專利名稱：1β－氧代－5,11(13)－二烯桉烷－12－酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類天然產(chǎn)物桉烷型倍半萜酸衍生物，即1β-氧代-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸在制備治療乙肝病毒感染疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的傳染病。通過(guò)血液與體液傳播，具有慢性攜帶狀態(tài)。本病在我國(guó)廣泛流行，人群感染率高，在某些地區(qū)感染率達(dá)到35％以上。據(jù)有關(guān)資料，肝炎檢測(cè)陽(yáng)性的患者已經(jīng)達(dá)到1.89億，而應(yīng)就診未就診人數(shù)(攜帶者)將近4億。是當(dāng)前危害人民健康最嚴(yán)重的傳染病之一。乙肝臨床表現(xiàn)多樣化，易發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化，少數(shù)病人可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝癌?，F(xiàn)在乙型肝炎的治療主要有核苷類藥物、保肝類藥物和免疫制劑等，但均不能完全控制病情的進(jìn)展。目前核苷類藥物中最常用也是最有效的是拉米夫啶，但其長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致耐藥性，停藥后易反跳，這嚴(yán)重影響了藥物的療效。
目前使用的抗病毒藥物其實(shí)只是病毒復(fù)制的抑制劑，并不能直接殺滅病毒和破壞病毒體，否則就會(huì)損傷宿主細(xì)胞。這些抗病毒藥物還存在毒副作用大、易引起病毒基因突變、停藥后易反跳等缺點(diǎn)，因此開(kāi)發(fā)新型抗病毒藥是當(dāng)今藥物研發(fā)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。
桉烷型倍半萜酸是十五個(gè)碳構(gòu)成骨架的萜類化合物，其特征是12位碳氧化為羧酸。桉烷型倍半萜類化合物一般具有多種生物活性，報(bào)道多集中在抗腫瘤、抗菌、抗瘧和抗真菌方向。最近國(guó)外發(fā)現(xiàn)該類桉烷型倍半萜醇具有多種抗病毒活性。如1996年Hayashi等(Journal of Antimicrobial Chemotherapy，1996，37(4)，759-768)對(duì)Tripterygium屬植物Tripterygium wilfordii Hook fil.var.regelii Makino進(jìn)行研究時(shí)分離得到了一個(gè)對(duì)1型單純皰疹病毒(herpes simplex virus type 1，HSV-1)選擇性治療指數(shù)(treatmentindex，TI)超過(guò)10的化合物Triptofordin C-2(化合物1)。
1999年Duan等(Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu，1999，41st，535-540)對(duì)Tripterygium屬的植物Tripterygium hypoglaucum(Levi.)Hutch的根部位的甲醇提取物的乙酸乙酯部分進(jìn)行了系統(tǒng)分離，得到化合物2，并發(fā)現(xiàn)它具有一定的抗HIV病毒的活性，同時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞因子的生成。在對(duì)該植物的繼續(xù)深入研究(Duan等，Journalof Natural Products，2000，63(3)，357-361)中分離到的新的桉烷型倍半萜生物堿衍生物Triptonine B(化合物3)體現(xiàn)了潛在的抗HIV病毒的活性，其半數(shù)有效值(EC50)小于0.1μg/ml，而且它的體外治療指數(shù)大于1000，所以很有開(kāi)發(fā)價(jià)值。
2002年Hoang Vu Dinh等(Phytochemistry，2002，59(3)，325-329)從Litseaverticillata Hance(Lauraceae)中分離得到新的桉烷型倍半萜verticillatol(化合物4)，用被HIV病毒感染的骨肉瘤(human osteosarcoma)HOG.R5細(xì)胞作為模型進(jìn)行的測(cè)試表明其具有抗愛(ài)滋病毒的活性(其半抑制濃度IC50值為34.5μg/ml)，同時(shí)在20μg/ml時(shí)檢測(cè)不到其對(duì)細(xì)胞的毒性，可以作為抗愛(ài)滋病的先導(dǎo)化合物。
2004年Sun等(Journal of Natural Products，2004，67(12)，1975-1979)報(bào)道了從Caragana intermedia分離到的新桉烷型倍半萜4(15)-桉烷-1β，7α-二醇(5)對(duì)感染入MT-2細(xì)胞的HIV-IIIB病毒的最低抑制濃度為10μg/ml，而另外三個(gè)化合物(6，7，8)則顯示了對(duì)稻瘟病病毒的抑制作用，最低抑制濃度分別為12，16和20μg/ml。
總結(jié)一下上述研究結(jié)果，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)至今已報(bào)道之具有抗病毒活性的桉烷型倍半萜化合物多集中在桉烷醇類化合物上，而桉烷酸類化合物尚少有研究者涉足。發(fā)明人因而進(jìn)一步對(duì)前人未加研究過(guò)的桉烷型倍半萜酸類衍生物進(jìn)行抗病毒活性測(cè)試。
本發(fā)明人以往工作中曾系統(tǒng)研究了云南民間治療流感和腮腺炎的草藥菊科六棱菊屬植物靈丹草(即齒翼六棱菊Laggera pterodonta(DC.)Benth)和六棱菊(Laggera alata(D.Don)Sch.-Bip.ex Oliv)的化學(xué)成分和藥理作用，發(fā)現(xiàn)其中蘊(yùn)含大量的桉烷型倍半萜酸類化合物[周長(zhǎng)新，趙昱等，中國(guó)中藥雜志，(綜述)2006，31(14)，1133-1140，以及該文引用的相關(guān)文獻(xiàn)]。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，靈丹草和六棱菊的提取物具有顯著的抗炎作用，能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，對(duì)角叉菜所致大鼠足趾腫脹、角叉菜所致大鼠胸膜炎具有明顯的抑制作用[伍義行(Yihang Wu)，趙昱等，Journalof Ethnopharmacology，2006；伍義行(Yihang Wu)，趙昱等，Phytotherapy Research，2006，20(7)，585-590]。本發(fā)明人在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上作了進(jìn)一步的研究，主要針對(duì)該種植物化學(xué)單體成分抗病毒活性進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)從六棱菊屬藥用植物中提取的一類具有1β-氧代-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸骨架的桉烷型倍半萜酸具有顯著的抗乙肝病毒作用，該類桉烷型倍半萜酸同時(shí)具有降低乙肝表面抗原的作用，并經(jīng)文獻(xiàn)查閱，到目前為止，尚沒(méi)有關(guān)于該類化合物治療乙肝病毒感染性疾病和制備抗乙肝病毒藥物的報(bào)道。據(jù)此完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了式(1)所示的一類高效低毒的具有1β-氧代-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸骨架的桉烷型倍半萜酸及其可藥用鹽或溶劑化物，具體地說(shuō)是該類桉烷型倍半萜酸在治療乙肝病毒感染性疾病和制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。
式(1)其中式(1)中，R為氫、1～8個(gè)碳的烷氧基、或?yàn)橐驭粱颚聵?gòu)型與C-1上氧原子相聯(lián)的五碳糖和六碳糖。本發(fā)明中式(1)所示桉烷型倍半萜酸優(yōu)選從植物中分離純化，更優(yōu)選從菊科植物中得到，最優(yōu)選從菊科六棱菊屬植物靈丹草或六棱菊中得到。
從菊科六棱菊屬植物靈丹草或六棱菊中得到的式(1)化合物具體為化合物1-a1β-羥基-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸；化合物1-b1β-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-4α氫-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸。
本發(fā)明的又一目的是提供了式(1)化合物用于防治乙型病毒性肝炎、降低乙肝表面抗原的用途；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種含有式(1)化合物的防治乙型病毒性肝炎、降低乙肝表面抗原的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(1)化合物，或者它的可藥用鹽和可藥用輔料。其可以是片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、貼片劑、皮下植埋劑、外用搽劑、口服液或軟膏劑，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。
具體實(shí)施例方式
該式(1)所示之桉烷型倍半萜酸的制備方法，可參見(jiàn)發(fā)明人等研究者已經(jīng)發(fā)表文章(李順林、丁靖凱，云南植物研究，1996，6(3)，349；趙昱(Yu Zhao)等，J Nat Prod，1997，60(6)645。)本發(fā)明根據(jù)文獻(xiàn)中描述的方法制備得到式(1)化合物，純化得到的化合物1-a其光譜數(shù)據(jù)與上述文獻(xiàn)中1β-hydroxy pterodontic acid即1β-羥基臭靈丹酸的報(bào)道值相符。此處我們按照其學(xué)名稱1-a化合物為1β-羥基-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸，其英文名為1β-hydroxy-5，11(13)-dien-eudesman-12-oic acid。純化得到的化合物1-b其光譜數(shù)據(jù)與上述文獻(xiàn)中pterodontoside A即臭靈丹苷A的報(bào)道值相符。此處我們按照其學(xué)名稱化合物1-b為1β-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-4α氫-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸，其英文名為1β-(β-D-glucopyranosyloxy)-4αH-5，11(13)-dien-eudesman-12-oic acid。純化得到的化合物光譜如下化合物1-a1β-羥基-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸1H-NMR(氘代吡啶，400MHz)6.52(1H，寬單峰)，5.66(1H，寬單峰)，5.49(1H，寬單峰)，3.66(1H，m)，3.56(1H，dd，J＝11.6，4.0Hz)，2.46(1H，m)，2.25(2H，m)，2.07(1H，m)，1.71(2H，m)，1.68(1H，m)，1.65(1H，m)，1.30(3H，s)，1.22(3H，d，J＝7.6Hz)。
化合物1-b1β-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-4α氫-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸(臭靈丹苷A)無(wú)色針晶；熔點(diǎn)248-249℃(甲醇)；1H-NMR(氘代吡啶，400MHz)6.49(1H，d，J＝1.4Hz)，5.66(1H，寬單峰)，4.88(1H，d，J＝7.7Hz)，4.52(1H，dd，J＝11.8，2.4Hz)，4.39(1H，dd，J＝11.8，5.2Hz)，4.22(1H，m)，4.01(1H，t，J＝8.3Hz)，3.94(1H，m)，3.66(1H，dd，J＝11.7，4.0Hz)，3.60(1H，m)，2.38(1H，m)，2.25(1H，ddt，J＝10.7，4.0，3.3Hz)，2.04(1H，m)，2.00(1H，m)，1.98(1H，m)，1.58(1H，m)，1.52(2H，m)，1.47(1H，m)，1.23(3H，s)，1.11(3H，d，J＝7.7Hz)。
采用MTT法測(cè)定式(1)化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。測(cè)試樣品對(duì)細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從靈丹草或六棱菊中提取的1-a和1-b在實(shí)驗(yàn)濃度下對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。測(cè)定桉烷型倍半萜衍生物對(duì)HBV的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從靈丹草或六棱菊中提取的1-a和1-b有顯著的抑制HBV的作用。其對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)明顯抑制作用，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙肝表面抗原(HBsAg)及乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)的復(fù)制具有顯著的抑制作用，提示式(1)化合物具有用藥安全及高效抗病毒的特點(diǎn)。因此，根據(jù)本發(fā)明人的研究，從靈丹草或六棱菊中提取的式(1)化合物1-a和1-b可以用于治療乙肝病毒感染性疾病和用于制備治療乙肝病毒感染性疾病的藥物。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用式(1)化合物1-a和1-b對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用及其對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg及HBV-DNA的復(fù)制之抑制作用試驗(yàn)的結(jié)果，說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。實(shí)施例給出了式(1)化合物1-a和1-b的部分活性數(shù)據(jù)。必須說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1式(1)化合物1-a和1-b對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用1)細(xì)胞培養(yǎng)將HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)于含10％滅活胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，100μg/mlG418的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2)采用MTT法測(cè)定式(1)化合物1-a和1-b對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2.2.15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成1×105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl，在37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后加入用培養(yǎng)基稀釋的式(1)化合物1-a和1-b，濃度分別為1000μg/ml，200μg/ml，40μg/ml和8μg/ml，每孔200μl，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入5mg/ml MTT試劑10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 200μl，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。以只加培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔為對(duì)照孔。
抑制率(％)＝(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照孔OD值×100％。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
測(cè)定式(1)化合物1-a和1-b對(duì)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2.2.15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成1×105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl，在37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后加入用培養(yǎng)基稀釋的式(1)化合物1-a和1-b，濃度分別為100μg/ml，20μg/ml和40μg/ml，每孔200μl，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同濃度樣品的培養(yǎng)基，將同一樣品同一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻，作為待測(cè)樣品。用ELISA試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)濃度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)為陽(yáng)性對(duì)照。
3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，從靈丹草或六棱菊中提取的式(1)化合物1-a和1-b有顯著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用。其對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)明顯抑制作用，但對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg在高、中、低劑量下抑制活性都高于拉米呋啶。
該實(shí)施例結(jié)果說(shuō)明式(1)化合物1-a和1-b在第八天對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有顯著的抑制作用，可預(yù)期發(fā)展為降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎癥狀的藥物。
表1.式(1)化合物對(duì)HepG2.2.15分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率(％)

實(shí)施例2式(1)化合物1-a和1-b對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)復(fù)制的抑制作用1)細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。
2)采用MTT法測(cè)定式(1)化合物1-a和1-b對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用方法同實(shí)施例1。
3)測(cè)定式(1)化合物1-a和1-b對(duì)乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)復(fù)制的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2.2.15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成1×105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl，在37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后分別加入用培養(yǎng)基稀釋的式(1)化合物1-a和1-b，濃度分別為100μg/ml，20μg/ml和40μg/ml，每孔200μl，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同濃度樣品的培養(yǎng)基，將同一樣品同一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻，作為待測(cè)樣品。第8天時(shí)用HBV-DNA定量PCR試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中HBC-DNA濃度。以拉米呋啶(3-TC)為陽(yáng)性對(duì)照。
4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，從靈丹草或六棱菊中提取的式(1)化合物1-a和1-b均有明顯的抑制乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)復(fù)制的作用。化合物1-b的高劑量組(100μg/ml)具有顯著的抑制HBV-DNA復(fù)制活性，略高于陽(yáng)性對(duì)照藥物拉米呋啶的低劑量(4μg/mL)組對(duì)HBV-DNA的抑制活性。
表2.式(1)化合物第8天時(shí)對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的HBV-DNA復(fù)制的抑制率(％)

該實(shí)施例結(jié)果說(shuō)明此類式(1)所示之1β-氧代-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸倍半萜類化合物對(duì)乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)的復(fù)制具有較強(qiáng)的抑制作用，屬于有效的非核苷類抑制乙肝病毒天然產(chǎn)物，值得進(jìn)一步深入研究，并可預(yù)期優(yōu)化發(fā)展為抑制乙肝病毒HBVDNA復(fù)制的藥物。
權(quán)利要求
1.式(1)所示桉烷型倍半萜酸衍生物1β-氧代-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙肝表面抗原(HBsAg)的抑制活性； 式(1)其中，式(1)中的R為氫、1～8個(gè)碳的烷氧基、或?yàn)橐驭粱颚聵?gòu)型與C-1上氧原子相聯(lián)的五碳糖和六碳糖。
2.權(quán)利要求1所述之式(1)化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)復(fù)制的抑制活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1～2的化合物，它們是化合物1-a1β-羥基-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸；化合物1-b1β-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-4α氫-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3的式(1)化合物用于防治乙型病毒性肝炎、降低乙肝表面抗原的醫(yī)藥用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的一種含有式(1)化合物的用于抑制乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)復(fù)制、降低乙肝表面抗原的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(1)化合物，或者它的可藥用鹽和可藥用輔料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其可以是片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、貼片劑、皮下植埋劑、外用搽劑、口服液或軟膏劑，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6的式(1)化合物的制備，其特征是從植物中分離純化，優(yōu)選從菊科植物中得到，最優(yōu)選從菊科六棱菊屬植物中得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有式(1)所示結(jié)構(gòu)之1β－氧代－5，11(13)－二烯桉烷－12－酸及其可藥用鹽或溶劑化物及其藥物組合物在降低乙型肝炎表面抗原和抑制乙肝病毒HBV－DNA復(fù)制活性的醫(yī)藥用途。本發(fā)明化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV－DNA)的復(fù)制具有較強(qiáng)的抑制作用，其抑制HBsAg能力在同一劑量超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照拉米呋啶；其在100μg/mL、20μg/mL和4μg/mL濃度時(shí)對(duì)乙肝病毒HBV－DNA的復(fù)制都有明顯的抑制活性，屬于強(qiáng)效的非核苷類抗乙肝病毒天然產(chǎn)物，可以預(yù)期應(yīng)用于制備治療乙肝病毒感染疾病的藥物。
文檔編號(hào)C07C59/00GK1927197SQ200610053610
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2006年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月27日
發(fā)明者趙昱, 李校堃, 黃可新, 李海波, 巫秀美, 孫先鳳, 郝小江, 孫漢董, 約阿施·史托克希特 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院