一種測(cè)定CS/siRNA復(fù)合體系中siRNA復(fù)合率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種SiRNA復(fù)合率的測(cè)定方法，具體說是一種殼聚糖作為SiRNA遞送 載體體系時(shí)形成的CS/siRNA復(fù)合體系中siRNA復(fù)合率的一種檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小干擾RNA(siRNA)由21~23個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成，可在細(xì)胞質(zhì)中特異性與其堿基對(duì)互 補(bǔ)的信使RNA(mRNA)結(jié)合并使其經(jīng)核酸酶降解，從而阻斷其編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)，即通過RNA 干擾（RNAi)實(shí)現(xiàn)基因沉默。因此，siRNA作為藥物在癌癥和流感、炎等病毒感染疾病治療 領(lǐng)域有重要科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。然而，荷負(fù)點(diǎn)的親水性siRNA難以跨越表面負(fù)電的疏水 性細(xì)胞膜，易被核酸酶降解及快速?gòu)难貉h(huán)中清除。因此需要安全高效的載體釋放系統(tǒng) 保護(hù)并高效運(yùn)送進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮功能。
[0003] 殼聚糖（Chitosan，CS),是由甲殼素（chitin)脫乙酰化制得的一種聚氨基葡萄 糖，是一種含3 (1，4) 2乙酰胺基D葡糖單元和3 (1，4) 2胺基D葡糖單元的共聚物。殼聚糖 是天然多糖中唯一的堿性多糖，含有游離氨基并在酸性條件下能結(jié)合氫離子，成為帶正電 荷的電解質(zhì)，可與帶負(fù)電荷siRNA通過靜電相互作用，自聚集形成納米結(jié)構(gòu)復(fù)合體系，無需 使用有機(jī)溶劑及超聲處理，減少對(duì)核酸損傷。由于殼聚糖載體纏繞、包裹而被束縛的siRNA 處于復(fù)合態(tài)，而不受束縛的siRNA處于游離態(tài)。
[0004] 評(píng)價(jià)CS/siRNA納米復(fù)合物質(zhì)量的指標(biāo)有粒徑及粒徑分布、表面zeta電位和siRNA 復(fù)合率等。其中siRNA復(fù)合率（即復(fù)合態(tài)siRNA占總siRNA百分率）對(duì)siRNA最終作用效 果以及殼聚糖材料優(yōu)化、成本核算等方面有重要影響。目前，用于測(cè)定殼聚糖載體體系中 siRNA復(fù)合率的方法往往存在較大的問題，如方法的靈敏性、重復(fù)性差，甚至無法定量。
[0005] 聚丙烯酰胺及瓊脂糖凝膠電泳法最常用于表征siRNA復(fù)合狀態(tài)。Xiudong Liu 等人報(bào)道了用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)法考察了殼聚糖分子量及脫乙酰度對(duì)siRNA 復(fù)合的影響（Xiudong Liua, Kenneth A. Howard, Mingdong Dong, et al. The if luence of polymeric properties on chitosan/siRNA nanoparticle formulation and gene silencing [J] ? Biomaterials28 (2007) 1280 - 1288.)。游離態(tài)siRNA在電場(chǎng)力作用下沿凝 膠孔遷移，而復(fù)合態(tài)siRNA由于納米?？臻g位阻作用不隨電場(chǎng)力遷移，最終游離態(tài)與復(fù)合 態(tài)siRNA發(fā)生分離。后經(jīng)siRNA熒光染料作用后紫外照射下siRNA呈現(xiàn)明亮的條帶，且條 帶明亮程度與游離siRNA濃度正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)組游離siRNA條帶與不含載體的對(duì)照組siRNA 對(duì)比后評(píng)價(jià)各條件下載體對(duì)siRNA復(fù)合能力。
[0006] 將納米粒復(fù)合物與游離siRNA分離后直接測(cè)定后者濃度可以得出siRNA復(fù)合率。 Xudong Yuan等利用離心方法將游離siRNA分離并測(cè)得siRNA復(fù)合率（Xudong Yuan, Bruhal A.Shah, Naimesh K.Kotadia et al. The Development and Mechanism Studies of Cationic Chitosan-Modified Biodegradable PLGA anoparticles for Efficient siRNA Drug Delivery[J]. Pharm Res(2010)27:1285 - 1295.)。制備的納米粒復(fù)合物懸液經(jīng) 3000rpm離心20min后，納米粒沉降而得以與游離siRNA分離。離心上清液經(jīng)紫外分光光度 計(jì)檢測(cè)260nm處紫外吸光度值，并利用繪制的siRNA濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離siRNA濃度，進(jìn)而計(jì)算得到納米粒體系siRNA復(fù)合率為最高位77. 7%。
[0007] 凝膠電泳法表征siRNA復(fù)合狀況，結(jié)果直觀明了，對(duì)比強(qiáng)烈，雖然可以通過圖像處 理軟件分析條帶亮度而給出復(fù)合率值，然而這種定量方法重復(fù)性難以滿足要求。離心、超濾 等方法分離游離siRNA并測(cè)定其濃度得出復(fù)合率的方法可以實(shí)現(xiàn)精確定量，但分離操作繁 瑣，且分離過程對(duì)siRNA復(fù)合狀態(tài)產(chǎn)生不可避免的影響，最終導(dǎo)致得到的復(fù)合率結(jié)果準(zhǔn)確 性差。同時(shí)，紫外燈檢測(cè)方法特異性弱，靈敏性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)現(xiàn)有方法的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種定量測(cè)定CS/siRNA體系中 siRNA復(fù)合率的方法，該方法無需將納米粒與游離siRNA分離，原位加入核酸燃料便可根據(jù) 熒光強(qiáng)度變化精確測(cè)定游離siRNA濃度。
[0009] 本發(fā)明定量檢測(cè)siRNA復(fù)合率是利用核酸染料與游離siRNA結(jié)合后熒光特性發(fā)生 改變的特性，根據(jù)siRNA濃度-熒光強(qiáng)度計(jì)算體系中游離siRNA濃度，進(jìn)而計(jì)算到siRNA復(fù) 合率。本發(fā)明所用核酸染料指SYBRU:Gold及SYBRliGreenI，均購(gòu)自美國(guó)Molecular Probes公司，原液為DMSO為溶劑濃度為10000X(10000倍）濃縮液，使用時(shí)根據(jù)需要選擇 合適的緩沖溶液將其稀釋至合適的濃度，如稀釋10000倍得濃度IX工作液，稀釋2000倍得 濃度5X工作液。核酸染料未與siRNA結(jié)合時(shí)，所發(fā)射熒光極其微弱，而嵌入siRNA后其熒 光強(qiáng)度增強(qiáng)500-1000倍。在CS/siRNA體系中核酸染料可與游離siRNA自由結(jié)合，而siRNA 復(fù)合后由于自身構(gòu)象變化及殼聚糖空間位阻作用將無法與染料嵌合。因此，根據(jù)加入核酸 染料后樣品熒光強(qiáng)度并結(jié)合siRNA濃度-熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出siRNA復(fù)合率。
[0010] 由此，本發(fā)明人利用核酸染料該熒光性質(zhì)，提出如下精準(zhǔn)測(cè)定CS/siRNA體系中 siRNA復(fù)合率的方法。
[0011] 本發(fā)明提出的具體技術(shù)方案：
[0012] (1)將摩爾濃度為Csi，體積為Vsi的SiRNA加入到質(zhì)量濃度為Wes，體積為Ves的殼 聚糖（chitosan，CS)溶液中，反應(yīng)經(jīng)時(shí)間T1后形成CS/siRNA復(fù)合物。
[0013] (2)將濃度為Csy、體積為Vsy核酸染料加入到步驟（1)制備的復(fù)合物溶液中，反應(yīng) 時(shí)間T2。
[0014] (3)將步驟（2)獲得的溶液測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)Ai為470-510nm，發(fā)射波長(zhǎng) 入 2 為 520_550nm)。
[0015] (4)配制系列siRNA濃度溶液，繪制siRNA濃度-熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0016] (5)使用步驟（3)獲得的熒光強(qiáng)度通過步驟（4)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到體系中游離 siRNA濃度為Csi_&M，并按照如下公式計(jì)算得出siRNA復(fù)合率CE:
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定CS/siRNA復(fù)合體系中SiRNA復(fù)合率的方法，其特征在于：將核酸染料加入 到CS/siRNA復(fù)合物溶液中，反應(yīng)5-60min，通過測(cè)定溶液中核酸染料的熒光強(qiáng)度，得到CS/ siRNA復(fù)合物體系中游離siRNA濃度，從而計(jì)算出siRNA復(fù)合率。
2. 按照權(quán)利要求1所述的測(cè)定CS/siRNA復(fù)合體系中siRNA復(fù)合率的方法，其特征在于 所述方法的具體步驟如下： (1) 將摩爾濃度為Csi、體積為Vsi的siRNA加入到質(zhì)量濃度為Wes、體積為V es的殼聚糖 (chitosan，CS)溶液中，反應(yīng)經(jīng)時(shí)間T1后形成CS/siRNA復(fù)合物； (2) 將濃度為Csy、體積為Vsy核酸染料加入到步驟（1)制備的復(fù)合物溶液中，反應(yīng)時(shí)間 T2; (3) 將步驟（2)獲得的溶液測(cè)定熒光強(qiáng)度；熒光的激發(fā)波長(zhǎng)λ i為470-510nm，發(fā)射波 長(zhǎng) λ 2 為 520-550nm ; (4) 配制體積為 Vsi+Vcs、摩爾濃度分別為 80nM、160nM、240nM、320nM、400nM 的 siRNA 溶 液，并加入將濃度為Csy、體積為Vsy核酸染料，反應(yīng)時(shí)間T2后檢測(cè)各濃度siRNA樣品熒光強(qiáng) 度，繪制siRNA濃度-熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線；熒光的激發(fā)波長(zhǎng)λ i為470-510nm，發(fā)射波長(zhǎng)λ 2 為 520_550nm ; (5) 將步驟（3)獲得的熒光強(qiáng)度代入步驟（4)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到體系中游離siRNA 摩爾濃度為Csi_f_，并按照如下公式計(jì)算得出siRNA復(fù)合率CE :
3. 按照權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定CS/siRNA復(fù)合體系中siRNA復(fù)合率的方法，其特征 在于：核酸染料為SYBRu Gold或SYBRx Green I。
4. 按照權(quán)利要求1所述的測(cè)定CS/siRNA復(fù)合體系中siRNA復(fù)合率的方法，其特征 在于：所述 Csi 為 0· 1-10μΜ，Vsi 為 l-100μ L，Wcs 為 0· 01-lmg/mL，Vcs 為 l-100μ L，T1 為 5-60min，Csy 為 0· 5-5Χ，Vsy 為 10-100 μ L，T2 為 5-60min。
5. 按照權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定CS/siRNA復(fù)合體系中siRNA復(fù)合率的方法，其特征 在于：該方法適合測(cè)定分子量20kDa-500kDa，脫乙酰度60%-95%范圍內(nèi)的殼聚糖所制備CS/ siRNA復(fù)合物中siRNA復(fù)合率。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測(cè)定殼聚糖（CS）基載siRNA復(fù)合物體系中siRNA復(fù)合率的方法。本發(fā)明以與雙鏈siRNA特異性結(jié)合的核酸染料加入到CS/siRNA復(fù)合物溶液中，通過測(cè)定溶液熒光強(qiáng)度并結(jié)合染料熒光強(qiáng)度-siRNA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算體系中游離siRNA濃度并得出siRNA復(fù)合率。本發(fā)明提供的方法無需將復(fù)合物與游離siRNA分離便可精確測(cè)定復(fù)合物體系中siRNA復(fù)合率，且具檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高、容易操作等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N21-64
【公開號(hào)】CN104655600
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410081450
【發(fā)明人】馬小軍, 張德蒙, 劉袖洞, 于煒婷
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2014年3月6日