21天和第28天評價大鼠致炎側(cè)足腫脹程度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)。給藥28天后，麻醉情況下取血，測外周血淋巴細胞和中性細胞。分離血清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)測血清中白介素6 (IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α )和前列腺素2(PGE2)的含量。大鼠踝關(guān)節(jié)固定于10%福爾馬林內(nèi)，經(jīng)1096EDTA脫鈣后常規(guī)石蠟包埋，制片，HE染色，由病理專業(yè)人員閱片，觀察關(guān)節(jié)滑膜組織、關(guān)節(jié)骨、軟骨組織損傷程度進行評分比較。
[0036]實驗結(jié)果
延胡索總生物堿對大鼠足腫脹程度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響
以致炎前大鼠足體積與給藥后大鼠足體積的差值(AmL)來衡量大鼠足腫脹的程度。如表I所示，與正常組對比，模型組大鼠致炎測足部顯著腫脹(P < 0.05)。與模型組相比較，延胡索總生物堿高低劑量組均顯著抑制大鼠關(guān)節(jié)腫脹(P < 0.05)。
[0037]表1.延胡索總生物堿、去氫延胡索甲素對大鼠致炎側(cè)足體積變化的影響組別致炎側(cè)足體積變化(Λ mL)
第7天， 第14天， 第21天， 第28天正常組，0.16±0.03， 0.15±0.01，0.14±0.04， 0.15±0.01
模型組，2.52±0.17， 2.25±0.23，2.31±0.24， 2.12±0.35
陽性藥組，1.23±0.08， 1.13±0.15，0.98±0.07， 0.86±0.15
延胡索總生物堿，1.21±0.12*， 1.11±0.53*，0.45±0.08*，0.37±0.21*
去氫延胡索甲素，0.76±0.02*， 0.58±0.03*，0.39±0.03*，0.29±0.05*
綠原酸去氫延胡索甲素，0.65±0.02*， 0.42±0.02*，0.36±0.03*，0.19±0.05*
*為與模型組比較具有顯著性差異(P < 0.05)
大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)采用通用的5分標準，即O分為無改變，I分為踝骨部有腫脹，2分為踝骨部和跗骨部均有腫脹，3分為腫脹延伸至跖骨部，4分為整個后足腫脹明顯。每只受試大鼠的關(guān)節(jié)炎評分最高分為8分，即兩只后足評分的加和。如表2所示，與模型組比較，延胡索總生物堿的高低劑量組均顯著降低大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(P < 0.05)。
[0038]表2.延胡索總生物堿、去氫延胡索甲素對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響組別關(guān)節(jié)炎指數(shù)
第7天，第14天， 第21天，第28天模型組，5.23±0.75,6.89±0.56,5.56±0.21,4.32±0.60
陽性藥組，4.12±0.32,2.78±0.69,2.14±0.23，1.52±0.53
延胡索總生物堿，3.21±0.11*, 4.17±0.24*, 3.14±0.21*, 2.17±0.24*
去氫延胡索甲素，2.42±0.23*, 2.13±0.16*, 2.03±0.14*，1.42±0.18*
綠原酸去氫延胡索甲素，2.14±0.17*，1.86±0.12*，1.87±0.12*，1.26±0.15*
*為與模型組比較具有顯著性差異(P < 0.05)
延胡索總生物堿、去氫延胡索甲素對大鼠外周血淋巴細胞和中性細胞的影響如表3所示，與正常組比較，模型組大鼠外周血淋巴細胞顯著降低(P < 0.05)，中性細胞顯著升高(P < 0.05)。延胡索總生物堿高低劑量組與模型組比較，外周血淋巴細胞均顯著升高，中性細胞均顯著降低。
[0039]表3.延胡索總生物堿對大鼠外周血淋巴細胞和中性細胞的影響組別，淋巴細胞計數(shù)(106)，中性細胞計數(shù)(106)
正常組，156.21±5.52，45.75±2.52
模型組，79.22±2.45，102.87±6.02
陽性藥組，115.52±6.38， 68.13±1.96
延胡索總生物堿，137.84±7.28*， 59.12±1.36*
去氫延胡索甲素，145.31±2.14*， 51.25±1.52*
綠原酸去氫延胡索甲素，158.76±2.35*， 42.13±1.79*
*為與模型組比較具有顯著性差異(P < 0.05)
延胡索總生物堿、去氫延胡索甲素對大鼠血清IL-6、TNF- α和PGE2含量的影響模型組大鼠血清中IL-6、TNF-a和PGE2的含量與正常組比較顯著性提高(P < 0.05)。延胡索總生物堿提取物、去氫延胡索甲素大鼠血清中IL-6、TNF_a和PGE2的水平與模型組對比，均顯著性降低(P < 0.05)。。
[0040]表4.延胡索總生物堿對大鼠血清IL-6、TNF- α和PGE2含量的影響組別，IL-6 (pg/mL)TNF-a (pg/mL) PGE2 (pg/mL)
正常組，35.78±1.23， 51.24±1.89，31.48±2.56
模型組，78.14±3.26， 121.3±5.31，98.45±4.23
陽性藥組，38.79±1.75， 87.56±4.89，56.21 ±3.75
延胡索總生物堿，4L31±2.46*， 78.32±3.56*， 48.45土 L 39*
去氫延胡索甲素，38.18±1.29*， 62.17±1.78*，42.17±1.81*
綠原酸去氫延胡索甲素，36.72±1.26*， 53.26±1.26*， 36.12±1.27*
*為與模型組比較具有顯著性差異(P < 0.05)
延胡索總生物堿、去氫延胡索甲素對大鼠關(guān)節(jié)病理變化的影響大鼠踝關(guān)節(jié)固定于10%福爾馬林內(nèi)，經(jīng)1096EDTA脫鈣后常規(guī)石蠟包埋，制片，HE染色，由病理專業(yè)人員閱片，觀察關(guān)節(jié)滑膜組織、關(guān)節(jié)骨、軟骨組織損傷程度進行評分比較。根據(jù)各部位病變輕重程度，依次定量為O至4分。I分(輕度)，2分(中度)，3分(重度)，4分(極重度)，0分(基本正常)。累加所有分數(shù)，得出每組平均分數(shù)。
[0041]結(jié)果顯示，正常組大鼠的滑膜表面覆有1-4層滑膜細胞，無明顯變性、壞死，無增生。關(guān)節(jié)面骨和軟骨組織無變性、壞死。周圍皮膚未見炎癥反應。
[0042]模型組大鼠的滑膜細胞中度變性，滑膜組織中度充血，內(nèi)有炎細胞浸潤，炎細胞類型主要為單核巨噬細胞和中性粒細胞。真皮及皮下組織內(nèi)有大量炎細胞浸潤，炎細胞類型主要為單核巨噬細胞、淋巴細胞及少量中性粒細胞。
[0043]與模型組比較，延胡索總生物堿、去氫延胡索甲素均顯著減輕關(guān)節(jié)炎病變。
[0044]表5.延胡索總生物堿、去氫延胡索甲素對大鼠關(guān)節(jié)病理變化的影響組別動物只數(shù)病理變化評分
正常組，10，0.00±0.00
模型組，10，6.00±0.36
陽性藥組，10，1.89±0.42
延胡索總生物堿，10，1.23±0.14*
去氫延胡索甲素，10, 0.87±0.12*
綠原酸去氫延胡索甲素，10, 0.72±0.16*
為與模型組比較具有顯著性差異(P < 0.05)
實施例7去氫延胡索甲素的薄層色譜法鑒定薄層色譜法:
吸附劑:硅膠G薄層預制板(青島)；
展開劑:乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-氨水(10: 3: 1.5: 2: 1)，
實施例2樣品I μ L點板，
展開溫度室溫，展開前預飽和15min,展距1cm,
取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。
[0045]7.2 cm僅出現(xiàn)唯一的斑點。
[0046]實施例8高效液相色譜法:
色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；島津液相儀流動相為乙腈-1%甲酸水溶液(20: 80體積比)，等度洗脫；
流速1.0mL/min ;柱溫30°C ;檢測波長280nm。
[0047]在上述條件下，分別吸取實施例2樣品(流動相溶液)10 μ L，注入高效液相色譜儀進行分析，
該圖譜中I個色譜峰，出峰時間20.12分鐘，峰面積789563.35AU。
【主權(quán)項】
1.一種延胡索的制藥用途，特征在于延胡索在制備抗類風濕性關(guān)節(jié)炎疼痛藥物中的應用。
2.一種延胡索總生物堿的制藥用途，特征在于延胡索總生物堿在制備抗類風濕性關(guān)節(jié)炎及疼痛藥物中的應用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于:所述的去氫延胡索甲素來源于延胡索總生物堿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于:取延胡索生藥，加入鹽酸溶液加熱提取，合并提取液，過濾，減壓濃縮，調(diào)節(jié)PH值至堿性，繼而用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯，繼而用石油醚萃取，棄去石油醚層，回收溶劑至干，精制，得去氫延胡索甲素。
5.一種治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其特征在于:是由有效量的去氫延胡索甲素為活性成分，加上藥學上課接受的輔料或輔助性成分制備成常用的藥物制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于:所述的制劑為口服制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于:綠原酸l_20mg，去氫延胡索甲素10-40mgo
【專利摘要】本發(fā)明提供了延胡索提取物在制備治療類風濕關(guān)節(jié)炎及疼痛中的用途及其藥物組合物。
【IPC分類】A61K31-216, A61K36-66, A61K31-4375, A61P19-02, A61P29-00, C07D455-03
【公開號】CN104547053
【申請?zhí)枴緾N201510035008
【發(fā)明人】王小華
【申請人】王小華
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月25日