專利名稱：具有活性的刺猬狀蛋白偶聯(lián)物及其生產(chǎn)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種活性增強(qiáng)的刺猬狀(hedgehog)蛋白偶聯(lián)物(conjugate)及其生產(chǎn)方法和醫(yī)療用途。
刺猬狀(hh)蛋白可以理解為是一族分泌出的信號(hào)蛋白，在胚胎發(fā)生中它們對(duì)許多結(jié)構(gòu)的形成都起作用(J.C.Smith，《細(xì)胞》76(1994)193-196,N.Perrimon，《細(xì)胞》80(1995)517-520,C.Chiang等，《自然》83(1996)407,M.J.Bitgood等，《當(dāng)代生物學(xué)》，6(1996)296,A.Vortkamp等，《科學(xué)》273(1996)61 3,C.J.Lai等，《發(fā)育》121(1995)2349)。在其生物合成過(guò)程中，對(duì)信號(hào)序列的裂解和自身催化的裂解后，可得到20kD的N-末端結(jié)構(gòu)域和25kD的C-末端結(jié)構(gòu)域。在天然蛋白質(zhì)中，裂解C-末端結(jié)構(gòu)域后，N-末端結(jié)構(gòu)域在它的C-末端受到膽固醇修飾(J.A.Porter等，《科學(xué)》274(1996)255-259)。在高等的生命形式中，hh家族至少由三個(gè)成員組成即sonic、indian和desert hh(shh、Ihh、Dhh；M.Fietz等，《發(fā)育》(增刊)(1994)43-51)組成。在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中重組產(chǎn)生后可以觀察到生成的刺猬狀蛋白活性的差異(M.Hynes等，《神經(jīng)元》15(1995)35-44和T.Nakamura等，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊》237(1997)465-469)。
Hynes等比較了在轉(zhuǎn)化的人胚腎293細(xì)胞的上清液中hh(真核細(xì)胞hh)與大腸桿菌中生成的hh的活性，發(fā)現(xiàn)從腎細(xì)胞系上清液中得到的hh的活性高四倍。這種hh活性增長(zhǎng)的原因經(jīng)討論認(rèn)為是由于存在只能在真核細(xì)胞中表達(dá)的潛在的額外輔助因子、翻譯后的修飾、不同的N-末端(因?yàn)閺拇竽c桿菌細(xì)胞分離的hh 50％都攜帶兩個(gè)附加N-末端氨基酸(Gly-Ser)或縮短了5-6個(gè)氨基酸)，或者是由于較高聚集狀態(tài)(如通過(guò)與鎳瓊脂糖珠結(jié)合)。
Nakamura等比較了在轉(zhuǎn)化的雞胚胎成纖維細(xì)胞上清液中的shh與從大腸桿菌中分離的仍具有N-末端多組氨酸部分的shh融合蛋白的活性。在C3H10T1/2細(xì)胞中刺激堿性磷酸酶(AP)方面，該成纖維細(xì)胞上清液中的shh比純化的該大腸桿菌蛋白有高7倍的活性。現(xiàn)已假定這種增強(qiáng)的活性是由于hh與諸如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)之類分子的協(xié)同作用的緣故，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白僅存在于真核細(xì)胞的上清液中，與hh組合時(shí)能夠更強(qiáng)地誘導(dǎo)AP。
Kinto等，F(xiàn)EBS Letters,404(1997)319-323中描述了在膠原上肌內(nèi)植入分泌hh的成纖維細(xì)胞能夠誘導(dǎo)異位骨形成。但是，分離出的hh蛋白尚未知有這一活性。
本發(fā)明的目的是提供比已知形式具有顯著提高的活性的hh蛋白(多肽類)。
該目的是通過(guò)重組生成已人工使其親脂化的刺猬狀蛋白而得以實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選這種親脂化是采用化學(xué)修飾方法實(shí)現(xiàn)的。這類刺猬狀蛋白偶聯(lián)物最好包括一個(gè)附加多肽，所述多肽是共價(jià)結(jié)合的(優(yōu)選在C-末端和/或N-末端)，并且由10-30個(gè)優(yōu)選的疏水氨基酸和/或那些形成跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸組成。這種附加多肽特別優(yōu)選包含2-12個(gè)賴氨酸和/或精氨酸但是不含多組氨酸部分，所述多組氨酸部分適合于在Ni螯合物柱上純化該偶聯(lián)物。也優(yōu)選共價(jià)結(jié)合(優(yōu)選在C-末端和/或N-末端)1-4個(gè)鏈長(zhǎng)為8-24個(gè)碳原子的飽和或不飽和烴基或有親脂性(疏水)作用的類固醇。而且，優(yōu)選通過(guò)氧化所形成的二硫橋?qū)⑹杷詭€基化合物，如特別是巰基膽固醇和巰基鏈烷烴、巰基鏈烯烴與hh蛋白共價(jià)偶聯(lián)(優(yōu)選在C-末端和/或N-末端半胱氨酸，此處是在N-末端半胱氨酸)。
所述蛋白質(zhì)可以用這類親脂基團(tuán)疏水化，這樣能夠改善該蛋白質(zhì)與真核細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的脂膜的相互作用。
所以，應(yīng)當(dāng)將本發(fā)明親脂化蛋白理解為是疏水化蛋白，它相對(duì)于未修飾的蛋白具有增強(qiáng)的表面疏水性，這樣增加了它對(duì)非極性分子或兩親物的親合力。該蛋白親脂性程度的增加可以通過(guò)如Haque,Z.等，農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志(J.Agric.Food Chem.)30(1982),481所述的在脂質(zhì)層聚集的程度來(lái)測(cè)定。蛋白質(zhì)的疏水化(親脂化)修飾方法例如在Haque,Z.等，農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志31(1983)1225-1230；Webb,R.J.等，《生物化學(xué)》37(1998)673-679；Hancock,J.F.，《細(xì)胞》63(1990)133-139；《膜蛋白純化的實(shí)踐指南》，G.v.Jagow,Hermann Schagger(1994)編輯，(第16章，第535-554頁(yè))中進(jìn)行了描述。
令人驚奇的結(jié)果是在藥劑和體外試驗(yàn)中這種親脂化刺猬狀蛋白(在下文中也指刺猬狀蛋白偶聯(lián)物(hh偶聯(lián)物))比未修飾的刺猬狀蛋白(如在大腸桿菌中細(xì)胞質(zhì)表達(dá)后)活性顯著提高，優(yōu)選提高至少10倍，特別優(yōu)選提高103-105倍。另外，還令人驚奇的是本發(fā)明這種刺猬狀蛋白偶聯(lián)物可特別有利地用于對(duì)骨、軟骨、神經(jīng)細(xì)胞(在神經(jīng)損傷或神經(jīng)變性疾病中)或肌肉組織的局部治療中。
從Yang等在《發(fā)育》124(1997)4393-4404中得知，對(duì)體內(nèi)藥物有效活性來(lái)說(shuō)，刺猬狀蛋白的局部高濃度必須在身體內(nèi)作用部位保持至少16小時(shí)。由于Yang等就此所述的載體系統(tǒng)(即裝載有刺猬狀蛋白的色譜基質(zhì)affigel CM),Marti等在《自然》375(1995)322-325中所述的Ni瓊脂糖或者Lopez-Martinez等在《當(dāng)代生物學(xué)》5(1995)791-796中所用的Affigel蘭或者他們所用的肝素瓊脂糖顆粒具有免疫原性，并且能夠引起炎癥反應(yīng)，所以它們都不太適合用于藥物應(yīng)用中。
本發(fā)明的偶聯(lián)物是新的活性物質(zhì)，可用于生產(chǎn)施用的藥物劑型?？偟恼f(shuō)來(lái)，偶聯(lián)導(dǎo)致刺猬狀蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)曲線有所改良。疏水性烴基能使刺猬狀蛋白定位于靶細(xì)胞的細(xì)胞膜上，這樣，除了容易使刺猬狀蛋白整合到細(xì)胞內(nèi)以外，總的說(shuō)來(lái)還使刺猬狀蛋白在細(xì)胞表面的存在時(shí)間顯著延長(zhǎng)，這對(duì)藥理作用來(lái)說(shuō)是最好不過(guò)了。
本發(fā)明偶聯(lián)物不一定需要另外偶聯(lián)到載體上以便緩慢釋放。本發(fā)明刺猬狀蛋白偶聯(lián)物在未從載體中形成長(zhǎng)期持續(xù)釋放(幾天)的情況下也能在體內(nèi)作用部位具有較高活性。不過(guò)，對(duì)局部使用本發(fā)明刺猬狀蛋白偶聯(lián)物來(lái)說(shuō)，使用包含本發(fā)明偶聯(lián)物和載體基質(zhì)的這樣一種藥物組合物是有利的。該載體基質(zhì)具體來(lái)說(shuō)是通過(guò)為這種藥物組合物提供局部使用的合適最小粘度而基本上起到利于局部應(yīng)用的作用。該藥物組合物優(yōu)選緩沖于pH4-9之間，并且包括一種或幾種非離子型去污劑如聚氧山梨酸酯或聚氧乙烯型去污劑(如Tween20,Tween80,TritonX-100)、辛基葡糖苷，或離子型去污劑如脫氧膽酸鈉、膽酸鈉、?；敲撗跄懰徕c。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)了在N-末端和/或C-末端包含附加的10-30個(gè)主要是疏水氨基酸的hh蛋白，因?yàn)檫@些氨基酸也摻入到細(xì)胞膜中[Webb等，《生物化學(xué)》37(1998)673-679,Skolnick等，生物膜(1996)536-554；ed.:Merz和Roux]。在本發(fā)明情況中，應(yīng)當(dāng)將疏水性氨基酸理解為在從水相到疏水/有機(jī)相的轉(zhuǎn)換中具有負(fù)自由能的氨基酸。而且，已知能形成跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的N-末端和/或C-末端序列(如M28肽)，或者能夠作為螺旋結(jié)構(gòu)而與膜表面作用的N-末端和/或C-末端序列(如maginin2)(Skolnick等，1996)也適合用于增加hh蛋白的活性。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)含有2-12個(gè)賴氨酸和/或精氨酸的多肽基團(tuán)對(duì)刺猬狀蛋白的N-末端和/或C-末端進(jìn)行修飾。在這種情況下，有可能省略用烴基進(jìn)行的修飾。
具有疏水作用并且鏈長(zhǎng)為8-24，優(yōu)選10-24，最優(yōu)選12-18個(gè)碳原子的一種飽和或不飽和脂族烴基優(yōu)選是任意用氧或硫原子或羰基打斷的飽和的/或單一不飽和到多不飽和的脂肪酸或烷基醇基團(tuán)。特別優(yōu)選的飽和脂肪酸是癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸和山萮酸。優(yōu)選的單一不飽和脂肪酸是肉豆蔻酸、棕櫚油酸和油酸。特別優(yōu)選的多不飽和脂肪酸是亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸。這類脂肪酸基團(tuán)優(yōu)選通過(guò)酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵或硫酯鍵而與該蛋白的反應(yīng)性基團(tuán)偶聯(lián)。
每個(gè)蛋白質(zhì)分子的疏水性烴鏈數(shù)能夠通過(guò)反應(yīng)條件(如稀釋)或者通過(guò)選擇被修飾的氨基酸來(lái)適當(dāng)?shù)乜刂啤＠?，shh包含三個(gè)半胱氨酸，其中N-末端半胱氨酸特別活潑。這樣，反應(yīng)步驟能夠使得N-末端半胱氨酸被一個(gè)或者多個(gè)疏水性烴鏈所修飾。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上講，修飾兩個(gè)或幾乎所有三個(gè)半胱氨酸也是可能的。盡管當(dāng)修飾其他氨基酸時(shí)優(yōu)選修飾所指定的氨基酸，但也有可能在藥物組合物中使用衍生的刺猬狀蛋白，所述衍生的刺猬狀蛋白存在每個(gè)分子大約1到4條鏈的烴鏈修飾這種統(tǒng)計(jì)學(xué)分布。盡管每個(gè)分子中烴鏈數(shù)較高是適合的，但由此使得藥物組合物的溶解度下降，這會(huì)破壞活性三維蛋白結(jié)構(gòu)。當(dāng)與長(zhǎng)鏈烷基(C14-C24，優(yōu)選C16-C24)偶聯(lián)時(shí)，優(yōu)選只偶聯(lián)1-2條碳鏈，然而，當(dāng)偶聯(lián)短碳鏈時(shí)，優(yōu)選偶聯(lián)2-3個(gè)烷基。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述衍生作用也包括將兩個(gè)疏水烴鏈偶聯(lián)于一個(gè)氨基酸上。這可通過(guò)例如將脂肪酸的甘油二酯與所述氨基酸偶聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
由于刺猬狀蛋白十分不穩(wěn)定，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將N-末端半胱氨酸的SH基團(tuán)受到保護(hù)的刺猬狀蛋白用于偶聯(lián)。通過(guò)在偶聯(lián)步驟之前或偶聯(lián)過(guò)程中迅速還原受保護(hù)的SH基團(tuán)即可以得到一種SH偶聯(lián)產(chǎn)物。優(yōu)選通過(guò)形成同源刺猬狀二硫鍵或混合的二硫鍵(如用GSH或β-巰基乙醇)來(lái)保護(hù)該半胱氨酸的SH基團(tuán)。
巰基保護(hù)基在本領(lǐng)域是已知的，包括但不限于三苯甲基(三苯甲游基)和s-叔丁基、s-對(duì)硝基芐基和s-對(duì)甲氧基芐基(參見如Greene和Wuts，《有機(jī)合成中的保護(hù)性基團(tuán)》，第二版，John Wiley&Sons，紐約(1991)，和Atherton等，《肽》，Gross和Meienhofer編輯，Academic Press，紐約(1983)，第19卷，1-38)。對(duì)生產(chǎn)巰基受到修飾的刺猬狀蛋白來(lái)說(shuō)，這種巰基受到保護(hù)的或同型二聚體化的刺猬狀蛋白是有價(jià)值的中間體，它們是本發(fā)明的主題。
本發(fā)明還涉及刺猬狀蛋白的用途，其中N-末端半胱氨酸的SH基團(tuán)受到保護(hù)或被同型二聚體化，可作為穩(wěn)定的中間體來(lái)生產(chǎn)SH受到修飾的刺猬狀蛋白。在該工藝中，裂解保護(hù)性基團(tuán)或者裂解同型二聚體，并且與激活的衍生劑反應(yīng)。
優(yōu)選下列方法來(lái)偶聯(lián)SH受到保護(hù)的刺猬狀蛋白Ⅰ．當(dāng)用咪唑化物(imidazolides)或輔酶A衍生物進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)，優(yōu)選在偶聯(lián)混合物中還原二硫化物或裂解保護(hù)基團(tuán)。
Ⅱ．還原二硫化物，在酸性基質(zhì)中分離未被保護(hù)的單體，立即在中性范圍使用激活的二硫化物(如吡啶基-SS)作偶聯(lián)劑進(jìn)行偶聯(lián)。
現(xiàn)已清楚N-末端半胱氨酸上的雙?；饕霈F(xiàn)在用咪唑化物或輔酶A衍生物(約60-70％)的偶聯(lián)中，其中，被偶聯(lián)的疏水化合物一方面以酰胺結(jié)合，另一方面以硫酯形式結(jié)合。選擇性裂解以硫酯形式結(jié)合的疏水性化合物能夠合成單一疏水化的刺猬狀蛋白。這種選擇性裂解可用還原劑如DTE或羥胺進(jìn)行。
通過(guò)激活的二硫化物如吡啶基-SS衍生物的偶聯(lián)會(huì)導(dǎo)致單烷基化。本發(fā)明所述的工藝能夠使許多疏水物質(zhì)如類固醇、含有巰基的碳鏈(如脂肪酸)偶聯(lián)到刺猬狀蛋白質(zhì)上。
所以，本發(fā)明的另一個(gè)主要目的是生產(chǎn)巰基被修飾的刺猬狀蛋白或其N-末端片段(優(yōu)選主要含有N-末端結(jié)構(gòu)域的片段)的工藝，其特征在于保護(hù)刺猬狀蛋白的N-末端半胱氨酸的巰基，分離以這種方式修飾的蛋白質(zhì)，在裂解了保護(hù)基團(tuán)后，優(yōu)選通過(guò)一種疏水化合物如脂肪酸或類固醇而與SH基團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)，從而在N-末端半胱氨酸處將該刺猬狀蛋白衍生化。這種偶聯(lián)優(yōu)選是可逆的，能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中和體內(nèi)存在的生理還原條件下逆轉(zhuǎn)，從而形成未疏水化的刺猬狀蛋白。
本發(fā)明的又一個(gè)主要目的是將疏水化合物通過(guò)N-末端半胱氨酸的SH基而偶聯(lián)到刺猬狀蛋白或其片段上的工藝，其特征在于保護(hù)刺猬狀蛋白的N-末端半胱氨酸的巰基，將所述受到保護(hù)的SH基還原，并且使該刺猬狀蛋白與疏水化合物的一種激活的衍生物反應(yīng)從而在該刺猬狀蛋白和疏水化合物之間形成一個(gè)硫醇鍵。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過(guò)一個(gè)酰胺鍵將疏水化合物的另一分子偶聯(lián)到刺猬狀蛋白上。
例如，疏水化合物的咪唑化物和輔酶A衍生物適合作為激活的疏水化合物。這種激活的化合物優(yōu)選用于方法Ⅰ中(參見上述)。
疏水化合物的吡啶基二硫化物衍生物也適合于作為激活的疏水化合物。這種激活的化合物優(yōu)選用于方法Ⅱ中(參見上述)。
優(yōu)選使用天然或非天然的飽和和單一不飽和或多不飽和脂肪酸，特別是鏈長(zhǎng)為4-18、優(yōu)選8-18個(gè)碳原子的飽和脂肪酸或者類固醇通過(guò)咪唑化物工藝來(lái)?；题瑺畹鞍祝纱说玫狡鋬?nèi)烴基具有8-24個(gè)碳原子的偶聯(lián)物。
為了通過(guò)吡啶基二硫化物工藝連接疏水化合物和刺猬狀蛋白，優(yōu)選使用天然或非天然的飽和和單一不飽和或多不飽和巰基烷烴，特別是含巰基、鏈長(zhǎng)為8-24個(gè)碳原子的飽和碳鏈，巰基類固醇，特別是巰基膽固醇。
在本發(fā)明的工藝中，優(yōu)選刺猬狀蛋白的使用濃度為0.01-10mg/ml，特別優(yōu)選為3mg/ml。鹽濃度優(yōu)選為0-2mol/1。優(yōu)選使用氯化鈉。偶聯(lián)劑與蛋白質(zhì)的摩爾比在1∶2到20∶1比較好。優(yōu)選的緩沖液是Hepes緩沖液、磷酸鹽緩沖液和MES緩沖液。該偶聯(lián)反應(yīng)優(yōu)選在pH4.5-8.5，更優(yōu)選在pH6.5-7.5之間進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間取決于所用的條件，對(duì)制備二棕櫚?；膕hh來(lái)說(shuō)最好是5分鐘到5天。該反應(yīng)優(yōu)選在0-40℃之間的溫度范圍進(jìn)行。低溫下(優(yōu)選在10℃以下，如4℃)副產(chǎn)物的比例較低。
去污劑的加入對(duì)本發(fā)明的工藝特別有益。這種試劑可以是諸如離子型或非離子型去污劑。優(yōu)選兩性離子去污劑。優(yōu)選的濃度大約是0.5-3％(v/v)。
烴鏈或類固醇可有利地通過(guò)酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵或硫酯鍵與該蛋白質(zhì)的反應(yīng)性基團(tuán)如游離的羥基、巰基、羧基或氨基偶聯(lián)。這種工藝對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的，在例如Wong,S.S.,Chemistry of Protein Conjugation and CrossLinking,CRC Press,Boca Raton,FL.,美國(guó)，1993中進(jìn)行了描述。例如，脂肪酸能夠通過(guò)琥珀酰亞胺酯或N-順丁烯二酰亞胺偶聯(lián)劑(如棕櫚酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)或通過(guò)脂肪酸酐、脂肪酸咪唑酯或酸性氯化物與輔酶A(例如棕櫚酰基輔酶A)偶聯(lián)成硫酯。
棕櫚酰基輔酶A、硬脂?；o酶A或肉豆蔻?；o酶A的偶聯(lián)工藝?yán)缭赗oss等，《神經(jīng)科學(xué)研究雜志》21(1988)35-44,Bizzozero等，《生物化學(xué)雜志》262(1987)2138-2145中進(jìn)行了描述，對(duì)于微管蛋白的偶聯(lián)工藝在0zols,J.等，《細(xì)胞的分子生物學(xué)》8(1997)637-645中進(jìn)行了描述。對(duì)于卵清蛋白(Segawa,A.,等，Int.Archs Allergy appl.Immun.66(1981)189-199)或肽類(Yadav,S.P.等，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊》205(1994)1688-1695)的脂肪酸酐的衍生作用也進(jìn)行了描述。還有許多用脂肪酸琥珀酰亞胺酯乙?；睦樱鐚?duì)酪蛋白的乙?；?Haque,Z.等，《農(nóng)業(yè)食品化學(xué)雜志》31(1983)1225-1230)，(Haque,Z.等，《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》46(1982)597-599)。也可以通過(guò)融合對(duì)象(例如棕櫚?；?Cys-CHO)上的醛基偶聯(lián)到N-末端半胱氨酸上(Liu等，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》91(1994)6584-6588)。實(shí)現(xiàn)絲氨酸的N-末端偶聯(lián)的方法是將它轉(zhuǎn)化成醛基、與酰肼(例如，棕櫚?；?Cys酰肼)反應(yīng)并穩(wěn)定所形成的腙(如通過(guò)用NaBH3CN還原)(Gaertner等，Bioconjugate Chem.3(1992)262-268)。
根據(jù)偶聯(lián)化學(xué)，以例如醚、硫醚、酯、硫酯、二硫化物或酰胺的形式將疏水烴鏈結(jié)合到活性氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、精氨酸或賴氨酸的側(cè)基上。Wong,S.S.在《蛋白質(zhì)共軛和交聯(lián)化學(xué)》，CRC Press Inc.,Boca Raton,FL，美國(guó)(1993)和Lundblad(1995)在《蛋白質(zhì)修飾技術(shù)》中描述了對(duì)特定氨基酸進(jìn)行特殊偶聯(lián)的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將疏水化合物溶于有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑和水的混合物(優(yōu)選含有10％(v/v)以上的有機(jī)溶劑)中。這類有機(jī)溶劑優(yōu)選是二噁烷、四氫呋喃或異丙醇。為了偶聯(lián)疏水化合物和刺猬狀蛋白，將該疏水化合物的這種溶液與含有去污劑的刺猬狀蛋白(優(yōu)選以它的受保護(hù)形式)溶液混合，使得該混合物包括10％或更少的有機(jī)溶劑?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含有高于10％的有機(jī)溶劑的刺猬狀蛋白溶液會(huì)使刺猬狀蛋白沉淀和/或變性。
在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，在有增溶性去污劑如具體是脫氧膽酸鈉、膽酸鈉、牛磺脫氧膽酸鈉、辛基葡糖苷或TritonX-100的存在下，通過(guò)氧化形成二硫橋而將巰基膽固醇與巰基，特別是N-末端半胱氨酸的巰基偶聯(lián)。與用膽固醇在C-末端天然修飾的hhN-末端片段相比，在此工藝中生成了在N-末端含有巰基膽固醇的hh形式。這種形式具有與天然形式相似的增強(qiáng)活性，但是能夠更簡(jiǎn)單更大量地生成。由于二硫橋的細(xì)胞質(zhì)不穩(wěn)定性，所以，這種hh形式?jīng)]有或只有輕微的免疫原性潛力。
為了增加經(jīng)親脂性修飾的hh蛋白的溶解度，另外優(yōu)選在有可溶性陰離子多糖如蘇拉明和肝素存在下進(jìn)行衍生作用和/或隨后的純化或藥物配制。
本發(fā)明所述的活性應(yīng)當(dāng)理解為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中該多肽能夠誘導(dǎo)的堿性磷酸酶的活性(在堿性磷酸酶試驗(yàn)中的活性)。在該方法中，用含有胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞系。接著，加入過(guò)濾除菌的樣品，大約5天后裂解細(xì)胞，并通過(guò)生色底物(pNP，對(duì)硝基苯酚)的裂解來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解物中的堿性磷酸酶(J.Asahina,《實(shí)驗(yàn)細(xì)胞學(xué)研究》222(1996)38-47和T.Nakamura(1997))。
本發(fā)明的刺猬狀蛋白應(yīng)當(dāng)理解為是一種分泌的信號(hào)蛋白(19kD的N-末端的信號(hào)結(jié)構(gòu)域)，這種信號(hào)蛋白對(duì)胚胎發(fā)生中許多結(jié)構(gòu)的形成起作用。特別優(yōu)選使用sonic、indian或desert hh(Fietz M.等，《發(fā)育》(增刊)(1994)43-51)。優(yōu)選使用具有EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中No.L38518所述序列的hh蛋白。刺猬狀蛋白家族的蛋白質(zhì)在它們的氨基酸序列中具有明顯的同源性，這就是為什么也優(yōu)選表達(dá)編碼與上述sonic刺猬狀蛋白(shh)序列有80％或更大同源性的刺猬狀蛋白的那些核酸的原因。蛋白質(zhì)同源性能夠在計(jì)算機(jī)程序Gap或BestFit幫助下測(cè)定(Wisconsin大學(xué)；Needleman和Wunsch，《分子生物學(xué)雜志》48(1970)443-453；Smith和Waterman，《高等應(yīng)用數(shù)學(xué)》2(1981)482-489)。
人sonic hh前體蛋白是由EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中No.L38518所述序列的第1-462位氨基酸組成。氨基酸1-23表示信號(hào)肽，氨基酸24-197表示成熟的信號(hào)結(jié)構(gòu)域，氨基酸32-197表示縮短了八個(gè)氨基酸的信號(hào)結(jié)構(gòu)域，氨基酸198-462表示在自身蛋白水解裂解后自動(dòng)加工的C-末端結(jié)構(gòu)域。所以，按照本發(fā)明，hh蛋白中優(yōu)選發(fā)生偶聯(lián)的N-末端或C-末端應(yīng)當(dāng)理解為是N-末端信號(hào)結(jié)構(gòu)域24-197的第一個(gè)氨基酸(N-末端)或最后一個(gè)氨基酸(C-末端)。優(yōu)選偶聯(lián)于最初10個(gè)或最后10個(gè)氨基酸中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸處。特別優(yōu)選偶聯(lián)于N-末端結(jié)構(gòu)域N-末端的第一個(gè)或第二個(gè)氨基酸(AA24或25)或者N-末端結(jié)構(gòu)域C-末端的最后一個(gè)或倒數(shù)第二個(gè)氨基酸(AA196或197)。在本發(fā)明刺猬狀蛋白偶聯(lián)物中，優(yōu)選將親脂基團(tuán)或烴鏈偶聯(lián)于hh蛋白的N-末端結(jié)構(gòu)域，偶聯(lián)產(chǎn)物具體是在24位的N-末端半胱氨酸與月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸或油酸或者類固醇形成的硫酯或酰胺，或者是通過(guò)二硫橋結(jié)合了巰基膽固醇或巰基鏈烷烴/鏈烯烴的hh蛋白。優(yōu)選在原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌)中，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的方法重組生產(chǎn)未修飾的hh蛋白。該刺猬狀蛋白優(yōu)選以可溶解的方式作為融合蛋白而重組產(chǎn)生，從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中分離出來(lái)，或者在溶解宿主細(xì)胞后，用一種序列特異性蛋白酶如腸激酶裂解(優(yōu)選N-末端)融合部分(如多組氨酸、鏈霉抗生物素蛋白等)，并且通過(guò)與巰基保護(hù)試劑反應(yīng)或者通過(guò)在該半胱氨酸處由二硫橋?qū)⒃摯题瑺畹鞍锥垠w化來(lái)保護(hù)N-末端半胱氨酸的游離巰基。
本發(fā)明藥物組合物含有藥理上有效劑量的hh偶聯(lián)物，并且優(yōu)選能夠局部給藥。優(yōu)選將本發(fā)明的偶聯(lián)物與刺猬狀蛋白家族的其它蛋白或者骨生長(zhǎng)因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)(Wozney等，《骨的細(xì)胞分子生物學(xué)》，骨形態(tài)發(fā)生蛋白及其基因表達(dá)(1993)學(xué)術(shù)出版公司，131-167)或甲狀旁腺素(Karablis等，《基因和發(fā)育》8(1994)277-289)或者胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-Ⅰ或Ⅱ)或者轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)一起結(jié)合使用。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選含有蘇拉明的本發(fā)明刺猬狀蛋白偶聯(lián)物的藥物組合物，這能有利于使用。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該藥物組合物含有濃度為0.01-10mg/ml、尤其是0.01-1mg/ml的刺猬狀蛋白偶聯(lián)物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該藥物組合物還含有一種藥學(xué)上可接受的緩沖液，該緩沖液在pH4-10，特別優(yōu)選pH6-9，最好在pH7左右是生物相容性的。為了防止折疊結(jié)構(gòu)的變性和絡(luò)合在刺猬狀蛋白上的Zn的脫落，該藥物組合物的pH值最好是高于pH4。該緩沖液的濃度優(yōu)選是1-500mmol/1，更優(yōu)選10-100mmol/l。所以在一個(gè)適當(dāng)?shù)膶?shí)施方案中，將20mmol/l磷酸鉀緩沖液(pH7.2)用作緩沖液。
而且，生產(chǎn)該藥物組合物時(shí)，最好加入輔助物質(zhì)，如糖(甘露糖醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖，優(yōu)選20-100mg/ml)或者氨基酸如甘氨酸或精氨酸，以及抗氧化劑如EDTA、檸檬酸鹽、聚乙二醇(1-10重量％)、抗壞血酸、生育酚、去污劑(優(yōu)選非離子型去污劑)(優(yōu)選0.005-1重量％)如聚山梨酸酯類或聚氧乙烯型去污劑(如Tween20、Tween80)或聚氧乙烯類，或者離子型去污劑如膽酸鈉、脫氧膽酸鈉或?；敲撗跄懰徕c，抗炎劑，局部麻醉劑，抗生素和/或穩(wěn)定劑如脂類、脂肪酸或甘油。
本發(fā)明的偶聯(lián)物在骨誘導(dǎo)藥物組合物中可有利地用于誘導(dǎo)或刺激軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，或者也能誘導(dǎo)肌肉和神經(jīng)細(xì)胞。例如從US5,364,839、WO97/35607和WO95/16035中可獲知一些骨誘導(dǎo)藥物組合物。
可以按照Glansbeek,H.L.等，《實(shí)驗(yàn)室研究》78(1998)133-142；US專利No.5,270,300；Toriumi,D.M.，等，Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.117(1991)1101-1112；Cook,S.D.,等，《骨和關(guān)節(jié)外科雜志》(J.Bone and Joint Surgery)76-A(1994)827-837；以及Riley,E.H.等，Clin.Orthopaed.and RelatedResearch324(1996)39-46所述體內(nèi)評(píng)估本發(fā)明刺猬狀蛋白偶聯(lián)物的活性。
當(dāng)將本發(fā)明偶聯(lián)物局部給藥時(shí)，優(yōu)選將它與作為載體的適當(dāng)基質(zhì)和/或與螯合劑一起使用。這類基質(zhì)適合于體內(nèi)特別是在骨或軟骨組織的周圍以活性形式緩慢釋放該蛋白質(zhì)。該多價(jià)螯合劑是一種易于通過(guò)例如注射給藥和/或可防止或者至少是延遲本發(fā)明蛋白質(zhì)從給藥部位遷移的物質(zhì)。
本發(fā)明藥物組合物優(yōu)選含有具有細(xì)胞粘附功能的聚合物(結(jié)構(gòu)物質(zhì))。這類結(jié)構(gòu)物質(zhì)例如是膠原。
生物相容性的、可降解的物質(zhì)例如基于膠原的物質(zhì)或者基于聚乳酸、聚乙醇酸或者乳酸和乙醇酸共聚物的其它聚合物特別適合于用作基質(zhì)物。這類聚合物基質(zhì)在例如W093/00050中進(jìn)行了描述。
多價(jià)螯合劑例如是纖維素和纖維素樣物質(zhì)，例如烷基纖維素、羧甲基纖維素、透明質(zhì)酸、藻酸鈉、聚乙二醇和聚乙烯醇，其中特別優(yōu)選透明質(zhì)酸，特別是當(dāng)在沒(méi)有載體基質(zhì)的藥物組合物中時(shí)。
下面的實(shí)施例、說(shuō)明書、序列表和附圖進(jìn)一步解釋本發(fā)明和專利權(quán)利要求所描述的保護(hù)范圍。所描述的方法應(yīng)當(dāng)理解為僅是舉例，即使在改進(jìn)后也能描述本發(fā)明的主題。
附圖描述

圖1表示用棕櫚?；o酶A衍生后的重組人shh的活性。
圖2表示用巰基膽固醇衍生后的重組人shh的活性。
實(shí)施例1a)克隆連有His-6錨以及腸激酶裂解位點(diǎn)的人sonic hh；在大腸桿菌中表達(dá)使用下列步驟從任何理想質(zhì)?；蚝衧onic hh的相應(yīng)cDNA中擴(kuò)增人sonic hh的成熟N-末端部分(aa24-Cys到197-Gly)借助于兩個(gè)引物(344和345)，擴(kuò)增從內(nèi)部RsrⅡ裂解位點(diǎn)直到氨基酸198編碼序列的一段shh基因，同時(shí)可以在C末端連上幾個(gè)終止密碼子和一個(gè)PstⅠ裂解位點(diǎn)。SEQ ID NO:1引物344:5′-ca gaattc ttg cggaccg ggc agg gg 26-merEcoRⅠ RsrⅡSEQ ID NO:2引物345:5′-ga ctgcag tta a tca tta gcc tcc cga ttt ggc cgc 36-merPstⅠ終止 終止 終止密碼子密碼子密碼子可用RsrⅡ和PstⅠ再裂解以這種方式擴(kuò)增的DNA片段，這在下述步驟中是必需的(片段344/345)。
通過(guò)將另外兩個(gè)引物(346/347)退火來(lái)構(gòu)建接頭，借助于該接頭，在N-末端摻入6個(gè)組氨酸殘基和一個(gè)腸激酶裂解位點(diǎn)(EK):SEQ ID NO:3引物346:5′-aattc atg cat cat cac cac cac cac gat gac gac gac aaa tg cg| His6 EkEcoRⅠ突出SEQ ID NO:4引物347:5′-gtc cgc att cgt cgt cgt cat cgt ggt ggt ggt gat gat gca tg|RsrⅡ突出346和347退火后的銜接頭aattc atg cat cat cac cac cac cac gat gac gac gac aaa tgc gg tac gta gta gtg gtg gtg gtg cta ctg ctg ctg ttt acg c ctg為了進(jìn)行表達(dá)，將PCR片段344/345與銜接頭346/347一起克隆到已用EcoRⅠ/PstⅠ裂解的載體中。這一步驟可以直接進(jìn)行或者在間接將片段344/345克隆至其它載體后進(jìn)行。為了在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，已用EcoRⅠ/PstⅠ裂解的載體必需在EcoRⅠ末端含有一個(gè)適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，優(yōu)選T5、tac、lac等。為了進(jìn)行該表達(dá)，將shh表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到一個(gè)適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌菌株中。該表達(dá)系統(tǒng)還含有編碼原核細(xì)胞中的精氨酸t(yī)RNAAGA/AGG的核酸(Brinkmann等，《基因》85(1989)109-114)。
b)發(fā)酵101 hedgehog的大腸桿菌表達(dá)克隆的發(fā)酵從典型培養(yǎng)物(存放在-20℃下的平板涂片或安瓿中)制備前培養(yǎng)物，并將其在30-37℃振搖培養(yǎng)。在每種情況下，接下來(lái)的大體積培養(yǎng)中，接種體積為1-10體積％。將氨芐青霉素(50-100mg/1)加入前培養(yǎng)物和主要培養(yǎng)物中以便對(duì)質(zhì)粒的丟失進(jìn)行負(fù)篩選。
可以使用的營(yíng)養(yǎng)物是酶解的蛋白質(zhì)和/或酵母提取物作N-和C-源，以及甘油和/或葡萄糖作額外的C-源。將該培養(yǎng)基緩沖于pH7，并且加入生理可耐受濃度的金屬鹽來(lái)穩(wěn)定發(fā)酵過(guò)程。發(fā)酵溫度為25-37℃。通過(guò)測(cè)定528nm處的光密度來(lái)確定生長(zhǎng)情況。用IPTG誘導(dǎo)該表達(dá)。在經(jīng)過(guò)約30小時(shí)的發(fā)酵期后，在OD穩(wěn)定時(shí)通過(guò)離心收集生物量。實(shí)施例2a)重組人shh二聚物的制備用高壓壓濾器將實(shí)施例1b中制備的55g生物量溶解、離心分離，并且將上清液上樣到50ml螯合瓊脂糖柱(Pharmacia Biotech)中，該柱已事先裝載了Zn。用在50mM Hepes；250mM NaCl；pH7.4中0到200mM的咪唑梯度洗脫shh融合蛋白。通過(guò)SDS-PAGE鑒別出含有shh的洗脫級(jí)分，將它們合并，并用一體積的50mM Hepes；pH7.4稀釋。離心分離在稀釋過(guò)程中產(chǎn)生的沉淀，在4℃對(duì)50mMHepes(pH7.4)透析該上清液。向500mg以這種方式得到的shh融合蛋白中加入腸激酶(1∶500；ww；Boehringer Mannheim GmbH)和β-ME(終濃度10mM)，并且在35℃的水浴中溫育16小時(shí)。接著加入固體DTT到10mM的濃度。將樣品上樣到166ml的SP-瓊脂糖(Pharmacia Biotech)柱上，用在20mM HEPES,pH7.4中的0-800mM NaCl梯度洗脫。經(jīng)SDS-PAGE分析峰級(jí)分后，合并主要級(jí)分，等分并且在-80℃下存放直到下一次使用。在非還原性條件下這些主要級(jí)分含有的shh是二聚物，它是通過(guò)可還原的二硫橋而交聯(lián)的，具有大約38kDa的表觀分子量。
b)通過(guò)還原條件下的保溫來(lái)修飾用10mM DTE還原二聚物形式的shh(濃度為1mg/ml)(30分鐘，25℃)，并且對(duì)含有0.5mM DTT的PBS透析過(guò)夜。通過(guò)RP-HPLC脫鹽后，該透析液的質(zhì)譜顯示大多數(shù)單體化shh是32±4道爾頓(N-末端半胱氨酸的雙氧化)和47±4道爾頓的加合物(即除了導(dǎo)致質(zhì)譜峰拓寬的沒(méi)有特殊說(shuō)明的其他修飾之外)。以這種方式修飾的shh形式不能通過(guò)再氧化重新二聚化。這表明N-末端半胱氨酸的SH基團(tuán)已經(jīng)修飾為穩(wěn)定的形式。所以該SH基團(tuán)不再能夠進(jìn)行進(jìn)一步的反應(yīng)，例如形成硫酯，從而大大降低了用疏水化合物進(jìn)行衍生作用的產(chǎn)率。所以，為了體外酰化N-末端半胱氨酸，已還原的shh存在于溶液中的時(shí)間應(yīng)當(dāng)盡可能地短，在適當(dāng)?shù)呐悸?lián)化學(xué)中，該反應(yīng)應(yīng)當(dāng)在Tris(2-羧基乙基)膦鹽酸化物(TCEP·HCl)的存在下進(jìn)行，因?yàn)檫@將只攻擊二硫化合物而不攻擊(激活的)硫酯。
c)與溶劑pH值有關(guān)的shh再氧化形成二聚物的動(dòng)力學(xué)通過(guò)加入2mM TCEP(Tris(2-羧基乙基)膦鹽酸化物)在25℃還原分子間二硫橋15分鐘而使0.5ml shh二聚物(濃度為2.7mg/ml)單體化。接著用在PBS pH7.0或PBS pH5.0中的PD-10-柱(Pharmacia)將樣品重新緩沖，在通過(guò)RP-HPLC除去還原劑后，分析自發(fā)二聚化(于25℃)相對(duì)于保溫時(shí)間的情況。
結(jié)果總結(jié)在表2中表2
可以看出shh單體可自發(fā)發(fā)生二聚化。這種二聚體化作用在pH7.0時(shí)非常迅速，但在pH5.0是以更緩慢的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行的。實(shí)施例3a)制備偶聯(lián)劑以用于選擇性?；腚装彼嶂械腟H基團(tuán)(Ⅰ)咪唑化物工藝采用與文獻(xiàn)(Leksyszyn,J.等，《合成》(1978)478-479；StaabH.A.,Angew.Chem.74(1962)407-423；Fahrenholtz,K.E.等，《醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志》17(1974)337-342)相似的方法，通過(guò)一般工藝A、B或C來(lái)制備起始物質(zhì)(咪唑化物)。
Ⅰa)一般工藝A將10mmol相應(yīng)的羧酸和10mmol的1,1’-羰基二咪唑溶于無(wú)水四氫呋喃中，在室溫下攪拌30分鐘到24小時(shí)。將混合物真空蒸干，使用前不作進(jìn)一步純化。
Ⅰb)一般工藝B在沒(méi)有濕氣的無(wú)水甲苯中，將10mmol相應(yīng)的酸性氯化物和20mmol咪唑回流加熱1-24小時(shí)。過(guò)濾所形成的咪唑氫氯化物，將濾液真空蒸干。用乙酸乙酯/庚烷通過(guò)硅膠層析法或通過(guò)重結(jié)晶法純化該殘余物。
Ⅰc)一般工藝C在二氯甲烷中將10mmol相應(yīng)羧酸與10mmol二環(huán)己基碳二亞胺和10mmol咪唑于室溫下一起攪拌1-48小時(shí)。冷卻到0℃后，濾除所形成的脲，用水萃取該濾液，在硫酸鈉上干燥，真空蒸發(fā)并重結(jié)晶。
得到脂肪酸的下列咪唑化物衍生物1-咪唑-1-基-己-1-酮(無(wú)色油狀；產(chǎn)率66％)1-咪唑-1-基-辛-1-酮(無(wú)色晶體；產(chǎn)率59％)1-咪唑-1-基-癸-1-酮(無(wú)色晶體；產(chǎn)率79％)1-咪唑-1-基-十二烷-1-酮(無(wú)色晶體；產(chǎn)率86％)1-咪唑-1-基-十四烷-1-酮(無(wú)色晶體；產(chǎn)率52％)1-咪唑-1-基-十六烷-1-酮(無(wú)色晶體；產(chǎn)率70％)l7-(4-咪唑-1-基-1-甲基-4-氧代-丁基)-10,13-二甲基-十二氫化-環(huán)戊二烯并[a]菲-3,7,12-三酮) (無(wú)色晶體；產(chǎn)率56％)4-(10,13-二甲基-十六氫化-環(huán)戊二烯并[a]菲-17-基)-1-咪唑-1-基-戊-1-酮(無(wú)色晶體；產(chǎn)率71％)(Ⅱ)吡啶基二硫化物工藝按照文獻(xiàn)(Lee,S.等，Bull.Chem.Soc.Jpn.64(1991)2019-2021)，采用一般工藝A制備起始物質(zhì)(吡啶基二硫化物)。將10mmol的相應(yīng)硫醇和10mmol的2,2’-二硫代聯(lián)吡啶溶于30ml的無(wú)水二氯甲烷中，并且在室溫下攪拌6-24小時(shí)。真空除去溶劑，向該殘余物中加入乙醚并且過(guò)濾。將該濾液真空蒸干，用乙酸乙酯/庚烷通過(guò)硅膠層析法純化。
得到下列物質(zhì)2-癸基二硫基-吡啶 (無(wú)色油狀物，產(chǎn)率76％)(2-decyldisulfanyl pyridine)2-十六烷基二硫基-吡啶 (無(wú)色晶體；產(chǎn)率64％)2-{17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫化-1H-環(huán)戊二烯并[a]-菲-3-基二硫基}-吡啶 (無(wú)色晶體；產(chǎn)率56％)
b)用棕櫚?；溥蚧镏苽渥貦磅；闹亟M人shh用實(shí)施例2的二聚化的未修飾重組人shh作離析物。該蛋白質(zhì)以3mg/ml的濃度存在于PBS緩沖液(10mM磷酸鈉緩沖液，150mMNaCl,pH7.4)中。將去污劑(優(yōu)選200μl的10％Zwittergent 3-14溶液)加入2ml的該樣品中。接著將三(2-羧乙基)膦(TCEP)加入至濃度為2mM。在室溫保溫15分鐘后，加入于二噁烷中的60mM棕櫚?；溥蚧?1-咪唑-1-基-十六烷-1-酮)溶液50μl。優(yōu)選在4℃振搖下將該溶液保溫1-3天。
在這些條件下形成的主要產(chǎn)物是二棕櫚酰化shh(70-75％)，按照實(shí)施例6中所述用RP-HPLC和質(zhì)譜法對(duì)其進(jìn)行了鑒定。在實(shí)施例7中所述的活性試驗(yàn)中，以這種方法修飾的shh比沒(méi)有被修飾的shh具有高得多的生物活性。在70ng/ml達(dá)到最大活性的一半。
所用去污劑的類型對(duì)二棕櫚?；痵hh的產(chǎn)率和其生物活性水平具有較大的影響(表1)。表1所用去污劑對(duì)反應(yīng)混合物中二棕櫚?；痵hh的比率的影響(在室溫下進(jìn)行)。定量方法如實(shí)施例6中所述。
c)用2-十六烷二硫基吡啶制備烷基化的重組人shh使用實(shí)施例2a的二聚化的未修飾重組人shh作離析物。該蛋白質(zhì)以3mg/ml的濃度存在于PBS緩沖液(10mM磷酸鈉緩沖液，150mMNaCl,pH7.4)中。加入2mM TCEP后，保溫15分鐘以形成單體。接著，用平衡于5mM磷酸鉀緩沖液，150mM NaCl,pH5.0的PD-10柱除去TCEP。使用以這種方式制備的shh單體的200μl等分液，通過(guò)兩種不同方法與2-十六烷基二硫基-吡啶反應(yīng)。A)向該shh單體中加入20μl的10％Zwittergent 3-14溶液；20μl的0.5M HEPES pH7.0和1倍至20倍摩爾過(guò)量的偶聯(lián)劑(溶于二噁烷溶液，60mM)。B)向該shh單體中加入2μl的10％脫氧膽酸鈉、20μl的1M磷酸鉀緩沖液，pH7.6和2倍到20倍摩爾過(guò)量的偶聯(lián)劑(溶于甲醇中，60mM)。
在上述兩種方法中15分鐘后完成反應(yīng)。
10倍摩爾過(guò)量的偶聯(lián)劑在方法A)中得到的單烷基化shh占反應(yīng)混合物中的43％，在方法B)中得到的單烷基化shh占反應(yīng)混合物的47％。在方法A)中，生物活性比未修飾的shh有巨大的增長(zhǎng)，并且半最大活性為200ng/ml shh。單倍摩爾過(guò)量的2-十六烷基二硫基吡啶只得到稍微降低的產(chǎn)率。在方法B中，活性也比未修飾的shh要提高一些，但程度較小相同量的蛋白質(zhì)只能達(dá)到30％的生物活性。所以，優(yōu)選使用方法A。
d)烷基化shh衍生物的純化用50mM HEPES,0.1％Tween80,pH7.4將偶聯(lián)產(chǎn)物按1∶4稀釋，接著用SP-Sepharose HP(Pharmacia)純化。
平衡緩沖液50mM HEPES,0.1％Tween80,pH7.4，洗脫緩沖液含有0.8M NaCl的50mM HEPES,0.2％Tween80,pH7.4梯度洗脫(2×6柱體積)和不連續(xù)洗脫。
在二棕櫚酰化shh中，有可能分離出多余的棕櫚?；溥蚧铮⒉糠址蛛x出未修飾的shh。在用2-十六烷基二硫基吡啶修飾時(shí)，單棕櫚?；痵hh顯著富集，為76％。修飾的shh能夠用例如肝素Sepharose進(jìn)一步純化。實(shí)施例4a)用棕櫚?；?CoA制備棕櫚?；闹亟M人shh將2ml的shh濃度為0.35mg/ml的已純化二聚體shh樣品與DTE混合至最終濃度為20mM，在37℃保溫2小時(shí)，接著在下列溶液中透析a)50mM Tris/HCl,1mM DTE,0.1mM ZnCl2,0.5％TritonX-100,pH8.5,b)100mM MOPS,1mM DTE,0.1％TritonX-100,0.1mg/ml蘇拉明，pH7.4,c)100mM MOPS,1mM DTE,0.1％TritonX-100,pH7.4。
接著將不同體積的棕櫚酰基-CoA(于100mM MOPS,1mM DTT,0.2％TritonX-100,pH7.6中，10mg/ml)加入到0.5ml等分的樣品中，使得混合物中棕櫚?；?CoA的濃度為1)0μM2)50μM3)500μM然后在37℃將它們保溫1小時(shí)。在過(guò)濾并1/200稀釋以用于細(xì)胞試驗(yàn)之前，將樣品與BSA(1mg/ml最終濃度)和蘇拉明(0.1mg/ml最終濃度)混合。用上述樣品，如實(shí)施例7所述進(jìn)行shh活性測(cè)試，結(jié)果表明在含有500μM棕櫚酰基-CoA的緩沖液b)和c)中保溫的shh樣品比沒(méi)有棕櫚?；?CoA的混合物具有顯著增長(zhǎng)的生物學(xué)活性(參見圖1)。以這種方式棕櫚?；膕hh能夠用已經(jīng)就膜蛋白描述過(guò)的方法純化，這些方法例如在“膜蛋白的實(shí)踐指導(dǎo)”(1994；Jagow&Schlagger編輯，Academic Press)或者在歐洲專利申請(qǐng)No.98102095.1中進(jìn)行了描述。
b)?；瘜?duì)shh濃度和shh與棕櫚?；?CoA(Pal-CoA)之間摩爾比的依賴性用PBS稀釋二聚化shh(在PBS中)到濃度為150μM或37.5μM，加入Tween80(最終濃度為0.05％)、DTE(最終濃度為3mM)和TCEP(最終濃度為1mM)。然后以所述的量加入Pal-CoA(在水中，20mM)，在25℃將混合物保溫過(guò)夜。用RP-HPLC分析諸樣品，或者在用PBS,1mg/ml BSA,0.05％Tween80 pH7.3稀釋并且無(wú)菌過(guò)濾后，以不同的稀釋度用于細(xì)胞測(cè)試中。結(jié)果總結(jié)在表3中表3
>*EC50是用于細(xì)胞試驗(yàn)中達(dá)到堿性磷酸酶最大誘導(dǎo)結(jié)果一半所需的shh濃度。由于細(xì)胞傳代次數(shù)的差異和由此導(dǎo)致的細(xì)胞生理學(xué)改變，在不同時(shí)間進(jìn)行的測(cè)定之間這一數(shù)值會(huì)稍微變化。
偶聯(lián)劑中度過(guò)量(＜50倍)主要導(dǎo)致形成在N-末端半胱氨酸酰化兩次的shh衍生物。隨著提高Pal-CoA與shh的比率，棕櫚酰化兩次以上的shh的形成量增加。用兩個(gè)以上脂肪酸殘基進(jìn)行棕櫚?；彩够钚栽黾?。當(dāng)shh濃度為37.5μM時(shí)，就活性而言，大約10倍過(guò)量的Pal-CoA是理想的。在shh的濃度為150μM時(shí)，Pal-CoA過(guò)量3倍就已經(jīng)達(dá)到了兩次棕櫚酰化shh的高產(chǎn)率和高活性。
c)?；瘜?duì)去污劑的類型和濃度的依賴性用pH7.4的PBS將二聚化shh調(diào)節(jié)到0.75mg/ml的濃度，并按所述量與相應(yīng)去污劑混合，所有情況下都混合入500μM Pal-CoA和3mM DTE或3mM TCEP(最終濃度)。在25℃將偶聯(lián)混合物保溫過(guò)夜，接著用RP-HPLC分析，或者在用PBS,1mg/ml BSA,0.05％Tween80 pH7.3稀釋并過(guò)濾除菌后，以不同稀釋度用于細(xì)胞測(cè)試中。結(jié)果總結(jié)在表4中表4
pal.=棕櫚?；?用3mM的TCEP替代3mM的DTE還原。
結(jié)果表明使用0.05％Tween80或0.5％辛基糖苷能夠得到高棕櫚?；剩挥?.05％Zwittergent進(jìn)行棕櫚?；矊?dǎo)致活性大大增加。同時(shí)用TCEP還原得到與用DTE還原的相似結(jié)果。
d)還原的單體shh的酰化與偶聯(lián)混合物pH值的關(guān)系用10mM的DTE還原二聚化shh(濃度為0.7mg/ml)，并對(duì)PBS,0.05％Tween80,0.5mM DTE透析過(guò)夜。用PBS,0.05％Tween80,0.5mM DTE將透析液調(diào)整到最終濃度為0.25mg/ml和各種pH值，加入125μM Pal-CoA。將混合物在37℃保溫2小時(shí)，接著以1∶500稀釋度在細(xì)胞試驗(yàn)中進(jìn)行分析。在表5中總結(jié)了該樣品的活性，該活性是作為AP活性相對(duì)于未刺激的C3H10T1/2細(xì)胞(=100％)的基本活性的刺激表5
這樣最大激活出現(xiàn)在中性到微堿性的pH。
e)含有不同碳鏈長(zhǎng)度之?；孽；鵆oA衍生物的偶聯(lián)用PBS,0.05％Tween80 pH7.4將二聚化shh調(diào)節(jié)成濃度為0.75mg/ml，加入3mM DTE和0.5mM的相應(yīng)?；?CoA衍生物并且將它在25℃保溫過(guò)夜。將樣品用RP-HPLC分析，或者在用PBS,1mg/mlBSA,0.05％Tween80 pH7.3稀釋并無(wú)菌過(guò)濾后將該樣品的不同稀釋度用于細(xì)胞試驗(yàn)中。在RP-HPLC上保留值的偏移以及二?；痵hh的產(chǎn)率和細(xì)胞試驗(yàn)中的活性總結(jié)在表6中。表6
這表明通過(guò)利用Pal-CoA衍生物的方法能夠有效地轉(zhuǎn)移具有不同鏈長(zhǎng)的?；?。所用去污劑的濃度以及去污劑的類型需要根據(jù)被轉(zhuǎn)移的?；逆滈L(zhǎng)進(jìn)行最優(yōu)化。?；滈L(zhǎng)的縮短或不飽和碳鍵數(shù)目的增加均導(dǎo)致酰化shh衍生物的比活性下降。實(shí)施例5a)用巰基膽固醇衍生重組人shh為了通過(guò)二硫橋?qū)€基膽固醇連接到氨基末端半胱氨酸上而修飾shh，用下列的反應(yīng)緩沖液以1∶3的比率稀釋在0.5mM DTT pH7.0中的0.66mg/ml已還原單體shh100mM乙醇胺100mM NaCl
50μM CuCl2pH9.50.8％(w/v)脫氧膽酸鈉或0.4％(w/v)膽酸鈉或1.3％(w/v)正辛基糖苷或0.3％TritonX-100。
通過(guò)加入(最終濃度)5％(v/v)丙酮或100μM巰基膽固醇(于丙酮中的10mM溶液)或500μM巰基膽固醇(于丙酮中的10mM溶液)而起始反應(yīng)，混合物在室溫下振搖30分鐘。
在無(wú)菌過(guò)濾前，已經(jīng)將樣品用9體積的20mM磷酸鈉，0.9％NaCl,0.05％Tween80,1mg/mlBSA、0.1mg/ml蘇拉明，pH7.2稀釋，再以1/20稀釋后用于細(xì)胞試驗(yàn)中進(jìn)行分析。
如圖2所示，活性有一個(gè)增長(zhǎng)，這種增長(zhǎng)取決于巰基膽固醇的濃度，其在含有陰離子去污劑的樣品中最有效地產(chǎn)生或穩(wěn)定下來(lái)。
b)用巰基膽固醇吡啶基二硫化物衍生重組人shh為了通過(guò)二硫橋?qū)€基膽固醇連接到氨基末端半胱氨酸上而修飾shh，在室溫下用2mM TCEP還原在N-末端半胱氨酸之間通過(guò)二硫鍵共價(jià)交聯(lián)的shh二聚物15分鐘，接著重緩沖于PBS緩沖液pH5中以通過(guò)PD10柱(Pharmacia)分離還原劑。為了進(jìn)行偶聯(lián)，用PBSpH5將shh濃度調(diào)節(jié)到1mg/ml。通過(guò)加入濃縮的緩沖液(如40體積百分比的0.4M磷酸鈉，pH9.2)將pH調(diào)節(jié)到中性到微堿性pH值(如pH7.6)，然后立即先加入去污劑，再加入溶于有機(jī)溶劑(如甲醇，40℃)的偶聯(lián)劑(5mM巰基膽固醇吡啶基二硫化物)。在室溫下將反應(yīng)混合物保溫幾小時(shí)，接著用HPLC和質(zhì)譜術(shù)進(jìn)行分析，或者在用PBS,1mg/ml BSA,0.05％Tween80 pH7.3稀釋并無(wú)菌過(guò)濾后將其不同稀釋液用于細(xì)胞試驗(yàn)中。偶聯(lián)混合物的一些例子的結(jié)果總結(jié)在表7中。表7
如表7所示，shh的二硫化物偶聯(lián)的巰基膽固醇衍生物能夠在適當(dāng)條件下以50％以上的產(chǎn)率生產(chǎn)，并且在細(xì)胞試驗(yàn)中具有二棕櫚?；痵hh的比活性的至少10％。實(shí)施例6由RP-HPLC和質(zhì)譜術(shù)鑒定具有巰基膽固醇吡啶基二硫化物的shh偶聯(lián)制劑將已在PBS,0.05％Tween80中透析過(guò)的、含有0.7mg/ml shh,1％膽酸鈉，250μM巰基膽固醇吡啶基二硫化物，pH7.6的100μl偶聯(lián)制劑上樣到1×150mm Butyl柱(VydacTM214TP5115)中，該柱已在18％乙腈和0.1％三氟乙酸(TFA)中平衡過(guò)。在25℃，用0.1％TFA中的18-90％乙腈的梯度洗脫。分離洗脫液，一方面通過(guò)測(cè)定在220nm處的吸收值來(lái)在線分析，另一方面通過(guò)電噴霧質(zhì)譜儀(API100,Sciex；參數(shù)設(shè)置起始質(zhì)量(m/z)900原子量單位(amu)，終止質(zhì)量(m/z)1500amu，步長(zhǎng)0.3amu，停留時(shí)間0.5ms，銳孔電壓(orifice voltage)30V)在線分析。在第18分鐘(42-44％乙腈)洗脫出分別具有19560道爾頓和39120道爾頓的還原的shh單體和再氧化的shh二聚體，在第24.5分鐘(48.5％乙腈)洗脫出具有19962.7道爾頓的含有巰基膽固醇的二硫化交聯(lián)的shh。實(shí)施例7在細(xì)胞試驗(yàn)中對(duì)堿性磷酸酶的誘導(dǎo)(測(cè)定堿性磷酸酶的活性)在96孔微量滴定板上的每個(gè)孔中接種鼠間充質(zhì)多潛能性細(xì)胞系C3H10T1/2(ATCC CC1-226)5000個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞在100μl DMEM,2mM谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和10％胎牛血清(FCS)中培養(yǎng)。第二天，將待檢測(cè)的活性物質(zhì)用培養(yǎng)基稀釋后，以100μl的體積按適當(dāng)濃度加入其中。5天后停止試驗(yàn)。為了進(jìn)行測(cè)試，去掉上清液，并且用PBS將細(xì)胞洗滌一次。將細(xì)胞在50μl0.1％TritonX-100中裂解并凍于-20℃。融化后，將25μl用于蛋白質(zhì)測(cè)定，另25μl用于測(cè)定堿性磷酸酶的活性。按照生產(chǎn)商Pierce的操作指示進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定向混合物中加入75μl重蒸餾水，然后加入100μl BCA蛋白試劑(Pierce Micro BCA,No.23225)。60分鐘后，測(cè)定550nm處的光密度(0D)。按照生產(chǎn)商Sigma的操作指示測(cè)定堿性磷酸酶的活性向該制劑中加入100μl反應(yīng)緩沖液(Sigma221)。將一個(gè)底物膠囊(Sigma 104-40)溶于10ml重蒸餾水中，然后用取液器將100μl加入到試驗(yàn)混合物中。在顏色變黃后，測(cè)定405nm處的OD值。在該反應(yīng)中，堿性磷酸酶將對(duì)硝基苯基磷酸酯轉(zhuǎn)化成了對(duì)硝基苯酚。
用標(biāo)準(zhǔn)曲線將OD值分別轉(zhuǎn)化成nmol或μg。按照下列公式進(jìn)行評(píng)估nmol的pNP/(測(cè)定的)分鐘/mg(細(xì)胞)蛋白質(zhì)參考文獻(xiàn)《膜蛋白純化實(shí)用指南》G.v.Jagow,Hermann Schgger編(1994)，第16章，pp.535-554Asahina,J.，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究，222(1996)38-47Atherton et al.，《肽》，Gross和Meienhofer編，Academic Press,New York(1983),Vol.19,1-38Bitgood,M.J.et al.，當(dāng)代物生學(xué)，6(1996)296Bizzozero et al.，生物化學(xué)雜志，262(1987)2138-2145Brinkmann et al.，基因，85(1989)109-114Chiang,C.et al.，自然，83(1996)407Cook,S.D.,et al.，骨和關(guān)節(jié)外科雜志，76-A(1994)827-837歐洲專利申請(qǐng)No.98102095.1Fahrenholtz,K.E.et al.，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志，17(1974)337-342Fietz,M.et al.，發(fā)育(增刊)(1994)43-51Gaertner et al.，生物偶聯(lián)物化學(xué)，3(1992)262-268Glansbeek,H.L.,et al.，實(shí)驗(yàn)室研究，78(1998)133-142Greene and Wuts，《有機(jī)合成中的保護(hù)基》，第二版，John Wiley&Sons,New York(1991)Hancock,J.F.，細(xì)胞，63(1990)133-139Haque,Z.et al.，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，46(1982)597-599Haque,Z.et al.，農(nóng)業(yè)食品化學(xué)雜志，30(1982)481Haque,Z.et al.，農(nóng)業(yè)食品化學(xué)雜志，31(1983)1225-1230Hyness,M.et al.，神經(jīng)元15(1995)35-44Karablis et al.，基因與發(fā)育，8(1994)277-289Kinto et al.,FEBS Letters,404(1997)319-323Lai,C.J.et al.，發(fā)育121(1995)2349Lee,S.et al.,Bull.Chem.Soc.Jpn.64 1991)2019-2021Leksyszyn,J.et al.，合成，(1978)478-479Liu et al.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，91(1994)6584-6588Lopez-Martinez et al.當(dāng)代生物學(xué)，5(1995)791-796Lundblad，《蛋白質(zhì)修飾技術(shù)》，CRC Press,Boca Raton,FL,USA(1995)Marti et al.，自然，375(1995)322-325Nakamura,T.et al.，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊，237(1997)465-469Needleman and Wunsch，分子生物學(xué)雜志，48(1970)443-453Ozols,J.et al.，細(xì)胞的分子生物學(xué)，8(1997)637-645Perrimon,N.，細(xì)胞，80(1995)517-520Porter,J.A.et al.，科學(xué)，274(1996)255-259Riley,E.H.,et al.,Clin.Orthopaed.and Related Research324(1996)39-46Ross et al.，神經(jīng)科學(xué)研究雜志，21(1988)35-44Segawa,A.et al.,Int.Archs Allergy appl.Immun.66(1981)189-199Skolnick et al.,《生物膜》(1996)536-554；Merz和Roux編Smith,J.C.，細(xì)胞，76(1994)193-196Smith and Waterman，高等應(yīng)用數(shù)學(xué)，2(1981)482-489Staab H.A.,Angew.Chem.74(1962)407-423Toriumi,D.M.,et al.,Arch.Otolaryngol. Head Neck Surg.117(1991)1101-1112美國(guó)專利No.5,270,300美國(guó)專5,364,839Vortkamp,A.et al.，科學(xué)273(1996)613Webb,R.J.et al.，生物化學(xué)，37(1998)673-679WO93/00050WO95/16035WO97/35607Wong,S.S.，《蛋白質(zhì)結(jié)合和關(guān)聯(lián)化學(xué)》，CRC Press,Boca Raton,USA,1993Wozney et al.，《骨、骨形態(tài)發(fā)生蛋白及其基因表達(dá)的分子生物學(xué)》，(1993),Academic Press Inc.,131-167Yadav,S.P.et al.，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊，205(1994)1688-1695Yang et al.，發(fā)育，124(1997)4393-4404序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名ROCHE DIAGNOSTICS GMBH(B)街區(qū)Sandhofer大街116號(hào)(C)城市曼海姆(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼(ZIP):D-68305(G)電話08856/60-3446(H)傳真08856/60-3451(ⅱ)發(fā)明名稱具有活性的刺猬狀蛋白偶聯(lián)物及其生產(chǎn)方法和用途(ⅲ)序列數(shù)4(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release #1.0，版本#1.30B(EPO)(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物344”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CAGAATTCTT GCGGACCGGG CAGGGG 26(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物345”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:GACTGCAGTT AATCATTAGC CTCCCGATTT GGCCGC36(2)SEQ ID NO:3的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物346”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:AATTCATGCA TCATCACCAC CACCACGATG ACGACGACAA ATGCG 45(2)SEQ ID NO:4的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度44個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物347”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GTCCGCATTT GTCGTCGTCA TCGTGGTGGT GGTGATGATG CATG 4權(quán)利要求
1．一種刺猬狀蛋白偶聯(lián)物，它包含共價(jià)連接到刺猬狀蛋白上的a)由10到30個(gè)疏水氨基酸和/或能夠形成跨膜螺旋結(jié)構(gòu)并且?guī)д姾傻陌被峤M成的多肽，b)鏈長(zhǎng)為8-24個(gè)碳原子并且具有疏水作用的1到4個(gè)飽和或不飽和的脂族烴基，或者c)一種疏水性巰基化合物。
2．按照權(quán)利要求1所述的刺猬狀蛋白偶聯(lián)物，其中的多肽含有2到12個(gè)賴氨酸和/或精氨酸。
3．按照權(quán)利要求1所述的刺猬狀蛋白偶聯(lián)物，其中的烴基是作為酯、硫酯、酰胺或二硫化物而連接的脂肪酸或烷基醇?xì)埢?br> 4．按照權(quán)利要求3所述的刺猬狀蛋白偶聯(lián)物，其中的脂肪酸是月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、亞麻酸或花生四烯酸。
5．按照權(quán)利要求1所述的刺猬狀蛋白偶聯(lián)物，其中的疏水性巰基化合物是巰基膽固醇。
6．按照權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的刺猬狀蛋白偶聯(lián)物，其中的烴基、多肽或巰基化合物連接于刺猬狀蛋白的C-末端和/或N-末端。
7．一種生產(chǎn)如權(quán)利要求3或4或6所述的刺猬狀蛋白偶聯(lián)物的方法，其中所述烴基與刺猬狀蛋白的游離羥基、巰基、羧基或氨基共價(jià)偶聯(lián)。
8．一種通過(guò)將烴基或疏水性巰基化合物與刺猬狀蛋白共價(jià)偶聯(lián)來(lái)生產(chǎn)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述刺猬狀蛋白偶聯(lián)物的方法，其中所述烴基、多肽或疏水性巰基化合物的共價(jià)偶聯(lián)和/或分離步驟是在蘇拉明、肝素、陰離子多糖或去污劑存在下進(jìn)行的。
9．一種通過(guò)將脂肪酸殘基或疏水性巰基化合物與刺猬狀蛋白共價(jià)偶聯(lián)來(lái)生產(chǎn)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述刺猬狀蛋白偶聯(lián)物的方法，其中將棕櫚酰輔酶A或棕櫚?；溥蚧?palmitoylimidazolide)用作脂肪酸偶聯(lián)劑，將巰基膽固醇或含巰基的碳鏈用作疏水性巰基化合物。
10．一種藥物組合物，它含有藥理有效量的權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的刺猬狀蛋白偶聯(lián)物以及藥學(xué)輔助物質(zhì)、去污劑、穩(wěn)定劑、基質(zhì)材料、蘇拉明、肝素、陰離子多糖和/或螯合劑。
11．一種生產(chǎn)藥物組合物的方法，其中將權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的刺猬狀蛋白偶聯(lián)物用作該組合物的主要成分。
12．一種刺猬狀蛋白，其中N-末端半胱氨酸的巰基偶聯(lián)了一個(gè)巰基保護(hù)基，或者該刺猬狀蛋白是其中N-末端半胱氨酸通過(guò)二硫鍵而連接的同型二聚體。
13．權(quán)利要求12所述的刺猬狀蛋白在生產(chǎn)刺猬狀蛋白偶聯(lián)物中的用途，其中所述刺猬狀蛋白偶聯(lián)物包含共價(jià)連接到刺猬狀蛋白上的a)由10到30個(gè)疏水氨基酸和/或能夠形成跨膜螺旋結(jié)構(gòu)并且?guī)д姾傻陌被峤M成的多肽，b)鏈長(zhǎng)為8-24個(gè)碳原子并且具有疏水作用的1到4個(gè)飽和或不飽和的脂族烴基，或者c)一種疏水性巰基化合物。
全文摘要
一種刺猬狀(hedgehog)偶聯(lián)物,其特征在于包含共價(jià)連接到刺猬狀蛋白上的:a)由10到30個(gè)疏水氨基酸和/或能夠形成跨膜螺旋結(jié)構(gòu)并且?guī)д姾傻陌被峤M成的多肽,b)鏈長(zhǎng)為8—24個(gè)碳原子并且具有疏水作用的1到4個(gè)飽和或不飽和的脂族烴基,或者c)一種疏水性巰基化合物。該刺猬狀蛋白偶聯(lián)物活性提高了數(shù)倍,適于用作藥劑。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1233616SQ9910630
公開日1999年11月3日 申請(qǐng)日期1999年4月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月30日
發(fā)明者A·艾斯威恩, K·朗, P·盧格, T·塞特 申請(qǐng)人:羅切診斷學(xué)有限公司