專利名稱：具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在醫(yī)藥、飲食品領域有用的可以誘發(fā)細胞凋亡的物質及其制造方法，以及含有該誘發(fā)細胞凋亡物質的醫(yī)藥、食品或飲料。
先有技術近年來，在細胞組織死亡中，細胞凋亡(apotosis，細胞自發(fā)突然性死亡或細胞自然死亡)的形式正引起關注。與由于病理原因導致的細胞壞死不同，細胞凋亡是從一開始就與細胞自身的基因結合在一起所導致的死亡。即，細胞凋亡以內部或外部因素作為引發(fā)劑使得編程基因活化，由此進行程序性死亡基因蛋白質的生化合成。另外某些情況下細胞內存在的非活性型程序性死亡蛋白質被活化。我們相信由此生成的活性型程序死亡蛋白質使得細胞自身分解，以至死亡。如果將細胞凋亡在所希望的組織、細胞中表達，則有可能將不需要或有害的細胞以它們自然的形態(tài)從生命體中排出，這將具有很深遠的意義。
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的目的是提供醫(yī)藥、飲食品領域有用的可以誘發(fā)細胞凋亡的物質及其制造方法，以及提供含有以誘發(fā)細胞凋亡物質為主要成份的醫(yī)藥、食品或飲料。解決問題的手段本發(fā)明者為達到上述目的，通過銳意探討，結果發(fā)現加熱從(a)戊糖、(b)脫氧核糖等戊糖衍生物、(c)核糖核苷、核糖核苷酸、核糖核酸等含有戊糖的化合物、(d)脫氧核苷、脫氧核苷酸、脫氧核糖核酸等含有戊糖衍生物的化合物中選擇的至少一種化合物得到的加熱處理物，對癌細胞具有強力細胞凋亡誘發(fā)能力，并成功地分離得到了具有細胞凋亡誘發(fā)能力的該加熱處理物中活性成份，從而完成了本發(fā)明。
概述本發(fā)明如下。本發(fā)明的第一發(fā)明涉及具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質的制造方法，其特征包括加熱處理從下述(a)、(b)、(c)、(d)中選擇的至少一種化合物(但糖醛酸及/或糖醛酸衍生物、以及含有糖醛酸及/或糖醛酸衍生物的化合物除外)的工序。
(a)戊糖(b)戊糖衍生物(c)含有戊糖的化合物(d)含有戊糖衍生物的化合物。
本發(fā)明的第一發(fā)明中的戊糖是以核糖或木糖為例但本發(fā)明并不局限于此。作為戊糖衍生物的脫氧戊糖，例如脫氧核糖、5位上與帶負電荷的基團鍵合的戊糖衍生物(如與磷酸基或硫酸基鍵合的戊糖衍生物)。作為含有戊糖的化合物，例如核糖核苷、核糖核苷酸或核糖核酸、以及5位上與帶負電荷的基團鍵合的戊糖，例如與磷酸基或硫酸基鍵合的戊糖。作為含有戊糖衍生物的化合物，例如脫氧核苷、脫氧核苷酸或脫氧核糖核酸。具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質，例如從4,5-二羥基-2-戊烯醛，4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮、以及4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮中選擇的化合物。
本發(fā)明的第二發(fā)明涉及細胞凋亡誘發(fā)性化合物，該化合物是從4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1,3-二氧雜戊環(huán)、以及下面通式[Ⅰ]表示的化合物中選擇的。

(式中，R表示從含有SH基團的化合物中除去SH基的剩余基團)。
本發(fā)明的第二發(fā)明并不是限定本發(fā)明的，含有SH基的化合物例如可以舉出半胱氨酸、谷胱甘肽。
本發(fā)明的第三發(fā)明涉及對從4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮、以及通式[Ⅰ]表示的化合物中選擇的化合物具有感受性的疾病的治療用以及預防用醫(yī)藥品，其特征是含有從4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮、以及通式[Ⅰ]表示的化合物中選擇的化合物為有效成份。
本發(fā)明的第三發(fā)明并不是限定本發(fā)明，藥物可以是例如抗癌藥、細胞凋亡誘發(fā)劑、抗風濕劑、人胰島素樣增殖因子產生誘導劑、活性氧產生抑制劑、或熱休克蛋白誘導劑。
本發(fā)明的第四發(fā)明涉及食品或飲料，其中含有、稀釋和/或添加通過加熱處理下述(a)、(b)、(c)、(d)中選擇的至少一種化合物(但糖醛酸及/或糖醛酸衍生物、以及含有糖醛酸及/或糖醛酸衍生物的化合物除外)得到的具有細胞凋亡誘發(fā)能力的加熱處理物以及/或其部分精制產物。
(a)戊糖(b)戊糖衍生物(c)含有戊糖的化合物(d)含有戊糖衍生物的化合物。
本發(fā)明的第四發(fā)明并不是限定本發(fā)明，作為食品或飲料例如是抗癌用、細胞凋亡誘發(fā)用、抗風濕用、人胰島素樣增殖因子產生誘導用、活性氧產生抑制用、或熱休克蛋白誘導用等的食品或飲料。


圖1為4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮的質譜圖。
圖2為4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮的1H-NMR譜圖。
圖3為4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮的質譜圖。
圖4為4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮的1H-NMR譜圖。
圖5為1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮的質譜圖。
圖6為1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮的1H-NMR譜圖。
圖7為2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)的質譜圖。
圖8為2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)的1H-NMR譜圖。
圖9為戊糖濃度與4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮生成量的關系圖。
圖10為峰1的質譜圖。
圖11為峰3的質譜圖。
圖12為峰1的1H-NMR譜圖。
圖13為峰3的1H-NMR譜圖。
圖14為在各培養(yǎng)條件下添加2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)培養(yǎng)時培養(yǎng)基中NO2-的濃度圖。
下面詳細說明本發(fā)明。
戊糖是具有5個碳原子糖的總稱，天然存在的戊醛糖如阿糖、木糖、核糖、來蘇糖等，戊酮糖如核酮糖、木酮糖等。
戊糖衍生物例如脫氧戊糖、戊糖醇等，前者天然存在的例如脫氧核糖、后者如核糖醇、阿糖醇、木糖醇等。另外碳原子數為5的氨基糖、糖醛酸、醛醇糖酸等也是戊糖衍生物，可通過合成的方法得到。
含有戊糖的化合物例如磷酸戊糖、核糖核苷、核糖核苷酸等低分子化合物，以及核糖核酸、阿拉伯糖(arabinan)以及木聚糖等高分子化合物。另外戊糖的酯、醚、苷、及其鹽類等也是含戊糖化合物，可以通過合成法制備。
含有戊糖衍生物的化合物例如含有脫氧戊糖的脫氧戊糖磷酸、脫氧核糖核苷、脫氧核苷酸、脫氧核糖核酸，含有戊糖醇的核黃素、核糖醇胞壁酸等。另外戊糖衍生物的酯、醚、酰胺、苷、及其鹽類等也是含戊糖衍生物的化合物，可以通過合成法制備。
核糖核酸、核糖核苷、核糖核苷酸、脫氧核糖核酸、脫氧核糖核苷、脫氧核苷酸作為輔酶可保存并表達遺傳信息，對生物體來說是非常重要的物質。核糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、木酮糖-5-磷酸作為磷酸戊糖循環(huán)的代謝中間體在許多生物體中廣泛存在。植物膠質、粘質、半纖維素或細菌多糖中含有阿糖或木糖，人心肌中的來蘇黃素或某些抗生素是來蘇糖的衍生物。
本發(fā)明中使用的含有戊糖的化合物也包括5位上與帶有負電荷的基團鍵合的戊糖以及含有5位上與帶有負電荷基團鍵合的戊糖的化合物。本發(fā)明中的帶有負電荷的基團，是指在通常的化學反應條件下，即在至少滿足PH1-13、0℃-200℃中一個條件下，在水溶液中帶有負電荷的基團，例如磷酸基、硫酸基。另外，本說明書中也包括它們的鹽、酯、酸酐等帶負電荷的基團。但是，羧基雖為帶負電荷的基團，但5位帶有羧基的戊醛糖即糖醛酸，不包括在本發(fā)明使用的含有戊糖的化合物之內。
對本發(fā)明中可以使用的5位上與帶有負電荷的基團鍵合的戊糖沒有特別的限定，通過加熱處理可以得到具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質例如4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的，均包括在本發(fā)明的含有戊糖的化合物中。即，只要是通過加熱處理可以生成例如4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮即可，而不管其戊糖的種類、帶有負電荷的基團的種類。5位上與帶有負電荷的基團鍵合的戊糖例如核糖-5-磷酸、核糖-5-硫酸等。
對本發(fā)明中含有5位上與帶有負電荷基團鍵合的戊糖的化合物沒有特別的限定，例如可以使用核糖核酸、核糖核苷酸、核糖核苷，以及通過化學的、酶的、物理的方法得到的它們的降解產物、降解產物的衍生物、降解產物的鹽類等。
將本發(fā)明中的上述戊糖、戊糖衍生物、含有戊糖的化合物、含有戊糖衍生物的化合物加熱處理，只要能生成具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質，則沒有任何限定。另外，戊糖、戊糖衍生物、含有戊糖的化合物、含有戊糖衍生物的化合物可以通過從動植物微生物細胞中分離的方法、發(fā)酵法等制備、也可通過化學合成的方法得到。不論使用何種方法制備，只要該物質通過加熱處理可以生成具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質，則在本發(fā)明中就可以使用。
本發(fā)明也可以使用含有戊糖、戊糖衍生物、含有戊糖的化合物及/或含有戊糖衍生物的化合物的物質。由于在動植物的組織中、動植物微生物的細胞中含有各種戊糖、戊糖衍生物、含有戊糖的化合物、含有戊糖衍生物的化合物，這些物質可以直接在本發(fā)明中使用。另外，本發(fā)明中的含有戊糖的化合物及/或含有戊糖衍生物的化合物中，含有糖醛酸及/或糖醛酸衍生物的化合物除外。糖醛酸衍生物是指糖醛酸的內酯、糖醛酸的酯類、糖醛酸的酰胺類、糖醛酸的鹽類等。
本發(fā)明具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質通過加熱處理得到，對反應條件沒有特別的限定，只要得到的加熱處理物具有細胞凋亡誘發(fā)能力即可，例如將上述(a)～(d)中選擇的至少一種化合物(糖醛酸及/或糖醛酸衍生物、及含有糖醛酸及/或糖醛酸衍生物的化合物除外)，在例如30℃～400℃下加熱處理數秒～數日，優(yōu)選在50～200℃下加熱處理數秒～24小時，得到具有細胞凋亡誘發(fā)能力的加熱處理物。由于加熱處理物中含有兩種或更多的具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質，根據要求改變PH、時間、溫度、原料濃度等加熱處理條件，使制備的加熱處理物中含有所期望的具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質。
例如在使用核糖或核糖-5-磷酸時，在80～150℃下加熱處理數分鐘～數日，可以得到含有4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的加熱處理物。
下面將具有細胞凋亡誘發(fā)能力的、從上述(a)～(d)中選擇的化合物的加熱處理物，簡稱為本發(fā)明的加熱處理物。
加熱處理時原料的濃度，如經加熱處理可得到具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質，則原料濃度范圍沒有特別的限定，最好從操作性、收率等方面考慮進行設定。本發(fā)明的加熱處理方式可以是濕式加熱法，也可以是干式加熱法。濕式加熱法可采用水蒸氣加熱、水蒸氣加壓加熱、加壓式加熱等任意的濕式加熱方法。干式加熱法可采用通過干燥熱風的直接加熱法、通過在隔壁設置熱源加熱的間接加熱法等。直接加熱法例如氣流干熱法、噴霧干熱法等，間接加熱法例如滾筒干熱法等。另外，生產本發(fā)明具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質的原料，可用通常的煮、燒、炒、煎、炸等任意的加熱方法進行處理。
本發(fā)明的具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質可以細胞凋亡誘發(fā)作用作為指標進行精制處理。精制手段可以使用周知的化學方法、物理方法等。
例如，使用核糖時，將其2M的水溶液在121℃下加熱處理14小時，在其加熱處理物中生產4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。將加熱處理物中的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮用溶劑萃取，濃縮萃取物。將該濃縮物通過硅膠柱色譜法分離，濃縮洗脫的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮組份，用氯仿從濃縮物中萃取4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮，通過萃取濃縮物的正相柱色譜法，可以分離得到本發(fā)明的加熱處理物中的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。
另外將上述核糖加熱處理物通過離子交換樹脂柱，優(yōu)選陰離子交換樹脂柱處理，收集非吸附性組份，得到精制的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮?；驅⑸鲜龊颂羌訜崽幚砦锿ㄟ^活性炭進行處理，除去非吸附組份，將柱洗凈后，用親水性有機溶劑例如乙醇水溶液、優(yōu)選40％以上的乙醇水溶液進行洗脫，得到精制的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。將這些方法組合使用，可以得到更高純度的精制4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。
使用同樣的精制方法，可以從本發(fā)明的加熱處理物中得到從4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮中選擇的化合物。
另外，通過這些精制方法精制得到的精制物以及部分精制物，也包括在本發(fā)明的具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質中。
本發(fā)明者在本發(fā)明的加熱處理物中，發(fā)現含有Biochemistry第35卷、第659～665頁(1996)中記載的反式-4,5-二羥基-2-戊烯醛及其類似物，發(fā)現這些化合物具有抗癌作用，和細胞凋亡誘發(fā)作用等。
另外，通過本發(fā)明的加熱處理物，可以成功地分離得到4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮、4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。另外，發(fā)現通過4,5-二羥基-2-戊烯醛可以生成2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)，并成功地分離。另外，發(fā)現將4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮與含有SH基的化合物反應，可以生成由通式[Ⅰ]表示的化合物并成功地分離。并且發(fā)現這些化合物具有癌細胞增殖抑制活性、以及細胞凋亡誘發(fā)活性等生理活性。
所以，以從4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮以及通式[Ⅰ]表示的化合物(以下稱為本發(fā)明的化合物)中選擇的化合物作為有效成份，可以提供一種預防及治療對本發(fā)明化合物具有感受性的疾病，例如癌癥、需要誘發(fā)細胞凋亡的疾病、需要抑制產生活性氧的疾病、需要誘導產生人胰島素樣增殖因子的疾病、需要誘導產生熱休克蛋白質的疾病有用的醫(yī)藥品。
將本發(fā)明的加熱處理物、或從本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份，與公知的醫(yī)藥用載體組合作成制劑，可以制得細胞凋亡誘發(fā)劑。即一般來說，將本發(fā)明的加熱處理物或從本發(fā)明化合物中選擇的化合物，與藥學上允許的液體或固體載體配合，根據需要可以加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等，可以制成片劑、顆粒劑、散劑、粉劑、膠囊劑等固體制劑，以及常用的溶液劑、混懸劑、乳劑等液體制劑。另外，另外也可制成干燥品，在使用前加入適當載體制成溶液劑。
含有以本發(fā)明的加熱處理物、或從本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份的細胞凋亡誘發(fā)劑，可以制成口服制劑、注射劑和輸液用制劑等非口服制劑。
醫(yī)藥用載體，可以根據上述給藥形式或劑型進行選擇，口服制劑例如可使用淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等。另外在調劑口服制劑時，也可以配合使用粘合劑、崩解劑、界面活性劑、潤滑劑、增流劑、矯味劑、著色劑、香料等。
另一方面，在非口服制劑時，根據常法，將本發(fā)明的有效成份即本發(fā)明的加熱處理物、或從本發(fā)明化合物中選擇的化合物，在稀釋劑例如注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等溶劑中溶解或混懸，根據需要可以加入抑菌劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、無痛劑等進行調劑。
含有本發(fā)明的加熱處理物或從本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份的細胞凋亡誘發(fā)劑，可根據制劑形態(tài)采取適當的形式給藥。給藥方法沒有特別的限定，可通過內服、外用或注射等給藥。注射劑給藥包括靜脈內、肌內、皮下、皮內給藥等，外用制劑如栓劑等。
本發(fā)明的加熱處理物作為有效成份的細胞凋亡誘發(fā)劑的給藥量，可根據制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及適用的患者年齡、體重、癥狀等進行適當調整，沒有一定的限定，一般制劑中含有的有效成份成人通常為1日1～1000mg，優(yōu)選10～200mg。當然給藥量隨各種條件不同會發(fā)生變化，有時比上述給藥量少就已經足夠，有時則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥劑可以直接經口給藥，也可以任意添加至飲料食品當中日常服用。
本發(fā)明的化合物中選擇的化合物作為有效成份的細胞凋亡誘發(fā)劑的給藥量，可根據制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及適用的患者年齡、體重、癥狀等進行適當調整，沒有一定的限定，一般制劑中含有的有效成份成人通常為1日0.01～50mg，優(yōu)選0.1～10mg。當然給藥量隨各種條件不同會發(fā)生變化，有時比上述給藥量少就已經足夠，有時則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥劑可以直接經口給藥，也可以任意添加至飲料食品當中日常服用。
本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明的化合物對癌細胞具有細胞凋亡誘發(fā)作用、細胞增殖抑制作用、拓樸異構酶Ⅱ阻礙作用等，所以將本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份，可以制成抗癌劑。即，將本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份，與公知的醫(yī)藥用載體組合制劑化，可以制成抗癌劑?？拱﹦┑闹圃炜梢园凑丈鲜龅姆椒ㄟM行。
抗癌劑可制成口服劑、或注射劑、點滴用藥劑等非口服制劑給藥。
醫(yī)藥用載體可以根據上述制劑劑型進行選擇，按照上述細胞凋亡誘發(fā)劑的要求使用。
抗癌劑可以根據制劑形式采用適當的給藥途徑。給藥方式沒有特別的限定，可采用內服、外用或注射等方式。注射劑例如靜脈內、肌內、皮下、皮內給藥等、外用制劑包括栓劑等。
本發(fā)明的加熱處理物作為有效成份的抗癌劑的給藥量，可根據制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及適用的患者年齡、體重、癥狀等進行適當調整，沒有一定的限定，一般制劑中含有的本發(fā)明的加熱處理物的量成人通常為1日1～1000mg，優(yōu)選10～200mg。當然給藥量隨各種條件不同會發(fā)生變化，有時比上述給藥量少就已經足夠，有時則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥劑可以直接經口給藥，也可以任意添加至飲料食品當中日常服用。
本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份的抗癌劑的給藥量，可根據制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及適用的患者年齡、體重、癥狀等進行適當調整，沒有一定的限定，一般制劑中含有的有效成份成人通常為1日0.01～50mg，優(yōu)選0.1～10mg。當然給藥量隨各種條件不同會發(fā)生變化，有時比上述給藥量少就已經足夠，有時則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥劑可以直接經口給藥，也可以任意添加至飲料食品當中日常服用。
風濕是由于骨膜細胞或軟骨細胞障礙引起的自身免疫疾病。本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明的化合物，對synovial細胞具有細胞凋亡誘發(fā)作用，所以將本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份，可以制成抗風濕劑。即，將本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份，與公知的醫(yī)藥用載體組合制劑化，可以制成抗風濕劑?？癸L濕劑的制造可以按照上述的方法進行。
抗風濕劑可制成口服劑、或注射劑、點滴用藥劑等非口服制劑給藥。
醫(yī)藥用載體可以根據上述制劑劑型進行選擇，按照上述細胞凋亡誘發(fā)劑的要求使用。
抗風濕劑可以根據制劑形式采用適當的給藥途徑。給藥方式沒有特別的限定，可采用內服、外用或注射等方式。注射劑例如靜脈內、肌內、皮下、皮內給藥等、外用制劑包括栓劑等。
本發(fā)明的加熱處理物作為有效成份的抗風濕劑的給藥量，可根據制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及適用的患者年齡、體重、癥狀等進行適當調整，沒有一定的限定，一般制劑中含有的本發(fā)明的加熱處理物的量成人為1日1～1000mg，優(yōu)選10～200mg。當然給藥量隨各種條件不同會發(fā)生變化，有時比上述給藥量少就已經足夠，有時則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥劑可以直接經口給藥，也可以任意添加至飲料食品當中日常服用。
本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份的抗風濕劑的給藥量，可根據制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及適用的患者年齡、體重、癥狀等進行適當調整，沒有一定的限定，一般制劑中含有的有效成份成人為1日0.01～50mg，優(yōu)選0.1～10mg。當然給藥量隨各種條件不同會發(fā)生變化，有時比上述給藥量少就已經足夠，有時則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥劑可以直接經口給藥，也可以任意添加至飲料食品當中日常服用。
人胰島素樣增殖因子(以下稱hIGF-1)對各種細胞具有多種生理作用，作為Ⅱ-型糖尿病(胰島素非依賴型)和生長障礙疾病(侏儒癥)的治療藥物使用。本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明的化合物具有hIGF-1產生誘導作用。所以將本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份，可以制成hIGF-1產生誘導劑。即，將本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份，與公知的醫(yī)藥用載體組合制劑化，可以制成hIGF-1產生誘導劑。hIGF-1產生誘導劑的制造可以按照上述的方法進行。hIGF-1產生誘導劑用于需要誘導產生hIGF-1的疾病、作為Ⅱ型糖尿病治療藥、預防藥、侏儒癥的治療藥使用。
hIGF-1產生誘導劑可制成口服劑、或注射劑、點滴用藥劑等非口服制劑給藥。
醫(yī)藥用載體可以根據上述制劑劑型進行選擇，按照上述細胞凋亡誘發(fā)劑的要求使用。
hIGF-1產生誘導劑可以根據制劑形式采用適當的給藥途徑。給藥方式沒有特別的限定，可采用內服、外用或注射等方式。注射劑例如靜脈內、肌內、皮下、皮內給藥等、外用制劑包括栓劑等。
本發(fā)明的加熱處理物作為有效成份的hIGF-1產生誘導劑的給藥量，可根據制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及適用的患者年齡、體重、癥狀等進行適當調整，沒有一定的限定，一般制劑中含有的本發(fā)明的加熱處理物的量成人為1日1～1000mg，優(yōu)選10～200mg。當然給藥量隨各種條件不同會發(fā)生變化，有時比上述給藥量少就已經足夠，有時則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥劑可以直接經口給藥，也可以任意添加至飲料食品當中日常服用。
本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份的hIGF-1產生誘導劑的給藥量，可根據制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及適用的患者年齡、體重、癥狀等進行適當調整，沒有一定的限定，一般制劑中含有的有效成份成人為1日0.01～50mg，優(yōu)選0.1～10mg。當然給藥量隨各種條件不同會發(fā)生變化，有時比上述給藥量少就已經足夠，有時則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥劑可以直接經口給藥，也可以任意添加至飲料食品當中日常服用。
本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物具有活性氧產生的抑制作用，所以將本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份，可以制成活性氧產生抑制劑，對有必要抑制活性氧產生的疾病按一定方法給藥。
即，本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物具有抑制活性氧產生的作用，將該化合物作為有效成份的活性氧產生抑制劑等抗氧化劑對由于活性氧的產生以及/或過剩引起的疾病具有治療或預防作用。
活性氧可以大體分為游離基型與非游離基型活性氧兩類。游離基型活性氧為羥基游離基、羥基過氧游離基、過氧游離基、烷氧基游離基、二氧化氮、一氧化氮(以下稱NO)、硫游離基、超氧化物。非游離基型活性氧為單態(tài)氧、過氧化氫、脂質氫過氧化物、次氯酸、臭氧、過氧亞硝酸鹽。這些物質與許多病態(tài)，即各種炎癥性疾病、糖尿病、癌、動脈硬化、神經系統(tǒng)疾病、缺血牲再回流障礙等有關。
例如NO是內皮細胞血管平滑肌松弛因子(EDRF)的主要成份〔Nature、第327卷、第524～526頁(1987)〕。本發(fā)明提供了對有必要抑制NO產生的疾病的治療劑或預防劑。
在本發(fā)明中，對有必要抑制NO產生的疾病沒有特別的限定，例如由于毒性休克或用某種細胞素治療產生的全身性血壓低下、血壓應答低下、自身免疫疾病、炎癥、關節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎、糖尿病、炎癥性腸道疾病、血管機能不全、病因性血管擴張、組織損傷、心臟血管系統(tǒng)缺血、過敏性疼痛、腦缺血、血管新生伴隨的疾病、癌癥等，在特表平9-504524號、特表平9-505288號、特表平8-501069號、特表平8-512318號、特表平6-508849號各公報中記載的疾病。本發(fā)明的活性氧產生抑制劑，作為NO產生抑制劑，對需要抑制NO產生的疾病具有治療、預防作用。
活性氧產生抑制劑可制成口服劑、或注射劑、點滴用藥劑等非口服制劑給藥。
醫(yī)藥用載體可以根據上述制劑劑型進行選擇，按照上述細胞凋亡誘發(fā)劑使用。
活性氧產生抑制劑可以根據制劑形式采用適當的給藥途徑。給藥方式沒有特別的限定，可采用內服、外用或注射等方式。注射劑例如靜脈內、肌內、皮下、皮內給藥等、外用制劑包括栓劑等。
本發(fā)明的加熱處理物作為有效成份的活性氧產生抑制劑的給藥量，可根據制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及適用的患者年齡、體重、癥狀等進行適當調整，沒有一定的限定，一般制劑中含有的本發(fā)明的加熱處理物的量成人為1日1～1000mg，優(yōu)選10～200mg。當然給藥量隨各種條件不同會發(fā)生變化，有時比上述給藥量少就已經足夠，有時則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥劑可以直接經口給藥，也可以任意添加至飲料食品當中日常服用。
本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份的活性氧產生抑制劑的給藥量，可根據制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及適用的患者年齡、體重、癥狀等進行適當調整，沒有一定的限定，一般制劑中含有的有效成份成人為1日0.01～50mg，優(yōu)選0.1～10mg。當然給藥量隨各種條件不同會發(fā)生變化，有時比上述給藥量少就已經足夠，有時則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥劑可以直接經口給藥，也可以任意添加至飲料食品當中日常服用。
本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物具有熱休克蛋白誘導作用，以本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份可以制成熱休克蛋白誘導劑，對有必要誘導產生熱休克蛋白的疾病按一定方法給藥。
即，本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物對70kDa(HSP70)等的熱休克蛋白有誘導活性，對肝炎病毒、愛滋病毒、流感病毒、水皰性口內炎病毒、皰疹性病毒等RNA病毒、DNA病毒具有抗病毒作用。另外熱休克蛋白與癌癥免疫有關，這些化合物對癌癥免疫有效。另外也對抗炎癥等具有生體防御作用。通過攝入本發(fā)明的加熱處理物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物，可以預防、治療由于流感病毒引起的感冒等病毒性疾病。
熱休克蛋白是細胞或個體在突然受到比平常溫度高5～10℃的溫度變化情況下合成的蛋白質的總稱，在原核生物到高等真核生物中廣泛分布。真核生物的熱休克蛋白為HSP90、HSP70、ubiquitin和HSP26等。其中HSP70為分子chaperone的一種，在開合沒有完成或不完全開合部位的蛋白質結合，以促成立體構造的形成。熱休克蛋白的氨基酸排列在進化過程中被很好地保存下來，HSP70與大腸桿菌的Dank蛋白質相同。人體中大約存在10個HSP70的遺傳基因，其中有些在機體組成中被表達，有些通過各種刺激誘導產生。熱休克蛋白的合成除熱休克以外，還可以通過各種化學物質、氧化應激等細胞障礙誘導產生。
熱休克蛋白誘導劑可制成口服劑、或注射劑、點滴用藥劑等非口服制劑給藥。
醫(yī)藥用載體可以根據上述制劑劑型進行選擇，按照上述細胞凋亡誘發(fā)劑的要求使用。
熱休克蛋白誘導劑可以根據制劑形式采用適當的給藥途徑。給藥方式沒有特別的限定，可采用內服、外用或注射等方式。注射劑例如靜脈內、肌內、皮下、皮內給藥等、外用制劑包括栓劑等。
本發(fā)明的加熱處理物作為有效成份的熱休克蛋白誘導劑的給藥量，可根據制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及適用的患者年齡、體重、癥狀等進行適當調整，沒有一定的限定，一般制劑中含有的本發(fā)明的加熱處理物的量成人為1日1～1000mg，優(yōu)選10～200mg。當然給藥量隨各種條件不同會發(fā)生變化，有時比上述給藥量少就已經足夠，有時則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥劑可以直接經口給藥，也可以任意添加至飲料食品當中日常服用。
本發(fā)明化合物中選擇的化合物作為有效成份的熱休克蛋白誘導劑的給藥量，可根據制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及適用的患者年齡、體重、癥狀等進行適當調整，沒有一定的限定，一般制劑中含有的有效成份成人為1日0.01～50mg，優(yōu)選0.1～10mg。當然給藥量隨各種條件不同會發(fā)生變化，有時比上述給藥量少就已經足夠，有時則有必要超出上述范圍。本發(fā)明的藥劑可以直接經口給藥，也可以任意添加至飲料食品當中日常服用。
本發(fā)明的加熱處理物以及/或其部分精制物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物，可以作為細胞凋亡誘發(fā)用飲食品、抗癌用飲食品、抗風溫用飲食品、hIGF-1產生誘導用飲食品、活性氧產生抑制用飲食品或熱休克蛋白誘導用飲食品的原料使用。
含有、稀釋以及/或添加本發(fā)明的加熱處理物以及/或其部分精制物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物的食品或飲料中，需要含有必要量的本發(fā)明的加熱處理物以及/或其部分精制物、或本發(fā)明化合物中選擇的化合物，以發(fā)揮其生理作用。
本發(fā)明的食品或飲料，例如細胞凋亡誘發(fā)用食品或細胞凋亡誘發(fā)用飲料、抗癌用食品或抗癌用飲料的制造方法，沒有特別的限定，可以采用調理、加工以及常用的食品或飲料的制造方法生產，通過含有、稀釋以及/或添加的方法，使制得的食品或飲料中含有有效量的具有細胞凋亡誘發(fā)作用或抗癌作用等的本發(fā)明的加熱處理物以及/或其部分精制物、或本發(fā)明的化合物中選擇的化合物。
另外，本發(fā)明的加熱處理物的部分精制物，是通過精制本發(fā)明的加熱處理物得到的具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質，沒有特別的限定，可以使用常用的食品、飲料原料的精制工序得到，沒有特別的限定。
這些食品或飲料中，含有、添加以及/或稀釋含有有效量的具有細胞凋亡誘發(fā)作用或抗癌作用等的本發(fā)明的加熱處理物以及/或其部分精制物、或本發(fā)明的化合物中選擇的化合物，其形狀沒有特別的限定，可以包括片狀、顆粒狀、膠囊狀、散劑狀、溶膠狀等各種可通過口服攝入的形狀。
將具有生理活性的有效劑量的本發(fā)明加熱處理物、其部分精制物、本發(fā)明的化合物給小鼠灌胃，沒有發(fā)現急性毒性，例如給小鼠分別單次灌胃4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮各100mg/kg，沒有發(fā)現死亡例。
本發(fā)明的藥劑具有維持機體體內平衡的作用。將本發(fā)明的加熱處理物以及/或其部分精制物、或本發(fā)明的化合物中選擇的化合物作為有效成份誘發(fā)細胞凋亡的方法，對研究機體防御機能、免疫機能或癌、病毒性疾病等與機體的關系，開發(fā)細胞凋亡誘發(fā)阻滯劑是等是有用的。
通過使食品或飲料中含有本發(fā)明的加熱處理物以及/或其精制物，可以開發(fā)制造細胞凋亡誘發(fā)用食品或飲料、抗癌用食品或飲料、抗風濕用食品或飲料、hIGF-1產生誘導用食品或飲料、活性氧產生抑制用或者熱休克蛋白誘導用的食品或飲料。含有本發(fā)明的加熱處理物以及/或其精制物的食品或飲料是一種健康食品或飲料，具有該加熱處理物以及/或其精制物具有的各種生理活性，即細胞凋亡誘發(fā)作用、抗癌作用、抗風濕作用、hIGF-1產生誘導作用、活性氧產生抑制作用、熱休克蛋白誘導作用等，攝入體內具有預防癌癥、抑制癌癥效果、抗病毒效果等，是對維持機體體內平衡、特別是對維持胃腸道健康有用的食品或飲料。
另外，4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮可以通過化學合成的方法制造。作為公知的方法，例如Tanaka,T.等的方法〔Tetrahedron、第32卷、第1713頁(1976)〕、Nara,M.等的方法〔Tetrahedron、第36卷、第3161頁(1980)〕、以及Gill,M.等的方法〔Aust.J.Chem.、第34卷、第2587頁(1981)〕等。這些方法的合成步驟多而且復雜，收率低，效果不好。在此，本發(fā)明者等將4-環(huán)戊烯-1,3-二酮用氯化鈰(Ⅲ)以及硼氫化鈉還原，發(fā)現僅用一步反應，就得到了高收率的4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。所以通過本發(fā)明可以提供工業(yè)上4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的合成方法。
將4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮其光學異構體以及/或它們的鹽與含有SH的化合物反應，在反應液中生成上述通式[Ⅰ]表示的化合物(以下稱硫衍生物)。
含有SH基團的化合物沒有特別的限定，例如甲硫醇、丁硫醇、巰基乙醇、含有SH的氨基酸、含有SH的氨基酸衍生物等。含有SH的氨基酸例如半胱氨酸、高半胱氨酸等。
含有SH的氨基酸衍生物例如上述的氨基酸衍生物，如半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸的肽、含有半胱氨酸衍生物的肽等。含有半胱氨酸的肽是指肽中有半胱氨酸作為組成成份，沒有特別的限定。含有半胱氨酸的肽例如低聚肽，包括低分子化合物如谷胱苷肽到高分子化合物如蛋白質等。另外若反應中存在可以生成含有半胱氨酸或高半胱氨酸的肽的條件的話，例如通過還原處理等，包含胱氨酸或高胱氨酸的肽也可以作為含有半胱氨酸或高半胱氨酸的肽來使用。作為含有半胱氨酸的肽，例如包括含糖、脂質等的半胱氨酸的肽。另外上述各種物質的鹽類、酸酐、酯等也可以。
4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮與上述的含有SH的化合物反應，可以形成硫衍生物。
4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、其光學異構體以及/或它們的鹽類，與含有SH的化合物例如含有SH的氨基酸、或其衍生物反應，生成硫衍生物或其光學異構體，其精制、分離的方法可以按照公知的化學，物理等精制方法進行，例如通過將凝膠過濾法、利用分子量分級膜的分級法、溶劑萃取法、分餾法、使用離子交換樹脂等各種色譜法等以往公知的精制方法組合使用，可以從反應生成物中精制、分離出本發(fā)明的化合物或其光學異構體或它們的鹽類。
例如將等摩爾的4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮與谷胱苷肽(還原型)反應，在反應液中生成下面通式[Ⅱ]表示的硫衍生物，將含有該衍生物的反應生成物通過硅膠柱色譜法，可以精制、分離得到該硫衍生物。 硫衍生物光學異構體的分離可以用消旋混合物的機械拆分法、優(yōu)先結晶法、作為非對映異構物或包接物的結晶拆分法、使用酶或微生物的動力學拆分法、使用色譜法的拆分法等。
作為色譜拆分法，例如氣相色譜法、液相色譜法、薄層色譜法等，分別使用適當的手性固定相。
作為通過液相色譜法的光學拆分，可以舉出使用手性固定相的方法、使用手性洗脫液的方法、拆分消旋體等方法。
作為手性的固定相，例如酰胺系固定相、尿素系固定相、配位體交換型固定相、多糖.多糖衍生物固定相、蛋白質固定相、聚甲基丙烯酸酯固定相、聚甲基丙烯酰胺固定相等。
作為洗脫液，例如可以使用己烷類、醇類、水(緩沖液)等，可以與上述固定相按適當組合配合使用。
作為硫衍生物或其光學異構體的鹽，是醫(yī)藥學允許的鹽類，可以按照公知的方法進行變換。
硫衍生物或其光學異構體或它們的鹽類，具有抗癌活性、抑制癌細胞增殖的活性、細胞凋亡誘發(fā)活性等生理活性，利用這些活性，可以提供含有從硫衍生物或其光學異構體或它們的鹽類中選擇的化合物作為有效成份的醫(yī)藥品。
實施例下面通過實施例詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于實施例。另外實施例中的％表示重量％。
實施例1
1M L(+)-阿糖(和光春藥社生產、010-04582)水溶液、1M D(-)-阿糖(和光春藥社生產、013-04572)水溶液、1M D(+)-木糖(Nacalaitesque社生產、367-19)水溶液、D-核糖(Nacalai tesque社銷售、302-10)水溶液，PH值依次為5.3、4.9、4.4、4.7。
在121℃下加熱處理4小時，按下述方法測定對人前骨髓性白血病細胞HL-60的細胞凋亡誘發(fā)活性。
用0.22μm的濾膜將各加熱物以及非加熱物滅菌，配制細胞凋亡誘發(fā)活性的試樣。將這些試樣用滅菌蒸餾水稀釋2倍、4倍、8倍、16倍以及32倍，按下面方法測定對人前骨髓性白血病細胞HL-60的細胞增殖抑制活性，比較細胞凋亡誘發(fā)活性的強度。
即，將稀釋液各10μl或滅菌蒸餾水各10μl分別注入96孔微量滴定板的池中。加入含5000個HL-60細胞(ATCC CCL240)的10％牛胎兒血清(Gibco公司生產)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Nissui公司生產)90μl，在5％二氧化碳氣體中37℃下培養(yǎng)48小時。用光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)后，加入5mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT;Sigma公司生產)的磷酸緩沖氯化鈉水溶液10μl，在培養(yǎng)4小時后，用顯微鏡觀察細胞的發(fā)育狀態(tài)，觀察細胞內甲_的形成。然后加入含有0.04N HCl的2-丙醇100μl，充分攪拌，在590nm處測定吸光度作為細胞增殖度(MTT法)。
結果在添加了未加熱的L(+)-阿糖水溶液、D(-)-阿糖水溶液、D(+)-木糖水溶液、D-核糖水溶液的區(qū)域與添加了水分作為對照的區(qū)域，未發(fā)現細胞增殖差異，未發(fā)現細胞凋亡誘發(fā)活性。相反，在添加了經121℃加熱處理4小時的L(+)-阿糖水溶液、D(-)-阿糖水溶液、D(+)-木糖水溶液、D-核糖水溶液的各4倍、4倍、8倍、16倍稀釋液的區(qū)域，通過鏡檢發(fā)現細胞變形，與添加水分的對照相比，590nm的吸光度減少，由此確認了抑制癌細胞增殖的活性。
實施例2(1)1M 2-脫氧-D-核糖(Sigma公司生產、D2751)水溶液與0.1M 2-脫氧-D-核糖水溶液的pH值分別為4.7、5.4。取0.1M 2-脫氧-D-核糖水溶液的一部分，用1N的NaOH調整pH為7.1。在121℃下加熱處理4小時，按實施例1的方法測定對HL-60細胞的細胞凋亡誘發(fā)活性。另外，稀釋倍數為2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍以及128倍。
結果發(fā)現添加未加熱的2-脫氧-D-核糖水溶液的區(qū)域與添加對照水分的區(qū)域未發(fā)現細胞增殖差異，未發(fā)現細胞凋亡誘發(fā)活性。相反，在分別添加了經121℃下加熱處理4小時的1M的2-脫氧-D-核糖水溶液、0.1M的2-脫氧-D-核糖水溶液(未調整pH)、0.1M的2-脫氧-D-核糖水溶液(pH7.1)的128倍、16倍、16倍稀釋液的區(qū)域，發(fā)現細胞增殖受到抑制。
(2)將實施例2-(1)得到的1M的2-脫氧-D-核糖水溶液的121℃下4小時的加熱處理物用以下的反相HPLC進行分離。
試樣注入量40μl柱YMC-Pack ODS-AM(4.6×250nm、YMC公司生產)流動相A水B80％乙腈水溶液流速0.8ml/分洗脫流動相A(5分鐘)→從流動相A到B的濃度梯度(20分鐘)→流動相B(5分鐘)檢測在215nm處測定吸光度每2分鐘收集餾分，減壓濃縮，按實施例1的方法測定對HL-60細胞的細胞凋亡誘發(fā)活性。結果發(fā)現，餾分4(保留時間6分鐘～8分鐘)活性強，餾分8(保留時間14分鐘～16分鐘)活性弱。
(3)將餾分4反復通過實施例2-(2)的反相HPLC，得到餾分4的干燥物。用DX302(日本電子公司生產)進行本試樣的質量分析。另外，將本試樣溶解在重二甲亞砜中，用JNM-A500(日本電子公司生產)進行核磁共振測定。
FAB-MS
m/z 117[M+H]+但是，使用甘油作為基質進行測定。1H-NMRδ3.44(2H,m,5-H),4.27(1H,m,4-H),4.95(1H,t,5-OHのH),5.32(1H,d,J=5.0Hz,4-OHのH),6.20(1H,ddd,J=2.0,8.0,15.5 Hz,2-H),7.10(1H,dd,J=4.0,15.5 Hz,3-H),9.55(1H,d,J=8.0Hz,1-H)但是，重二甲亞砜的殘留質子的化學位移值為2.49ppm。
1H-NMR的信號歸屬序號如下式[Ⅲ]所示。
結果發(fā)現本試樣的物理參數與反式-4,5-二羥基-2-戊烯醛一致，由此表明本試樣為下式[Ⅲ]表示的反式-4,5-二羥基-2-戊烯醛。
本試樣表現出強的細胞凋亡誘發(fā)活性以及癌細胞增殖抑制活性。 實施例3(1)將4種100mM的脫氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)在121℃下加熱4小時。按實施例1記載的MMT法測定各加熱試樣的細胞增殖抑制活性。
結果發(fā)現，在添加了dATP、dGTP的各加熱處理物的16倍稀釋液、以及dCTP、dTTP的各加熱處理物的8倍稀釋液的培養(yǎng)基中，與添加水的培養(yǎng)基相比，活細胞數目明顯減少。另外，通過光學顯微鏡觀察，在添加試樣培養(yǎng)的細胞中，分別發(fā)現了細胞核聚集、細胞縮小、形成細胞凋亡體等。在對照的添加了10μl水的培養(yǎng)細胞中沒有發(fā)現這些現象。
(2)配制5種脫氧核苷(脫氧腺核苷、脫氧鳥苷、脫氧胞啶、脫氧胸腺啶、脫氧尿啶)的水溶液，在121℃下加熱4小時。但由于各自的溶解度不同，在水溶液中的濃度分別為脫氧腺核苷25mM、脫氧鳥苷25mM、脫氧胞啶1M、脫氧胸腺啶0.4M、脫氧尿啶1M。
用實施例1記載的MTT法測定各加熱試樣的癌細胞增殖抑制活性。結果發(fā)現，在添加了脫氧腺核苷加熱處理液的2倍稀釋液(換算為1.25mM脫氧核苷)、脫氧鳥苷加熱處理液的4倍稀釋液(換算為0.625mM脫氧核苷)、脫氧胞啶加熱處理液的128倍稀釋液(換算為0.78mM脫氧核苷)、脫氧胸腺啶加熱處理液的16倍稀釋液(換算為2.5mM脫氧核苷)、脫氧尿啶加熱處理液的64倍稀釋液(換算為1.56mM脫氧核苷)的培養(yǎng)基中，與添加水的相比活細胞數顯著減少。另外，通過光學顯微鏡觀察，在添加試樣培養(yǎng)的細胞中，分別發(fā)現了細胞核聚集、細胞縮小、形成細胞凋亡體等。在對照的添加了10μl水的培養(yǎng)細胞中沒有發(fā)現這些現象。
(3)將實施例3-(2)配制的各加熱處理物在下面條件下用HPLC進行分離。
柱TSKgel ODS-80Ts(5μm)、(20mm×25cmTosoh公司生產)流動相A0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液B0.1％TFA/50％乙腈水溶液流速8ml/分洗脫流動相A100％(10分鐘)→經40分鐘從流動相A100％到流動相B100％→流動相B100％(10分鐘)檢測在215nm處測定吸光度將實施例3-(2)配制的加熱處理物各1.5ml分別通過HPLC，將每1分鐘收集餾分濃縮干燥后再溶解于水，按實施例1的MTT法測定，發(fā)現所有加熱溶液試樣15～16分附近峰以及25～28分附近峰均具有細胞凋亡誘發(fā)活性。
(4)將實施例3-(3)得到的在15～16分附近出峰的物質，與實施例2-(3)分離、結構解析得到的反式-4,5-二羥基-2-戊烯醛，在下述條件下用HPLC進行比較。
柱TSKgel ODS-80Ts(5μm)、4.6×250mm流動相A0.1％TFA水溶液B0.1％TFA/50％乙腈水溶液流速1ml/分洗脫流動相A100％(10分鐘)→經10分鐘從流動相A100％到流動相B100％→流動相B100％(10分鐘)檢測在215nm處測定吸光度結果發(fā)現15～16分鐘附近洗脫的活性物質與反式-4,5-二羥基-2-戊烯醛的位置相同。
然后，用核磁共振1H-NMR對各加熱物15～16分鐘附近的活性物質進行構造解析。結果發(fā)現15～16分鐘附近的活性物質與反式-4,5-二羥基-2-戊烯醛的相同。
實施例4(1)0.25mg/ml脫氧核糖核酸(DNA)鈉鹽(和光純藥公司生產、047-22491)的水溶液pH為8.9。取其中部分用1N的HCl調整pH為7.3。在121℃下加熱4小時，在實施例1的方法測定對HL-60細胞的細胞增殖抑制活性。稀釋倍數為2倍、4倍、8倍、16倍以及32倍。
結果發(fā)現，在添加了121℃下加熱處理4小時的DNA鈉鹽水溶液(未調整pH)、DNA鈉鹽水溶液(pH7.3)的各8倍、16倍稀釋液的區(qū)域與添加水的對照區(qū)域相比較，590nm處的吸光度減少，具有細胞增殖抑制活性。
(2)將在121℃下加熱處理2小時的10W/V％的DNA鈉鹽水溶液，按1∶2與乙酸乙酯分配，乙酸乙酯萃取液減壓餾去溶劑后，溶解在氯仿和甲醇比為9∶1的混和液中。
然后，將大約250cm3的柱色譜用硅膠(富士Silicia Kagaku公司生產、BW-300SP)用氯仿與甲醇為9∶1的混和液平衡，填充至φ25mm×60cm的柱中，將上述溶解液用氯仿∶甲醇為9∶1的混和液在0.25Kgf/cm2的壓力下色譜分離，每8ml作為一餾分。
將餾分餾去適量溶劑，用50％乙醇水溶液置換，按實施例1記載的MTT法測定癌細胞增殖抑制活性。其中，將試樣用50％乙醇水溶液按2倍系列稀釋，將各稀釋液2μl或50％乙醇水溶液2μl分別注入平底96孔微量滴定板的池中。培養(yǎng)時間為16小時。
結果發(fā)現，添加了餾分65～81、或177進行培養(yǎng)的細胞，與添加50％乙醇水溶液的相比較，活細胞數明顯減少。另外，通過光學顯微鏡觀察，添加餾分65～81、或177培養(yǎng)的細胞中分別發(fā)現細胞核凝聚、細胞縮小、形成細胞凋亡體等現象。與此對照的添加了50％乙醇水溶液2μl的培養(yǎng)細胞中沒有發(fā)現這些現象。
(3)將餾分65～81用薄層色譜法以及反相HLPLC法進行分析，按實施例1記載的MTT法測定癌細胞增殖抑制活性以及細胞凋亡體形成的情況，結果發(fā)現具有癌細胞增殖抑制活性以及細胞凋亡誘發(fā)活性。
薄層色譜法使用Silicagel 60F254(Merck公司生產、1.05554)，用氯仿與甲醇為9∶1的混和液展開，用苔黑酚硫酸顯色試液進行檢測。
反相HPLC使用TSKgel ODS-80Ts柱(4.6×250mm,Tosoh公司生產)，用水在0.8ml/分流速下洗脫5分鐘后，用濃度梯度法洗脫20分鐘至乙腈水溶液為80％，在206nm處測定吸光度。
上述餾分65～81的活性物質，與薄層色譜法中Rf值為0.42點的物質對應，與反相HPLC分析中保留時間8.8分鐘峰的物質對應。
收集Rf值為0.42的點的物質，減壓餾去溶劑。
另外，用HPLC精制活性成份。使用TSKgel ODS-80Ts柱(φ20×250mm,Tosoh公司生產)，用水以6.5ml/分的流速洗脫，檢測206nm吸光度。收集每個峰的餾分，減壓濃縮后，按上述的MTT法測定活性，將確認具有活性的峰溶解在重水或重二甲亞砜中，通過核磁共振分析。
結果如下所示。1H-NMRδ2.38(1H,dd,J=2.0,19.0Hz,5-H),2.98(1H,dd,J=6.5,19.0Hz,5-H),5.18(1H,m,4-H),6.47(1H,dd,J=1.5,6.0Hz,2-H),7.94(1H,dd,J=2.5,6.0Hz,3-H),但是，HOD的化學位移值為4.65ppm。
1H-NMR的信號歸屬序號如下式[Ⅳ]所示。 由上述可明確判斷本物質為4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。
(4)對于餾分177，按實施例4-(3)同樣通過薄層色譜法以及反相HPLC進行分析，按照實施例4-(2)記載的MTT法測定癌細胞增殖抑制活性以及細胞凋亡體的形成，結果確認了癌細胞增殖抑制活性以及細胞凋亡誘發(fā)活性。
上述餾分177的活性物質，與薄層色譜法中Rf值為0.37的點的物質對應，與反相HPLC分析中保留時間16.8分鐘峰的物質對應。
收集Rf值為0.37的點的餾分177，減壓餾去溶劑。
另外，用HPLC精制活性成份。使用TSKgel ODS-80Ts柱(φ20×250mm,Tosoh公司生產)，用水以6.5ml/分的流速洗脫，檢測206nm吸光度。收集每個峰的餾分，減壓濃縮后，按上述的MTT法測定活性，用DX302質量分析計(日本電子公司生產)進行確認具有活性的峰的質量分析。用間-硝基芐基醇為基質，按正離子方式測定。FAB-MSm/z216〔M+H〕+
然后，用核磁共振測定。核磁共振裝置使用JNM-A500(日本電子公司生產)，結果如下所示。1H-NMRδ2.71(1H,dd,J=3.0,18.5Hz,5-H),2.98(1H,dd,J=7.5,18.5Hz,5-H),5.89(1H,m,4-H),6.50(1H,dd,J=2.0,5.5Hz,2-H),7.24(2H,br-s,6’-NH2のH),7.85(1H,dd,J=2.5,5.5Hz,3-H),8.10(1H,s,2’-H),8.14(1H,s,8’-H)但是，試樣溶解在重二甲亞砜中，重二甲亞砜的殘留質子的化學位移值為2.49ppm。
1H-NMR的信號歸屬序號如下式[Ⅴ]所示。 從上述可確認本物質為4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮。圖1是4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮的質譜圖。圖中，橫坐標表示m/z，縱坐標表示相對強度(％)。
圖2是4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮的1H-NMR圖。圖中，橫坐標表示化學位移值(ppm)，縱坐標表示信號的強度。
(5)將10W/V％的DNA鈉鹽水溶液在121℃下加熱處理2小時。該加熱處理液與乙酸乙酯按1∶2分配，將得到的水相按1∶1與氯仿和甲醇為3∶1的混和液進行再分配，減壓餾去有機溶劑相后，加入氯仿與甲醇為9∶1的混和液，除去殘渣得到溶解液。
然后，將大約250cm3的硅膠柱色譜用硅膠(富士Silicia Kagaku公司生產、BW-300SP)用上述混和液平衡，填充至φ25mm×60cm的柱中，在0.25Kgf/cm2的壓力下將上述溶解液在用氯仿∶甲醇為9∶1的混和液、然后用6∶1的混和液色譜分離，每8ml作為一餾分。
將各餾分用氯仿∶甲醇為4∶1的混和液進行薄層色譜展開，用苔黑酚硫酸顯色試液進行檢測。餾分380～500檢測出呈赤褐色的Rf值0.36的點。
收集餾分400～420，減壓餾去溶劑后用乙醇置換，進行反相HPLC。
反相HPLC使用TSKgel ODS-80Ts柱(φ20×250mm,Tosoh公司生產)，用8％乙腈水溶液在6ml/分流速下洗脫5分鐘后，按濃度梯度法洗脫30分鐘至乙腈水溶液為40％，在206nm處測定吸光度，分餾洗脫時間為35分鐘的峰。
將洗脫時間為35分鐘的峰進行反相HPLC分析，以及HL-60細胞的MTT檢定。
反相HPLC分析使用YMC-Pack ODS-AM柱(φ4.6×250mm,YMC公司生產)，在0.8ml/分的流速下，按濃度梯度法用20分鐘使用從4％至24％的乙腈水溶液進行洗脫，檢測210nm吸光度，檢測洗脫時間為14分的峰。
在MTT檢定中使用約13μg/ml的洗脫時間為35分鐘的峰的干燥物，就可發(fā)現細胞變形以及細胞凋亡體的形成，確認癌細胞增殖抑制活性和細胞凋亡誘發(fā)活性。
對洗脫時間35分鐘的峰進行質量分析以及溶解在重二甲亞砜中進行核磁共振分析。
質量分析使用DX302質量分析計。用甘油為基質，按正離子方式測定。FAB-MSm/z232〔M+H〕+核磁共振裝置使用JNM-A500(日本電子公司生產)，將試樣溶解在重二甲亞砜中，重二甲亞砜的殘留質子的化學位移值為2.49ppm。1H-NMRσ2.61(1H,dd,J=3.5,18.5Hz,5-H),2.91(1H,dd,J=7.0,18.5Hz,5-H),5.65(1H,m,4-H),6.42(2H,br-s,2’-NH2のH),6.46(1H,dd,J=2.0,6.0Hz,2-H),7.65(1H,s,8’-H),7.81(1H,dd,J=2.5,6.0Hz,3-H)信號歸屬序號如下式[Ⅵ]所示。 從上述可確認本物質為4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮。
圖3是4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮的質譜圖。圖中，橫坐標表示m/z，縱坐標表示相對強度(％)。
圖4是4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮的1H-NMR圖。圖中，橫坐標表示化學位移值(ppm)，縱坐標表示信號的強度。
實施例5(1)將2M的D-核糖(Nacalai Tesque公司生產、302-10)水溶液在121℃下加熱處理4小時。將該加熱處理液減壓濃縮后與乙酸乙酯按1∶2分配，在乙酸乙酯中萃取，減壓餾去乙酸乙酯后，溶解在氯仿與甲醇為9∶1的混和液中。
將大約250cm3的柱色譜用硅膠(富士Silicia Kagaku公司生產、BW-300SP)用氯仿與甲醇為9∶1的混和液平衡，填充至φ25mm×60cm的柱中，將上述溶解液用氯仿∶甲醇為9∶1的混和液在0.2Kgf/cm2的壓力下色譜分離，每8ml作為一餾分。將餾分餾去適量的溶劑，用50％乙醇水溶液置換后，按實施例4-(2)記載的MTT法測定細胞增殖抑制活性。
結果發(fā)現，添加了餾分28～36進行培養(yǎng)的細胞，與添加50％乙醇水溶液的相比較，活細胞數明顯減少。另外，通過光學顯微鏡觀察，添加餾分28～36培養(yǎng)的細胞中分別發(fā)現細胞核凝聚、細胞縮小、形成細胞凋亡體等現象。與此對照的添加了50％乙醇水溶液2μl的培養(yǎng)細胞中沒有發(fā)現這些現象。
(2)對于餾分28～36，按實施例4-(3)同樣通過薄層色譜法以及反相HPLC進行分析，按照實施例4-(2)記載的MTT法測定癌細胞增殖抑制活性以及細胞凋亡體的形成，結果確認了癌細胞增殖抑制活性以及細胞凋亡誘發(fā)活性。
上述餾分28～36的活性物質，與薄層色譜法中Rf值為0.44的點的物質對應，與反相HPLC分析中保留時間9.7分鐘峰的物質對應。
收集主要含Rf值0.44的點的餾分28～36，減壓濃縮，用反相HPLC分析，檢測保留時間為9.7分鐘的信號峰。
將該餾分用DX302質量分析計進行質量分析。以硫代甘油為基質，按正離子方式測定。FAB-MSm/z 115〔M+H〕+97〔M-H2O+H〕+79〔M-2H2O+H〕+然后，測定核磁共振譜。核磁共振使用JNM-A500裝置，結果如下所示。1H-NMRδ4.27(1H,ddd,J=2.0,4.0,19.5Hz,5-H),4.51(1H,td,J=2.5,19.5Hz,5-H),4.93(1H,d,J=6.0Hz,1-H),6.02(1H,m,3-H),7.23(1H,ddd,J=2.5,4.0,10.0Hz,4-H),7.26(1H,d,J=6.0Hz,1-OHのH)但將試樣溶解在重二甲亞砜中，重二甲亞砜的殘留質子的化學位移值為2.49ppm。
1H-NMR的信號歸屬序號如下式[Ⅶ]所示。

從上述可確認本物質為1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮。
圖5是1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮的質譜圖。圖中，橫坐標表示m/z，縱坐標表示相對強度(％)。
圖6是1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮的1H-NMR圖。圖中，橫坐標表示化學位移值(ppm)，縱坐標表示信號的強度。
實施例6(1)將2M的2-脫氧-D-核糖(Sigma公司生產、D2851)水溶液在121℃下加熱處理4小時。將該加熱處理液5ml減壓干燥后溶解在氯仿與甲醇為98∶2的混和液中。
將大約250cm3的柱色譜用硅膠(富士Silicia Kagaku公司生產、BW-300SP)用上述混和液平衡，填充至φ25mm×60cm的柱中，將上述溶解液用氯仿∶甲醇為98∶2的混和液在0.2Kgf/cm2的壓力下色譜分離，每8ml作為一餾分。
將餾分餾去溶劑，用50％乙醇水溶液置換后，用于薄層色譜法、反相HPLC分析以及人前骨髓性白血病細胞HL-60細胞的MTT測定。
薄層色譜法使用Silicagel 60F254(Merck公司生產、1.05554)，用氯仿與甲醇為9∶1的混和液展開，用苔黑酚硫酸顯色試液進行檢測。反相HPLC分析使用TSKgel ODS-80Ts柱(4.6×250mm,Tosoh公司生產)，用水在0.8ml/分流速下洗脫5分鐘后，用濃度梯度法洗脫20分鐘至乙腈水溶液為80％，在206nm處測定吸光度。
MTT分析按照實施例4-(2)記載的方法進行。
通過MTT分析，發(fā)現餾分48以及88具有強的細胞增殖抑制活性。餾分48在薄層色譜法中為Rf值0.52的點，反相HPLC分析中在保留時間9.1分鐘的峰被檢出。餾分88在薄層色譜法中為Rf值0.35的點，反相HPLC分析中在保留時間9.1分鐘的峰被檢出。
通過對這些餾分的質量分析以及溶解在重二甲亞砜中進行的核磁共振分析，表明餾分48為4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮，餾分88為反式-4,5-二羥基-2-戊烯醛。
(2)將實施例6-(1)調制的反式-4,5-二羥基-2-戊烯醛的乙醇溶液，在-40℃的冷凍機中靜置保存，產生白色固體物質。
用濾紙過濾該固體物質，用冷乙醇洗滌，得到乙醇溶液和固體物質。
將乙醇溶液用硅膠柱再次進行色譜法。即，將大約250cm3的柱色譜用硅膠(富士Silicia Kagaku公司生產、BW-300SP)用氯仿∶甲醇為98∶2的混和液平衡后，用上述混和液在0.2Kgf/cm2的壓力下色譜分離，每8ml作為一餾分。
反式-4,5-二羥基-2-戊烯醛在餾分90至126中洗脫，副產物在餾分67到76中洗脫。
反相HPLC分析使用YMC-Pack ODS-AM柱(φ4.6×250mm,YMC公司生產)，用水在0.8ml/分流速下洗脫5分鐘后，用濃度梯度法洗脫20分鐘至乙腈水溶液為80％，在210nm處測定吸光度。
固體物質在洗脫時間18分鐘的單峰中被檢出，副產物在洗脫時間18分鐘的主峰中被檢出。
MTT分析在固體物質、副產物中均發(fā)現細胞變形以及細胞凋亡體形成，確認分別具有細胞凋亡抑制活性、細胞凋亡誘導活性。
對固體物質進行質量分析，并溶解在重二甲亞砜中進行核磁共振分析。
質量分析使用DX302質量分析計。以甘油為基質，按正離子方式測定。FAB-MSm/z 215〔M+H〕+237〔M+Na〕+然后，測定核磁共振譜。核磁共振使用NM-A500裝置，將試樣溶解在重二甲亞砜中，重二甲亞砜的殘留質子的化學位移值為2.49ppm。1H-NMRσ3.30(2H,m,1-H),3.80(1H,dd,J=5.0,8.5Hz,7-H),4.01(1H,m,2-H),4.05(1H,t,J=8.5Hz,7-H),4.66(1H,t,J=6.0Hz,1-OHのH),4.84(1H,m,6-H),4.96(1H,d,J=5.0Hz,2-OHのH),5.31(1H,d,J=6.5Hz,5-H),5.66(1H,ddd,J=1.5,6.5,15.5Hz,4-H),6.01(1H,dd,J=4.5,15.5Hz,3-H),6.21(1H,ddd,J=1.5,8.0,15.5Hz,9-H),7.03(1H,dd,J=5.5,15.5Hz,8-H),9.57(1H,d,J=8.0Hz,10-H)信號歸屬序號如下式[Ⅷ]所示。 從上述可確認本物質為2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)。
圖7是2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)的質譜圖。圖中，橫坐標表示m/z，縱坐標表示相對強度(％)。
圖8是2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)的1H-NMR圖。圖中，橫坐標表示化學位移值(ppm)，縱坐標表示信號的強度。
(3)調制實施例6-(1)記載的加熱處理物的濃縮物，將該濃縮物進行硅膠柱色譜。即將大約250cm3的柱色譜用硅膠(富士SiliciaKagaku公司生產、BW-300SP)用氯仿∶甲醇為98∶2的混和液平衡后，用上述混和液在0.2Kgf/cm2的壓力下色譜分離，每8ml作為一餾分。
分餾67～76的餾分，濃縮后用YMC-Pack ODS-AM柱(φ4.6×250mm,YMC公司生產)，用水在0.8ml/分流速下洗脫5分鐘后，用濃度梯度法洗脫20分鐘至乙腈水溶液為80％，在210nm處測定吸光度，分餾洗脫時間18分鐘的單峰，得到2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)。
實施例7(1)將10g的D-葡糖醛酸(Sigma公司生產G 5269)溶解在1升的水中，在121℃下加熱4小時后減壓濃縮至10ml。在其中加入乙酸丁酯∶乙酸∶水=3∶2∶2混和液的上層溶液40ml,混和后離心，將得到的上清液減壓濃縮至10ml。
將上述萃取液作用于硅膠BW-300SP(2×28cm、富士Silicia化學公司生產)進行柱色譜法，用乙酸丁酯∶乙酸∶水=3∶2∶2的上層溶液作為洗脫液，以5ml/分的流速在壓縮機作用的0.2kg/cm2壓力下洗脫。分餾以每10ml作為一個餾分，取各餾分的一部分進行薄層色譜分析，發(fā)現從餾分61至餾分80中含有高純度的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。收集這些餾分減壓下濃縮，用40ml的氯仿萃取，減壓濃縮萃取液得到100mg下式[Ⅸ]表示的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。

(2)實施例7-(1)得到的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的物理性質如下所示。4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的質量分析使用DX302質量分析計(日本電子公司生產)。另外，NMR譜的測定使用重氯仿溶劑，JNM-A500(日本電子公司生產)。比旋光度、UV吸收光譜、紅外吸收光譜分別使用DIP-370型旋光計(日本分光公司生產)、UV-2500分光光度計(島津制作所公司生產)、FTIR-8000紅外分光光度計(島津制作所生產)。FAB-MSm/z115〔M+H〕+使用甘油作為基質。1H-NMR(CDCl3)δ4.20(1H,d,J=2.4Hz,5-H)、4.83(1H,m,4-H)、6.30(1H,dd,J=1.2,6.1Hz,2-H)、7.48(1H,dd,J=2.1,6.1Hz,3-H)但1H-NMR的化學位移值以CHCl3的化學位移值7.26ppm表示。旋光度〔α〕D200°(c 1.3、水)IR(KBr法)3400、1715、1630、1115、1060、1025cm-1有吸收UVλmax 215nm(水)該餾分使用Palpack S柱進行正相HPLC分離，用215nm的紫外線吸收檢測，純度為98％。
(3)取2M D-核糖(Nakalai Tesque公司生產、302-10)水溶液或2M D-(+)-木糖(Nakalai Tesque公司生產、367-19)水溶液，分別在121℃下加熱14小時。在90μl的加熱處理液中加入1M苯硫酚(Nakalai Tesque公司生產、338-01)乙醇溶液10μl，在37℃下反應30分鐘。將加熱處理液以及加熱處理液的苯硫酚反應物通過下面的反相HPLC進行分析。
柱YMC-Pack ODS-AM、(4.6×250mmYMC公司生產)流動相A0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液B0.1％TFA/80％乙腈水溶液流速0.8ml/分洗脫流動相A(5分鐘)→流動相A到流動相B的直線濃度梯度(20分鐘)→流動相B(5分鐘)檢測在215nm處測定吸光度試樣注入量10μl對加熱處理液進行分析，結果發(fā)現核糖與木糖都有保留時間6.5分鐘的峰。這與實施例7-(1)得到的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的保留時間一致。
對加熱處理液的苯硫酚反應物分析，結果發(fā)現核糖與木糖的保留時間6.5分鐘的峰均消失，新出現保留時間19.6分鐘的峰。新出現的峰與實施例7-(1)得到的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮與苯硫酚反應時生成的峰一致。
由上述可知，將核糖或木糖加熱，可以生成4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。
(4)將0.1M、0.2M、0.5M、1M或2M的D-核糖或D-(+)-木糖水溶液分別在121℃下加熱14小時。按實施例7-(2)同樣進行反相HPLC分析，測定保留時間6.5分鐘的峰高，測定4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的生成量。其結果如圖9所示。即，圖9為戊糖濃度與4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮生成量的關系圖，橫軸表示戊糖濃度(M)，縱軸表示4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮生成量(mM)。另外，圖9中黑色圓圈表示D-核糖加熱處理物中4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的生成量，黑三角形表示D-(+)-木糖加熱處理物中4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的生成量。
實施例8(1)將50mg的核糖-5-磷酸鈉(Nakalai Tesque公司生產、302-12)溶解在5ml水中，用HCl調制pH為3，在121℃下加熱4小時。將上述的加熱物用下面的反相HPLC進行分析。
柱TSK gel ODS-80Ts、(4.6mm×250mmTosoh公司生產)流動相TFA水溶液流速1ml/分檢測在215nm處測定吸光度試樣注入量20μl結果發(fā)現保留時間4.7分鐘的峰，與實施例7-(1)得到的精制4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的保留時間一致。另外，從表示用該精制4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮得到的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮與峰面積間關系的標準曲線，可以計算出本加熱物中的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的濃度為6.3μg/ml。
與上述方法相同，取本加熱物200μl進行HPLC，分餾保留時間3.8～5.8分鐘的餾分。反復進行同樣操作2次，將分餾的餾分減壓濃縮，得到干燥固體。在其中加入N,O-雙(三甲基甲硅烷基)-乙酰胺(Nakalai Tesque公司生產)∶三甲基氯硅烷(G.L.Science生產)∶吡啶(Pierce公司生產)=4∶1∶1的混和液進行三甲基硅烷化，用DX-302質量分析計(日本電子公司生產)進行氣相色譜/質量分析，得到的構造解析結果表明，與實施例7-(1)得到的精制4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮具有相同保留時間的峰的質譜，與該精制4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮一致。
由此，確認生成了4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。
(2)將30mg的核糖-5-磷酸鈉溶解在3ml水中，用1N HCl調節(jié)pH為2.5。本試樣中含有的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的量可通過下面的凝膠過濾HPLC進行測定。
柱TSK gel G2500PW(XL)(7.8×300mmTosoh公司生產)柱溫40℃
流動相水流速1ml/分檢測在215nm處測定吸光度結果發(fā)現保留時間11.4分鐘的峰，與實施例7-(1)得到的精制4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的保留時間一致。另外，從表示用該精制4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮得到的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮與峰面積間關系的標準曲線，可以計算出本加熱物中的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的濃度為8.9μg/ml。
所以，通過將核糖-5-磷酸鈉加熱，可以生成4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。
實施例9將2M D-核糖水溶液在121℃下加熱處理4小時。將該加熱處理液減壓濃縮后乙酸乙酯按1∶2分配，用乙酸乙酯萃取，減壓餾去乙酸乙酯后，溶解在氯仿與甲醇為9∶1的混和液中。
將大約250cm3的柱色譜用硅膠(富士Silicia Kagaku公司生產、BW-300SP)用上述混和液平衡，填充至φ25mm×60cm的柱中，將上述溶解液用氯仿∶甲醇為9∶1的混和液在0.2Kgf/cm2的壓力下色譜分離，每8ml作為一餾分。將餾分餾去適量溶劑，用于薄層色譜法，收集餾分38至57，其中含有Rf值0.5的點，餾去溶劑后用50％乙醇水溶液置換。
薄層色譜法使用Silicagel 60F254，用氯仿與甲醇為9∶1的混和液展開，用苔黑酚硫酸顯色試液進行檢測。然后，通過反相HPLC進行活性物質的精制。分餾使用TSKgel ODS-80Ts柱(4.6×250mm)，用水在6.5ml/分流速下洗脫10分鐘后，用濃度梯度法洗脫15分鐘至乙腈水溶液為60％，在206nm處測定吸光度。分餾洗脫時間為15分的峰。
將洗脫時間為15分的峰按實施例4-(2)記載的MTT法測定細胞增殖抑制活性以及細胞凋亡誘發(fā)活性，發(fā)現細胞變形以及阻礙甲_形成，確認細胞增殖阻礙活性以及細胞凋亡誘發(fā)活性。
將洗脫時間15分的峰進行反相HPLC分析。分析使用TSKgelODS-80Ts柱(4.6×250mm)，用水在0.8ml/分流速下洗脫5分鐘后，用濃度梯度法洗脫20分鐘至乙腈水溶液為80％，在206nm處測定吸光度。在該分餾中，洗脫時間15分鐘的峰在洗脫時間5.7分鐘被洗脫出，與實施例7-(1)記載的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的洗脫時間一致。另外，將洗脫時間為15分鐘的峰的餾分溶解在重二甲亞砜中，通過核磁共振分析，確認為4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的圖譜。
實施例10將4-環(huán)戊烯-1,3-二酮(Aldrich公司，編碼16,168-3)l0g以及氯化鈰(Ⅲ).7H2O(Nacalai Tesque公司，編碼077-20)1.94g(5.2mmol)溶解在25ml水中。在冰浴攪拌下，邊攪拌邊緩慢添加NaBH4(Nacalai Tesque公司，編碼312-29)198mg(5.2mmol)，添加結束后用1N的HCl調制pH在中性以下。
用CHCl3∶MeOH=9∶1的展開液將反應液在TLC展開，苔黑酚硫酸檢測，在Rf值0.5附近檢測出紅色點。將該中和反應液減壓濃縮至糖漿狀，用100ml的CHCl3∶MeOH=40∶1的溶液萃取該糖漿，萃取液用硅膠過濾。濾液減壓濃縮后，用80g的中壓硅膠柱色譜法(CHCl3∶MeOH=40∶1)精制，得到淡黃色的油狀的高純度4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮236mg(收率23％)，通過核磁共振進行確認。
實施例11將含有50mM 4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮以及l(fā)00mM L-谷胱甘肽的200mM磷酸緩沖液(pH7)2ml，在37℃下加熱1小時作為試樣，用反向HPLC色譜法分餾峰。使用的柱子為TSKgel ODS-80Ts(φ20×250mm,Tosoh公司生產)，用蒸餾水在6.5ml/分下洗脫，206nm出檢測吸光度。分餾峰后，減壓濃縮，用于實施例1記載的人前骨髓性白血病細胞HL-60細胞的MTT檢測。
通過MTT檢測，發(fā)現洗脫時間14.4分的峰1以及洗脫時間16.6分鐘的峰3具有細胞增殖抑制活性并形成細胞凋亡體。將確認具有活性的兩個峰物質用相同的柱子再次進行色譜精制。
對確認具有活性的兩個峰進行質量分析以及核磁共振分析。
質量分析使用DX302質量分析計(日本電子公司)，將甘油作為基質，按正離子方式測定。
峰1的FAB-MS；m/z406[M+H]+峰3的FAB-MS；m/z406[M+H]+428[M+Na]+核磁共振裝置為JNM-A500(日本電子公司)，溶解在重水中測定。HOD的化學位移值為4.65ppm時1H-NMR的化學位移值如下所示。
峰1；σ2.13(2H,m,5’-H)、2.29(1H,m,2-H)、2.45(1H,m,5-H)、2.50(2H,m,4’-H)、2.65(1H,m,5-H)、2.69(1H,m,2-H)、2.90～3.00(1H,m,1’-H)、3.10～3.18(1H,m,1’-H)、3.61(1H,m,3-H)、3.76(1H,m,6’-H)、3.89(2H,s,9’-H)、4.50～4.62(2H,m,4-H,2’-H)峰3;σ2.10(2H,m,5’-H)、2.27(1H,m,2-H)、2.29(1H,m,5-H)、2.48(2H,m,4’-H)、2.76～2.84(1H,m,5-H)、2.84～2.92(1H,m,2-H)、2.93～3.02(1H,m,1’-H)、3.09～3.21(1H,m,1’-H)、3.40(1H,m,3-H)、3.73(1H,m,6’-H)、3.86(2H,s,9’-H)、4.31～4.40(1H,m,4-H)、4.59(1H,m,2’-H)峰1以及峰3的信號歸屬如下式[Ⅹ]所示。 峰1為3R、4S體與3S、4R體的非對映異構體混合物、峰3為3R、4R體與3S、4S體的非對映異構體混合物。
由此可知，本試樣峰1的3位和4位為順式的順-3-L-谷胱甘肽-s-基-4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮，峰3的3位和4位為反式的反-3-L-谷胱甘肽-s-基-4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。
圖10為峰1的質譜圖。圖中，橫軸表示m/z，縱軸表示相對強度(％)。
圖11為峰3的質譜圖。圖中，橫軸表示m/z，縱軸表示相對強度(％)。
圖12為峰1的1H-NMR譜。圖中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱軸表示信號強度。
圖13為峰3的1H-NMR譜。圖中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱軸表示信號強度。
實施例12(1)將用含10％胎牛血清(56℃下經30分鐘處理)的RPMI1640培養(yǎng)基(BioWhittaker公司生產)在37℃下培養(yǎng)的HL-60(ATCCCCL-240)在RPMI1640培養(yǎng)基上混懸成2.5×105個/5ml。
該混懸液每5m1中，分別添加10μl的實施例6-(1)配制的4,5-二羥基-2-戊烯醛的12.5mM、25mM、50mM或100mM的70％乙醇水溶液、實施例6-(1)配制的4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的0.05mM、0.5mM、5mM或50mM的70％乙醇水溶液、實施例4-(4)配制的4-(9-adenynl)-2-環(huán)戊烯-1-酮的5mM、10mM或20mM的70％乙醇水溶液、實施例4-(5)配制的4-(9-guanynl)-2-環(huán)戊烯-1-酮的2.5mM、5mM、15mM或25mM的70％乙醇水溶液、實施例5-(2)配制的1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮的75mM、150mM或300mM的70％乙醇水溶液、或實施例6-(2)配制的2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧戊烷的5mM、25mM或50mM的70％乙醇水溶液，在37℃、5％二氧化碳存在下培養(yǎng)24小時。
用光學顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞，發(fā)現在添加了最終濃度為1μM以上的4,5-二羥基-2-戊烯醛、最終濃度為10μM以上的4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、最終濃度為10μM以上的4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、最終濃度為39μM以上的4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、最終濃度為625μM以上的1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮、最終濃度為80μM以上的2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)進行培養(yǎng)的細胞中分別出現細胞核凝集、細胞縮小、細胞凋亡體形成等。在作為對照的添加了70％乙醇溶液10ml的培養(yǎng)細胞中沒有發(fā)現這些現象。
(2)將用含10％胎牛血清(56℃下經30分鐘處理)的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)的HL-60在RPMI1640培養(yǎng)基上混懸成2.5×105個/5ml。
該混懸液每5ml，分別添加10μl的4,5-二羥基-2-戊烯醛的12.5mM、25mM、50mM或100mM的70％乙醇水溶液、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的0.05mM、0.5mM、5mM或50mM的70％乙醇水溶液、實施例4-(4)配制的4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮的5mM、10mM或20mM的70％乙醇水溶液、實施例4-(5)配制的4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮的2.5mM、5mM、15mM或25mM的70％乙醇水溶液、實施例5-(2)配制的1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮的75mM、150mM或300mM的70％乙醇水溶液、或實施例6-(2)配制的2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)的5mM、25mM或50mM的70％乙醇水溶液，在37℃、5％二氧化碳存在下培養(yǎng)24小時和48小時。取這些細胞，按1994年秀潤社發(fā)行的細胞工學別冊實驗”ExperimentalProtocol Series-Apoptosis Experiment Protocol”，第129～130頁記載的方法，用FACScan進行細胞凋亡細胞的測定，按1995年羊土社發(fā)行的”Biomanual Up Series-New Experimental Methods forApoptosis”第61～63頁記載的方法進行DNA片斷的解析。
在添加了最終濃度為50μM以上的4,5-二羥基-2-戊烯醛、最終濃度為10μM以上的4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、最終濃度為10μM以上的4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、最終濃度為20μM以上的4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、最終濃度為600μM以上的1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮、最終濃度為50μM以上的2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)進行培養(yǎng)的細胞中發(fā)現了細胞凋亡細胞形成。在添加了最終濃度50、100、200μM的4,5-二羥基-2-戊烯醛、最終濃度為10μM以上的4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、最終濃度為10、30μM以上的4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮進行培養(yǎng)的細胞中，發(fā)現了DNA片斷。另外，在作為對照的添加了70％乙醇溶液10μl的培養(yǎng)細胞中沒有發(fā)現這些現象。
(3)按實施例9-(2)同樣的方法，將培養(yǎng)24小時的細胞部分取樣，用0.4％錐蟲藍染色后，用光學顯微鏡觀察，測定未被染色的活細胞數以及被染成藍色的死細胞數目，求出生存率為50％的各樣品的濃度(生存率50)，如表1所示。
表1物質名稱生存率50(μM)4,5-二羥基-2-戊烯醛 1244-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮25.54-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮22.44-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮67.91,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮 4382-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反 74.4式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)實施例13(1)在2μl拓撲異構酶Ⅱ[Topogen公司生產、2單位/μl]、2μl的10倍濃度緩沖液
、2μl的0.1％牛血清白蛋白(寶酒造社生產)、11μl蒸餾水以及2μl的對照蒸餾水或用水配制的各種濃度的4,5-二羥基-2-戊烯醛、或4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的混合液中，添加0.25μg/μl pBR322 DNA(寶酒造社生產)1μl，在37℃下反應。反應30分鐘后，添加1％十二烷基硫酸鈉、50％甘油、0.02％溴酚藍水溶液2μl，使反應停止。
在瓊脂糖LO3(寶酒造社生產)與TAE緩沖液[40mM Tris、5mM乙酸鈉、1mM乙二胺四醋酸(EDTA)二鈉、用乙酸調整pH7.8]制成的1％瓊脂糖凝膠中，加入上述反應液20μl，在TAE緩沖液中電泳。電泳后，將凝膠在1μg/ml的溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁水溶液中浸潤，紫外線照射觀察DNA電泳模式。另外，在添加水的對照中，DNA由超螺旋型至弛緩型發(fā)生完全變化，阻礙拓撲異構酶Ⅱ活性，則超螺旋型至弛緩型的變化部分或完全被阻礙。
結果發(fā)現，在添加水的對照中，DNA從超螺旋型至弛緩型發(fā)生完全變化，通過添加100μM以上的4,5-二羥基-2-戊烯醛、或4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮，使得DNA超螺旋型至弛緩型的變化部分或完全被阻礙，確認了各化合物的拓撲異構酶Ⅱ阻礙活性。
(2)按實施例13-(1)同樣的方法，測定各化合物的拓撲異構酶Ⅰ阻礙活性。但用拓撲異構酶Ⅰ[Topogen公司生產、0.01單位/μl]代替拓撲異構酶Ⅱ，10倍濃度的緩沖液為100mM Tris-HCl(pH7.9)、10mM EDTA二鈉、1mM精脒、50％甘油。
結果發(fā)現各化合物對拓撲異構酶Ⅰ沒有阻礙活性。
如上所述，各化合物對拓撲異構酶Ⅱ僅在正常細胞分裂期發(fā)生瞬間效果，但對癌變細胞整個周期均高度有效。另外，本發(fā)明的其他化合物也具有同樣的阻礙活性。
實施例145％CO2存在下，37℃下將人細胞株Hs68細胞(ATCC CRL-1635)在含有10％胎牛血清(FBSBioWhittaker)的D-MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL)中培養(yǎng)至培養(yǎng)器飽和，用胰蛋白酶-EDTA溶液(BioWhittaker)在上述培養(yǎng)基中混懸使得細胞為3×105個/ml，分別取200μl注入96孔微量滴定板的池中。培養(yǎng)5天后，當細胞幾乎在培養(yǎng)器中飽和時清除培養(yǎng)基，加入含有5、10、20、40、100或200μM的4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的培養(yǎng)基。取96小時作為一個時間段，每24小時回收培養(yǎng)的上清液，用hIGF-1的ELISA-kit(DiagnosticSystem Labo.)來測定4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮對Hs68細胞的hIGF-1產生誘導活性的影響。
結果對Hs68細胞來說，添加100μM以上的4,5-二羥基-2-戊烯醛、或4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮時，hIGF產生誘導活性在第24小時最大，然后經時減少。另外，與4,5-二羥基-2-戊烯醛相比，4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的hIGF-1誘導活性強。
結果如表2和表3所示。
表24-羥基-2-環(huán)戊培養(yǎng)時間烯-1-酮24小時48小時72小時96小時濃度(μM)hIGF-1產生誘導活性(ng/ml)0 0 0 0 040 0 0 0 010039.9 10.0 9.6 4.420037.9 10.4 9.9 4.2表34,5-二羥基-2-培養(yǎng)時間戊烯醛 24小時48小時72小時96時濃度(μM)hIGF-1產生誘導活性(ng/ml)0 0 0 0 040 0 0 0 010015.3 10.0 5.2 4.620011.3 11.1 9.9 4.5以上顯示了4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的hIGF-1產生誘導活性。另外，本發(fā)明的其他物質也具有相同的活性。
實施例15(1)將從組織性淋巴瘤患者的胸水中得到的滑膜細胞株U937細胞(ATCC CRL-1593)在含有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基上混懸成5×105個/ml，在96孔微量滴定板的池中各注入100μl。然后，加入上述培養(yǎng)基100μl，再加入4,5-二羥基-2-戊烯醛或4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮使之濃度為50、75、100、150或200μM。在37℃下二氧化碳中培養(yǎng)，24、48、72小時后，加入10μl的Premix WST-1(MK400,TakaraShuzo生產)，37℃下反應3小時，將450nm的吸光度(A450)至650nm的吸光度(A650)的差值(A450-650)作為細胞增殖度。
結果如表4和表5所示。
表44-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮 培養(yǎng)時間24小時48小時72小時濃度(μM)細胞增殖度(A450-650)0 0.940 3.912 1.82950 0.501 0.930 0.87575 0.557 0.968 0.821100 0.591 1.054 0.532150 0.524 1.126 0.478200 0.353 0.643 0.338表54,5-二羥基-2-戊烯醛 培養(yǎng)時間24小時48小時72小時濃度(μM) 細胞增殖度(A450-650)0 0.940 3.912 1.82950 0.821 1.471 1.24575 0.606 0.879 0.862100 0.560 0.948 0.597150 0.505 0.823 0.465200 0.370 0.644 0.753以上顯示了4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮對滑膜細胞的增殖抑制活性。另外，本發(fā)明的其他物質也具有相同的活性。
(2)5％CO2存在下，37℃下將從人慢性風濕患者的滑膜得到的織維芽細胞株DSEK細胞(體外試驗中作為風濕模型，琦玉醫(yī)科大學綜合醫(yī)療中心第二內科保存)在含有10％FBS(BioWhittaker)的Iscov-MEM培養(yǎng)基(IMDM:Gibco BRL)中培養(yǎng)至培養(yǎng)器飽和，用胰蛋白酶-EDTA溶液(BioWhittaker)在上述培養(yǎng)基中混懸使得細胞為3×104個/ml，分別取200μl注入96孔微量滴定板(FALCON公司生產)的池中。培養(yǎng)5～7天后，當細胞在培養(yǎng)器中達到80％飽和時更換培養(yǎng)基，加入含有50、75、100、150μM的4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的上述培養(yǎng)基。
取96小時作為一個時間段，每24小時加入10μl的Premix WST-1(MK400,Takara Shuzo生產)，37℃下反應3.5小時，將450nm的吸光度(A450)至650nm的吸光度(A650)的差值(A450-650)作為細胞增殖度。
結果如表6和表7所示。
表64-羥基-2-環(huán)戊培養(yǎng)時間烯-1-酮24小時48小時72小時96小時濃度(μM) 細胞增殖度(A450-660)0 1.04 1.25 1.46 2.3550 0.57 0.71 0.73 0.5475 0.51 0.68 0.68 0.551000.50 0.64 0.67 0.511500.46 0.55 0.63 0.50
表74,5-二羥基-2- 培養(yǎng)時間戊烯醛 24小時 48小時 72小時 96小時濃度(μM)細胞增殖度(A450-650)0 1.041.251.462.3350 1.120.830.960.9875 1.110.770.670.59100 1.020.630.540.59150 0.960.610.410.55通過A450-650的數值求得的半數細胞增殖抑制濃度-IC50如表8所示。
表8IC504-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮4,5-二羥基-2-戊烯醛48小時96小時48小時96小時濃度(μM)60 35165 75(3)在實施例15-(2)記載的條件下調整DSEK細胞，加入含有25、50、75、100、200或400μM的4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)的培養(yǎng)基20μl。
取72小時作為一個時間段，每24小時測定細胞增殖度。另外，求出各化合物的IC50。
結果如表9所示。
表9物質名 IC50(μM)24小時72小時4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮207604,5-二羥基-2-戊烯醛 2321194-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮132672-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式- 267682-甲酰基乙烯基)-1,3-二氧雜戊環(huán)未添加試樣的對照品在第24小時、第72小時的增殖度分別為3.95、3.97。
以上，在體外試驗風濕模型的DSEK細胞中，添加了4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)，與添加PBS的對照區(qū)域相比，添加各化合物的區(qū)域內風濕細胞的增殖受到強烈抑制。另外通過經時觀察，發(fā)現這些化合物的增殖抑制活性不僅持續(xù)存在，而且隨時間變化增強的趨勢。
根據以上結果，發(fā)現4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)具有強的抗風濕活性，并期待開發(fā)出對治療慢性風濕有用的治療藥品以及健康食品。另外，本發(fā)明的其他化合物也具有同樣的抗風濕活性。
在DSEK細胞培養(yǎng)時，每24小時經時回收150μl/池的培養(yǎng)上清液，分別使用對細胞素具有特異性的ELISA-kit(人FGF-β和人IL-10、INTERGEN公司生產、人TGF-β和人IL-1α、Promega公司生產)，來測定4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮對細胞產生的細胞素(人TGF-β、人FGF-β、人IL-1α、人IL-10)的影響。
結果發(fā)現，4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮抑制人FGF-β和人IL-1α的產生。4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮抑制人TGF-β和人FGF-β的產生，但使人IL-1α活化。2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)使人IL-1α活化。4,5-二羥基-2-戊烯醛使人IL-1α和人IL-10活化。
實施例16將從肝胚細胞瘤患者的原發(fā)性肝芽細胞瘤中得到的細胞株HepG2細胞(ATCC HB-8065)在含有10％FBS(Bio Whittaker)的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基上混懸成3.8×103個/ml，在96孔微量滴定板的池中各注入200μl,5％CO2存在下，37℃下培養(yǎng)至培養(yǎng)器飽和。交換培養(yǎng)基后，加入4,5-二羥基-2-戊烯醛或4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮，使?jié)舛确謩e為25、50、100或150μM，培養(yǎng)24、48、72小時后，加入10μl的Premix WST-1(MK 400,Takara Shuzo生產)，37℃下反應3小時，將450nm的吸光度(A450)至650nm的吸光度(A650)的差值(A450-650)作為細胞增殖度。
結果如表10和表11所示表104-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮 培養(yǎng)時間24小時48小時72小時濃度(μM) 細胞增殖度(A450-650)03.47 2.96 2.5725 1.30 0.70 0.4950 1.38 0.81 0.47100 1.31 0.56 0.35150 1.23 0.43 0.30
表114,5-二羥基-2-戊烯醛 培養(yǎng)時間24小時48小時72小時濃度(μM) 細胞增殖度(A450-650)0 3.47 2.96 2.5725 3.39 2.69 1.7050 1.97 2.96 1.70100 1.81 2.70 0.89150 1.40 0.79 0.35由此表明，4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮對人肝胚細胞瘤的HepG2細胞具有癌細胞增殖抑制活性。另外，本發(fā)明的其他化合物也具有相同的活性。
實施例17將RAW264.7細胞(ATCC TIB 71)在含有10％胎牛血清(Gibco)、不含酚紅、含有2mM L-谷氨酸(Lifetech Oriental生產、25030-149)的、由Dulbecco(BioWhittaker、12-917F) 改良的Eag1e培養(yǎng)基上混懸至3×105個/ml，在48孔微量滴定板的池中各注入500μl,5％CO2存在下，37℃下培養(yǎng)12小時。在池中，加入10μl的50μg/ml脂聚糖(LPS、Sigma制、L-2012)或2.5μg/mlLPS與500單位/ml干擾素γ(Genzyme:MG-IFN)各10μl，再加入10μl的1000、500或250μM的2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1,3-二氧雜戊環(huán)水溶液，培養(yǎng)18小時后，根據在培養(yǎng)基中氧化的NO測定生成的NO2-的濃度。作為對照，設定不添加LPS和干擾素γ的區(qū)域，以及不添加2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)的區(qū)域。
上述培養(yǎng)后，在100μl的培養(yǎng)基中加入100μl的4％Griess試劑(Sigma,G4410)，在室溫下放置15分鐘后，490nm處測定吸光度。通過上述培養(yǎng)基中溶解的已知濃度的NaNO2制作的檢量線，計算培養(yǎng)基中NO2-的濃度。所有測定都進行3次。
結果2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1,3-二氧雜戊環(huán)根據濃度不同可以抑制LPS產生NO，也可以抑制LPS和干擾素γ產生NO。
結果如圖14所示。即，圖14為添加2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)在各培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中NO2-的濃度。圖14中橫軸為培養(yǎng)條件，縱軸為NO2-的濃度(μM)。另外圖中2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1,3-二氧雜戊環(huán)簡單記載為二氧雜戊環(huán)。
最終濃度10μM的2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)，即使完全沒有細胞增殖抑制的活性，也顯示具有約50％NO產生抑制的活性。結果表明，2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲酰基乙烯基)-1,3-二氧雜戊環(huán)抑制NO的產生，并不是由2-(反式-3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(反式-2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)引起的細胞增殖抑制的起因。另外，本發(fā)明的其他化合物也具有同樣的活性。
實施例18將含有2×105個/ml HL-60(ATCC CCL-240)的含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基5ml，注入6孔滴定板的個池中，5％CO2存在下，37℃下培養(yǎng)24小時后，添加4,5-二羥基-2-戊烯醛使最終濃度為0、12.5、25、50或100μM，或添加4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮使最終濃度為0、2.5、5、10、20、40或80μM，再持續(xù)培養(yǎng)6小時。
培養(yǎng)結束后，計測細胞數，用離心分離回收細胞，PBS洗滌后，配制各試樣的處理細胞。在45℃下加熱處理5分鐘后，同樣配制培養(yǎng)的細胞。
用這些處理細胞，按Molecular Cloning Cold Spring Harb orLaboratory Press(1989)記載的方法，進行SDS-PAGE。將這些處理細胞在SDS-PAGE Sample buffer中混懸成2×106個/ml。將該細胞混懸液在100℃下處理10分鐘后，各取5μl分別加至2個SDS-PAGE(5％積層凝膠和10％分離凝膠)中，進行電泳。其中一個凝膠被Coomassie染色，另外的凝膠吸附在聚偏氟乙烯轉移膜[ImmobilonTM:MILLIPORE Cat.IPVH000-10]上。將該膜在Block Ace(大日本制藥株式會社Cat.UK-B25)4℃下封閉一夜。
將該封閉的膜與和被熱誘導的70kDa熱休克蛋白具有特異反應的單克隆抗體HSP72/73(Ab-1)(Oncogene Research Products;catalogno.HSP01)反應后，用含有0.05％Tween20的TBS洗滌，再用TBS洗滌。然后，與Peroxidase復合物二次抗體HRP-Rabbit Anti MouseIgG(H+L)[ZYMED Laboratories,Inc.生產Cat.61-6520]反應，與上述同樣操作進行洗滌。將與一次抗體、二次抗體反應的膜，與chemiluminol試劑RENAISSANCEAM[Dupont NEN,catalog no.NEL-100]反應后，在X-射線下感光，確認70kDa的熱休克蛋白的誘導。
結果確認4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的熱休克蛋白誘導活性。其誘導的強弱如表13和表13所示。另外，在表12、表13中，+表示誘導強度，+越多表示誘導越強。另外，-說明沒有發(fā)現誘導作用，±說明稍微有誘導作用。另外，本發(fā)明的其他化合物也具有同樣的熱休克蛋白誘導活性。
表12濃度(μM)1.2525501004,5-二羥基-2-戊烯醛 - ±+++ -
表13濃度(μM)2.55102040804-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮 - ±++++++±但是，未處理的為-，45℃下加熱處理5分鐘為++。
實施例19注射劑將實施例1記載的D-核糖的加熱處理物的中和物的濃縮干燥固體溶解在注射用蒸餾水中，配制1％的溶液。將該溶液填充至冷凍干燥用瓶中，1瓶內換算為上清液中的干燥物為10mg，冷凍干燥。添加2m1生理食鹽水作為另外的溶解液。
同樣，用4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲酰基乙烯基)-1,3-二氧雜戊環(huán)配制注射液。
實施例20片劑按下面處方配制片劑。

使用實施例4記載的DNA鈉鹽加熱處理物的冷凍干燥物。同樣，用4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)制成片劑。
本發(fā)明提供了具有細胞凋亡誘發(fā)能力的、可以誘發(fā)癌癥細胞細胞凋亡的、對該疾病的預防、治療有效的本發(fā)明的加熱處理物以及/或其部分精制物，以及具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質。另外，提供了從除糖醛酸以外的戊糖類得到4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的制造方法。對于癌癥疾病，特別是大腸癌、胃癌等消化系統(tǒng)的癌癥，通過經口服用含有從具有細胞凋亡誘發(fā)能力的、本發(fā)明的加熱處理物以及/或部分精制物中選擇的化合物的食品和飲料，可以引發(fā)癌癥細胞凋亡，含有、添加以及/或稀釋具有細胞凋亡誘發(fā)能力的、從本發(fā)明的加熱處理物以及/或部分精制物中選擇的物質得到的食品或飲料，對消化系統(tǒng)癌癥的治療和預防具有優(yōu)良的效果。含有以具有細胞凋亡誘發(fā)能力的、從本發(fā)明的加熱處理物以及/或其部分精制物中選擇的物質作為有效成分的醫(yī)藥品，對癌細胞、滑膜細胞等異常增殖細胞具有增殖抑制活性，對維持機體的恒常性極為有用。另外，通過hIGF產生誘導能力，對治療和預防需要誘導產生hIGF的疾病有用。另外，對需要抑制活性氧，例如抑制NO產生的疾病的治療和預防有用。再有，由于具有熱休克蛋白誘導能力，對治療和預防需要誘導熱休克蛋白的疾病，例如病毒性疾病有用。
具有細胞凋亡誘發(fā)能力的、本發(fā)明的加熱處理物以及/或其部分精制物，可以廉價并大量的供給作為食品的原料。另外，通過使用具有細胞凋亡誘發(fā)能力的、本發(fā)明的加熱處理物以及/或其部分精制物，作為有效成分使用，可以提供簡便的誘發(fā)細胞凋亡的方法，通過使用該方法，可以進行細胞凋亡機制的研究、開發(fā)細胞凋亡誘發(fā)阻礙劑的。
本發(fā)明提供了以本發(fā)明的化合物中選擇的化合物作為有效成分的醫(yī)藥品，該醫(yī)藥品對治療和預防癌癥疾病、風濕、糖尿病、病毒性疾病等疑難病癥極為有用。
另外，本發(fā)明提供了通過含有、添加以及/或稀釋得到的含有本發(fā)明化合物中選擇的化合物組成的食品或飲料，該食品或飲料對預防癌癥疾病、風濕、糖尿病、病毒性疾病等疑難病以及改善癥狀等有用，是具有細胞凋亡誘發(fā)用、抗癌用、抗風濕用、抗糖尿病用、熱休克蛋白誘導用等的功能性食品或飲料。
另外，通過本發(fā)明，可以提供簡單的生產4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的方法。另外，可以提供具有生理活性的新型化合物，例如4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)以及通式[Ⅰ]表示的化合物。
權利要求
1．具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質的制造方法，其特征是包括加熱處理從下述(a)、(b)、(c)、(d)中選擇的至少一種化合物(但是，糖醛酸以及/或糖醛酸衍生物、以及含有糖醛酸以及/或糖醛酸衍生物的化合物除外)的工序，(a)戊糖(b)戊糖衍生物(c)含有戊糖的化合物(d)含有戊糖衍生物的化合物。
2．權利要求1記載的制造方法，其中戊糖是核糖或木糖。
3．權利要求1記載的制造方法，其中戊糖衍生物是脫氧戊糖。
4．權利要求3記載的制造方法，其中戊糖衍生物是脫氧核糖。
5．權利要求1記載的制造方法，其中含有戊糖的化合物是核糖核苷、核糖核苷酸、核糖核酸。
6．權利要求1記載的制造方法，其中含有戊糖的化合物是5位上與帶負電荷的基團鍵合的戊糖。
7．權利要求1記載的制造方法，其中戊糖衍生物是5位上與帶負電荷的基團鍵合的戊糖衍生物。
8．權利要求6或7記載的制造方法，其中帶負電荷的基團是磷酸基或硫酸基。
9．權利要求1記載的制造方法，其中含有戊糖衍生物的化合物是脫氧核苷、脫氧核苷酸或脫氧核糖核酸。
10．權利要求1-9任一項記載的制造方法，其中具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質是從4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮、4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮中選擇的化合物。
11．細胞凋亡誘發(fā)性化合物，是從4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)以及下面通式[Ⅰ]表示的化合物中選擇的化合物， 式中，R表示從含有SH基團的化合物中除去SH的殘基。
12．對從4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮以及通式[Ⅰ]表示的化合物中選擇的化合物具有感受性的疾病的治療和預防用藥物，其特征是含有從4,5-二羥基-2-戊烯醛、4-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-腺嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-(9-鳥嘌呤基)-2-環(huán)戊烯-1-酮、2-(3,4-二羥基-1-丁烯基)-4-(2-甲?；蚁┗?-1,3-二氧雜戊環(huán)、1,5-環(huán)氧-1-羥基-3-戊烯-2-酮以及通式[Ⅰ]表示的化合物中選擇的化合物作為有效成份，
13．權利要求12中記載的藥物，是抗癌劑、細胞凋亡誘發(fā)劑、抗風濕劑、人胰島素樣增殖因子產生誘導劑、活性氧產生抑制劑、或熱休克蛋白誘導劑。
14．一種食品或飲料，其中含有、稀釋以及/或添加將選自下述(a)、(b)、(c)、(d)中的至少一種化合物(但是，糖醛酸以及/或糖醛酸衍生物、以及含有糖醛酸以及/或糖醛酸衍生物的化合物除外)加熱處理得到的具有細胞凋亡誘發(fā)能力的加熱處理物以及/或其部分精制物，(a)戊糖(b)戊糖衍生物(c)含有戊糖的化合物(d)含有戊糖衍生物的化合物。
15．權利要求14記載的食品或飲料，是抗癌用、細胞凋亡誘發(fā)用、抗風濕用、人胰島素樣增殖因子產生誘導用、活性氧產生抑制用或熱休克蛋白誘導用的食品或飲料。
全文摘要
具有細胞凋亡誘發(fā)能力的物質的制造方法,其特征是包括加熱處理從下述(a)、(b)、(c)、(d)中選擇的至少一種化合物(但是,糖醛酸以及/或糖醛酸衍生物、以及含有糖醛酸以及/或糖醛酸衍生物的化合物除外)的工序:(a)戊糖(b)成糖衍生物(c)含有戊糖的化合物(d)含有戊糖衍生物的化合物。
文檔編號A61K31/198GK1288456SQ99802229
公開日2001年3月21日 申請日期1999年1月14日 優(yōu)先權日1998年1月19日
發(fā)明者巽容子, 佐川裕章, 大野木宏, 小林英二, 務華康, 小山信人, 豬飼勝重, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社