專利名稱：與丙型肝炎病毒感染相關(guān)的疾病或狀態(tài)的酶性核酸治療的制作方法
本專利申請(qǐng)要求1999年2月24日提交的Blatt等，USSN(尚未有申請(qǐng)?zhí)?、1998年9月18日提交的Blatt等，USSN 60/100,842以及1998年4月27日提交的McSwiggen等，USSN 60/083,217的優(yōu)先權(quán)，所有這些在先申請(qǐng)均以“與丙型肝炎病毒感染相關(guān)的疾病或狀態(tài)的酶性核酸治療”為標(biāo)題。此處這些申請(qǐng)包括圖整個(gè)均被引入作為參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于治療與丙型肝炎病毒感染相關(guān)的疾病或狀態(tài)的方法和試劑。
下面是相關(guān)技術(shù)的討論，其中無一被認(rèn)為是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
在1989年，HCV被確定為一種RNA病毒而且被認(rèn)為是大多數(shù)非甲非乙型病毒性肝炎的病因(Choo等，科學(xué)1989；244:359-362)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒例如HIV不同，HCV不經(jīng)過DNA復(fù)制相，而且在宿主染色體中未檢測(cè)到病毒基因組的整合形式(Houghton等，肝臟病學(xué)(Hepatology)1991；14:381-388)。相反，編碼(正)鏈的復(fù)制是通過形成一個(gè)復(fù)制(負(fù))鏈來介導(dǎo)的，復(fù)制鏈的形成導(dǎo)致產(chǎn)生數(shù)個(gè)拷貝的正鏈HCV RNA?；蚪M由一個(gè)單一的大開放閱讀框所組成，其翻譯成一個(gè)多聚蛋白(Kato等，F(xiàn)EBS Letters 1991:280:325-328)。隨后該多聚蛋白經(jīng)過翻譯后切割，產(chǎn)生幾種病毒蛋白(Leinbach等，病毒學(xué)(Virology)1994；204:163-169)。
對(duì)HCV的9500個(gè)堿基的基因組進(jìn)行的檢測(cè)證實(shí)病毒核酸能夠以高的頻率發(fā)生突變(Smith等，分子進(jìn)化(Mol.Evol.)1997；45:238-246)。這種突變率導(dǎo)致進(jìn)化成幾種不同基因型的HCV，這些基因型的HCV之間擁有大約70％的序列相同性(Simmonds等，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)1994；75:1053-1061)。注意這些序列在進(jìn)化上是相當(dāng)遙遠(yuǎn)的，這很重要。例如，在人和靈長類如黑猩猩之間的遺傳相同性大約為98％。此外，已經(jīng)證實(shí)，在單個(gè)患者中的一次HCV感染是由幾種不同的且不斷進(jìn)化的準(zhǔn)種所組成，這些準(zhǔn)種在RNA水平上具有98％的相同性。因此，HCV基因組是高度可變的而且不斷在改變。雖然HCV基因組是高度可變的，但基因組中存在3個(gè)高度保守的區(qū)域。這些保守的序列出現(xiàn)在5’和3’非編碼區(qū)以及核心蛋白編碼區(qū)的5’端，而且它們被認(rèn)為是HCV RNA復(fù)制和HCV多聚蛋白翻譯的關(guān)鍵。因此，針對(duì)這些保守的HCV基因組區(qū)域的治療劑可能對(duì)很多種HCV基因型具有顯著的效果。此外，對(duì)特異性針對(duì)HCV基因組保守區(qū)域的核酶發(fā)生藥物抗性是不太可能的。相反，以對(duì)酶例如病毒蛋白酶或螺旋酶進(jìn)行抑制為目的的治療方式，則因?yàn)檫@些病毒編碼酶的RNA位于HCV基因組的高度可變區(qū)內(nèi)而易導(dǎo)致耐藥株的篩選。
在最初暴露于HCV后，患者經(jīng)過一個(gè)短暫的肝臟酶升高，其表示炎癥過程正在發(fā)生(Alter等，IN:SeeffLB,Lewis JH編，現(xiàn)代肝臟病學(xué)(CurrentPerspectives in Hepatology)，紐約Plenum Medical Book Co；1989:83-89)。這種肝臟酶的升高將在最初暴露的至少4周后發(fā)生，并可以持續(xù)長達(dá)2個(gè)月(Farci等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New England Journal of Medicine)1991；325:98-104)。在肝臟酶升高前，利用RT-PCR分析在患者血清中可能會(huì)檢測(cè)到HCV RNA(Takahashi等，美國胃腸病學(xué)雜志(American Joumal ofGastroenterology)1993；88:2:240-243)。疾病的該階段被稱為急性期，而且由于HCV感染所致急性病毒性肝炎患者75％是無癥狀的而通常未檢測(cè)到。其余25％的患者發(fā)展為黃疸或其它肝炎癥狀。
急性HCV感染是一種良性的疾病，然而多達(dá)80％的急性HCV患者進(jìn)展為慢性肝臟疾病，其表現(xiàn)為血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平的持續(xù)升高和循環(huán)HCV RNA的持續(xù)存在(Sherlock，柳葉刀(Lancet)1992；339:802)。慢性HCV感染在10到20年間的自然進(jìn)展導(dǎo)致20％至50％的患者發(fā)生肝硬化(Davis等，傳染性因子和疾病(Infectious Agents and Disease)1993；2:150-154)，而且有許多資料證實(shí)HCV感染進(jìn)展為肝細(xì)胞癌(Liang等，肝臟病學(xué)1993；18:1326-1333；Tong等，西方醫(yī)學(xué)雜志(Westem Joumal ofMedicine)1994；160卷，第2期133-138)。尚沒有研究來確定最可能進(jìn)展為肝硬化和/或肝細(xì)胞癌的亞人群，因此所有患者都有同等的風(fēng)險(xiǎn)。
重要的是需指出被診斷為肝細(xì)胞癌的患者的生存期僅為在最初診斷之后0.9到12.8個(gè)月(Takabashi等，美國胃腸病學(xué)雜志1993；88:2:240-243)。用化學(xué)治療劑對(duì)肝細(xì)胞癌進(jìn)行治療不能證實(shí)是有效的，而且由于肝臟中廣泛的腫瘤侵襲僅有10％的患者會(huì)從外科手術(shù)中獲益(Trinchet等，PresseMedicine 1994；23:831-833)。由于原發(fā)性肝細(xì)胞癌的侵襲特性，除了外科手術(shù)外唯一可行的療法是肝臟移植(Pichlmayr等，肝臟病學(xué)1994；20:33S-40S)。
在向肝硬化進(jìn)展的過程中，慢性HCV感染的患者表現(xiàn)出臨床特征，如果不考慮起因這是臨床肝硬化中常見的(D’Amico等，消化性疾病和科學(xué)(Digestive Diseases and Sciences)1986；31:5:468-475)。這些臨床特征可能包括出血性食管曲張、腹水、黃疸和腦病(Zakim D,Boyer TD，肝臟病學(xué)肝臟疾病教科書(Hepatology atextbook ofliver disease)第二版，第一卷。1990 W.B.Saunders Company.費(fèi)城)。在肝硬化的早期，將患者歸類為代償性肝硬化，其意指雖然發(fā)生了肝臟組織損傷，但患者的肝臟仍能夠?qū)ρ髦械拇x物進(jìn)行解毒。此外，大多數(shù)具有代償性肝臟疾病的患者是無癥狀的，而少數(shù)有癥狀的僅報(bào)告為輕微的癥狀，例如消化不良和虛弱。在肝硬化的晚期，將患者歸類為失代償性肝硬化，意指其對(duì)血流中代謝物解毒的能力降低，而且正是在該階段上述的臨床特征將表現(xiàn)出來。
在1986年，D’Amico等描述了1155名嗜酒和病毒相關(guān)的肝硬化患者的臨床表現(xiàn)和生存率(D’Amico，同上)。在1155名患者中，雖然在研究開始時(shí)70％無癥狀，但435名(37％)具有代償性疾病。其余的720名患者(63％)具有失代償性肝臟疾病，其中78％表現(xiàn)為具有腹水史，31％有黃疸，17％有出血而16％有腦病。在6名(0.5％)具有代償性疾病的患者中以及在30(2.6％)名具有失代償性疾病的患者中觀察到肝細(xì)胞癌。
在6年中，具有代償性肝硬化的患者以每年10％的比例發(fā)展出失代償性疾病的臨床特征。在大多數(shù)情況下，腹水是失代償?shù)牡谝粋€(gè)表現(xiàn)。此外，59名最初表現(xiàn)為代償性疾病的患者到6年的研究結(jié)束時(shí)發(fā)展為肝細(xì)胞癌。
至于生存率，D’Amico的研究表明研究中所有患者的5年生存率僅為40％。對(duì)于最初具有代償性肝硬化的患者6年生存率為54％，而對(duì)于最初具有失代償性疾病的患者6年生存率僅為21％。在嗜酒性肝硬化的患者和病毒相關(guān)肝硬化的患者之間生存率無顯著差別。在D’Amico的研究中患者的主要死因包括肝臟衰竭占49％，肝細(xì)胞癌占22％以及出血占13％(D’Amico同上)。
慢性丙型肝炎是肝臟的一種緩慢進(jìn)展的炎癥性疾病，由一種病毒(HCV)介導(dǎo)，其在10到20年的時(shí)間內(nèi)可以導(dǎo)致肝硬化、肝臟衰竭和/或肝細(xì)胞癌。在美國，據(jù)估計(jì)HCV感染是美國每年50,000例急性肝炎新增病例的原因(NIH Consensus Development Conference Statement on Management ofHepatitis C,1997年3月)。據(jù)估計(jì)HCV在美國的發(fā)病率為1.8％,CDC估計(jì)慢性感染的美國人的數(shù)量為大約450萬人。CDC還估計(jì)由慢性HCV感染引起每年高達(dá)10,000例的死亡人數(shù)。
很多嚴(yán)格控制的在慢性HCV感染的治療中利用干擾素(IFN-α)的臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，每周3次的治療在6個(gè)月的療程結(jié)束時(shí)使大約50％(從40％至70％)的病人血清ALT值降低(Davis等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志1989；321:1501-1506；Marcellin等，肝臟病學(xué)1991；13:393-397；Tong等，肝臟病學(xué)1997；26:747-754；Tong等，肝臟病學(xué)1997；26(6)1640-1645)。然而，在干擾素治療停止后，大約50％的反應(yīng)患者復(fù)發(fā)，導(dǎo)致通過血清ALT濃度的標(biāo)準(zhǔn)化所評(píng)價(jià)的“持久”的應(yīng)答率大約為20至25％。
近幾年，通過利用分支DNA或逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析對(duì)HCV RNA進(jìn)行直接檢測(cè)已經(jīng)成為可能。通常，RT-PCR方法更靈敏，而且能夠?qū)εR床過程進(jìn)行更精確的評(píng)價(jià)(Tong等，同上)。利用HCV RNA值的改變作為臨床終點(diǎn)，對(duì)6個(gè)月的I型干擾素治療進(jìn)行觀察的研究表明高達(dá)35％的患者在治療結(jié)束時(shí)檢測(cè)不到HCV RNA(Marcellin等，同上)。然而，若以ALT為終點(diǎn)，大約50％的患者在停止治療后6個(gè)月復(fù)發(fā)，使持久的病毒學(xué)應(yīng)答僅為12％(Marcellin等，同上)。對(duì)48周的治療進(jìn)行觀察的研究表明持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答高達(dá)25％(NIH consensus statement:1997)。因此，目前用I型干擾素治療慢性HCV感染的治療標(biāo)準(zhǔn)為48周，并利用HCV RNA濃度的改變作為對(duì)療效的主要評(píng)價(jià)(Hoofnagle等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志1997；336(5)347-356)。
由I型干擾素治療所導(dǎo)致的副作用可以分為4大類，包括1．流感樣癥狀；2．神經(jīng)精神副作用；3．實(shí)驗(yàn)室異常；以及4．其他(Dusheiko等，病毒性肝炎雜志(Joumal of Viral Hepatitis)1994；1:3-5)。流感樣癥狀的實(shí)例包括疲勞、發(fā)熱、肌痛、不適、食欲減退、心動(dòng)過速、僵直、頭痛和關(guān)節(jié)痛。流感樣癥狀通常是短暫的，而且在給藥的頭4周后趨于減輕(Dushieko等，同上)。神經(jīng)精神副作用包括易怒、淡漠、情緒改變、失眠、認(rèn)知改變和抑郁。這些神經(jīng)精神副作用中最重要的是抑郁，有抑郁史的患者不應(yīng)給予I型干擾素。實(shí)驗(yàn)室異常包括髓系細(xì)胞減少，包括粒細(xì)胞、血小板以及少量的紅細(xì)胞。血細(xì)胞數(shù)量的這些改變很少導(dǎo)致任何顯著的臨床后遺癥(Dushieko等，同上)。此外，已觀察到甘油三酯濃度的增加以及血清丙氨酸和天冬酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶濃度的升高。最后，甲狀腺異常也已被報(bào)道。這些甲狀腺異常在干擾素治療停止后通常可逆轉(zhuǎn)，而且在治療中可以用適當(dāng)?shù)乃幬飳?duì)其進(jìn)行控制。其他副作用包括惡心、腹瀉、腹痛和背痛、瘙癢、脫發(fā)和鼻漏。通常，大部分副作用將在4至8周的治療后減輕(Dushieko等，同上)。
Welch等，基因治療(Gene Therapy)1996；3(11):994-1001描述了用表達(dá)針對(duì)丙型肝炎病毒的發(fā)夾型核酶的兩種載體進(jìn)行的體外和體內(nèi)研究。
Sakamoto等，臨床研究雜志(J.Clinical Investigation)1996；98(12):2720-2728描述了由某些表達(dá)錘頭型核酶的載體對(duì)丙型肝炎病毒RNA的細(xì)胞內(nèi)切割和對(duì)病毒蛋白翻譯的抑制。
Lieber等，病毒學(xué)雜志(J.Virology)1996；70(12):8782-8791描述了通過腺病毒介導(dǎo)的對(duì)某些錘頭型核酶的表達(dá)使被丙型肝炎病毒感染的肝細(xì)胞中的該病毒RNA清除。
Ohkawa等，1997，肝臟病學(xué)雜志(J.Hepatology),27；78-84描述了利用某些體外轉(zhuǎn)錄的錘頭型核酶對(duì)HCV RNA的體外切割和病毒蛋白翻譯的抑制。
Barber等，PCT國際公開號(hào)WO 97/32018描述了利用腺病毒載體來表達(dá)某些抗丙型肝炎病毒的發(fā)夾型核酶。
Kay等，PCT國際公開號(hào)WO 96/18419描述了利用某些重組腺病毒載體來表達(dá)抗HCV錘頭型核酶。
Yamada等，日本專利申請(qǐng)第JP 07231784號(hào)描述了一個(gè)特異性多聚-(L)-賴氨酸連接的針對(duì)HCV的錘頭型核酶。
Draper，美國專利第5,610,054號(hào)描述了能夠抑制HCV復(fù)制的酶性核酸分子。
Alt等，肝臟病學(xué)1995；22(3):707-717描述了由某種反義硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸對(duì)丙型肝炎病毒基因表達(dá)的特異性抑制。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及核酶或酶性核酸分子，其被引導(dǎo)來切割丙型肝炎病毒(HCV)和/或由HCV編碼的RNA樣品。特別是申請(qǐng)人描述了能夠特異性切割HCVRNA的核酶的篩選和功能。此類核酶可被用于治療同HCV感染相關(guān)的疾病。
由于HCV基因組序列的高度可變性，用于廣泛治療用途的核酶的篩選可能涉及HCV基因組的保守區(qū)。具體地，本發(fā)明描述了可以在HCV基因組的保守區(qū)中切割的錘頭型核酶。一系列30個(gè)源自HCV基因組保守區(qū)(5’-非編碼區(qū)(NCR)、核心蛋白編碼區(qū)的5’端以及3’-NCR)的錘頭型核酶示于表Ⅳ中。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)通常切割位點(diǎn)位于HCV基因組5’端的酶性核酸分子可以阻斷翻譯，而切割位點(diǎn)位于基因組3’端的核酶可以阻斷RNA復(fù)制。已經(jīng)鑒定出大約50個(gè)HCV分離株，并對(duì)基因型1a、lb、2a、2b、2c、3a、3b、4a、5a和6的這些分離株進(jìn)行了序列的對(duì)齊排列。申請(qǐng)人利用這些對(duì)齊排列來在各基因型之間的高度保守區(qū)域內(nèi)確定30個(gè)錘頭型核酶位點(diǎn)。在保守區(qū)內(nèi)最同源的區(qū)域中鑒別出23個(gè)核酶位點(diǎn)。因此，可以設(shè)計(jì)一個(gè)核酶來切割所有不同的HCV分離株。根據(jù)申請(qǐng)人所述，針對(duì)各種HCV分離株的保守區(qū)設(shè)計(jì)的核酶將能夠在多樣的患者群中有效抑制HCV的復(fù)制，并且可以保證針對(duì)HCV準(zhǔn)種的核酶的有效性，所述的HCV準(zhǔn)種由于在HCV基因組非保守區(qū)中的突變而進(jìn)化。
“抑制”意指使HCV的活性或由HCV基因組所編碼的RNA的水平低于在沒有核酸的情況下所觀察到的水平，特別是通過核酶的抑制優(yōu)選低于無活性RNA分子(能結(jié)合mRNA上相同位點(diǎn)而不能切割該RNA)存在時(shí)所觀察到的水平。
“酶性核酸”意指一種能夠催化反應(yīng)的核酸分子，所述的催化反應(yīng)包括，但不限于，位點(diǎn)特異性切割和/或其它核酸分子的連接、肽和酰胺鍵的切割以及反式剪接。此類具有核酸內(nèi)切酶活性的分子可能在底物結(jié)合區(qū)中對(duì)特定的基因靶標(biāo)具有互補(bǔ)性，而且還具有在該靶標(biāo)中特異性切割RNA或DNA的酶促活性。也就是說，具有核酸內(nèi)切酶活性的核酸分子能夠在分子內(nèi)或分子間切割RNA或DNA，由此滅活靶RNA或DNA分子。該互補(bǔ)性使酶性RNA分子同靶RNA或DNA可以充分雜交，以使切割能夠發(fā)生。優(yōu)選100％的互補(bǔ)性，但在本發(fā)明中互補(bǔ)性低至50-75％可能也是有效的?？梢栽趬A基、糖和/或磷酸集團(tuán)處對(duì)核酸進(jìn)行修飾。術(shù)語酶性核酸分子與短語例如核酶、催化性RNA、酶性RNA、催化性DNA、催化性寡核苷酸、nucleozyme、DNA酶、RNA酶、核糖核酸內(nèi)切酶、核酸內(nèi)切酶、minizyme、leadzyme、oligozyme或DNA酶互換使用。所有這些術(shù)語均描述具有酶活性的核酸分子。本申請(qǐng)中所述的特異性酶性核酸分子在本發(fā)明中并非限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到對(duì)于本發(fā)明的酶性核酸分子而言，重要的是其具有同一個(gè)或多個(gè)靶核酸區(qū)域互補(bǔ)的特異性底物結(jié)合位點(diǎn)，以及其具有在該底物結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)或周圍的核苷酸序列，所述的核苷酸序列賦予該分子以核酸切割活性。
“酶性部分”或“催化結(jié)構(gòu)域”意指核酶中對(duì)于核酸底物的切割至關(guān)重要的部分/區(qū)域(例如見

圖1)。
“底物結(jié)合臂”或“底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域”意指核酶同其底物的一部分互補(bǔ)(即，能夠堿基配對(duì))的部分/區(qū)域。通常，此類互補(bǔ)性為100％，但如果需要可以更低。例如，少至14個(gè)中的10個(gè)堿基可配對(duì)。此類臂大體上示于圖1和3中。也就是說，這些臂含有核酶內(nèi)部序列，其意圖通過互補(bǔ)堿基配對(duì)作用將核酶和靶RNA連接到一起。本發(fā)明的核酶可以具有相鄰或不相鄰的結(jié)合臂，并且可以為各種長度。結(jié)合臂的長度優(yōu)選多于或等于4個(gè)核苷酸；特別是12-100個(gè)核苷酸；更特別是14-24個(gè)核苷酸長。如果選擇2個(gè)結(jié)合臂，則設(shè)計(jì)成結(jié)合臂的長度是對(duì)稱的(即，每個(gè)結(jié)合臂長度相同；例如，5個(gè)和5個(gè)核苷酸、6個(gè)和6個(gè)核苷酸或者7個(gè)和7個(gè)核苷酸長)或者是非對(duì)稱的(即，結(jié)合臂的長度不同；例如，6個(gè)和3個(gè)核苷酸、3個(gè)和6個(gè)核苷酸長、4個(gè)和5個(gè)核苷酸長、4個(gè)和6個(gè)核苷酸長、4個(gè)和7個(gè)核苷酸長、等等)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶性核酸分子形成于錘頭型或發(fā)夾型基元中，但是也可形成于丁型肝炎病毒、Ⅰ組內(nèi)含子、Ⅱ組內(nèi)含子或RNA酶P RNA(與RNA引導(dǎo)序列相關(guān))或者鏈孢霉屬VS RNA的基元中。Dreyfus，同上、Rossi等，1992，AIDS研究和人類逆轉(zhuǎn)錄病毒(AIDSResearch and Human Retroviruses)8，183描述了此類錘頭型基元的實(shí)例；Hampel等，EP0360257、Hampel和Tritz,1989，生物化學(xué)28,4929、Feldstein等1989，基因82,53、Haseloff和Gerlach,1989，基因82,43以及Hampel等，1990，核酸研究18,299描述了發(fā)夾型基元；Perrotta和Been,1992，生物化學(xué)31,16描述了丁型肝炎病毒基元；Guerrier-Takada等，1983，細(xì)胞35,849、Forster和Altman,1990，科學(xué)249,783、Li和Altman,1996，核酸研究24,835描述了RNA酶P基元；Collins(Saville和Collins，1990，細(xì)胞61,685-696；Saville和Collins，1991，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88,8826-8830；Collins和Olive,1993，生物化學(xué)32,2795-2799；Guo和Collins,1995，歐洲分子生物學(xué)組織雜志(EMBO.J.)14,363)描述了鏈孢霉屬VS RNA核酶基元；Griffin等，1995，化學(xué)和生物學(xué)(Chem.Biol.)2,761；Michels和Pyle,1995，生物化學(xué)34,2965；Pyle等PCT國際公開號(hào)WO96/22689描述了Ⅱ組內(nèi)含子；Cech等，美國專利4,987,071描述了Ⅰ組內(nèi)含子；Chartrand等，1995，核酸研究23,4092；Santoro等，1997，美國國家科學(xué)院院報(bào)94,4262描述了DNA酶基元。在本發(fā)明中這些特異性的基元并非限制性的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到對(duì)本發(fā)明的酶性核酸分子重要的是其具有同一個(gè)或多個(gè)靶基因RNA區(qū)域互補(bǔ)的特異性的底物結(jié)合位點(diǎn)，以及其具有在底物結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)或周圍的核苷酸序列，所述的核苷酸序列使該分子具有核酸切割活性。
HCV的“等價(jià)”RNA意指在各種動(dòng)物中同HCV感染相關(guān)的那些天然存在的RNA分子，所述動(dòng)物包括人、嚙齒類、靈長類、兔和豬。除了編碼區(qū)外，等價(jià)的RNA序列還包括如5’-非翻譯區(qū)、3’-非翻譯區(qū)、內(nèi)含子、內(nèi)含子-外顯子連接處等的區(qū)域。
“互補(bǔ)性”意指一種核酸其能通過傳統(tǒng)的Watson-Crick堿基配對(duì)或其它非傳統(tǒng)類型(例如，Hoogsteen型)的堿基配對(duì)作用與另一RNA序列形成氫鍵。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備對(duì)于預(yù)期靶標(biāo)RNA表現(xiàn)出高度特異性的酶性切割劑的方法。酶性核酸分子優(yōu)選靶向于編碼HCV蛋白的靶mRNA的高度保守序列區(qū)，以便用一種或幾種酶性核酸可以提供對(duì)疾病或狀態(tài)的特異性治療。此類酶性核酸分子可以按照所需外源地傳遞至特定的細(xì)胞?；蛘撸嗣缚梢杂蓚鬟f至特定細(xì)胞的DNA/RNA載體來表達(dá)。
此類核酶對(duì)于預(yù)防上述疾病或狀態(tài)以及與細(xì)胞或組織中HCV活性水平相關(guān)的任何其它疾病或狀態(tài)是有效的。
“相關(guān)”意指HCV RNA的抑制以及由此所致病毒活性水平的降低在一定程度上將減輕疾病或狀態(tài)的癥狀。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酶具有結(jié)合臂，其與表Ⅳ-Ⅸ中的靶序列互補(bǔ)。此類核酶的實(shí)例也示于表Ⅳ-Ⅸ中。此類核酶的實(shí)例基本上由這些表中所確定的序列組成?？赡艽嬖谄渌蛄?，其不干擾此類切割。
“基本上由……組成”意指活性核酶含有一個(gè)與實(shí)施例中的那些等價(jià)的酶性中心或核心，以及能夠結(jié)合mRNA以便在靶位點(diǎn)發(fā)生切割的結(jié)合臂。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明以抑制基因表達(dá)和/或病毒復(fù)制的核酶為特征。這些化學(xué)或酶促合成的RNA分子含有結(jié)合至其靶mRNA的可接近區(qū)域的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。RNA分子還含有催化RNA切割的結(jié)構(gòu)域。RNA分子優(yōu)選為具有錘頭型或發(fā)夾型基元的核酶。通過結(jié)合，核酶切割靶mRNA，阻止翻譯和蛋白質(zhì)的積累。在靶基因不表達(dá)的情況下，HCV基因表達(dá)和/或復(fù)制被抑制。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酶可直接加入，或者可以與陽離子脂質(zhì)形成復(fù)合物，包裹于脂質(zhì)體中，或者傳遞至靶細(xì)胞。通過注射、輸液泵或支架可以將摻入或未摻入到生物多聚體中的核酸或核酸復(fù)合物回體或體內(nèi)局部地施予相關(guān)組織。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將核酶在適當(dāng)?shù)闹|(zhì)體載體中施予HCV作用位點(diǎn)(例如，肝細(xì)胞)。
在本發(fā)明的另一方面中，將切割靶分子并抑制HCV活性的核酶由插入到DNA或RNA載體中的轉(zhuǎn)錄單位來表達(dá)。重組載體優(yōu)選為DNA質(zhì)?；虿《据d體。表達(dá)核酶的病毒載體可以基于，但不限于，腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或α病毒而構(gòu)建。優(yōu)選如上所述來傳遞能夠表達(dá)核酶的重組載體，并保持在靶細(xì)胞中?；蛘?，可以利用提供核酶瞬時(shí)表達(dá)的病毒載體。此類載體根據(jù)需要可以重復(fù)施予。核酶一旦被表達(dá)便切割靶mRNA。表達(dá)核酶的載體可以系統(tǒng)投予，例如通過靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)施予、通過施予從患者取出的靶細(xì)胞，隨后重新引入患者或者通過使得可以引入目的靶細(xì)胞的任何其它方式(綜述見Couture和Stinchcomb,1996,TIG.,12,510)。在本發(fā)明的另一方面中，切割靶分子并抑制病毒復(fù)制的核酶由插入到DNA、RNA或病毒載體的轉(zhuǎn)錄單位來表達(dá)。優(yōu)選如上所述將能夠表達(dá)核酶的重組載體局部投予，并瞬時(shí)保持于平滑肌細(xì)胞中。然而，為了此目的可以利用指導(dǎo)RNA表達(dá)的其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞載體。
“患者”意指一種生物體，其為移植細(xì)胞的供體或受體，或者為細(xì)胞本身。“患者”還指可以施予酶性核酸分子的一種生物體。優(yōu)選患者為哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。更優(yōu)選患者為人或人的細(xì)胞。
“載體”意指任何用于傳遞目的核酸的基于核酸和/或病毒的技術(shù)。
這些核酶單個(gè)、或聯(lián)合或者連帝其它藥物可以用于治療上述的疾病或狀態(tài)。例如，為了治療與HCV水平相關(guān)的疾病或狀態(tài)，可以治療患者，或者可以治療其它適當(dāng)?shù)募?xì)胞，這對(duì)于那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員是清楚的。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將從下面對(duì)其優(yōu)選的實(shí)施方案的描述以及權(quán)利要求來明確。
優(yōu)選實(shí)施方案描述首先將對(duì)附圖進(jìn)行簡要描述。
附圖圖1顯示7個(gè)不同種類酶性核酸分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型。箭頭指示切割位點(diǎn)?！瓨?biāo)明靶序列。由點(diǎn)間隔的線指示三級(jí)相互作用。-表示堿基配對(duì)作用。Ⅰ組內(nèi)含子P1-P9.0代表各種莖環(huán)結(jié)構(gòu)(Cech等，1994，自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)(Nature Struc.Bio.)1,273)。RNA酶P(M1RNA):EGS代表外部引導(dǎo)序列(Foster等，1990，科學(xué)249,783；Pace等，1990，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)265,3587)。Ⅱ組內(nèi)含子5’SS意指5’剪接位點(diǎn)；3’SS意指3’剪接位點(diǎn)；IBS意指內(nèi)含子結(jié)合位點(diǎn)；EBS意指外顯子結(jié)合位點(diǎn)(Pyle等，1994，生物化學(xué)(Biochemistry)33,2716)。VS RNAⅠ-Ⅵ標(biāo)明6個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)；陰影區(qū)表示三級(jí)相互作用(Collins，PCT國際公開號(hào)WO96/19577)。HDV核酶Ⅰ-Ⅳ標(biāo)明4個(gè)基環(huán)結(jié)構(gòu)(Been等，美國專利號(hào)5,625,047)。錘頭型核酶Ⅰ-Ⅲ意為標(biāo)明3個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)；莖Ⅰ-Ⅲ可以為任何長度并且可以是對(duì)稱或不對(duì)稱的(Usman等，1996,Curr.Op.Struct.Biol.,1,527)。發(fā)夾型核酶螺旋1、4和5可以為任何長度；螺旋2長度介于3到8個(gè)堿基對(duì)之間；Y為一個(gè)嘧啶；提供至少4個(gè)堿基對(duì)的螺旋2(H2)(即，n為1、2、3或4)，而螺旋5的長度選擇性地提供為2個(gè)或更多堿基(優(yōu)選3-20個(gè)堿基，即m為從1-20或更多)。螺旋2和螺旋5可以通過一個(gè)或多個(gè)堿基共價(jià)相連(即，r為1個(gè)堿基)。螺旋1、4或5也可以擴(kuò)展2個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)(例如，4-20個(gè)堿基對(duì))以穩(wěn)定核酶的結(jié)構(gòu)，并且優(yōu)選為蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。在每種情況下，每個(gè)N和N’分別為任何正?；蛐揎椀膲A基，而每個(gè)短劃線代表一個(gè)潛在的堿基配對(duì)作用?？梢栽谔恰A基、或磷酸處修飾這些核苷酸。在螺旋中不需要堿基完全配對(duì)，但優(yōu)選完全配對(duì)。螺旋1和4可以為任何大小(即o和p各自單獨(dú)為從0至任何數(shù)字，例如，20)，只要維持一些堿基配對(duì)。將關(guān)鍵的堿基示為結(jié)構(gòu)中特定的堿基，但那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為一個(gè)或多個(gè)可以被化學(xué)修飾(無堿基的、堿基、糖和/或磷酸修飾)或用其它堿基取代而沒有明顯的效應(yīng)。螺旋4可以由2個(gè)獨(dú)立的分子相成，即沒有連接環(huán)。當(dāng)連接環(huán)存在時(shí)可以為核糖核苷酸，其堿基、糖或磷酸有或沒有修飾。“q”為2個(gè)堿基。連接環(huán)也可以由非核苷酸連接分子來取代。H指堿基A、U或C。Y指嘧啶堿基。“—”指共價(jià)鍵。(Burke等，1996，核酸和分子生物學(xué)(Nucleic Acids & Mol.Biol.)10,129；Chowrira等，美國專利號(hào)5,631,359)。
圖2為一個(gè)圖，其展示了靶向于保守的5’HCVUTR區(qū)中各位點(diǎn)的核酶切割由數(shù)個(gè)基因型產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄子的能力。
圖3為雙重報(bào)導(dǎo)基因系統(tǒng)的圖示，其被用來證實(shí)細(xì)胞培養(yǎng)中由核酶介導(dǎo)的熒光素酶活性的降低。
圖4顯示核酶在OST-7細(xì)胞中降低熒光素酶活性的能力。
圖5顯示靶向于HCV.5-313和HCV.5-318位點(diǎn)的核酶與它們無活性的對(duì)照相比在OST-7細(xì)胞中降低熒光素酶活性的能力。
圖6A為說明核酶處理對(duì)HCV-脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)復(fù)制的效果的條圖。在96孔板中用HCV-PV以0.1的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染HeLa細(xì)胞。然后用培養(yǎng)基置換病毒接種液，所述的培養(yǎng)基含有5％血清以及所指定的同陽離子脂質(zhì)復(fù)合的核酶或?qū)φ?200nm)。24小時(shí)后，通過凍融3次裂解細(xì)胞并通過空斑檢測(cè)對(duì)病毒進(jìn)行定量。將打亂的對(duì)照(scrambled control,SAC)、結(jié)合對(duì)照(BC)、3 P=S核酶和4 P=S核酶標(biāo)出。將空斑形成單位(pfu)/ml以三個(gè)重復(fù)樣品的均值+標(biāo)準(zhǔn)差(S.D.)表示。
圖6B為說明核酶處理對(duì)野生型PV復(fù)制的效果的條圖。在96孔板中用野生型PV以MOI=0.05感染HeLa細(xì)胞30分鐘。在(B)中所有的核酶含有4P=S。將空斑形成單位(pfu)/ml以三個(gè)重復(fù)樣品的均值+標(biāo)準(zhǔn)差(S.D.)表示。
圖7為靶向于HCV RNA的各種錘頭型核酶構(gòu)建體的圖示。
圖8說明位點(diǎn)183核酶處理對(duì)單輪HCV-PV感染的影響。在核酶或?qū)φ仗幚砬皩eLa細(xì)胞用HCV-PV以MOI=5感染30分鐘。在6、7或8小時(shí)后裂解細(xì)胞，并通過空斑檢測(cè)對(duì)病毒進(jìn)行定量。將核酶結(jié)合臂/莖Ⅱ形式(7/4、7/3、6/4、6/3)以及打亂的對(duì)照(SAC、7/4形式)標(biāo)出。所有都含有4P=S穩(wěn)定性。將pfu/ml的結(jié)果表示為2個(gè)重復(fù)樣品的中值±范圍。
圖9顯示在該申請(qǐng)中所述的3種核酶基元的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型。
圖10顯示同干擾素聯(lián)合的抗HCV核酶的活性。以pfu/ml表示結(jié)果為2個(gè)重復(fù)樣品的中值±范圍。BAC，結(jié)合減弱的對(duì)照分子；IF，干擾素；Rz，靶向于HCV位點(diǎn)183的錘頭型核酶；pfu，空斑形成單位。
核酶目前已知7個(gè)基本種類的天然酶性RNA。此外，幾種體外篩選(進(jìn)化)策略(Orgel,1979,Proc.R Soc.London,B 205,435)被用來進(jìn)化能夠催化磷酸二酯鍵裂解和連接的新的核酸催化劑(Joyce,1989，基因82,83-87；Beaudry等，1992，科學(xué)257,635-641；Joyce,1992，科學(xué)美國人(Scientific American)267,90-97；Breaker等，1994,TIBTECH 12,268；Bartel等，1993，科學(xué)261,1411-1418；Szostak,1993,TIBS17,89-93；Kumar等，1995,FASEB J.,9,1183；Breaker,1996,Curr.Op.Biotech,7,442；Santoro等，1997，美國國家科學(xué)院院報(bào)，94,4262；Tang等，1997,RNA 3,914；Nakamaye和Eckstein,1994，同上；Long和Uhlenbeck,1994，同上；Ishizaka等，1995，同上；Vaish等，1997，生物化學(xué)36,6495；所有這些均被引入本申請(qǐng)作為參考)。每種都可以催化一系列反應(yīng)，包括在生理?xiàng)l件下磷酸二酯鍵的反式水解(并因此可以切割其它RNA分子)。表Ⅰ總結(jié)了這些核酶中一部分的某些特征。通常，酶性核酸通過首先結(jié)合至靶RNA來發(fā)揮作用。這種結(jié)合通過酶性核酸的靶標(biāo)結(jié)合部分來進(jìn)行，所述的靶標(biāo)結(jié)合部分緊鄰該分子酶性部分，所述的酶性部分的作用為切割靶RNA。因此，酶性核酸分子首先識(shí)別然后通過互補(bǔ)堿基配對(duì)結(jié)合靶RNA，而且一旦結(jié)合至正確的位點(diǎn)，可酶促切割靶RNA。此類靶RNA的策略性切割將破壞其指導(dǎo)所編碼蛋白合成的能力。在一種酶性核酸結(jié)合并切割其RNA靶標(biāo)后，其由那個(gè)RNA釋放以尋找另一個(gè)靶標(biāo)，并可以反復(fù)結(jié)合和切割新的靶標(biāo)。
核酶的酶性特征是優(yōu)于其它技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)橛绊懸环N治療性處理所需的核酶的濃度將更低。該優(yōu)點(diǎn)反映了核酶發(fā)揮酶性作用的能力。因此，一個(gè)核酶分子就能裂解靶RNA的很多個(gè)分子。此外，核酶是一種高度特異的抑制物，具有不僅依賴于結(jié)合靶RNA的堿基配對(duì)機(jī)制而且依賴于靶RNA切割的機(jī)制的抑制特異性。可以選擇鄰近切割位點(diǎn)的單個(gè)錯(cuò)配或堿基置換來徹底消除核酶的催化活性。
具有核酸內(nèi)切酶酶活性的核酸分子能夠以一種核苷酸堿基序列特異性的方式反復(fù)切割其它獨(dú)立的RNA分子。此類酶性核酸分子可以靶向于幾乎任何RNA轉(zhuǎn)錄子，并且在體外實(shí)現(xiàn)有效切割(Zaug等，324，自然429，1986；Uhlenbeck,1987，自然328,596；Kim等，84，美國國家科學(xué)院院報(bào)8788,1987；Dreyfus,1988,Einstein Quart.醫(yī)學(xué)生物學(xué)雜志(J.Bio.Med.),6,92；Haseloff和Gerlach,334，自然585,1988；Cech,260,JAMA3030,1988；以及Jefferies等人，17，核酸研究1371,1989；Chartrand等，1995，核酸研究23,4092；Santoro等，1997，美國國家科學(xué)院院報(bào)94,4262)。
由于它們的序列特異性，反式切割性核酶作為人類疾病的治療劑具有前景(Usman和McSwiggen,1995,Ann.Rep.Med.Chem.30,285-294；Christoffersen和Marr,1995，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(J.Med.Chem.)38，2023-2037)。可以通過設(shè)計(jì)使核酶在細(xì)胞RNA的背景內(nèi)切割特異性的RNA靶標(biāo)。此類切割使RNA喪失功能并終止該RNA的蛋白表達(dá)。與疾病狀態(tài)相關(guān)的蛋白質(zhì)的合成可以這種方式被選擇性地抑制。
切割HCVRNA中特定位點(diǎn)的核酶代表丙型肝炎病毒感染的一種新型治療方法。申請(qǐng)人指出核酶能夠抑制HCV的活性，而且核酶的抑制效應(yīng)需要催化活性。那些本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)從所述的實(shí)施例中清楚的是切割HCV RNA的其它核酶可以很容易地設(shè)計(jì)出來，而且其在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
靶位點(diǎn)可以按照在Draper等，WO 93/23569；Sullivan等，WO 93/23057；Thompson等，WO 94/02595；Draper等，WO 95/04818；McSwiggen等，美國專利號(hào)5,525,468中所公布的來確定有效核酶的靶標(biāo)，本申請(qǐng)將這些全部引入作為參考。此處沒有重復(fù)在那些文獻(xiàn)中提供的指導(dǎo)，而是在下面提供了此類方法的特定實(shí)施例，但不限于本領(lǐng)域的那些。按照在那些申請(qǐng)中所述設(shè)計(jì)針對(duì)此類靶標(biāo)的核酶，并進(jìn)行合成以如所述接受體外和體內(nèi)測(cè)試。還可以按照在那些中所述的對(duì)此類核酶進(jìn)行優(yōu)化和投予。
利用計(jì)算機(jī)折疊算法篩選HCV RNA序列的最佳核酶靶位點(diǎn)。鑒定了錘頭型或發(fā)夾型核酶切割位點(diǎn)。這些位點(diǎn)示于表Ⅳ-Ⅷ中(在表中所有序列均為5’至3’)。在表中將核苷酸堿基位點(diǎn)注明為將被所設(shè)計(jì)的核酶類型切割的位點(diǎn)。
由于HCV RNA在某些區(qū)域是高度同源的，所以一些核酶靶位點(diǎn)也是同源的(見表Ⅳ和Ⅷ)。在此情況下，單個(gè)核酶將靶向不同類的HCV RNA。一種靶向于幾類HCV RNA的核酶的優(yōu)點(diǎn)是清楚的，特別是在這些RNA的一個(gè)或多個(gè)可能引起疾病狀態(tài)的情況下。
設(shè)計(jì)了能夠結(jié)合的錘頭型或發(fā)夾型核酶并通過計(jì)算機(jī)折疊(Jaeger等，1989，美國國家科學(xué)院院報(bào)，86,7706)分別分析來評(píng)價(jià)核酶序列是否折疊成適當(dāng)?shù)亩?jí)結(jié)構(gòu)。將那些在結(jié)合臂和催化核心間具有不利的分子內(nèi)相互作用的核酶從考慮中排除?？梢赃x擇各種結(jié)合臂長度來優(yōu)化活性。通常，在每個(gè)臂上至少5個(gè)堿基能夠結(jié)合靶RNA或者同靶RNA相互作用。將具有錘頭型或發(fā)夾型基元的核酶設(shè)計(jì)成與mRNA信使中的各位點(diǎn)退火。結(jié)合臂與上述的靶位點(diǎn)序列互補(bǔ)。
核酶的合成利用自動(dòng)方法合成長度大于100個(gè)核苷酸的核酸是困難的，而且此類分子的治療費(fèi)用阻止了其應(yīng)用。在本發(fā)明中，將小的核酸基元(例如，錘頭型或發(fā)夾型核酶)用于外源投予。這些分子的簡單結(jié)構(gòu)增加了核酸侵入mRNA結(jié)構(gòu)的靶區(qū)域的能力。然而，這些核酸分子還可以由真核啟動(dòng)子在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(例如，Izant和Weintraub,1985，科學(xué)229,345；McGarry和Lindquist,1986，美國國家科學(xué)院院報(bào)83,399；SullengerScanlon等，1991，美國國家科學(xué)院院報(bào)88,10591-5；Kashani-Sabet等，1992，反義研究進(jìn)展(Antisense Res.Dev.)2,3-15；Dropulic等，1992，病毒學(xué)雜志(J.Virol)66,1432-41；Weerasinghe等，1991病毒學(xué)雜志65,5531-4；Ojwang等，1992，美國國家科學(xué)院院報(bào)89,10802-6；Chen等，1992,核酸研究20,4581-9；Sarver等，1990，科學(xué)247,1222-1225；Thompson等，1995，核酸研究23,2259)。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員意識(shí)到任何核酸都可以由適當(dāng)?shù)腄NA/RNA載體表達(dá)于真核細(xì)胞中。此類核酸的活性可以通過由核酶將其從原始轉(zhuǎn)錄子中釋放而得到放大(Draper等，PCTWO93/23569，以及Sullivan等，PCT WO94/02595，在此兩者均被完整引入作為參考；Ohkawa等，1992,Nucleic Acids Symp.Ser.,27,15-6；Taira等，1991，核酸研究19,5125-30；Ventura等，1993，核酸研究，21,3249-55；Chowrira等，1994，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)269,25856)。
實(shí)施例中的核酶是化學(xué)合成的。所用的合成方法按照如在Usman等，1987，美國化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)109,7845；Scaringe等，1990，核酸研究18,5433；和Wincott等，1995，核酸研究23,2677-2684中所述的常規(guī)RNA合成方法，并利用通用的核酸保護(hù)和偶聯(lián)基團(tuán)，例如在5’-端的二甲氧基三苯甲基和在3’-端的亞磷酰胺。在394 AppliedBiosystems,Inc.合成儀上進(jìn)行小規(guī)模的合成，所用為調(diào)整的2.5μmol規(guī)模方案，其中對(duì)甲硅烷基保護(hù)的核苷酸實(shí)施5分鐘的偶聯(lián)步驟，對(duì)2’-O-甲基化的核苷酸實(shí)施2.5分鐘的偶聯(lián)步驟。表Ⅱ概要說明了在合成循環(huán)中所用試劑的數(shù)量以及接觸時(shí)間。在每個(gè)偶聯(lián)循環(huán)中利用相對(duì)于多聚體結(jié)合的5’-羥基6.5倍過剩的亞磷酰胺(0.1M 163μL=16.3μmol)以及24倍過剩的S-乙基四唑(0.25M 238μL=59.5μmol)。通過三苯甲基組分的比色定量確定在394 AppliedBiosystems,Inc.合成僅上的平均偶聯(lián)產(chǎn)量為97.5-99％。其它用于394Applied Biosystems,Inc.合成僅的寡核苷酸合成試劑脫三苯甲基溶液為在二氯甲烷中2％的TCA(ABI)；用在THF中16％的N-甲基咪唑(ABI)和在THF中10％的乙酸酐/10％的2,6-二甲基吡啶(ABI)進(jìn)行加帽；氧化溶液為在THF中16.9mM I2、49mM吡啶、9％的水(Millipore)。B&S合成級(jí)乙腈直接從試劑瓶中取用。S-乙基四唑溶液(在乙腈中0.25M)是由獲自美國國際化學(xué)公司(AmericanIntemational Chemical,Inc.)的固體制成。
如下進(jìn)行RNA脫保護(hù)。將多聚體結(jié)合的無三苯甲基的寡核糖核苷酸從合成柱轉(zhuǎn)移至4mL玻璃螺旋蓋瓶，并在65℃懸于甲胺(MA)溶液中10分鐘。冷卻至-20℃后，從多聚體支持物上移去上清。用1.0mL的EtOH∶MeCN∶H2O/3∶1∶1洗滌支持物3次，旋渦振蕩，然后將上清加到第一次的上清中。將合并的含有寡核糖核苷酸的上清抽干成白色粉末。
將堿基脫保護(hù)的寡核糖核苷酸重懸于無水TEA·HF/NMP溶液(1.5mLN-甲基吡咯烷酮、750μL TEA和1.0mL TEA·3HF的溶液250μL以提供1.4MHF)中，并加熱至65℃1.5h。將所獲的充分脫保護(hù)的寡聚體在陰離子交換脫鹽前用50mM TEAB(9mL)淬滅。
為了對(duì)脫保護(hù)寡聚體進(jìn)行陰離子交換脫鹽，將TEAB溶液上樣于用50mM TEAB(10mL)預(yù)洗過的Qiagen 500陰離子交換柱(QiagenInc.)上。在用50mM TEAB(10mL)洗滌已上樣的柱后，用2M的TEAB(10mL)洗脫RNA并抽干成白色粉末。
通過置換轉(zhuǎn)換G5A6的順序以及將A14置換成U來合成無活性的錘頭型核酶(由Hertel,K.J.等，1992，核酸研究20,3252進(jìn)行編號(hào))。無活性的核酶也可以通過將G5置換成U以及A14置換成U來合成。在某些情況下，底物結(jié)合臂的序列是隨機(jī)的，但保持總體的堿基組成。
平均每步偶聯(lián)產(chǎn)率大于98％(Wincott等，1995，核酸研究23,2677-2684)。
將發(fā)夾型核酶分成兩個(gè)部分合成，然后退火重建有活性的核酶(Chowrira和Burke,1992，核酸研究20,2835-2840)。利用T7噬菌體RNA聚合酶也可以由DNA模板合成核酶(Milligan和Uhlenbeck,1989，酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)180,51)。
通過用核酸酶抗性基團(tuán)對(duì)核酶進(jìn)行修飾來提高穩(wěn)定性和/或提高催化活性，例如，2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟基、2’-O-甲基、2’-H、核苷酸堿基修飾(綜述見Usman和Cedergren,1992,TIBS 17,34；Usman等，1994,Nucleic Acids Symp.Ser.31,163；Burgin等，1996，生物化學(xué)6，14090)。
利用普通的方法通過凝膠電泳純化核酶，或者通過高壓液相層析(HPLC；見Stinchcomb等，PCT國際公開號(hào)WO 95/23225，在此其整個(gè)被引入作為參考)來純化，并重懸于水中。
在本研究中有效的化學(xué)合成核酶的序列示于表Ⅳ-Ⅸ中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為這些序列僅僅是更多此類序列的代表，在所述的序列中改變了核酶的酶性部分(除結(jié)合臂外的全部)來影響活性。例如，可以改變(置換、缺失和/或插入)錘頭型核酶的莖環(huán)Ⅱ序列來含有任何序列，只要可以形成最小2個(gè)堿基對(duì)的莖結(jié)構(gòu)。類似地，可以改變(置換、缺失和或插入)發(fā)夾型核酶的莖環(huán)Ⅳ序列來含有任何序列，只要可以形成最小2個(gè)堿基對(duì)的莖結(jié)構(gòu)。優(yōu)選在這些位點(diǎn)插入不超過200個(gè)堿基。在表Ⅳ-Ⅸ中所列的序列可以形成核糖核苷酸或其它核苷酸或者非核苷酸。此類核酶(具有酶促活性)等價(jià)于在表中具體描述的核酶。
優(yōu)化核酶活性在本發(fā)明中所述核酶的催化活性可以按照由Drapper等，同上，所描述的進(jìn)行優(yōu)化。具體細(xì)節(jié)此處將不再重復(fù)，大體包括改變核酶結(jié)合臂的長度或者化學(xué)合成具有修飾(堿基、糖和/或磷酸)的核酶以阻止其被血清核糖核酸酶降解和/或提高其酶促活性(見例如，Eckstein等，國際公開號(hào)WO 92/07065；Perrault等，1990，自然344,565；Pieken等，1991，科學(xué)253,314；Usman和Cedergren,1992，生物化學(xué)科學(xué)趨勢(shì)(Trends in Biochem.Sci.)17,334；Usman等國際公開號(hào)WO93/15187；以及Rossi等，國際公開號(hào)WO91/03162；Sproat，美國專利號(hào)5,334,711；以及Burgin等，同上；所有這些描述了可以用于酶性RNA分子的堿基、磷酸和/或糖部分的各種化學(xué)修飾)。修飾以提高它們?cè)诩?xì)胞中的效力及從莖環(huán)結(jié)構(gòu)中去除堿基來縮短RNA合成時(shí)間和降低化學(xué)品的需求是需要的。(在此引入所有這些出版物作為參考)。
有幾個(gè)本領(lǐng)域中的實(shí)例，其描述了可以被引入酶性核酸分子而不顯著影響催化卻顯著提高它們對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性和效力的糖和磷酸的修飾。通過用核酸酶抗性基團(tuán)對(duì)核酶進(jìn)行修飾來提高穩(wěn)定性和/或提高催化活性，例如，2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟基、2’-O-甲基、2’-H、核苷酸堿基修飾(綜述見Usman和Cedergren,1992,TIBS 17,34；Usman等，1994,NucleicAcids Symp.Ser.31,163；Burgin等，1996，生物化學(xué)6,14090)。在本領(lǐng)域已經(jīng)對(duì)酶性核酸分子的糖的修飾進(jìn)行了廣泛的描述(見，Eckstein等，國際公開號(hào)WO 92/07065；Perrault等，自然1990,344,565-568；Pieken等，科學(xué)1991,253,314-317；Usman和Cedergren，生物化學(xué)科學(xué)趨勢(shì)(Trends in Biochem.Sci.)1992,17,334-339；Usman等國際公開號(hào)WO93/15187；Sproat，美國專利號(hào)5,334,711；以及Beigelman等，1995，生物化學(xué)雜志270,25702；在此所有這些參考文獻(xiàn)均被完整引入作為參考)。此類公開物描述了確定糖、堿基和/或磷酸修飾等摻入核酶而不抑制催化的位點(diǎn)的一般方法和策略，而且在此被引入作為參考。鑒于此類講授，類似的修飾可以如此處所述用于修飾本發(fā)明的核酸催化物。
本發(fā)明提供了有化學(xué)修飾的核酸催化物，其維持或提高了酶促活性。此類核酸還通常比未修飾的核酸對(duì)核酸酶抗性更強(qiáng)。因此，在細(xì)胞中和/或體內(nèi)，活性將不會(huì)顯著降低。如此處所展示的，此類核酶在細(xì)胞中和/或體內(nèi)即使總體活性降低了10倍也是有效的(Burgin等，1996，生物化學(xué)35，14090)。此處將此類核酶稱為針對(duì)所有RNA核酶“維持”了酶促活性。
外源給予的治療性核酶在細(xì)胞內(nèi)必需最好是穩(wěn)定的，直至靶RNA的翻譯被抑制足夠長的時(shí)間以降低不必要蛋白的水平。根據(jù)疾病的狀態(tài)，該時(shí)間段從數(shù)小時(shí)到數(shù)天不等。清楚的是，為了作為有效的細(xì)胞內(nèi)治療劑來發(fā)揮功能，核酶必需對(duì)核酸酶有抗性。RNA化學(xué)合成的進(jìn)展(Wincott等，1995，核酸研究23,2677；在此并入作為參考)已經(jīng)擴(kuò)展了修飾核酶的能力，即通過引入核苷酸修飾來以提高其核酶穩(wěn)定性。
此處所用的“核苷酸”如本領(lǐng)域所認(rèn)為的包括本領(lǐng)域熟知的天然堿基(標(biāo)準(zhǔn)的)，和修飾的堿基。此類堿基通常位于糖部分的1’位置上。核苷酸通常包括一個(gè)堿基、糖以及一個(gè)磷酸基團(tuán)。核苷酸可以為未修飾的或者在糖、磷酸和/或堿基部分被修飾，(也可被稱為核苷酸類似物，修飾的核苷酸、非天然核苷酸、非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸等；實(shí)例見Usman和McSwiggen，同上；Eckstein等，PCT國際公開號(hào)WO 92/07065；Usman等，PCT國際公開號(hào)WO93/15187；在此所有均被引入作為參考)。有幾個(gè)本領(lǐng)域已知的修飾的核酸堿基的實(shí)例，而且最近由Limbach等，1994，核酸研究22,2183總結(jié)?？杀灰朊感院怂岱肿佣伙@著影響其催化活性的堿基修飾的一些非限制性實(shí)例包括次黃嘌呤核苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶核苷、萘基、氨苯基、5-烷基胞嘧啶核苷(例如，5-甲基胞嘧啶核苷)、5-烷基尿嘧啶核苷(例如，胸腺嘧啶核糖核苷)、5-鹵尿嘧啶核苷(例如，5-溴尿嘧啶核苷)或6-氮嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿嘧啶核苷)等等(Burgin等，1996，生物化學(xué)，35,14090)?！靶揎椀膲A基”在該方面意指在1’位點(diǎn)上除腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶以外的核苷酸堿基或其等價(jià)物；此類堿基可用于酶的催化核心和/或底物結(jié)合區(qū)。
“無堿基的”意指在1’位點(diǎn)上沒有堿基或有其他化學(xué)基團(tuán)代替堿基的糖部分。
“未修飾的核苷酸”意指堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶之一連接到β-D-呋喃核糖的1’碳上。
“修飾的核苷酸”意指任何核苷酸堿基，其在未修飾的核苷酸堿基、糖和/或磷酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有修飾。
對(duì)核酶結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行各種修飾來提高核酶的實(shí)用性。例如，此類修飾將提高此類核酶的壽命、體外半衰期、穩(wěn)定性以及將此類核酶引入靶位點(diǎn)的簡易性從而提高對(duì)細(xì)胞膜的穿透以及使其具有識(shí)別并結(jié)合靶細(xì)胞的能力。
核酶的施予Sullivan等，PCT WO 94/02595描述了用于給予酶性RNA分子的一般方法?？梢酝ㄟ^多種由熟悉本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員所知的方法將核酶施予細(xì)胞，包括，但不限于包裹于脂質(zhì)體中、通過離子透入療法或者通過摻入其他載體，例如水凝膠、環(huán)糊精、生物可降解的毫微型膠囊以及生物粘附性微球體中。在某些說明中，可以用或不用前面所述的載體將核酶直接回體投予細(xì)胞或組織?；蛘?，通過注射或用導(dǎo)管、輸液泵或支架將RNA/載體組合局部投放。其他投藥途徑包括，但不限于，血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或關(guān)節(jié)注射、氣溶膠吸入、口服(片劑或丸劑形式)、局部、系統(tǒng)、眼部、腹膜內(nèi)和/或鞘內(nèi)投藥。核酶投藥和施予的更具體的描述提供于Sullivan等，同上和Draper等，PCT WO93/23569中，其在此被引入作為參考。
本發(fā)明的分子可以用作藥用劑。藥用劑在患者中阻止、抑制一種疾病狀態(tài)的發(fā)生或?qū)ζ溥M(jìn)行治療(在一定程度上緩解癥狀，優(yōu)選所有的癥狀)。
通過任何標(biāo)準(zhǔn)的方法，帶有或沒有穩(wěn)定劑、緩沖液等以形成藥物組合物，可以施予本發(fā)明的帶負(fù)電荷的多聚核苷酸(例如，RNA、DNA或蛋白質(zhì))并引入患者中。當(dāng)需要利用脂質(zhì)或脂質(zhì)體投藥機(jī)制時(shí)，可以遵循標(biāo)準(zhǔn)的配置方法。對(duì)本發(fā)明的組合物還可以如下進(jìn)行配置和使用用于口服施藥的片劑、膠囊或酏劑；用于直腸施藥的栓劑；無菌溶液；用于可注射施藥的懸液等等。
本發(fā)明還包括所述化合物的可藥用制劑。這些制劑包括上述化合物的鹽，例如，酸加成鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、乙酸鹽、以及苯磺酸鹽。
藥理學(xué)組合物或制劑指某種形式的組合物或制劑，所述的形式適于向細(xì)胞或患者，優(yōu)選人體內(nèi)施藥，例如系統(tǒng)施藥。適當(dāng)?shù)男问讲糠忠蕾囀褂玫幕蜻M(jìn)入的途徑，例如口服、經(jīng)皮或通過注射。此類形式不應(yīng)阻止組合物或制劑到達(dá)靶細(xì)胞(即，預(yù)期帶負(fù)電荷的多聚物將投予的細(xì)胞)。例如，注射到血流中的藥理學(xué)組合物應(yīng)為可溶的。其他因素在本領(lǐng)域是已知的，并且包括考慮例如毒性以及阻止組合物或制劑，發(fā)揮其效應(yīng)的形式。
“系統(tǒng)施予”是指體內(nèi)在血流中藥物的系統(tǒng)吸收或累積，隨后分布全身。引起系統(tǒng)吸收的施藥途徑包括，但不限于靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、吸入、口服、肺內(nèi)和肌肉內(nèi)。這些施藥途徑中的每個(gè)都將目的帶負(fù)電荷多聚物，例如核酸暴露給可接近的疾病組織。藥物進(jìn)入循環(huán)的比率表示為分子量或大小的函數(shù)。包括本發(fā)明化合物的脂質(zhì)體或其他藥物載體的應(yīng)用能有效定位藥物，例如于特定組織類型，如網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的組織中。一種能促進(jìn)藥物與諸如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞的表面相互聯(lián)系的脂質(zhì)體制劑也是有效的。該方法通過利用巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞對(duì)異常細(xì)胞，例如HCV感染的肝細(xì)胞的免疫識(shí)別特異性可以提高藥物向靶細(xì)胞的投予。
本發(fā)明還以一種組合物的應(yīng)用為特征，所述的組合物包括表面修飾的含有聚乙二醇脂質(zhì)的脂質(zhì)體(PEG修飾的脂質(zhì)體、或長期循環(huán)脂質(zhì)體或隱形(stealth)脂質(zhì)體)。這些制劑提供了一種用于增加藥物在靶組織中蓄積的方法。這類藥物載體抵抗單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS或RES)的調(diào)理和清除，因此能夠延長血液循環(huán)時(shí)間并增加所包裹藥物與組織的接觸(Lasic等，化學(xué)綜述(Chem.Rev.)1995,95,2601-2627；Ishiwata等，化學(xué)與藥學(xué)通報(bào)(Chem.Pharm.Bull.)1995,43,1005-1011)。此類脂質(zhì)體被表明在腫瘤中選擇性地蓄積，可能通過在血管新生的靶組織中的外滲和捕獲(Lasic等，科學(xué)1995,267,1275-1276；Oku等，1995，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)(Biochim.Biophys.Acta),1238,86-90)。長期循環(huán)脂質(zhì)體提高了DNA和RNA的藥代學(xué)和藥效學(xué)，特別是與傳統(tǒng)的已知在MPS組織中蓄積的陽離子脂質(zhì)體相比(Liu等，生物化學(xué)雜志1995,42,24864-24870；Choi等，PCT國際公開號(hào)WO 96/10391；Ansell等，PCT國際公開號(hào)WO 96/10390；Holland等，PCT國際公開號(hào)WO 96/10392；在此所有這些均被引入作為參考)。在此所有這些均被引入作為參考。
此外，其他陽離子分子也可以被用來投放本發(fā)明的分子。例如，可以將核酶結(jié)合至糖基化的多聚(L-賴氨酸)，其顯示可以提高反義寡核苷酸在肝臟中的定位(Nakazono等，1996，肝臟病學(xué)23,1297-1303；Nahato等，1997，生物化學(xué)與藥學(xué)(Biochem Pharm.)53,887-895)。糖基化的多聚(L-賴氨酸)可以共價(jià)連接于酶性核酸或者通過靜電相互作用結(jié)合于酶性核酸。
本發(fā)明還包括為儲(chǔ)藏或施藥而制備的組合物，其在可藥用載體或稀釋劑中包括藥用有效量的目的化合物。用于治療應(yīng)用的可藥用載體或稀釋劑在藥學(xué)領(lǐng)域是已知的，而且描述于例如Remington藥物科學(xué)(Remington’sPharmaceutical Sciences),Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編，1985)中，在此其被引入作為參考。例如可以添加防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和香味劑。同上1449頁。這些包括苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥苯甲酸酯。此外，可以使用抗氧化劑和懸浮劑。
藥用有效劑量是預(yù)防、抑制疾病狀態(tài)的發(fā)生或治療疾病狀態(tài)(一定程度上緩解癥狀，優(yōu)選全部癥狀)所需的劑量。藥用有效劑量依賴于疾病的類型、所用的組合物、施藥途徑、治療的哺乳動(dòng)物類型、所選特定哺乳動(dòng)物的體格特征、同時(shí)用的藥物以及其他因素，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解這些。通常，根據(jù)帝負(fù)電荷的多聚體的效力施予數(shù)量在0.1mg/kg到100mg/kg體重/天之間的活性成分。
或者，可以由真核啟動(dòng)子在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的酶性核酸分子(例如，Izant和Weintraub,1985，科學(xué)229,345；McGarry和Lindquist,1986，美國國家科學(xué)院院報(bào)83,399；Scanlon等，1991，美國國家科學(xué)院院報(bào)88,10591-5；Kashani-Sabet等，1992，反義研究進(jìn)展(Antisense Res.Dev.)2,3-15；Dropulic等，1992，病毒學(xué)雜志66,1432-41；Weerasinghe等，1991，病毒學(xué)雜志，65,5531-4；Ojwang等，1992，美國國家科學(xué)院院報(bào)89,10802-6；Chen等，1992，核酸研究20,4581-9；Sarver等，1990，科學(xué)247,1222-1225；Thompson等，1995，核酸研究23，2259；Good等，1997，基因治療(Gene Therapy)4,45；所有參考文獻(xiàn)均被完整引入此處作為參考)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道任何核酸都能夠在真核細(xì)胞中由適當(dāng)?shù)腄NA/RNA載體表達(dá)。此類核酸的活性可以通過由核酶將其從原始轉(zhuǎn)錄子中釋放而得到放大(Draper等，PCT WO93/23569，以及Sullivan等，PCT WO94/02595；Ohkawa等，1992,Nucleic Acids Symp.Ser.,27,15-6；Taira等，1991，核酸研究19,5125-30；Ventura等，1993,核酸研究，21,3249-55；Chowrira等，1994，生物化學(xué)雜志269，25856；所有參考文獻(xiàn)均被完整引入此處作為參考)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，切割靶分子的酶性核酸分子由插入到DNA或RNA載體中的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)(見，例如Couture等，1996,TIG.,12,510)。重組載體優(yōu)選為DNA質(zhì)粒或病毒載體。表達(dá)核酶的病毒載體可以基于，但不限于，腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或α病毒而構(gòu)建。優(yōu)選如上所述投予能夠表達(dá)核酶的重組載體，并在靶細(xì)胞內(nèi)維持。或者，可以利用瞬時(shí)表達(dá)核酶的病毒載體。此類載體可以根據(jù)需要反復(fù)施予。一旦表達(dá)，核酶便切割靶mRNA。有活性的核酶含有一個(gè)等同于實(shí)例中那些的酶性中心或核心，以及能結(jié)合靶核酸分子的結(jié)合臂，以便在靶位點(diǎn)發(fā)生切割?？梢源嬖诓桓蓴_這種切割的其他序列。表達(dá)核酶的載體的投藥可以為系統(tǒng)的，例如通過靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)施予，通過施予從患者外植的靶細(xì)胞，隨后重新引入患者，或者通過可以引入目的靶細(xì)胞的任何其他方式(綜述見Couture等，1996,TIG.12,510)。
在本發(fā)明特征的一個(gè)方面，公開了一種含有核酸序列的表達(dá)載體，所述的核酸序列編碼至少一種本發(fā)明的核酸催化劑。以一種使編碼本發(fā)明核酸催化劑的核酸分子可以表達(dá)的方式可操作地連接該核酸序列。
在本發(fā)明特征的另一方面，表達(dá)載體包括a)一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)(例如，真核polⅠ、Ⅱ或Ⅲ啟始區(qū))；b)一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(例如，真核polⅠ、Ⅱ或Ⅲ終止區(qū))；c)編碼至少一種本發(fā)明的核酸催化劑的基因；而其中以一種使得所述的核酸分子可以表達(dá)和/或傳遞的方式將所述的基因可操作地連接至所述的啟始區(qū)和所述的終止區(qū)。載體可以包括或不包括蛋白質(zhì)的開放閱讀框架(ORF)和/或內(nèi)含子(間插序列)，所述的開放閱讀框架可操作地連接于編碼本發(fā)明核酸催化劑的基因的5’側(cè)或3’側(cè)。
核酶序列的轉(zhuǎn)錄是由真核RNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)、RNA聚合酶Ⅱ(polⅡ)或RNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。polⅡ或polⅢ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄子將在所有細(xì)胞中高水平表達(dá)；在一給定的細(xì)胞中給定的polⅡ啟動(dòng)子的水平將依賴于其鄰近的基因調(diào)控序列(增強(qiáng)子、沉默子等)的性質(zhì)。只要原核RNA聚合酶可在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中表達(dá)，則也可使用原核RNA聚合酶啟動(dòng)子(Elroy-Stein和Moss,1990，美國國家科學(xué)院院報(bào)，87,6743-7；Gao和Huang,1993，核酸研究，21,2867-72；Lieber等，1993，酶學(xué)方法，217,47-66；Zhou等，1990，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.),10,4529-37)。幾個(gè)研究者已經(jīng)證實(shí)由此類啟動(dòng)子表達(dá)的核酶可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用(例如，Kashani-Sabet等，1992，反義研究進(jìn)展2,3-15；Ojwang等，1992，美國國家科學(xué)院院報(bào)，89,10802-6；Chen等，1992，核酸研究，20,4581-9；Yu等，1993美國國家科學(xué)院院報(bào)，90,6340-4；L’Huillier等，1992，歐洲分子生物學(xué)組織雜志11,4411-8；Lisziewicz等，1993，美國國家科學(xué)院院報(bào)，90,8000-4；Thompson等，1995，核酸研究23,2259:Sullenger和Cech,1993，科學(xué)，262,1566)。更特別的是，轉(zhuǎn)錄單位可在細(xì)胞內(nèi)有效產(chǎn)生高濃度目的RNA分子如核酶，所述的轉(zhuǎn)錄單位例如衍生自U6小核編碼基因(snRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的單位(Thompson等，同上；Couture和Stinchcomb,1996，同上；Noonberg等，1994，核酸研究，22,2830；Noonberg等，美國專利號(hào)5,624,803；Good等，1997，基因治療4,45；Beigelman等，PCT國際公開號(hào)WO96/18736；所有這些出版物在此均被引入作為參考)。上述的核酶轉(zhuǎn)錄單位可以被并入到用于引入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的多種載體中，包括但不限于，質(zhì)粒DNA載體、病毒DNA載體(例如腺病毒或腺病毒相關(guān)病毒載體)或者病毒RNA載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或α病毒載體)(綜述見Couture和Stinchcomb,1996，同上)。
在另一方面，本發(fā)明還以一種包括核酸序列的表達(dá)載體為特征，所述的核酸序列編碼至少一種本發(fā)明的催化性核酸分子，而所述的表達(dá)載體以一種使得該核酸分子可以表達(dá)的方式包括該核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體包括a)一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)；b)一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)編碼至少一個(gè)所述核酸分子的基因；其中以一種使得所述的核酸分子可以表達(dá)和/或傳遞的方式將所述的基因可操作地連接至所述的啟始區(qū)和所述的終止區(qū)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)載體包括a)一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)；b)一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)一個(gè)開放閱讀框架；d)編碼至少一個(gè)所述核酸分子的基因，其中將所述的基因可操作地連接至所述開放閱讀框架的3’-末端；而且其中以一種使得所述的核酸分子可以表達(dá)和/或傳遞的方式將所述的基因可操作地連接至所述的啟始區(qū)，所述的開放閱讀框架和所述的終止區(qū)。在另一實(shí)施方案中，表達(dá)載體包括a)一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)；b)一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)一個(gè)內(nèi)含子；d)編碼至少一個(gè)所述核酸分子的基因；其中以一種使得所述的核酸分子可以表達(dá)和/或傳遞的方式將所述的基因可操作地連接至所述的啟始區(qū)、所述的內(nèi)含子和所述的終止區(qū)。在另一實(shí)施方案中，表達(dá)載體包括a)一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)；b)一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)一個(gè)內(nèi)含子；d)一個(gè)開放閱讀框架；e)編碼至少一個(gè)所述核酸分子的基因，其中將所述的基因可操作地連接至所述開放閱讀框架的3’-末端；而且其中以一種使得所述的核酸分子可以表達(dá)和/或傳遞的方式將所述的基因可操作地連接至所述的啟始區(qū)、所述的內(nèi)含子和所述的終止區(qū)。
干擾素Ⅰ型干擾素(IFN)為一類天然的細(xì)胞因子，其包括一個(gè)超過25個(gè)成員的IFN-α家族(Pesta,1996，酶學(xué)方法119,3-14)以及IFN-β和IFN-ω。雖然進(jìn)化上源于相同的基因(Diaz等，基因組學(xué)(Genomics)22,540-552)，但是在這些分子的一級(jí)序列中存在很多差別，提示在生物學(xué)活性的進(jìn)化分歧。所有I型干擾素具有共同的生物學(xué)效應(yīng)模式，其始于IFN與細(xì)胞表面受體的結(jié)合(Pfeffer和Strulovici,1992,IFN-α/β的跨膜二級(jí)信使。在干擾素，原理和醫(yī)學(xué)應(yīng)用(Interfon.Principles and Medical Applications),S.Baron,D.H.Coopenhaver,F.Dianzani,WR.Fleischmann Jr,T.K.Hughes Jr.,G.R.Kimpel,D.W.Niesel,G.J.Stanton，和S.K.Tyring，編，151-160)。結(jié)合后活化酪氨酸激酶，包括Janus酪氨酸激酶和STAT蛋白，其導(dǎo)致產(chǎn)生數(shù)種IFN刺激的基因產(chǎn)物(Johnson等，1994，科學(xué)美國人(Sci.Am.)270,68-75)。IFN刺激的基因產(chǎn)物引起I型干擾素的多嗜性生物學(xué)效應(yīng)，包括抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，細(xì)胞因子的誘導(dǎo)以及HLAⅠ類和Ⅱ類的調(diào)節(jié)(Pestla等，1987，生物化學(xué)年鑒(Annu.Rev.Biochem)56,727)。IFN刺激基因產(chǎn)物的實(shí)例包括2-5-寡聚腺苷酸合成酶(2-5 OAS)、β2-微球蛋白、新蝶呤、p68激酶以及Mx蛋白(Chebath和Revel,1992,2-5A系統(tǒng)2-5A合成酶、同工酶和功能。在干擾素，原理和醫(yī)學(xué)應(yīng)用(Interfon.Principles andMedical Applications),S.Baron,D.H.Coopenhaver,F.Dianzani,W.R.Jr.Fleischmann,T.K.Jr.Hughes,G.R.Kimpel,D.W.Niesel,G.H.Stanton,和S.K.Tyring，編，225-236；Samuel,1992,RNA依賴的Pl/eIF-2α蛋白激酶。在干擾素，原理和醫(yī)學(xué)應(yīng)用(Interfon.Principles and MedicalApplications),S.Baron,D.H.Coopenhaver,F.Dianzani,W.R.Fleischmann Jr.T.K.Hughes Jr.,G.R.Kimpel,D.W.Niesel,G.H.Stanton，和S.K.Tyring，編，237-250；Horisberger,1992，MX蛋白功能和作用機(jī)制。在干擾素，原理和醫(yī)學(xué)應(yīng)用(Interfon.Principles and MedicalApplications),S.Baron,D.H.Coopenhaver,F.Dianzani,W.R.Fleischmann Jr.,T.K.Hughes Jr.,G.R.Kimpel,D.W.Niesel,G.J.Stanton,和S.K.Tyring，編，215-224)。雖然所有的I型IFN具有相似的生物學(xué)效應(yīng)，但并非每種I型IFN均具有所有的活性，而且在很多情況下，對(duì)于每種IFN亞型的活性差異很大(Fish等，1989，干擾素研究雜志(J.InterferonRes.)9,97-114；Ozes等，1992，干擾素研究雜志12,55-59)。更特別的是，對(duì)不同亞型IFN-α性質(zhì)的研究和IFN-α的分子雜交顯示藥理學(xué)性質(zhì)的差別(Rubinstein,1987，干擾素研究雜志7,545-551)。這些藥理學(xué)差別可能緣于少至3個(gè)氨基酸殘基的改變(Lee等，1982，癌癥研究(CancerRes.)42,1312-1316)。
在已知的IFN-α亞型中85到166個(gè)氨基酸是保守的。排除IFN-α假基因，大約有25個(gè)已知的不同IFN-α亞型。這些非等位基因亞型的配對(duì)比較顯示一級(jí)序列的差別在2％至23％的范圍內(nèi)。除了天然存在的IFN外，合成了已知為共同干擾素(CIFN)的非天然重組I型干擾素作為治療性化合物(Tong等，1997，肝臟病學(xué)26,747-754)。
目前干擾素用于至少12種不同的適應(yīng)癥包括傳染病和自身免疫病和癌癥(Borden,1992，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(N.Engl.J.Med.)326,1491-1492)。對(duì)于自身免疫病，IFN被用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和Crohn’s病。對(duì)于癌癥的治療，IFN被單獨(dú)使用或同多種不同化合物聯(lián)合使用。已使用IFN的特定類型的癌癥包括鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤、腎上腺樣瘤、血管瘤、毛細(xì)胞白血病和Kaposi’s肉瘤。在傳染病治療中，IFN增加巨噬細(xì)胞的吞噬活性以及淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，并抑制細(xì)胞病原體的繁殖。用IFN治療的特異性適應(yīng)癥包括乙型肝炎、6和11型人乳頭瘤病毒(即生殖器疣)(Leventhal等，1991，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志325,613-617)、慢性肉芽腫性疾病和丙型肝炎病毒。
在慢性HCV感染治療中利用IFN-α的很多良好控制的臨床試驗(yàn)證實(shí)每周治療3次在6個(gè)月的治療結(jié)束時(shí)在大約50％(從40％到70％)的患者中引起血清ALT值降低(Davis等，1989，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志321,1501-1506；Marcellin等，1991，肝臟病學(xué)13,393-397；Tong等，1997，肝臟病學(xué)26,747-754；Tong等，肝臟病學(xué)26,1640-1645)。然而，干擾素治療停止后，大約50％有反應(yīng)的患者復(fù)發(fā)，導(dǎo)致通過血清ALT濃度來評(píng)價(jià)的“持續(xù)”反應(yīng)率為大約20至25％。此外，利用HCV RNA值的改變作為臨床終末點(diǎn)，對(duì)6個(gè)月I型干擾素治療進(jìn)行檢測(cè)證實(shí)高達(dá)35％的患者在治療結(jié)束時(shí)無法檢測(cè)到HCV RNA(Tong等，1997，同上)。然而，對(duì)于ALT終末點(diǎn)，大約50％的患者在治療停止后6個(gè)月復(fù)發(fā)，導(dǎo)致持續(xù)的病毒學(xué)反應(yīng)僅為12％(23)。對(duì)48周治療的研究證實(shí)持續(xù)的病毒學(xué)反應(yīng)高達(dá)25％。
核酶聯(lián)合IFN具有改善HCV或上述任何其他適應(yīng)癥治療效果的潛能。靶向于與疾病，例如傳染病、自身免疫病和癌癥相關(guān)的RNA的核酶可以單獨(dú)使用或與其他治療如IFN聯(lián)合以提高療效。
實(shí)施例下面為非限制性的實(shí)施例，其顯示了本發(fā)明的酶性核酸分子的篩選、分離、合成以及活性。
下面的實(shí)施例描述了切割HCV RNA的核酶的篩選。這里所述的方法代表一個(gè)方案，通過該方案可以衍生出切割其他HCV復(fù)制所需的RNA靶標(biāo)的核酶。
實(shí)施例1在HCV RNA中潛在的核酶切割位點(diǎn)的鑒定利用一種計(jì)算機(jī)折疊算法篩選HCVRNA的序列中可接近的位點(diǎn)。將不形成二級(jí)折疊結(jié)構(gòu)并含有潛在的錘頭型和/或發(fā)夾型核酶切割位點(diǎn)的mRNA區(qū)域鑒定出來。這些切割位點(diǎn)的序列示于表Ⅳ-Ⅷ中。
實(shí)施例2在HCV RNA中核酶切割位點(diǎn)的篩選為檢測(cè)通過基于計(jì)算機(jī)的RNA折疊算法預(yù)測(cè)的位點(diǎn)是否與在HCVRNA中的可接近位點(diǎn)相應(yīng)，選擇20個(gè)錘頭型位點(diǎn)用于分析。通過分析HCV的基因組序列(輸入序列=HPCJTA(Acc#D11168和D01171))和根據(jù)折疊排列位點(diǎn)的優(yōu)先順序，而選擇核酶的靶位點(diǎn)。設(shè)計(jì)能夠結(jié)合每個(gè)靶標(biāo)的錘頭型核酶(見圖1)，并通過計(jì)算機(jī)折疊單個(gè)分析(Christoffersen等，1994,J.Mol.Struc.Theochem,31l,273；Jaeger等，1989，美國國家科學(xué)院院報(bào)，86,7706)來評(píng)價(jià)核酶序列是否折疊成適當(dāng)?shù)亩?jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)那些在結(jié)合臂和催化核心之間具有不利的分子內(nèi)相互作用的核酶不予考慮。如下面所述，可以選擇不同的結(jié)合臂長度來優(yōu)化活性。通常，在每個(gè)臂上至少5個(gè)堿基能夠結(jié)合至靶RNA或與靶RNA相互作用。
通過對(duì)來自HCV基因型1b所感染患者的HCV RNA序列中所有錘頭型切割位點(diǎn)的掃描開始核酶試驗(yàn)對(duì)象的篩選。該序列分析的結(jié)果示于表Ⅲ中。如通過表Ⅲ所看到的，通過該分析鑒定出1300個(gè)錘頭型核酶位點(diǎn)。然后，為了鑒定可以在HCV基因組的保守區(qū)域中切割的錘頭型核酶試驗(yàn)對(duì)象，完成了來自基因型1a、1b、2a、2b、2c、3a、3b、4a、5a和6的大約50個(gè)HCV分離株的序列對(duì)齊排列。在基因型中，鑒定在所有被測(cè)的分離株間具有最大序列相同性的區(qū)域中的位點(diǎn)。該分析將錘頭型核酶試驗(yàn)對(duì)象減少至大約23個(gè)(表Ⅲ)。
由于HCV基因組的高度序列可變性，用于廣泛治療應(yīng)用的核酶的篩選可能應(yīng)該涉及HCV基因組的保守區(qū)。源自HCV基因組保守區(qū)(5’-非編碼區(qū)(NCR)、核心蛋白編碼區(qū)的5’-末端和3’-NCR)的一列30個(gè)錘頭型核酶示于表Ⅳ中。通常，以位于HCV基因組5’末端區(qū)域的位點(diǎn)為靶的核酶應(yīng)該阻斷翻譯，而切割位點(diǎn)位于基因組3’末端區(qū)域的核酶應(yīng)該阻斷RNA復(fù)制。
實(shí)施例3核酶的化學(xué)合成和純化設(shè)計(jì)錘頭型或發(fā)夾型基元的核酶與RNA信使中的各位點(diǎn)退火。結(jié)合臂與上述靶位點(diǎn)序列互補(bǔ)。對(duì)核酶進(jìn)行化學(xué)合成。所用的合成方法按照如在Usman等(1987，美國化學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)109,7845)、Scaringe等，(1990，核酸研究，18,5433)和Wincott等，同上，中所述的常規(guī)RNA的合成方法，并利用常用的核酸保護(hù)和偶聯(lián)基團(tuán)，例如在5’-端的二甲氧三苯甲基以及在3’-端的亞磷酰胺。平均每步偶聯(lián)產(chǎn)率大于98％。
通過置換轉(zhuǎn)換G5A6的順序以及將A14置換成U來合成無活性的錘頭型核酶(按Hertel等，1992，核酸研究20,3252編號(hào))。將發(fā)夾型核酶分成兩個(gè)部分合成，然后退火重建有活性的核酶(Chowrira和Burke,1992，核酸研究20,2835-2840)。利用T7噬菌體RNA聚合酶也可以由DNA模板合成核酶(Milligan和Uhlenbeck,1989，酶學(xué)方法180,51)。通過用核酸酶抗性基團(tuán)對(duì)核酶進(jìn)行修飾來提高穩(wěn)定性，例如，2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟基、2’-O-甲基、2’-H(綜述見Usman和Cedergren,1992,TIBS 17,34；)。利用普通的方法通過凝膠電泳純化核酶，或者通過高壓液相層析(HPLC；見Wincott等，同上，在此其整個(gè)被引入作為參考)來純化，并重懸于水中。在本研究中所用的化學(xué)合成核酶的序列示于表Ⅳ-Ⅸ中。
實(shí)施例4核酶對(duì)HCV RNA靶標(biāo)的體外切割如上所述設(shè)計(jì)并合成靶向于HCV的核酶?？梢泽w外檢測(cè)這些核酶的切割活性，例如利用下面的方法。在表Ⅳ中給出了在HCV中的靶序列和核苷酸位置。
切割反應(yīng)在[α-32p]CTP存在下通過體外轉(zhuǎn)錄制備用于核酶切割檢測(cè)的全長或部分全長、內(nèi)部標(biāo)記的靶RNA，并通過G50 Sephadex凝膠柱旋轉(zhuǎn)層析，不用進(jìn)一步純化即可用作底物RNA?；蛘呃肨4多核苷酸激酶將底物進(jìn)行5’-32p末端標(biāo)記。通過在核酶切割緩沖液(50mM Tris-HCl,37℃時(shí)pH7.5,10mM MgCl2)中預(yù)熱2×濃度的純化的核酶進(jìn)行檢測(cè)，而且通過向也在切割緩沖液中預(yù)熱的等體積底物RNA(最大為1-5nM)中加入2×核酶混合物來啟動(dòng)切割反應(yīng)。作為最初的篩選，在37℃利用終濃度為40nM或1mM的核酶檢測(cè)1小時(shí)，即，核酶過量。通過加入等體積的95％甲酰胺、20mMEDTA、0.05％溴酚藍(lán)和0.05％二甲苯腈藍(lán)終止反應(yīng)，隨后將樣品加熱至95℃2分鐘，迅速冷卻，并上樣于變性聚丙烯酰胺凝膠。在凝膠的放射自顯影上使底物RNA和通過核酶切割產(chǎn)生的特異性RNA切割產(chǎn)物顯影。通過代表完整底物和切割產(chǎn)物的條帶的PhosphorImager定量來確定切割的百分比。
實(shí)施例5HCV核酶切割在患者血清中HCV RNA的能力利用提供核酸酶抗性的修飾對(duì)靶向于HCVRNA中的位點(diǎn)的核酶進(jìn)行合成(Beigelman,1995，生物化學(xué)雜志270,25702)。已經(jīng)證實(shí)，來自慢性丙型肝炎患者的血清含有平均3×106個(gè)拷貝/ml的HCV RNA。為了進(jìn)一步篩選候選核酶產(chǎn)物，利用從基因型1b HCV患者的血清中分離的HCV RNA鑒定了30個(gè)HCV特異性核酶的HCV RNA切割活性。對(duì)由HCV基因型1b的篩選得到的最佳試驗(yàn)對(duì)象用來自廣泛的HCV基因型的分離株進(jìn)行篩選，所述基因型包括1a、1b、2a、2b、2c、3a、3b、4a、5a和6。因此，根據(jù)核酶試驗(yàn)對(duì)象廣泛切割來自多種HCV基因型和準(zhǔn)種的HCV RNA的能力篩選用于進(jìn)一步開發(fā)的核酶。
實(shí)施例6核酶對(duì)保守HCVRNA靶位點(diǎn)的體外切割在一個(gè)基因型內(nèi)和不同基因型間都有3個(gè)高度保守的基因組區(qū)域。這些保守序列出現(xiàn)在5’和3’非編碼區(qū)(NCR)以及核心蛋白編碼區(qū)的5’-端。這些區(qū)域被認(rèn)為對(duì)于HCV RNA復(fù)制和翻譯是重要的。因此，靶向于這些保守的HCV基因組區(qū)域的治療劑可能對(duì)廣泛的HCV基因型具有顯著的影響。準(zhǔn)種的存在以及不止一種基因型感染的可能使之成為有效治療的一個(gè)關(guān)鍵特征。此外，藥物抗性將不太可能發(fā)生，因?yàn)楸徽J(rèn)為引起藥物抗性的突變通常不會(huì)發(fā)生在這些高度保守的區(qū)域內(nèi)。為了靶向多種基因型以及降低產(chǎn)生藥物抗性的機(jī)會(huì)，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了在上述保守區(qū)域內(nèi)具有相同性的區(qū)域中切割的核酶。
對(duì)于5’NCR、核心蛋白編碼區(qū)的5’端和3’NCR進(jìn)行了序列對(duì)齊排列。對(duì)于5’NCR，將代表基因型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4f和5a的34個(gè)不同的分離株進(jìn)行了對(duì)齊排列。對(duì)齊排列包括從核苷酸位點(diǎn)1至核苷酸位點(diǎn)350的序列(ATG啟始密碼子下游的18個(gè)核苷酸)，利用所報(bào)導(dǎo)的序列“HPCK1S1”作為編號(hào)的參照。對(duì)于核心蛋白編碼區(qū)，將代表基因型1a、1b、2a、2b、2c、3a、3b、4a、4c、4f、5a和6a的44個(gè)不同的分離株進(jìn)行了對(duì)齊排列。這些對(duì)齊排列包括600個(gè)核苷酸，開始于ATG啟始密碼子的上游8個(gè)核苷酸。作為編號(hào)的參照，利用了所報(bào)導(dǎo)的序列“HPCCOPR”，將啟始密碼子ATG上游的第8個(gè)核苷酸“C”指定為“1”。對(duì)于3’NCR區(qū)，將代表基因型1b、2a、2b、3a和3b的20個(gè)不同的分離株進(jìn)行了對(duì)齊排列。這些對(duì)齊排列包括基因組3’末端的235個(gè)核苷酸中的序列，將所報(bào)導(dǎo)的序列“D85516”用作編號(hào)的參照，將從3’端起的第235個(gè)核苷酸指定為“1”。
在每個(gè)區(qū)域的對(duì)齊排列分析過程中，將每個(gè)序列與各自的參考序列(上面確定的)進(jìn)行比較，確定在所有分離株間相同的區(qū)域。在參照序列中確定所有潛在的核酶位點(diǎn)。選擇核酶位點(diǎn)的最先決條件為在切割位點(diǎn)和結(jié)合臂中的每個(gè)位置上，位點(diǎn)應(yīng)在對(duì)齊排列的所有分離株間具有100％的相同性。選擇符合這些標(biāo)準(zhǔn)的核酶位點(diǎn)。此外，制訂了兩個(gè)特定的讓步如下1)如果一個(gè)潛在的核酶位點(diǎn)在除了1個(gè)或2個(gè)外的所有核苷酸位置處具有100％的序列相同性，那么在其有差別的分離株中檢測(cè)那個(gè)位置上的真正的核苷酸。如果那個(gè)核苷酸是，使被設(shè)計(jì)來允許“G:U搖擺”堿基配對(duì)的核酶能夠?qū)λ蟹蛛x株發(fā)揮功能，那么選擇那個(gè)位點(diǎn)。2)如果一個(gè)潛在的核酶位點(diǎn)在除了1個(gè)或2個(gè)外的所有核苷酸位置處具有100％的序列相同性，那么檢測(cè)含有不同核苷酸的分離株的基因型。如果其有差別的分離株的基因型為非常罕見的，那么也選擇那個(gè)位點(diǎn)。
所鑒定的和下面所指的核酶位點(diǎn)利用下面的命名法“含有位點(diǎn)的基因組區(qū)域”隨后為“切割位點(diǎn)5’端的核苷酸位置”(根據(jù)上面所述的參照序列和編號(hào))。例如，在5’NCR中67位核苷酸處的一個(gè)核酶切割位點(diǎn)被指定為“5-67”，而在核心編碼區(qū)中48位處的一個(gè)核酶切割位點(diǎn)被指定為“c48”。
在體外HCV切割檢測(cè)中對(duì)很多這些核酶進(jìn)行篩選，選出適于細(xì)胞培養(yǎng)研究的核酶試驗(yàn)對(duì)象。選來用于進(jìn)行篩選的核酶靶向于HCV翻譯所必需的5’UTR區(qū)。這些位點(diǎn)在8個(gè)主要的HCV基因型和18個(gè)亞型間都保守，并且在用于上述分析的每個(gè)HCV分離株中具有高度的同源性。從人類患者中分離4個(gè)不同基因型(1b、2a、4和5)的HCV RNA，并利用RT-PCR擴(kuò)增5’HCV UTR和5’核心區(qū)。利用T7 Megascript轉(zhuǎn)錄試劑盒和制造商的方法(Ambion,Inc.)從RT-PCR產(chǎn)物中制備5’HCV UTR區(qū)的失控轉(zhuǎn)錄子(～750 nt的轉(zhuǎn)錄子)，所述的RT-PCR產(chǎn)物含有一個(gè)T7啟動(dòng)子。通過在Bio-Gel P-60樹脂(Bio-Rad)上的旋轉(zhuǎn)柱過濾去除未摻入的核苷酸。利用多核苷酸激酶(Boehringer/Mannheim)和150μCi/μlγ-32P-ATP(NEN)用酶制造商的方法以32p對(duì)過濾的轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行5’-末端標(biāo)記。將激酶處理的轉(zhuǎn)錄子再次進(jìn)行旋轉(zhuǎn)純化以去除未摻入的γ-32P-ATP并在5％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行凝膠純化。
選擇靶向于表Ⅳ中各種位點(diǎn)的核酶，并在5’HCV UTR轉(zhuǎn)錄子序列上檢測(cè)RNA切割的效率。如前面所述，合成了15個(gè)核酶(Wincott等，同上)。
通過在核酶切割緩沖液(50mM TRIS pH7.5、10mM MgCl2、10單位的RNase抑制物(Boehringer/Mannheim)、10mM DTT、0.5μg tRNA)中預(yù)熱2×(2μm)濃度的純化核酶進(jìn)行檢測(cè)，并且通過向也在切割緩沖液中預(yù)熱的等體積底物RNA(17.46pmole的終濃度)中加入2×核酶混合物來啟動(dòng)切割反應(yīng)。在37℃利用終濃度1μM的核酶將檢測(cè)進(jìn)行24小時(shí)，即核酶過量。通過加入等體積的95％甲酰胺、20mM EDTA、0.05％溴酚藍(lán)和0.05％二甲苯腈藍(lán)終止反應(yīng)，隨后將樣品加熱至95℃2分鐘，迅速冷卻，并上樣于變性聚丙烯酰胺凝膠。在凝膠的放射自顯影上使底物RNA和核酶切割產(chǎn)生的特異性RNA切割產(chǎn)物顯影。通過代表完整底物和切割產(chǎn)物的條帶的PhosphorImager定量來確定切割的百分比。
通過與RNA標(biāo)記物比較，從凝膠中所觀察到的切割片段的大小與推測(cè)的片段大小相關(guān)。由phosphorimage板確定目的切割片段的光密度，并從所檢測(cè)的每種基因型HCV轉(zhuǎn)錄子的最高密度到最低來排等級(jí)，其中最高密度表示最多的切割產(chǎn)物。對(duì)于每個(gè)所檢測(cè)的基因型(在15個(gè)所檢測(cè)核酶中)對(duì)排名最高的3個(gè)切割核酶給定等級(jí)為5，對(duì)隨后的3個(gè)最高密度給定等級(jí)為4，等等。將每種核酶的等級(jí)在所檢測(cè)的基因型間進(jìn)行平均。將單個(gè)核酶等級(jí)值和平均核酶等級(jí)值作圖并比較。結(jié)果(圖2)表明在這些所檢測(cè)的核酶中很多都能夠產(chǎn)生高水平的切割而與基因型無關(guān)。特別是，靶向于位點(diǎn)HCV.5-258、HCV.5-294、HCV.5-313(Sakamoto等，臨床研究雜志(J ClinicalInvestigation)1996,98(12):2720-2728)和HCV.5-318(表Ⅳ)的核酶似乎顯示一種一致的RNA切割模式。
實(shí)施例7在OST7細(xì)胞中利用靶向HCV的核酶抑制熒光素酶活性利用雙重報(bào)導(dǎo)基因系統(tǒng)檢測(cè)核酶的細(xì)胞內(nèi)抑制HCV RNA的能力，所述的雙重報(bào)導(dǎo)基因系統(tǒng)利用螢火蟲和Renilla熒光素酶(圖3)。核酶靶向于5’HCV UTR區(qū)，其切割后可以阻止轉(zhuǎn)錄子翻譯成熒光素酶。將OST-7細(xì)胞在含有10％胎牛血清、1％青霉素/鏈霉素以及1％的L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基中以每孔12,500個(gè)細(xì)胞接種于不透明壁的96孔板(Packard)中，并在37℃溫育過夜。將一種含有T7啟動(dòng)子并表達(dá)5’HCV UTR和螢火蟲熒光素酶的質(zhì)粒(T7C1-341(Wang等，1993，病毒學(xué)雜志67,3338-3344))與pRLSV40Renilla對(duì)照質(zhì)粒(Promega公司)混合，隨后加入核酶和陽離子脂質(zhì)來形成5×濃度的試劑(T7C1-341(4μg/ml)、pRLSV40 renilla熒光素酶對(duì)照(6μg/ml)、核酶(250nM)、轉(zhuǎn)染試劑(28.5μg/ml))。
將復(fù)合混合物在37℃溫育20分鐘。從細(xì)胞上去除培養(yǎng)基，并向孔中加入120μl Opti-mem培養(yǎng)基，隨后加入30μl的5×復(fù)合混合物。向保留有未處理之細(xì)胞的孔中加入150μl的Opti-mem。將復(fù)合混合物在OST-7細(xì)胞上溫育4小時(shí)，用被動(dòng)裂解緩沖液(Promega公司)裂解，并利用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒按照制造商的方法(Promega公司)對(duì)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行定量。在表Ⅳ中給出了所用的核酶序列。所用的核酶含有錘頭型基元。對(duì)錘頭型核酶進(jìn)行化學(xué)修飾以便核酶由在5個(gè)位置上的核糖殘基組成(見，例如圖7)；位置4具有2’-C-烯丙基或2’-氨基修飾；位置7具有2’-氨基修飾或2-O-甲基修飾；其余的核苷酸位置含有2’-O-甲基置換；在5’末端的4個(gè)核苷酸含有硫代磷酸酯置換。此外，核酶的3’末端包括一個(gè)3’-3’連接的倒置無堿基部分(無堿基脫氧核糖；iH)。所給數(shù)據(jù)(圖4)為在螢火蟲熒光素酶和Renilla熒光素酶間的熒光比值。相對(duì)于renilla熒光素酶，所有靶向于5’HCV UTR的核酶都能夠降低螢火蟲熒光素酶的信號(hào)。
實(shí)施例9與核酶的無活性對(duì)照相比核酶在OST-7細(xì)胞中介導(dǎo)的對(duì)熒光素酶活性的抑制將上述的雙重報(bào)導(dǎo)基因系統(tǒng)用來確定與核酶的無活性對(duì)照相比由核酶介導(dǎo)的熒光素酶活性降低的水平。如上合成針對(duì)位點(diǎn)HCV 313和318(表Ⅳ)的核酶及其無活性對(duì)照，所述的核酶具有在前面實(shí)施例中所述的化學(xué)組成。無活性對(duì)照具有與活性核酶相同的核苷酸堿基組成，但核苷酸序列被打亂。用于組織培養(yǎng)和熒光素酶檢測(cè)的方法完全按照在實(shí)施例8中所給出的，除了在5×復(fù)合混合物中的核酶濃度為1mM(細(xì)胞上的終濃度為200nM)。
結(jié)果在圖5中給出。與未處理和無活性對(duì)照相比，靶向于HCV.5-318的核酶能夠大大降低螢火蟲熒光素酶的活性。與無活性對(duì)照相比，靶向于HCV.5-313的核酶輕度降低螢火蟲熒光素酶的活性。
實(shí)施例10核酶對(duì)病毒復(fù)制的抑制在HCV感染過程中，病毒RNA在幾個(gè)過程中表現(xiàn)為核酶切割的潛在靶標(biāo)脫衣殼、翻譯、RNA復(fù)制和包裝。靶RNA在這些步驟中的任何一期更易或更難被核酶切割。雖然在HCV 5’UTR/熒光素酶報(bào)導(dǎo)基因系統(tǒng)(實(shí)施例9)中模擬了在HCV啟始核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和翻譯裝置間的聯(lián)系，但在OST7系統(tǒng)中并未重現(xiàn)這些其他的病毒過程。與靶病毒RNA相關(guān)的RNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物產(chǎn)物也不存在。此外，在HCV感染的細(xì)胞中這些過程是連貫的，其能夠進(jìn)一步影響靶RNA的可接近性。因此，我們檢測(cè)設(shè)計(jì)用于切割HCV5’UTR的核酶是否能夠?qū)Σ《緩?fù)制系統(tǒng)發(fā)揮作用。
最近，Lu和Wimmer鑒定了一個(gè)HCV-脊髓灰質(zhì)炎病毒嵌合體，其中脊髓灰質(zhì)炎病毒的IRES由來自HCV的IRES取代(Lu和Wimmer,1996，美國國家科學(xué)院院報(bào)93,1412-1417)。脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)與HCV類似為一種正鏈RNA病毒，但與HCV不同的是其為無包膜病毒，而且可在細(xì)胞培養(yǎng)中有效復(fù)制。與野生型PV相比，HCV-PV嵌合體表達(dá)穩(wěn)定的小噬班表型。
合成下面的核酶用于試驗(yàn)(表Ⅷ)靶向于位點(diǎn)183的核酶(35’-末端硫代磷酸酯連接)、針對(duì)位點(diǎn)183的打亂的對(duì)照、針對(duì)位點(diǎn)318的核酶(35’-末端硫代磷酸酯連接)、靶向于位點(diǎn)183的核酶(45’-末端硫代磷酸酯連接)、靶向于位點(diǎn)183的無活性核酶(45’-末端硫代磷酸酯連接)。用HCV-PV嵌合體感染HeLa細(xì)胞30分鐘并立即用核酶處理。以9000-10,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將HeLa接種于U型底的96孔板中并在5％CO2下于37℃溫育24小時(shí)。通過在含有5％胎牛血清(FBS)的DMEM中將10×的核酶(2000nM)和10×的陽離子脂質(zhì)(80μg/ml)混合來實(shí)現(xiàn)核酶(200nM)的轉(zhuǎn)染。使核酶/脂質(zhì)復(fù)合物于37℃在5％CO2下溫育15分鐘。將培養(yǎng)基從細(xì)胞上吸出，并代之以80μl含有5％FBS血清的DMEM(GibcoBRL)，隨后加入20μl的10X復(fù)合物。將細(xì)胞在5％CO2下于37℃同復(fù)合物溫育24小時(shí)。
通過空斑試驗(yàn)對(duì)處理細(xì)胞的HCV-PV產(chǎn)量進(jìn)行定量(圖6A)。通過在無血清DMEM(Gibco BRL)中稀釋病毒樣品并加100μl至在6孔板中的HeLa細(xì)胞單層(～80％融合)30分鐘來進(jìn)行空斑試驗(yàn)。用3ml 1.2％瓊脂(Sigma)覆蓋感染的細(xì)胞單層，并于37℃在5％CO2下溫育。2至3天后，移去覆蓋層，將細(xì)胞單層用1.2％的結(jié)晶紫染色，并計(jì)數(shù)空斑形成單位。數(shù)據(jù)示于圖6A中。與打亂的對(duì)照相比，針對(duì)于位點(diǎn)183的核酶抑制HCV-PV復(fù)制的水平＞80％(P＜0.05)(圖6A，前兩個(gè)條)。此外，3或4個(gè)硫代磷酸酯穩(wěn)定化在抑制病毒復(fù)制中同樣有效(每個(gè)同對(duì)照相比均P＜0.05)(在圖6A中比較第一個(gè)和第四個(gè)條)。針對(duì)位點(diǎn)318的核酶對(duì)病毒復(fù)制也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(P＜0.05)的效應(yīng)(在圖6A中比較第二個(gè)和第三個(gè)條)。
為了證實(shí)核酶的切割機(jī)制是所觀察到的HCV-PV復(fù)制的抑制原因，將HCV-PV感染的細(xì)胞用針對(duì)位點(diǎn)183的保留有結(jié)合臂序列而在催化核心中含有一個(gè)突變以削弱切割活性的核酶(表Ⅰ)來處理。與用打亂的對(duì)照核酶處理的細(xì)胞相比，這些細(xì)胞中的病毒復(fù)制并未被抑制(圖6A，第四個(gè)和第五個(gè)條)，表明核酶切割活性是所觀察的對(duì)HCV-PV復(fù)制的抑制所需的。此外，靶向于HCV 5’UTR的位點(diǎn)183的核酶對(duì)于野生型PV復(fù)制沒有作用(圖6B)。這些資料提供證據(jù)顯示核酶介導(dǎo)的對(duì)HCV-PV復(fù)制的抑制是依賴于HCV 5’UTR的，而不是對(duì)PV復(fù)制的普遍抑制。
還對(duì)靶向于位點(diǎn)183的核酶檢測(cè)了在HeLa細(xì)胞的單個(gè)感染性周期中抑制HCV-PV復(fù)制的能力(圖8)。用靶向于位點(diǎn)183的核酶(7/4形式)處理的細(xì)胞產(chǎn)生的病毒明顯比用打亂的對(duì)照處理的細(xì)胞少(在感染后8個(gè)小時(shí)＞80％的抑制，P＜0.001)。
實(shí)施例11縮短核酶的長度上面在實(shí)施例10中所述的所有核酶在每個(gè)結(jié)合臂上都含有7個(gè)核苷酸，并含有4個(gè)堿基配對(duì)的莖Ⅱ元件(7/4形式)。對(duì)于治療性核酶的藥物制造，如果可能，使序列長度最小化是有益的。因此如下縮短靶向于位點(diǎn)183的核酶通過從每個(gè)結(jié)合臂中移走最外側(cè)的核苷酸，以使核酶在每個(gè)結(jié)合臂中具有6個(gè)核苷酸，而莖Ⅱ區(qū)為4個(gè)堿基配對(duì)的長度(6/4形式)；在莖Ⅱ中移走一個(gè)堿基對(duì)(2個(gè)核苷酸)產(chǎn)生含3個(gè)堿基配對(duì)的莖Ⅱ(7/3形式)；或者從每個(gè)結(jié)合臂中移走一個(gè)核苷酸并將莖Ⅱ縮短一個(gè)堿基對(duì)(6/3形式)。(這些核酶的每一個(gè)的圖示見圖7)。所有被檢測(cè)形式的核酶對(duì)病毒復(fù)制產(chǎn)生顯著的抑制(圖8)，在8小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)上7/4、7/3和6/3形式幾乎相同(對(duì)于所有形式在整個(gè)時(shí)間過程內(nèi)P＜0.001)。所檢測(cè)的最短的核酶(6/3形式)(＞90％的抑制，P＜0.001)比7/4核酶(～80％的抑制，P＜0.001)略微更有效。6/3核酶可能具有在HCV-PV嵌合體中接近位點(diǎn)183的更強(qiáng)能力。
實(shí)施例12HCV核酶和干擾素的聯(lián)合療法在完全培養(yǎng)基(DMEM+5％FBS)中將HeLa細(xì)胞(每孔10,000個(gè)細(xì)胞)用12.5單位/ml的α干擾素預(yù)處理或者僅用完全培養(yǎng)基預(yù)處理4小時(shí)，然后用HCV-PV以MOI=0.1感染30分鐘。然后移走病毒接種物，并在完全培養(yǎng)基中將200nM靶向于HCV位點(diǎn)183的核酶(Rz)或結(jié)合力削弱的對(duì)照(BAC)利用陽離子脂質(zhì)傳遞24小時(shí)，其中所述的BAC在核酶的催化核心具有嚴(yán)重削弱核酶活性的突變。24小時(shí)后，通過凍/融3次裂解細(xì)胞來釋放病毒，并通過噬斑檢測(cè)對(duì)病毒進(jìn)行定量。將病毒產(chǎn)量表示為每ml的平均空斑形成單位(pfu/ml)+SEM。資料示于圖10中。
在對(duì)照處理的細(xì)胞中用干擾素(IFN)預(yù)處理將病毒產(chǎn)量降低了約10-1(BAC+IFN比BAC)。核酶處理的細(xì)胞產(chǎn)生比對(duì)照處理的細(xì)胞少2×10-1的病毒(Rz比BAC)。Rz和IFN治療的聯(lián)合處理使病毒產(chǎn)量協(xié)同性降低4×10-2(Rz+IFN比BAC)。加性效應(yīng)將導(dǎo)致僅僅3×10-1的降低(1×10-1+2×10-1)。
實(shí)施例13利用其他核酶基元抑制丙型肝炎病毒對(duì)多種不同的核酶基元(RPI基元1-3；圖9)檢測(cè)其在組織培養(yǎng)中抑制HCV繁殖的能力。RPI基元Ⅰ的一個(gè)實(shí)例描述于Kore等，1998，核酸研究26,4116-4120中，而RPI基元Ⅱ的一個(gè)實(shí)例描述于Ludwig和Sproat,PCT國際公開號(hào)WO 98/58058中。RPI基元Ⅲ是一種新的核酶基元，其為申請(qǐng)人最近開發(fā)的，而且在此檢測(cè)了該基元的一個(gè)實(shí)例。
將OST7細(xì)胞維持于補(bǔ)充有10％胎牛血清、L-谷氨酰胺(2mM)和青霉素/鏈霉素的Dulbecco’s的調(diào)整型Eagle’s培養(yǎng)基(GIBCO BRL)中。為了轉(zhuǎn)染，將OST-7細(xì)胞以12,500個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于不透明壁的96孔板(PackardInstruments)中，并在5％CO2下于37℃溫育24小時(shí)。通過下面的方法實(shí)現(xiàn)靶報(bào)導(dǎo)基因HCVT7C(0.8μg/ml)、對(duì)照?qǐng)?bào)導(dǎo)基因pRLSV40(1.2μg/ml)和核酶50-200nM的共轉(zhuǎn)染在150μl無血清的OPTI-MEM(GIBCO BRL)中制備HCVT7C(4μg/ml)、pRLSV40(6μg/ml)、核酶(250-1000nM)和陽離子脂質(zhì)(28.5μg/ml)的5×混合物。在5％CO2下于37℃溫育20分鐘使得可以形成報(bào)導(dǎo)基因/核酶/脂質(zhì)復(fù)合物。從OST-7細(xì)胞上吸出培養(yǎng)基，代之以120μl無血清Opti-MEM(GIBCO BRL)培養(yǎng)基，隨后立即加入30μl的5×報(bào)導(dǎo)基因/核酶/脂質(zhì)復(fù)合物。將細(xì)胞在5％CO2下于37℃同復(fù)合物溫育4小時(shí)。如在實(shí)施例7中所述進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。資料總結(jié)于表Ⅸ中，每種基元的結(jié)果連同其對(duì)照列出。與不靶向于任何HCV的核酶(無關(guān)對(duì)照)相比，所有的核酶基元都能降低細(xì)胞所產(chǎn)生的HCV的量。
細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)雖然已有HCV在細(xì)胞培養(yǎng)中復(fù)制的報(bào)導(dǎo)(見下)，但是這些系統(tǒng)難以重復(fù)，而且已證實(shí)不可靠。因此，由于開發(fā)諸如干擾素和病毒唑等其他抗HCV療法時(shí)情況也是如此，所以在動(dòng)物研究中證實(shí)了安全性后申請(qǐng)人可以直接進(jìn)入臨床可行性研究。
幾篇最近的報(bào)導(dǎo)證明了HCV在人細(xì)胞系中的體外生長(Mizutani等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究快訊(Biochem Biophys Res Commun)1996,227(3):822-826；Tagawa等，胃腸病學(xué)和肝臟病學(xué)雜志(Joumal ofGasteroenterology and Hepatology)1995,10(5):523-527；Cribier等，普通病毒學(xué)雜志(Joumal of General Virology)76(10):2485-2491；Seipp等，普通病毒學(xué)雜志1997,78(10):2467-2478；Iacovacci等，病毒學(xué)研究(ResearchVirology)1997,148(2):147-151；Iocavacci等，肝臟病學(xué)1997,26(5):1328-1337；Ito等，普通病毒學(xué)雜志1996,77(5):1043-1054；Nakajima等，病毒學(xué)雜志1996,70(5):3325-3329；Mizutani等，病毒學(xué)雜志1996,70(10):7219-7223；Valli等，病毒學(xué)研究1995,146(4):285-288；Kato等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究快訊1995,206(3):863-869)。在T和B細(xì)胞系以及源自人肝細(xì)胞的細(xì)胞系中都顯示了HCV的復(fù)制。利用基于RT-PCR的檢測(cè)或者b-DNA檢測(cè)證明了復(fù)制。重要的是要強(qiáng)調(diào)近期關(guān)于HCV細(xì)胞培養(yǎng)的出版物記錄了長達(dá)6個(gè)月的復(fù)制。
除了可以用HCV感染的細(xì)胞系外，幾個(gè)小組報(bào)導(dǎo)用全長或部分HCV基因組的cDNA克隆對(duì)細(xì)胞系的成功轉(zhuǎn)化(Harada等，普通病毒學(xué)雜志1995,76(5):1215-1221；Haramatsu等，病毒性肝炎雜志(Joumal of ViralHepatitis)1997,4S(1):61-67；Dash等，美國病理學(xué)雜志(American Journalof Pathology)1997,151(2):363-373；Mizuno等，胃腸病學(xué)(Gasteroenterology)1995,109(6):1933-40；Yoo等，病毒學(xué)雜志1995,69(1):32-38)。
動(dòng)物模型HCV感染的最佳動(dòng)物模型是黑猩猩。此外，由HCV感染所導(dǎo)致的慢性肝炎在黑猩猩和人中是非常相似的。雖然臨床上是相關(guān)的，但黑猩猩模型遭遇幾個(gè)應(yīng)用的阻礙，其使該模型的利用很困難。這些包括高的花費(fèi)、需要長期孵育以及缺少足夠數(shù)量的動(dòng)物。由于這些因素，很多小組試圖發(fā)展慢性丙型肝炎感染的嚙齒類模型。雖然直接感染還未成為可能，但幾個(gè)小組報(bào)導(dǎo)了在嚙齒類中部分或全部HCV基因組的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(Yamamoto等，肝臟病學(xué)1997,22(3):847-855；Galun等，傳染病雜志(Joumal of InfectiousDisease)1995,172(1):25-30；Koike等，普通病毒學(xué)雜志1995,76(12):3031-3038；Pasquinelli等，肝臟病學(xué)1997,25(3):719-727；Hayashi等，Princess Takamatsu Symp 1995,25:1430149；Mariya K,YotsuyanagiH,Shintani Y,Fujie H,Ishibashi K,Matsuura Y,Miyamura T,Koike K.丙型肝炎病毒核心蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)肝臟脂肪變性。普通病毒學(xué)雜志1997,78(7):1527-1531；Takehara等，肝臟病學(xué)1995,21(3):746-751；Kawamura等，肝臟病學(xué)1997,25(4):1014-1021)。此外，HCV感染的人的肝臟移植到免疫受損的小鼠體內(nèi)導(dǎo)致在動(dòng)物血液中可長時(shí)間檢測(cè)出HCVRNA。
診斷應(yīng)用本發(fā)明的核酶可以用作診斷工具來檢測(cè)在患病細(xì)胞中的遺傳學(xué)漂移和突變或檢測(cè)在細(xì)胞中HCVRNA的存在。
在核酶活性和靶RNA結(jié)構(gòu)之間的密切關(guān)系使得可以檢測(cè)在該分子的任何區(qū)域中的突變，所述的突變改變了靶RNA的堿基配對(duì)和三維結(jié)構(gòu)。通過利用多種在本發(fā)明中所述的核酶，可以繪制核苷酸改變的圖譜，所述的核苷酸改變對(duì)于在體外以及在細(xì)胞和組織中RNA的結(jié)構(gòu)和功能是重要的。核酶對(duì)靶RNA的切割可以用于抑制基因表達(dá)并(基本上)確定特定基因產(chǎn)物在疾病進(jìn)展中的作用。以這種方式，可以確定作為疾病重要介質(zhì)的其他遺傳學(xué)靶標(biāo)。通過提供聯(lián)合治療的可能性(例如，多種靶向于不同基因的核酶、與已知的小分子抑制物偶聯(lián)的核酶或者用核酶和/或其他化學(xué)或生物分子聯(lián)合進(jìn)行間歇性治療)，這些試驗(yàn)將導(dǎo)致對(duì)疾病進(jìn)展的更好治療。本發(fā)明核酶的其他體外應(yīng)用在本領(lǐng)于是眾所周知的，而且包括對(duì)與HCV相關(guān)狀態(tài)相關(guān)的mRNA存在的檢測(cè)。在利用標(biāo)準(zhǔn)的方法以核酶進(jìn)行治療后，通過確定切割產(chǎn)物的存在對(duì)此類RNA進(jìn)行檢測(cè)。
在一個(gè)特定的實(shí)例中，將僅僅能夠切割野生型或突變形式靶RNA的核酶用于進(jìn)行檢測(cè)。將第一個(gè)核酶用來鑒定在樣品中存在的野生型RNA，而第二個(gè)核酶將被用來鑒定樣品中的突變RNA。作為反應(yīng)對(duì)照，將用兩種核酶切割野生型和突變RNA的合成底物來證明在反應(yīng)中核酶的相對(duì)效率以及對(duì)“非靶標(biāo)”RNA種類的切割的缺乏。合成底物的切割產(chǎn)物還可作為樣品群中野生型和突變RNA分析的分子量標(biāo)志物。因此，每個(gè)分析將需要兩種核酶、兩種底物以及一個(gè)未知的樣品，這些將被合并成6個(gè)反應(yīng)。利用RNA酶保護(hù)試驗(yàn)來確定切割產(chǎn)物的存在以便在聚丙烯酰胺凝膠的一條泳道內(nèi)可以分析每種RNA的全長和切割片段。對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量來了解突變RNA的表達(dá)以及推測(cè)的目的表型改變?cè)诎屑?xì)胞中的風(fēng)險(xiǎn)是完全不需要的。蛋白產(chǎn)物參與了表型形成(即，HCV)的mRNA的表達(dá)足以確定風(fēng)險(xiǎn)。如果將具有相當(dāng)?shù)奶禺愋曰钚缘奶结樣糜趦煞N轉(zhuǎn)錄子，那么RNA水平的定性比較便足夠，而且會(huì)降低最初診斷的花費(fèi)。無論對(duì)RNA水平進(jìn)行定性還是定量比較，較高的突變形式與野生型的比率將與較高的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。
額外用途本發(fā)明的序列特異性酶性核酸分子的潛在有效性可能對(duì)RNA的研究具有許多與DNA限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)于DNA研究所具有的同樣的應(yīng)用(Nathans等，1975，生物化學(xué)年鑒(Ann.Rev.Biochem.)44:273)。例如，限制性片段的模式可以用來確立在兩種相關(guān)RNA之間的序列關(guān)系，而且可以將大的RNA特異性地切割成對(duì)研究更有利的大小的片段。對(duì)核酶進(jìn)行序列特異性改造的能力將有利于于未知序列RNA的切割。
其他實(shí)施方案包括在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
表1天然核酶的特征Ⅰ組內(nèi)含子·大小～150至大于1000個(gè)核苷酸。
·在靶序列中緊接切割位點(diǎn)的5’處需要一個(gè)U。
·在切割位點(diǎn)的5’-側(cè)結(jié)合4-6個(gè)核苷酸。
·反應(yīng)機(jī)制通過鳥苷的3’-OH攻擊來產(chǎn)生具有3’-OH和5’-鳥苷的切割產(chǎn)物。
·在一些情況下需要額外的蛋白質(zhì)輔因子來幫助折疊和維持活性結(jié)構(gòu)。
·超過300個(gè)已知為該類的成員。在嗜熱四膜蟲rRNA、真菌線粒體、葉綠體、T4噬菌體、藍(lán)綠藻等等中發(fā)現(xiàn)為間插序列。
·主要通過系統(tǒng)發(fā)生的比較、誘變和生物化學(xué)研究[1,2]確定主要的結(jié)構(gòu)特征。
·對(duì)一種核酶確定了完整的動(dòng)力學(xué)框架[3,4,5,6]。
·核酶折疊和底物錨定的研究在進(jìn)行中[7,8,9]。
1 Michel,Francois；Westhof,Eric.光滑的底物。自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)(Nat.Struct.Biol.)(1994),1(1),5-7.
2 Lisacek,Frederique；Diaz,Yolande；Michel,Francois..在基因組DNA序列中Ⅰ組內(nèi)含子核心的自動(dòng)鑒定。分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)(1994),235(4),1206-17.
3 Herschlag,Daniel；Cech,Thomas R..嗜熱四膜蟲核酶對(duì)RNA切割的催化。1.對(duì)與活性位點(diǎn)互補(bǔ)的RNA底物的反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)描述。生物化學(xué)(Biochemistry)(1990),29(44),10159-71.
4 HerSchlag,Daniel；Cech,Thomas R..通過嗜熱四膜蟲核酶對(duì)RNA切割的催化。2.在活性位點(diǎn)形成一個(gè)錯(cuò)配的RNA底物的反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)描述。生物化學(xué)(1990),29(44),10159-71.
5 Knitt,Deborah S.；Herschlag,Daniel..四膜蟲核酶的pH依賴性揭示一種明顯的pKa的非傳統(tǒng)來源。生物化學(xué)(1996),35(5),1560-70.
6 Bevilacqua,Philip C.；Suginoto,Naoki；Tumer,DouglaS H..對(duì)于由四膜蟲核酶催化的剪接的第二個(gè)步驟的機(jī)械框架。生物化學(xué)(1996),35(2),648-58.
7 Li,Yi；Bevilacqua,Philip C.；Mathews,David；Turner,Douglas H..通過四膜蟲核酶結(jié)合一種芘標(biāo)記底物的熱動(dòng)力學(xué)和活化參數(shù)錨定并非擴(kuò)散控制的，而是由有利的熵改變來驅(qū)動(dòng)的。生物化學(xué)(1995),34(44),14394-9.
8 Banerjee,AlokeRaj；Turner,Douglas H..化學(xué)修飾的時(shí)間依賴性揭示在Ⅰ組核酶的折疊中的緩慢步驟。生物化學(xué)(1995),34(19),6504-12.
·已對(duì)重要?dú)埢M(jìn)行了充分地化學(xué)修飾研究[10,11]。
·小的(4-6nt)結(jié)合位點(diǎn)可以使該核酶對(duì)靶RNA的切割過于非特異，然而四膜蟲Ⅰ組內(nèi)含子已被用來通過將新的β-半乳糖苷酶序列連接至缺陷的信使上來修復(fù)一種“缺陷的”β-半乳糖苷酶信使[12]。
RNA酶PRNA(M1 RNA)·大小～290至400個(gè)核苷酸。
·一種遍在的核糖核蛋白酶的RNA部分。
·切割tRNA前體以形成成熟的tRNA[13]。
·反應(yīng)機(jī)制可能通過M2+-OH的攻擊來產(chǎn)生具有3’-OH和5’-磷酸的切割產(chǎn)物。
·在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)RNA酶P。細(xì)菌、酵母、嚙齒類和靈長類的RNA亞單位已被測(cè)序。
·通過外部指導(dǎo)序列(EGS)與靶RNA的雜交有可能募集內(nèi)源性RNA酶P用于治療應(yīng)用[14,15]。
·最近鑒定了重要磷酸基團(tuán)和2’OH的接觸[16,17]。
9 Zarrinkar,Patrick P.；Williamson,James R..P9.1-P9.2的外周延伸幫助指導(dǎo)四膜蟲核酶的折疊。核酸研究(1996),24(5),854-8.
10 Strobel,Scott A.；Cech,Thomas R..在四膜蟲核酶反應(yīng)位點(diǎn)處保守的G.cntdot.U對(duì)的小溝識(shí)別。科學(xué)(華盛頓特區(qū))(1995),267(5198),675-9.
11 Strobel,Scott A.；Cech,Thomas R..在四膜蟲核酶切割位點(diǎn)處的保守G.cntdot.U對(duì)的環(huán)外胺導(dǎo)致5′-剪接位點(diǎn)的選擇和過渡態(tài)的穩(wěn)定。生物化學(xué)(1996),35(4),1201-11.
12 Sullenger,Bruce A.；Cech,Thomas R..通過靶由核酶介導(dǎo)的經(jīng)定向的反式剪接對(duì)缺陷mRNA的修復(fù)。自然(Nature)(倫敦)(1994),371(6498),619-22.
13 Robertson,H.D.；Altman,S.；Smith,J.D.生物化學(xué)雜志，247,5243-5251(1972).
14 Forster,Anthony C.；Altman,Sidney.一種RNA酶的外部指導(dǎo)序列?？茖W(xué)(華盛頓特區(qū)，1883-)(1990),249(4970),783-6.
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17 Pan,Tao；Loria,Andrew；Zhong,Kun.探索RNA中的三級(jí)相互作用在RNA酶P RNA和前-tRNA間的2′-羥基-堿基的接觸。美國國家科學(xué)院院報(bào)(1995),92(26),12510-14.
Ⅱ組內(nèi)含子·大小大于1000個(gè)核苷酸。
.最近證實(shí)了靶RNA的反式切割[18,19]。
·未完全確定序列要求。
·反應(yīng)機(jī)制內(nèi)部腺苷的2′-OH產(chǎn)生具有3′-OH的切割產(chǎn)物和含有一個(gè)3′-5′及一個(gè)2′-5′分支點(diǎn)的“套索”RNA。
·除了RNA切割和連接外,只有天然核酶被證實(shí)參與DNA切割[20,21]。
·通過系統(tǒng)發(fā)生比較很大程度上確立了主要的結(jié)構(gòu)特征[22]。
·開始鑒定重要的2′-OH接觸[23]。
·動(dòng)力學(xué)框架正在研究中[24]。
鏈孢霉屬VS RNA·大小～144個(gè)核苷酸。
·最近證實(shí)了發(fā)夾型靶RNA的反式切割[25]。
·未完全確定序列要求。
18 Pyle,AnnaMarie；Green,JustinB..構(gòu)建一個(gè)Ⅱ組內(nèi)含子核酶活性的動(dòng)力學(xué)框架結(jié)構(gòu)域間結(jié)合和反應(yīng)率的定量。生物化學(xué)(1994),33(9),2716-25.
19 Michels,WilliamJ.Jr.；Pyle,AnnaMarie.Ⅱ組內(nèi)含子轉(zhuǎn)變成選擇性切割寡核苷酸的多重轉(zhuǎn)化的核酶反應(yīng)機(jī)制和結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系的說明。生物化學(xué)(1995),34(9),2965-77.
20 Zimmerly,Steven；Guo,Huatao；Eskes,Robert；Yang,Jian；Perlman,Philip S.；Lambowitz,Alan M..一種Ⅱ組內(nèi)含子RNA是與內(nèi)含子移動(dòng)性有關(guān)的DNA內(nèi)切酶的催化成分。細(xì)胞(Cell)(Cambridge,Mass.)(1995),83(4),529-38.
21 Griffin,Edmund A.,Jr.；Qin,Zhifeng；Michels,Williams J.,Jr.；Pyle,Anna Marie.以相似的效率切割DNA和RNA連接而且不與底物的2’-羥基接觸的Ⅱ組內(nèi)含子核酶?；瘜W(xué)和生物學(xué)(Chem.Biol.)(1995),2(11),761-70.
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24 Daniels,Danette L.；Michels,William J.,Jr.；Pyle,Anna Marie.Ⅱ組內(nèi)含子自我剪接的兩個(gè)競(jìng)爭途徑體外反應(yīng)率和產(chǎn)物的定量分析。分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)(1996),256(1),31-49.
25 Guo,Hans C.T.；Collins,Richard A..由一種源自鏈孢霉屬VS RNA的核酶對(duì)一種莖環(huán)RNA底物的有效反式切割。歐洲分子生物學(xué)組織雜志(EMBOJ.)(1995),14(2),368-76.
·反應(yīng)機(jī)制通過2′-OH攻擊易斷裂的鍵來產(chǎn)生具有2′,3′-環(huán)磷酸酯和5′-OH末端的切割產(chǎn)物。
·未完全確定結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)需求。
·該類只有1個(gè)已知成員。發(fā)現(xiàn)于鏈孢霉屬VS RNA中。
錘頭型核酶(參考見文本)·大小～13到40個(gè)核苷酸。
·需要在緊鄰切割位點(diǎn)5′處的靶序列UH。
·在切割位點(diǎn)兩側(cè)結(jié)合可變數(shù)量的核苷酸。
·反應(yīng)機(jī)制通過2′-OH攻擊易斷裂鍵的5’端來產(chǎn)生具有2′,3′-環(huán)磷酸酯和5′-OH末端的切割產(chǎn)物。
·該類有14個(gè)已知的成員。發(fā)現(xiàn)于多種利用RNA作為感染因子的植物病原體(擬病毒)中。
·很大程度上確定了基本的結(jié)構(gòu)特征，包括2個(gè)晶體結(jié)構(gòu)[26,27]。
·證實(shí)了最小的連接活性(用于通過體外篩選來進(jìn)行遺傳改造)[28]。
·對(duì)2個(gè)或多個(gè)核酶確立了完整的動(dòng)力學(xué)框架[29]。
·對(duì)重要?dú)埢M(jìn)行了深入地化學(xué)修飾研究[30]。
發(fā)夾型核酶·大小～50個(gè)核苷酸。
·需要在緊鄰切割位點(diǎn)3′處的靶序列GUC。
·結(jié)合切割位點(diǎn)5′-側(cè)的4-6個(gè)核苷酸以及切割位點(diǎn)3′-側(cè)的可變數(shù)量的核苷酸。
26 Scott,W.G.,Finch,J.T.,Aaron,K.一種全RNA錘頭型核酶的晶體結(jié)構(gòu)RNA催化切割的一種推測(cè)的機(jī)制。細(xì)胞，(1995),81,991-1002.
27 McKay，錘頭型核酶的結(jié)構(gòu)和功能一個(gè)未完的故事。RNA,(1996),2,395-403.
28 Long,D.,Uhlenbeck,O.,Hertel,K.錘頭型核酶的連接。美國專利號(hào)5,633,133.
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30 Beigelman,L，等，錘頭型核酶的化學(xué)修飾。生物化學(xué)雜志，(1995)270,25702-25708.
·反應(yīng)機(jī)制通過2′-OH攻擊易斷裂的鍵的5’端來產(chǎn)生具有2′,3′-環(huán)磷酸酯和5′-OH末端的切割產(chǎn)物。
·該類有3個(gè)已知的成員。發(fā)現(xiàn)于3種利用RNA作為感染因子的植物病原體(煙草環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病毒和菊苣黃斑駁病毒的衛(wèi)星RNA)中。
·很大程度上確定了基本的結(jié)構(gòu)特征[31,32,33,34]。
·連接活性(除了切割活性)使核酶可以通過體外篩選來進(jìn)行遺傳改造[35]。
·對(duì)1種核酶確立了完整的動(dòng)力學(xué)框架[36]。
·開始重要?dú)埢幕瘜W(xué)修飾研究[37,38]。
丁型肝炎病毒(HDV)核酶·大小～60個(gè)核苷酸。
·證實(shí)了對(duì)靶RNA的反式切割[39]。
31 Hampel,Arnold；Tritz,Richard；Hicks,Margaret；Cruz,Phillip.“發(fā)夾型”催化性RNA模型螺旋存在的證據(jù)及底物RNA的序列要求。核酸研究(Nucleic Acids Res.)(1990),18(2),299-304.
32 Chowrira Bharat M.；Berzal-Herranz,Alfredo；Burke,John M..發(fā)夾型核酶實(shí)施催化所需的新型鳥苷。自然(倫敦)(1991),354(6351),320-2.
33 Berzal-Herranz,Alfredo；Joseph,Simpson；Chowrira,Bharat M.；Butcher,Samuel E.；Burke,John M..發(fā)夾型核酶的基本核苷酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。歐洲分子生物學(xué)組織雜志(1993),12(6),2567-73.
34 Joseph,Simpson；Berzal-Herranz,Alfredo；Chowrira,Bharat M.；Butcher,Samuel E..通過體外篩選、突變以及錯(cuò)配底物分析確定的發(fā)夾型核酶的底物篩選原則?；蚝桶l(fā)育(Genes Dev.)(1993),7(1),130-8.
35 Berzal-Herranz,Alfredo；Joseph,Simpson；Burke,John M..通過RNA催化的依序切割和連接反應(yīng)對(duì)活性發(fā)夾型核酶的體外篩選?；蚝桶l(fā)育(1992),6(1),129-34.
36 Hegg,Lisa A.；Fedor,Martha J..發(fā)夾型核酶分子間催化的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)。生物化學(xué)(1995),34(48),15813-28.
37 Grasby,Jane A.；Mersmann,Karin；Singh,Mohinder；Gait Michael J..發(fā)夾型核酶基本殘基中RNA的催化性切割所需的嘌呤功能基團(tuán)。生物化學(xué)(1995),34(12),4068-76.
38 Schmidt,Sabine；Beigelman,Leonid；Karpeisky,Alexander；Usman,Nassim；Sorensen,Ulrik S.；Gait,Michael J..發(fā)夾型核酶內(nèi)環(huán)B中基本核苷酸殘基的RNA切割對(duì)堿基和糖的要求。二級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)質(zhì)。核酸研究(1996),24(4),573-81。
39 Perrotta,AnneT.；Been,Michael D..由源自丁型肝炎病毒RNA序列的核酶對(duì)寡核糖核苷酸的切割。生物化學(xué)(1992),31(1),16-21.
·雖然無需切割位點(diǎn)5′的序列，但未完全確定結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)需求。折疊的核酶含有一個(gè)假結(jié)結(jié)構(gòu)[40]。
·反應(yīng)機(jī)制通過2′-OH攻擊易斷裂的鍵的5’端來產(chǎn)生具有2′,3′-環(huán)磷酸酯和5′-OH末端的切割產(chǎn)物。
·該類只有2個(gè)已知成員。發(fā)現(xiàn)于人HDV中。
·HDV的環(huán)形形式是有活性的而且表現(xiàn)出提高了的核酸酶穩(wěn)定性[41]。
40 Perrotta,Anne T.；Been,Michael D..丁型肝炎病毒RNA自我切割所需的假結(jié)樣結(jié)構(gòu)。自然(倫敦)(1991),350(6317),434-6.
41 Puttaraju,M.；Perrotta,Anne T.；Been,Michael D..一種環(huán)形反式作用的丁型肝炎病毒核酶。核酸研究(1993),21(18),4253-8.
表Ⅱ2.5μmol RNA合成循環(huán)試劑 當(dāng)量 數(shù)量 等待時(shí)間*亞磷酰胺 6.5 163μL 2.5S-乙基四唑23.8238μl 2.5乙酸酐100 233μL 5秒N-甲基咪唑186 233μL 5秒TCA 83.21.73mL 21秒碘8.0 1.18mL 45秒乙腈 NA 6.67mL NA*等待時(shí)間不包括在傳遞過程中的接觸時(shí)間表Ⅲ核酶篩選特征
*HCV基因型1b為原型毒株**基于對(duì)HCV基因型1a、1b、1c、2a、2b、2c、3a、3b、4a、4c、4f、5a和6a的序列對(duì)齊排列表Ⅳ源自HCV基因組保守區(qū)的錘頭型核酶
表ⅤHCV錘頭型核酶及靶序列
其中“X”代表HH核酶的莖Ⅱ區(qū)(Hertel等，1992，核酸研究，20∶3252)莖Ⅱ的長度可以為2個(gè)堿基對(duì)。
表Ⅵ其它HCV錘頭型(HH)核酶和靶序列
其中“X”表示HH核酶的莖Ⅱ區(qū)(Hertel等，1992，核酶研究，20∶3252)莖Ⅱ的長度可以為2個(gè)堿基對(duì)。
表ⅦHCV發(fā)莢型(HP)核酶和靶序列
其中“X”代表HP核酶的莖Ⅳ區(qū)(Berzal-Herranx等人，1993，歐洲分子生物學(xué)組織雜志12,2567)。莖Ⅳ的長度可以為2個(gè)堿基對(duì)。
表Ⅷ其它HCV保守的錘頭型核酶和靶序列
其中“X”代表HH核酶的莖Ⅱ區(qū)(Hertel等，1992核酸研究20∶3252)莖Ⅱ的長度可以為2個(gè)堿基對(duì)。編號(hào)1-3的核心參考序列=HPCCOPR(Acc#L38318)1-600 bp*-為了給核心蛋白編碼區(qū)中的核酶位點(diǎn)編號(hào)，將231位的核苷酸(啟始密碼子ATG上游的8個(gè)核苷酸)指定為“1”。編號(hào)4-12的3′-NCR參考序列=D85516(Acc#D85516)9301-9535 bp*-為了將3＇NCR中的核酶位點(diǎn)編號(hào)，而將9301位的核苷酸指定為“1”+-位置編號(hào)反映了HPCCOPR的參考序列表Ⅸ用多重核酶基元在OST7細(xì)胞中對(duì)HCV RNA的抑制
對(duì)化學(xué)修飾作如下說明小寫=2′-O-甲基粗體(非斜體)2′-NH2U=2′-C-烯丙基G,A=核糖G,As=硫代磷酸酯連接B=反向無堿基的I=核糖次黃苷
權(quán)利要求
1．酶性核酸分子，其特異性切割源自丙型肝炎病毒(HCV)的RNA，其中所述的酶性核酸分子位于錘頭型基元中，其中所述酶性核酸分子的結(jié)合臂包括與在表Ⅳ-Ⅵ和Ⅷ中所定義的任何底物序列互補(bǔ)的序列。
2．酶性核酸分子，其特異性切割源自丙型肝炎病毒(HCV)的RNA，其中所述的酶性核酸分子位于發(fā)夾型基元中，其中所述酶性核酸分子的結(jié)合臂包括與在表Ⅶ中所定義的任何底物序列互補(bǔ)的序列。
3．權(quán)利要求1所描述的酶性核酸分子，其中所述的酶性核酸分子包括一個(gè)長度大于或等于2個(gè)堿基對(duì)的莖Ⅱ區(qū)。
4．權(quán)利要求1或2所描述的酶性核酸分子，其中所述的核酸包括12到100個(gè)與所述RNA互補(bǔ)的堿基。
5．權(quán)利要求1或2所描述的酶性核酸分子，其中所述的核酸包括14到24個(gè)與所述mRNA互補(bǔ)的堿基。
6．權(quán)利要求2所描述的酶性核酸分子，其中所述的酶性核酸分子包括一個(gè)長度在3到7個(gè)堿基對(duì)之間的莖Ⅱ區(qū)。
7．權(quán)利要求2所描述的酶性核酸分子，其中所述的酶性核酸分子基本上由在表Ⅶ中所定義的任何核酶序列組成。
8．權(quán)利要求1所描述的酶性核酸分子，其中所述的酶性核酸分子基本上由在表Ⅳ-Ⅵ和Ⅷ中所定義的任何核酶序列組成。
9．藥物組合物，其包括權(quán)利要求1或2所描述的酶性核酸分子。
10．哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其包括權(quán)利要求1或2中任何一個(gè)所描述的酶性核酸分子。
11．權(quán)利要求10所描述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人的細(xì)胞。
12．表達(dá)載體，其包括編碼權(quán)利要求1或2所述酶性核酸分子的至少一種的核酸序列，所述酶性核酸分子能由該載體表達(dá)。
13．哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其包括權(quán)利要求12所描述的表達(dá)載體。
14．權(quán)利要求13所描述的細(xì)胞，其中所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人的細(xì)胞。
15．用于治療肝硬化、肝衰竭或肝細(xì)胞癌的方法，其包括如下步驟在適于所述治療的條件下，向患者施予權(quán)利要求1或2所描述的酶性核酸分子。
16．用于治療肝硬化、肝衰竭和/或肝細(xì)胞癌的方法，其包括如下步驟在適于所述治療的條件下，向患者施予權(quán)利要求1或2所描述的表達(dá)載體。
17．對(duì)具有HCV感染相關(guān)狀態(tài)的患者進(jìn)行治療的方法，其包括將所述患者的細(xì)胞與權(quán)利要求1或2所描述的核酸分子相接觸，而且進(jìn)一步還包括在適于所述治療的條件下使用一種或多種藥物治療。
18．權(quán)利要求1所描述的酶性核酸分子，其中所述的核酸分子包括至少5個(gè)核糖殘基，而且其中所述的核酸分子在5’末端核苷酸中至少3個(gè)處包括硫代磷酸酯連接，并且其中所述的核酸分子在其4號(hào)位置上包括一個(gè)2’-C-烯丙基修飾，且其中所述的核酸包括至少10個(gè)2’-O-甲基修飾，并且其中所述的核酸包括一個(gè)3’-末端修飾。
19．權(quán)利要求18所描述的酶性核酸分子，其中所述的核酸在所述的3’-末端包括一個(gè)3’-3’連接的反向無堿基部分。
20．權(quán)利要求1所描述的酶性核酸分子，其中所述的核酸分子包括至少5個(gè)核糖殘基，而且其中所述的核酸分子在5’末端核苷酸中至少3個(gè)處包括硫代磷酸酯連接，并且其中所述的核酸分子在其4號(hào)位置上和/或7號(hào)位置上包括一個(gè)2’-氨基修飾，且其中所述的核酸包括至少10個(gè)2’-O-甲基修飾，并且其中所述的核酸包括一個(gè)3’-末端修飾。
21．權(quán)利要求1所描述的酶性核酸分子，其中所述的核酸分子包括至少5個(gè)核糖殘基，而且其中所述的核酸分子在5’末端核苷酸中至少3個(gè)處包括硫代磷酸酯連接，并且其中所述的核酸分子在其4號(hào)位置上和/或7號(hào)位置上包括一個(gè)無堿基的置換，且其中所述的核酸包括至少10個(gè)2’-O-甲基修飾，并且其中所述的核酸包括一個(gè)3’-末端修飾。
22．權(quán)利要求1所描述的酶性核酸分子，其中所述的核酸分子包括至少5個(gè)核糖殘基，而且其中所述的核酸分子在5’末端核苷酸中至少3個(gè)處包括硫代磷酸酯連接，并且其中所述的核酸分子在其4號(hào)位置上和/或7號(hào)位置上包括一個(gè)6-甲基尿苷置換，且其中所述的核酸包括至少10個(gè)2’-O-甲基修飾，并且其中所述的核酸包括一個(gè)3’-末端修飾。
23．在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制HCV復(fù)制的方法，其包括如下步驟在適于所述抑制的條件下，向所述細(xì)胞施予權(quán)利要求1或2的酶性核酸分子。
24．切割一種獨(dú)立的RNA分子的方法，其包括在適于切割所述獨(dú)立RNA分子的條件下將權(quán)利要求1或2的酶性核酸分子與獨(dú)立的RNA分子相接觸。
25．權(quán)利要求24所描述的方法，其中在一種二價(jià)陽離子的存在下進(jìn)行所述的切割。
26．權(quán)利要求25所描述的方法，其中所述的二價(jià)陽離子為Mg2+。
27．權(quán)利要求1或2所描述的核酸分子，其中對(duì)所述的核酸進(jìn)行化學(xué)合成。
28．權(quán)利要求12所描述的表達(dá)載體，其中所述的載體包括a)一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)；b)一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)一個(gè)編碼至少一種所述核酸分子的基因；而且其中以一種使得所述的核酸分子可以表達(dá)和/或傳遞的方式將所述的基因可操作地連接至所述的啟始區(qū)和所述的終止區(qū)。
29．權(quán)利要求12所描述的表達(dá)載體，其中所述的載體包括a)一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)；b)一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)一個(gè)開放閱讀框；d)一個(gè)編碼至少一種所述核酸分子的基因，其中將所述的基因可操作地連接至所述開放閱讀框的3’-末端；而且其中以一種使得所述的核酸分子可以表達(dá)和/或傳遞的方式將所述的基因可操作地連接至所述的啟始區(qū)、所述的開放閱讀框和所述的終止區(qū)。
30．權(quán)利要求12所描述的表達(dá)載體，其中所述的載體包括a)一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)；b)一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)一個(gè)內(nèi)含子；d)一個(gè)編碼至少一種所述核酸分子的基因；而且其中以一種使得所述的核酸分子可以表達(dá)和/或傳遞的方式將所述的基因可操作地連接至所述的啟始區(qū)、所述的內(nèi)含子和所述的終止區(qū)。
31．權(quán)利要求12所描述的表達(dá)載體，其中所述的載體包括a)一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)；b)一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)一個(gè)內(nèi)含子；d)一個(gè)開放閱讀框；e)一個(gè)編碼至少一種所述核酸分子的基因，其中將所述的基因可操作地連接至所述開放閱讀框的3’-末端；而且其中以一種使得所述的核酸分子可以表達(dá)和/或傳遞的方式將所述的基因可操作地連接至所述的啟始區(qū)、所述的內(nèi)含子、所述的開放閱讀框和所述的終止區(qū)。
32．酶性核酸分子，其特異性地切割源自丙型肝炎病毒(HCV)的RNA，其中所述的酶性核酸分子為DNA酶。
33．權(quán)利要求1、2或32中任何一個(gè)所描述的的酶性核酸分子，其中所述的酶性核酸分子包括至少一個(gè)2’-糖基修飾。
34．權(quán)利要求1、2或32中任何一個(gè)所描述的的酶性核酸分子，其中所述的酶性核酸分子包括至少一個(gè)核酸堿基修飾。
35．權(quán)利要求1、2或32中任何一個(gè)所描述的的酶性核酸分子，其中所述的酶性核酸分子包括至少一個(gè)硫代磷酸酯修飾。
36．權(quán)利要求17所描述的方法，其中所述的藥物治療為I型干擾素。
37．權(quán)利要求36所描述的方法，其中將所述的I型干擾素和酶性核酸分子同時(shí)施予。
38．權(quán)利要求36所描述的方法，其中將所述的I型干擾素和酶性核酸分子分開施予。
39．權(quán)利要求36所描述的方法，其中所述的I型干擾素為α干擾素。
40．權(quán)利要求36所描述的方法，其中所述的I型干擾素為β干擾素。
41．權(quán)利要求36所描述的方法，其中所述的I型干擾素為γ干擾素。
42．權(quán)利要求36所描述的方法，其中所述的I型干擾素為共同干擾素。
43．治療具有HCV感染相關(guān)狀態(tài)的患者的方法，其包括將所述患者的細(xì)胞與權(quán)利要求32所描述的核酸分子相接觸，而且進(jìn)一步還包括在適于所述治療的條件下使用一種或多種藥物治療。
44．權(quán)利要求43所描述的方法，其中所述的藥物治療為I型干擾素。
45．權(quán)利要求44所描述的方法，其中將所述的I型干擾素和酶性核酸分子同時(shí)施予。
46．權(quán)利要求44所描述的方法，其中將所述的I型干擾素和酶性核酸分子分開施予。
47．權(quán)利要求44所描述的方法，其中所述的I型干擾素為α干擾素。
48．權(quán)利要求44所描述的方法，其中所述的I型干擾素為β干擾素。
49．權(quán)利要求44所描述的方法，其中所述的I型干擾素為γ干擾素。
50．權(quán)利要求44所描述的方法，其中所述的I型干擾素為共同干擾素。
全文摘要
酶性核酸分子,其調(diào)節(jié)丙型肝炎病毒的表達(dá)和/或復(fù)制。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1312856SQ99807262
公開日2001年9月12日 申請(qǐng)日期1999年4月26日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月27日
發(fā)明者勞倫斯·布拉特, 詹姆斯·A·麥克斯威根, 伊利莎白·羅伯茨, 帕梅拉·A·佩維科, 丹尼斯·麥西加克 申請(qǐng)人:利博齊姆醫(yī)藥公司