦參5-20％，溪黃草5-30％，三七4-10％，丹參5-25％，桃仁4-15％，柴胡4-10％，女貞子5-25％，旱連草5-25％，太子參2-25％，甘草2-10％；（2）制備方法：采用壓差式提取與多級膜分離濃縮組合提取，最后用柱分離精制。本發(fā)明采用壓差式提取結合多級膜分離濃縮制備抗肝癌中藥提取組合物并利用吸附樹脂柱分離精制有效部位，有效的去除了大部分雜質并在保證療效的基礎上降低了患者的服藥量，為中藥的發(fā)展及生產(chǎn)提供了新思路。該有效部位可清熱解毒，活血化瘀，疏肝解郁，健脾補腎，抑制腫瘤生長。
【IPC分類】A61P1-16, A61K36-736, A61P35-00
【公開號】CN104586990
【申請?zhí)枴緾N201510050453
【發(fā)明人】劉鄉(xiāng)鄉(xiāng), 宋力飛, 彭憲, 周紹春
【申請人】廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司, 廣州中澤生物技術有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月30日