一種基于納米材料光熱效應(yīng)的細(xì)胞檢測(cè)方法及其裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于納米材料光熱效應(yīng)的細(xì)胞檢測(cè)方法及其裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]目前用于細(xì)胞檢測(cè)的方法有多種，例如免疫細(xì)胞化學(xué)法、PCR技術(shù)、電化學(xué)法及微流控裝置等。盡管這些方法靈敏度較高，并廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及醫(yī)院臨床診斷，但多數(shù)方法需要先進(jìn)的儀器設(shè)備及復(fù)雜的操作過(guò)程、耗時(shí)耗力，不適用于快速檢測(cè)。因此，簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)方法仍需進(jìn)一步研宄。
[0003]試紙條檢測(cè)方法是一種方便、快捷的檢測(cè)方法，包括免疫層析及免疫滲濾兩種操作模式。該方法雖然簡(jiǎn)單、快速，但其靈敏度相比其它方法仍然偏低。近年來(lái)，研宄者從諸多方面致力于提高試紙條檢測(cè)的靈敏度。吳偉等利用膠體金層析技術(shù)檢測(cè)人類胚胎干細(xì)胞，通過(guò)裸眼觀測(cè)可以檢測(cè)到10000個(gè)干細(xì)胞，而采用讀卡器可以將檢出限降低至7000個(gè)干細(xì)胞，該方法特異性高并且可在20min內(nèi)完成。劉國(guó)棟等人利用免疫膠體金層析及適配體技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示，裸眼直接觀測(cè)的檢出限為4000個(gè)細(xì)胞，使用便攜式電子讀卡器可以將檢出限降低至800個(gè)細(xì)胞。但其檢測(cè)靈敏度仍需進(jìn)一步提高。
[0004]乳腺癌是目前最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤疾病，也是世界上引起高死亡率的癌癥之一?？焖僮R(shí)別檢測(cè)乳腺癌腫瘤細(xì)胞有助于乳腺癌的診斷。但目前由于受限于細(xì)胞的檢測(cè)方法，往往因診斷不及時(shí)而錯(cuò)過(guò)了乳腺癌最佳的治療時(shí)間。因此，提供一種使用方法簡(jiǎn)單，能夠用于乳腺癌腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的試紙條具有較高應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種基于納米材料光熱效應(yīng)的細(xì)胞檢測(cè)方法及其裝置。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供該檢測(cè)裝置在乳腺癌腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008]一種基于納米材料光熱效應(yīng)的細(xì)胞檢測(cè)的裝置，由石墨烯-金-抗體復(fù)合物、滲濾試紙條和檢測(cè)設(shè)備組成；
[0009]所述石墨稀-金-抗體復(fù)合物由石墨稀-金納米材料和抗體按(0.5?2)mL:(0.1?I) μ g的比例混合，室溫振搖反應(yīng)4?8h，4°C過(guò)夜保存，4°C 1000r離心30min，棄上清，用儲(chǔ)存液將沉淀復(fù)溶，即得石墨烯-金-抗體復(fù)合物；其中，石墨烯-金納米材料和抗體加入量的比例關(guān)系是納米復(fù)合物的形成的關(guān)鍵影響因素，低于上述比例范圍，則會(huì)造成制備的納米材料上的抗體量太少，高于上述比例范圍，則會(huì)產(chǎn)生聚沉，按(0.5?2)mL石墨稀-金納米材料:(0.1?I) μ g抗體進(jìn)行混合，則能形成良好的納米復(fù)合物，上述比例范圍的選擇是通過(guò)無(wú)數(shù)次的實(shí)驗(yàn)，不斷的分析摸索才得到的，并非能通過(guò)有限次的實(shí)驗(yàn)就能得到。
[0010]所述石墨烯-金納米材料的制備方法為:將HAuCl4水溶液加熱至沸騰，保持煮沸Imin后，劇烈攪拌下迅速加入檸檬酸鈉，持續(xù)攪拌，至溶液變?yōu)榧t褐色時(shí)，加入氧化石墨烯，至溶液變?yōu)榧t色，待顏色保持不變后繼續(xù)煮沸并攪拌10?15min，停止加熱，冷卻，加入聚乙二醇。離心，除去多余的石墨烯及聚乙二醇，沉淀物用雙蒸水復(fù)溶，使溶液體積與離心前體積相同，即得石墨稀-金納米材料。
[0011]其中，所述HAuCl4水溶液為將ImL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %的HAuCl 4水溶液，用雙蒸水稀釋定容至10mL ;所述檸檬酸三鈉為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的檸檬酸三鈉溶液，加入量為3.5mL ；氧化石墨烯溶液的加入量為7mg。
[0012]所述儲(chǔ)存液是由0.7628g/L的硼酸鈉(Na2B4O7)、1.0g/L的疊氮鈉(NaN3)、1.0g/L的牛血清白蛋白(BSA)組成；
[0013]復(fù)溶用儲(chǔ)存液的加入量為原石墨烯-金納米材料和抗體混合液體積的1/10。
[0014]所述滲濾試紙條的制備方法為:將抗體用包被液稀釋，抗體與包被液的加入量的比為I yg:4-6 μ L，將用包被液稀釋后的抗體滴加到硝酸纖維素膜的加樣區(qū)內(nèi)，包被，然后加入封閉液，于37°C干燥箱中封閉30min，PBST溶液沖洗三次并晾干，即得滲濾試紙條；
[0015]所述包被液為含有I?10% (v/v，單位mL/mL)甲醇的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)；
[0016]所述封閉液為含0.1?0.5% (v/v,單位mL/mL)吐溫20與I?5% (m/v，單位g/mL) BSA 的 0.01mol/L 的 PBS 緩沖液；
[0017]所述PBST溶液為含有0.1?I % (v/v,單位mL/mL)吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽溶液；
[0018]其中，包被液、封閉液的組成能夠影響檢測(cè)的靈敏度，本發(fā)明研宄證明，采用含有I?10% (v/v)甲醇的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)作為包被液，采用含0.1?0.5% (v/v)吐溫20與I?5% (m/v)BSA的0.01mol/L的PBS緩沖液作為封閉液，能夠有效的降低背景，提高檢測(cè)的靈敏度。采用含有0.1?1% (v/v，單位mL/mL)吐溫20的
0.01mol/L磷酸鹽溶液(即PBST溶液)進(jìn)行沖洗，其效果較好，能有效的降低背景。
[0019]優(yōu)選的，所述包被液為含有6% (v/v)甲醇的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)；
[0020]優(yōu)選的，所述封閉液為含0.2 % (v/v)吐溫20與2 % (m/v)BSA的0.01mol/L的PBS緩沖液；
[0021]優(yōu)選的，所述沖洗液為含有0.4% (v/v)吐溫20的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBST緩沖液)；
[0022]所述包被的條件為:37°C干燥箱中包被2h或室溫過(guò)夜包被；
[0023]所述檢測(cè)設(shè)備包括激光筆和溫度測(cè)定裝置；其中，所述激光筆為近紅外激光筆，所述溫度測(cè)定裝置為紅外測(cè)溫槍。
[0024]采用該裝置進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)的方法，步驟如下:
[0025](I)細(xì)胞預(yù)處理:將待檢測(cè)細(xì)胞溶液置入EP管內(nèi)，1500r/min離心5min，棄上清，
0.0lmol/L的PBS復(fù)溶后再離心；重復(fù)三次上述操作，棄上清，用10 μ L 0.0lmol/L的PBS緩沖液將離心沉淀溶解后待用；
[0026](2)將步驟⑴處理好的細(xì)胞樣品滴加到滲濾試紙條上加樣區(qū)內(nèi)，PBST溶液沖洗三次；
[0027](3)再向滲濾試紙條的加樣區(qū)內(nèi)加入石墨烯-金-抗體復(fù)合物，PBST溶液沖洗三次并晾干；
[0028](4)用激發(fā)波長(zhǎng)為808nm的激光照射檢測(cè)裝置的加樣區(qū)10?90s，在此范圍內(nèi)可產(chǎn)生較高的溫度變化，有利于提高靈敏度，超過(guò)此范圍容易損壞試紙條，記錄照射前后的溫度，計(jì)算溫度差，以細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，溫度差為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)某一樣品，可通過(guò)測(cè)定樣品的溫度差，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。
[0029]步驟⑵中樣品的加入量和步驟(3)中石墨烯-金-抗體復(fù)合物加入量的比為10 μ L:5-20 μ L ;石墨烯-金-抗體復(fù)合物的加入量會(huì)影響檢測(cè)的結(jié)果，高于此范圍，細(xì)胞結(jié)合的石墨烯-金-抗體復(fù)合物會(huì)超過(guò)飽和值，造成不必要的浪費(fèi)，低于此范圍，結(jié)合到細(xì)胞上的石墨烯-金-抗體復(fù)合物數(shù)量減少，會(huì)降低靈敏度。
[0030]本發(fā)明的基于納米材料光熱效應(yīng)的細(xì)胞檢測(cè)的裝置可用于不同種類細(xì)胞的檢測(cè)，用于不同細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，制備石墨烯-金-抗體復(fù)合物加入的抗體不同，所加入的抗體應(yīng)與被檢測(cè)細(xì)胞特異性結(jié)合。
[0031]本發(fā)明的檢測(cè)原理是基于待檢測(cè)細(xì)胞與加樣區(qū)包被的能夠與待檢測(cè)細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體結(jié)合后，由于包被的抗體與石墨烯-金納米材料標(biāo)記所用的抗體來(lái)自不同的動(dòng)物免疫，因此與待檢測(cè)細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)不同。加入石墨烯-金-抗體復(fù)合物后，復(fù)合物上的抗體也會(huì)與待檢測(cè)細(xì)胞結(jié)合，從而形成抗體-細(xì)胞-抗體的夾心結(jié)構(gòu)。被捕獲的待檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目越多，結(jié)合在加樣區(qū)的石墨烯-金-抗體復(fù)合物就越多，鑒于石墨烯-金納米材料的光熱效應(yīng)，加樣區(qū)在808nm的激光照射下升溫也就越高。以細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，溫度差為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，針對(duì)特定樣品，通過(guò)測(cè)定樣品的溫度差，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算得到待檢物中的細(xì)胞數(shù)。
[0032]本發(fā)明的有益效果:
[0033](I)本發(fā)明的基于納米材料光熱效應(yīng)的檢測(cè)裝置及其檢測(cè)方法能夠適用于多種細(xì)胞的檢測(cè)，適用范圍廣；
[0034](2)本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的操作步驟，檢測(cè)時(shí)間短，通過(guò)激光照射和溫度測(cè)定，能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測(cè)；
[0035](3)本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度較高，本發(fā)明系首次將石墨烯的光熱效應(yīng)引入試紙條檢測(cè)方法中，使檢測(cè)靈敏度得以提高，并通過(guò)將石墨烯與納米金復(fù)合以降低檢測(cè)背景，進(jìn)一步提高了細(xì)胞檢測(cè)的靈敏度，采用本發(fā)明的檢測(cè)方法其檢出限為600個(gè)細(xì)胞，與現(xiàn)有技術(shù)中同類型的檢測(cè)方法的檢測(cè)限(800個(gè)細(xì)胞)相比，檢測(cè)限的標(biāo)準(zhǔn)提高了 25%。
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1為本發(fā)明的MCF-7細(xì)胞檢測(cè)裝置的制備及檢測(cè)流程示意圖；
[0037]圖2本發(fā)明實(shí)施例2繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0038]結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0039]實(shí)施例1:基于納米材料光熱效應(yīng)的MCF-7細(xì)胞檢測(cè)裝置的制備
[0040]1.石墨稀-金納米材料的制備
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