專利名稱：酶前體藥物作為抗感染劑的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物治療領域，特別是涉及酶的底物，該酶由感染物表達因而能阻斷當前可獲得的藥物的功效。
背景在本申請整個說明書中，參考了各種公開出版物的第一作者、日期、專利號或公開號。在本申請末尾、權(quán)利要求書的前面列出了所有參考的文獻目錄。這些公開出版物在此作為本申請說明書的參考、以進一步充分描述與本申請有關的技術水平。
對抗微生物劑的抗性是公認的醫(yī)學難題(Schaechter，等，1993；Murray，1997)。此問題早期被認為是葡萄球菌中的青霉素抗性，目前公認的問題是許多細菌感染的治療，實質(zhì)上包括所有醫(yī)院的(醫(yī)院獲得性)細菌感染(Bush，1998；Steinberg，等1996；Murry，1997)。有5％的住院病人出現(xiàn)醫(yī)院感染(美國每年約2百萬患者)；每年估計有2萬人死亡，另外促使醫(yī)院死亡6萬人。據(jù)估計醫(yī)院感染增加約750萬個住院日，每年醫(yī)療費增加十億美元(Wilson等1991)?？股乜剐约毦闹匾砸言龃?，因為許多生物體例如金黃色葡萄球菌已經(jīng)對數(shù)種不同的抗生素產(chǎn)生抗性(“多抗性”表型)。參與耐藥性的酶包括青霉素酶、β-內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶等等。這些酶通過將抗生素修飾成無活性的化合物而使抗生素失活。由酶所致的抗性也包括氯霉素轉(zhuǎn)乙?；负推渌被擒招揎椕府a(chǎn)生的抗生素修飾(Murray，1997)。導致抗生素抗性的其它機制包括藥物通透性突變、從靶生物體有效排出抗生素的轉(zhuǎn)運蛋白的表達和靶藥物自身的突變(Murray，1997)。
抗生素的特性抗生素是對靶生物體具有細胞抑制作用或細胞毒作用的藥物?？股赜行У年P鍵是對疾病目標的選擇性，并且對宿主或患者沒有毒性。許多抗生素是從微生物生物體本身的培養(yǎng)物純化的，其它的則是天然產(chǎn)生的抗生素的合成衍生物(Wilson，等1991)。大多數(shù)抗感染的有用抗生素是那些專一作用于微生物目標的抗生素。例如，β-內(nèi)酰胺抗生素通過與細胞壁前體結(jié)合而干擾細胞壁合成。由于哺乳動物細胞沒有細菌的細胞壁，這些藥物對患者具有極大的安全幅度。對β-內(nèi)酰胺抗生素的抗性的最常見形式是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，它可降解抗生素分子。β-內(nèi)酰胺酶由質(zhì)?；蛉旧w基因編碼。在葡萄球菌之類的革蘭氏陽性菌中，這些酶是胞外酶，而在大多數(shù)革蘭氏陰性茵中，這種酶被分泌到壁膜間隙(細菌細胞膜與細胞壁之間)中。
雖然抗生素的失活可能是耐藥性的最常見的機制，但抗性也可以是由于藥物目標本身中的突變所致。其中最具特征的是青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)中的突變，它可導致結(jié)合的減少或喪失。β-內(nèi)酰胺抗生素包括青霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素和頭孢菌素(包括頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢噻吩、頭孢噻肟和頭孢哌酮)。由于抗性是通過產(chǎn)生大量的β-內(nèi)酰胺酶而出現(xiàn)的，這是十分普遍，因此已開發(fā)新藥物抑制這些酶、由此增強β-內(nèi)酰胺抗生素的功效。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的例子包括棒酸鹽、羧噻吩青霉素-棒酸復合劑和舒巴坦(Bush，1988；Wilson，等1991；Schaechter，等1993)。β-內(nèi)酰胺抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的結(jié)合延長了這些抗生素的有用的藥理壽命(Bush，1998)。
常用抗微生物劑的缺點常用抗微生物劑的作用目標非常有特征。下面列出了幾個例子抗生素家族 實例 目標β-內(nèi)酰胺抗生素青霉素、頭孢茵素 細胞壁生物合成磺胺類 磺胺 阻斷四氫葉酸的合成氨基糖苷 鏈霉素 蛋白質(zhì)合成甲氧芐胺嘧啶-- 葉酸代謝氯霉素 -- 蛋白質(zhì)合成萬古霉素-- 細胞壁合成其它抗生素是通過阻斷DNA復制、細胞RNA的產(chǎn)生、或通過對多種細胞目標的修飾而產(chǎn)生作用的(Schaechter等1993)。出現(xiàn)對抗生素的抗性是很常見的，已經(jīng)有人描述了許多有關機制(Schaechter等1993；Murray，1997)。這些機制包括目標酶的超量表達、使抗生素失活的酶的表達、或者目標的突變以便不再被抗生素識別。下面列出了這些例子抗生素 抗性的主要機制青霉素和其它β-內(nèi)酰胺抗生素 被β-內(nèi)酰胺酶失活磺胺 二氫蝶酸合酶目標酶的突變氨基糖苷 通過氨基糖苷修飾酶、或通過目標突變的失活甲氧芐胺嘧啶 二氫葉酸還原酶目標酶的突變氯霉素 被氯霉素轉(zhuǎn)乙?；甘Щ罴籽跷髁?青霉素結(jié)合蛋白的突變?nèi)f古霉素 靶細胞壁肽中的突變已經(jīng)有人對細菌感染對抗生素治療的抗性增加作了詳細論述(參見例如Steinberg，等1996)，并且現(xiàn)在這已成為普遍公認的問題(Murray，1997)。對來源于前一代的“新”抗生素(如來源于青霉素的頭孢菌素)的抗性的每次出現(xiàn)都取得了初步成功，隨后有關抗性的報道不斷增加。β-內(nèi)酰胺酶抗生素的發(fā)展就是該領域的代表。每種接續(xù)的抗生素更易對β-內(nèi)酰胺酶降解產(chǎn)生抗性，之后生物體產(chǎn)生大量β-內(nèi)酰胺酶。這對醫(yī)源性感染尤其是個問題(Wilson，等，1991；Murray，1997)。雖然一些抗生素抗性調(diào)節(jié)劑位于細菌的染色體上，但傳遞耐藥性表型的最常見機制是通過質(zhì)粒進行的(Schaechter，等1993)。醫(yī)學界的失望是針對生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的抑制劑而提出的。不幸的是，雖然β-內(nèi)酰胺酶具有許多重迭的底物特異性，但它們演化不同、從而具有不同但相關的氨基酸序列。此問題是通過廣泛改變對不同酶的各β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的功效來表現(xiàn)的。另外，新一代抗生素通常較其前體更具毒性，且不能按常規(guī)方式給患者用藥。例如，通常叫做“最后一種抗生素”的萬古霉素因毒性很大，除非非常嚴重、對多種藥物耐藥、感染的情況下，一般不使用(《醫(yī)生工作參考》1996)。一種耐藥性循環(huán)已經(jīng)建立了，這需要用新的方法來解決。因此，需要新一代抗生素，它不易受已確立的藥物回避機制的影響。本發(fā)明能滿足這種需要，同時還提供了有關優(yōu)點。
本發(fā)明的摘要對于許多酶-前體藥物的組合已經(jīng)有詳細描述。各種應用包括了用于治療癌癥的更昔洛韋之類的抗病毒藥物(Straus，1993)和抗體或基因指導的細茵酶的表達(Melton，等1996；Stosor，等1996)。本發(fā)明將此技術改變?yōu)橹委煂股刂委熌退幍母腥拘约膊　?br> 因此，本發(fā)明提供了鑒定用于殺死抗生素抗性革蘭氏陰性微生物的潛在治療劑的方法，包括在有利于治療劑被酶激活的條件下，將樣本與候補的治療劑接觸，這種試劑是一種酶的選擇性底物，所述酶是被超量表達的并且賦予微生物抗生素抗性；和針對微生物增殖的抑制作用對樣品進行測定。
本發(fā)明還提供了一種選擇性抑制抗生素抗性革蘭氏陰性微生物的增殖的方法，包括將含微生物的樣本與有效量的前體藥物接觸，這種前體藥物被抗性酶本身選擇性地轉(zhuǎn)化為毒素。在一種實施方式中，生物體對新抗生素產(chǎn)生抗性的最便利的方法是失去β-內(nèi)酰胺酶的表達。因此本發(fā)明提供了一種使抗生素抗性生物體對原始抗生素再次敏感的方法。
附圖
的說明附圖描述了用于實施本發(fā)明的前體藥物。
實施本發(fā)明的方式本發(fā)明提供了一種將有毒的抗代謝物導向于革蘭氏陰性茵感染的方法?？墒惯@些抗生素用于抗癌之外的領域，鑒于它們的毒性，這些分子和其衍生物一直局限于抗癌領域。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種利用主要的疾病抗性機制-β-內(nèi)酰胺酶的超量產(chǎn)生、以局部激活這些藥物(在革蘭氏陰性菌的外周質(zhì)內(nèi))和克服微生物的抗性表型的方法。本發(fā)明還提供了一種選擇β-內(nèi)酰胺抗生素敏感性的方法，由于生物體可能抵抗前體藥物的可能機制是通過喪失β-內(nèi)酰胺酶活性，這可使細菌對β-內(nèi)酰胺抗生素再次敏感。因此，本發(fā)明提供了一種逆轉(zhuǎn)微生物中的抗生素抗性的方法，即通過選擇抗性酶活性的喪失。該方法需將微生物與被抗性酶代謝的前體藥物接觸，從而殺死表達抗性酶的微生物。只有失去抗性酶的生物體才能存活?，F(xiàn)在選擇存活的生物體對原始抗生素的敏感性，通過將它們與原始抗生素接觸可有效地殺死這些生物體。在此，本發(fā)明還提供了一種治療微生物感染的組合療法，其中微生物能出現(xiàn)下面所述的抗生素抗性。這種組合療法首先需要用抗生素治療，然后用本文所述的前體藥物治療，最后用原始抗生素治療。還要求保護一種逆轉(zhuǎn)微生物中的抗生素抗性的方法，此方法包括將這種微生物與有效量的試劑接觸，這種試劑是一種酶的選擇性底物，所述酶是被超量表達的并且賦予微生物抗生素抗性。
在一個實施方式中，本發(fā)明使用了用于治療感染性疾病、具有來源于β-內(nèi)酰胺的化療抗生素的通常結(jié)構(gòu)的藥物。與前面的工作(Melton和Sherwood，1996)不同，這里不需要與導向試劑組合。將前體藥物直接用于細菌感染的局部或系統(tǒng)治療。
本發(fā)明提供了一種鑒定用于殺死抗生素抗性革蘭氏陰性微生物的潛在治療劑的方法，即通過將含抗生素抗性微生物的樣本與候補的前體藥物接觸，這種前體藥物是一種酶的選擇性底物，這種酶是被超量表達的并且賦予感染微生物耐藥性。本文所用的術語“前體藥物”是指藥學上的活性劑或物質(zhì)的前體或衍生物形式，它與藥物代謝物相比對靶細胞的細胞毒性較小，且能被酶促激活或轉(zhuǎn)化為更有活性的形式。
在有利于前體藥物被酶激活的條件下，將前體藥物與樣本接觸，然后針對樣本中的感染細胞的微生物增殖的抑制對樣本進行測定，與對照細胞進行比較。將不同濃度的潛在試劑與樣本接觸以確定該試劑的最適宜的有效濃度。因此，一方面，本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)這些試劑及其用途，這些試劑是賦予微生物耐藥性的酶的選擇性底物。
還要求保護如本文所述的含有這些試劑和說明書(它們對進行篩選來說是必要的)的藥盒和體外方法。
本文所用的細胞或組織樣本包括特征在于具有耐藥性的細胞或組織，此耐藥性是通過感染微生物超量表達酶所致。這種細胞可以是真核細胞，即哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞或人細胞。這種細胞也可以是原核細胞，例如酵母或細菌細胞。這種細胞可以連續(xù)培養(yǎng)或從感染的動物或人身上分離。
此方法可以在體外、間接體內(nèi)(ex vivo)或體內(nèi)實施。本發(fā)明在動物如大鼠或小鼠的體內(nèi)實驗提供了便利的動物模型系統(tǒng)，這種模型系統(tǒng)可在治療劑或前體藥物的臨床試驗前使用。在此系統(tǒng)中，如果每次與未治療的感染動物相比，微生物量減少了或感染的癥狀得到改善，則潛在的前體藥物是成功的。有一個未被感染的細胞或動物的獨立陰性對照組也是有用的，它可提供比較的基礎。
當進行體內(nèi)試驗時，對動物給予有效量的候補前體藥物。本文所用的體內(nèi)“給藥”和間接體內(nèi)“給藥”(如果靶細胞群返回到同一患者(自身)或另一個患者(同種異體))是指給患者使用能有效減少細菌量的有效量候補前體藥物。在此情況下，這種試劑或前體藥物可與藥學上可接受的載體一同給藥。本發(fā)明的這些試劑和組合物可用于制備藥物，并通過常規(guī)方法給藥(例如活性成分存在于藥物組合物中)對人和其它動物進行治療。
對于本領域技術人員來說，藥物組合物的給藥方法是眾所周知的，這些方法包括但不局限于顯微注射、靜脈內(nèi)給藥或非腸道給藥。這些組合物可以用于表面、口服或局部給藥，以及靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給藥。整個治療過程中，可以連續(xù)或間歇給藥。對于本領域技術人員來說，確定最有效的給藥方式和劑量的方法是眾所周知的，可以根據(jù)用于治療的前體藥物、治療目的、所處理的微生物、感染的嚴重程度和接受治療的患者的不同來改變上述給藥方式和劑量。用主治醫(yī)生所選擇的劑量水平和類型來進行單一給藥或聯(lián)合給藥。例如，可將這些組合物用于已經(jīng)患有抗生素抗性細菌感染的患者。在此情況下，給予有效“治療量”的組合物可防止繼續(xù)感染、至少可部分抑制微生物的生長和增殖、改善與感染相關的癥狀。
但是，對于敏感的患者或個體或者有感染發(fā)展的危險的患者或個體，可以給予前體藥物。在這些實施方式中，給予“預防有效量”的組合物可使細胞的生存力和功能維持在接近感染前的水平。
通過預防或抑制患者或個體中的不希望有的細胞死亡，本發(fā)明的前體藥物組合物和方法還提供了治療、預防或改善與特征在于不希望有的感染的疾病有關的癥狀的方法。這些疾病包括但不局限于革蘭氏陰性菌感染，如下表所示。
生物體 疾病奈瑟氏球菌 淋病、腦膜炎、敗血癥沙門氏菌 傷寒、食物中毒志賀氏菌 菌痢嗜血桿菌 肺炎、腦膜炎變形細菌(Bacteriodes) 腹膜炎通過改進的聚合酶鏈反應(PCR)可檢測和監(jiān)視與微生物抗性有關的基因的擴增，如Takasuke，T等1988或美國專利5，085，983號所述?？蛇x擇的測定法包括酶活性測定法(Miller，1992；Spector，等1997)和通過聚合酶鏈反應(Spector，等1997和Maher，等1995)。
本發(fā)明還提供了一種選擇性抑制抗生素抗性革蘭氏陰性微生物的增殖的方法，包括將微生物與有效量的前體藥物接觸，這種藥物被一種酶選擇性地轉(zhuǎn)化為微生物中的一種毒素，這種酶的超量表達賦予微生物抗生素抗性。如上所述，這種接觸可在動物系統(tǒng)中體外、間接體內(nèi)或體內(nèi)完成，針對培養(yǎng)的或被取樣的細胞樣本。使用美國專利5，399，346號所述的改進方法也可間接體內(nèi)實施本發(fā)明方法。
在一種實施方式中，微生物對β-內(nèi)酰胺酶抗生素如青霉素或頭孢菌素具有抗性。
β-內(nèi)酰胺酶可在微生物的細胞外或外周質(zhì)間隙內(nèi)找到。一般說來，革蘭氏陽性茵的活性β-內(nèi)酰胺酶被分泌到介質(zhì)中。雖然可能出現(xiàn)一些酶泄漏到介質(zhì)中的情況，但革蘭氏陰性生物體中的β-內(nèi)酰胺酶活性主要是在外周質(zhì)間隙中發(fā)現(xiàn)的。β-內(nèi)酰胺酶合成的遺傳信息可攜帶在質(zhì)粒上、也可出現(xiàn)在細茵染色體中；這兩者都可導致對常見的β-內(nèi)酰胺抗生素產(chǎn)生抗性的酶的產(chǎn)生。
由于這些染色體外因子很容易從一種細菌菌株轉(zhuǎn)移到另一菌株，質(zhì)粒介導的β-內(nèi)酰胺酶特別不知不覺地增加了。一些開始在質(zhì)粒上編碼的β-內(nèi)酰胺酶可具有這種遺傳信息，最終進入染色體、永久地加入細胞脫氧核糖核酸中。對于細菌來說，攜帶多種質(zhì)粒(編碼多種抗生素修飾酶)并不罕見。在單一質(zhì)粒中攜帶有多種抗性因子也是可能的。因此，一種細菌出現(xiàn)對兩種或三種抗生素的抗性越來越多見了。
染色體的β-內(nèi)酰胺酶生產(chǎn)的一個最討厭的方面是這些酶容易出現(xiàn)誘導性，從而產(chǎn)生高濃度的β-內(nèi)酰胺酶。已知的最佳誘導物是β-內(nèi)酰胺酶抗生素，通常這些誘導物隨后被誘導酶水解。在一些情況下，可以選擇穩(wěn)定脫阻抑的突變體，其中β-內(nèi)酰胺酶的總含量占細菌細胞的總蛋白質(zhì)的4％。
被β-內(nèi)酰胺酶激活的適合的前體藥物，包括但不限于選自絲裂霉素、阿霉素(adriamycin)、阿霉素(doxorubiein)和氮芥的細胞毒分子。在一個特殊的實施方式中，前體藥物具有下列化學式 其中R是一種由化學合成衍生的結(jié)構(gòu)，通過體外和體內(nèi)的抗革蘭氏陰性菌試驗而最優(yōu)化。被β-內(nèi)酰胺酶激活后，R被轉(zhuǎn)化為細胞靜止藥物或細胞毒藥物(附圖中指R’)。在一個實施方式中，R’是一種能對感染細胞如細菌產(chǎn)生細胞毒作用的試劑，當從頭孢菌素-前體藥物釋放時它可超量表達β-內(nèi)酰胺酶。
本領域技術人員都知道，通過對美國專利5，549，974號；5，639，603號和5，679，773號的教導進行改進、采用本發(fā)明的方法可合成本文所述的前體藥物、并測定其生物活性。
細胞毒化合物是一種至少具有一個可以進行化學修飾的官能團的化合物，從而提供β-內(nèi)酰胺前體藥物的作用機制。一般來說，這些官能團選自氨基、羧基和羥基，這樣細胞毒試劑與β-內(nèi)酰胺成分之間的連接為氨基甲酸酯、酰胺、酯和碳酸酯類型的連接。
在下面的歐洲專利公開0 317 956(申請?zhí)?8119418.7)、0484 870A2(申請?zhí)?1118822.5)、0 302 473 B1(申請?zhí)?8112646.0)、EP 0 742015 A1(申請?zhí)?6106146.2)、EP 0 745 390 A2(申請?zhí)?6108570.1)中描述了這些前體藥物和一些潛在的衍生物的合成。這些結(jié)構(gòu)和合成方法在本領域是公知的，在此引作參考。這包括但不限于來源于絲裂霉素、阿霉素(adriamycin)/阿霉素(doxorubicin)、氮芥或其它具有相似結(jié)構(gòu)的細胞毒分子的β-內(nèi)酰胺前體藥物，它們可通過β-內(nèi)酰胺取代基的衍生化作用產(chǎn)生激活和細菌細胞殺傷。例如，采用組合化學、或通過其它本領域公知的方法，可對該一般結(jié)構(gòu)進行適當修飾。
在一個實施方式中，衍生物具有下列一般結(jié)構(gòu) 其中Q為氫、常用于頭孢菌素合成的氨基保護基團、或已知的7-?；被^孢菌素抗生素的酰基基團；L為直接鍵或-S-(CH2)n-；R是一種當從上述頭孢菌素-前體藥物釋放時能對細胞產(chǎn)生細胞毒作用的試劑；n為2、3或4；并且m為0或1，條件是，當L為直接鍵時，m為1；或其藥學上可接受的鹽。
對于本發(fā)明的目的而言，由于頭孢菌素部分是作為細胞毒藥物的載體而不對細胞毒藥物的治療作用產(chǎn)生影響，故取代基Q的性質(zhì)不是至關重要的。因此Q可以是，例如，氫、常用于頭孢茵素化學中的保護基團、或已知的頭孢菌素抗生素的取代基。后者的實例包括，但不限于苯乙酰基、2-亞硫酰乙?；?、a-羥基苯基乙?；⒈交拾滨；?、對羥基苯基甘氨?；?2-氨基-4噻唑基)(甲氧基氨基(methoxylmino))乙?；?。
在另一個實施方式中，細胞毒化合物是一種至少具有一個可以進行化學修飾的官能團的化合物，從而提供頭孢菌素前體藥物。一般來說，這些官能團選自氨基、羧基和羥基，這樣細胞毒試劑與頭孢菌素成分之間的連接為氨基甲酸酯、酰胺、酯和碳酸酯類型的連接。
本發(fā)明還要求保護具有上述結(jié)構(gòu)的化合物、衍生物、和其藥學上有效的鹽、以及含這些的藥物。上述化合物可以單獨使用，或者與可接受的載體例如藥學上可接受的載體組合使用。這些化合物也可與其它用于組合治療的治療劑合用。制備這些化合物的方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的目的之一是提供可被任何β-內(nèi)酰胺酶激活的前體藥物，從而避開選擇合適的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑這一問題。由于前體藥物的β-內(nèi)酰胺加合物可以被多種細菌的β-內(nèi)酰胺酶廣泛激活(參見如Vrudhula，等1995)，發(fā)現(xiàn)單一前體藥物具有治療多種不同感染的功效，由于靶生物體產(chǎn)生了大量β-內(nèi)酰胺酶，先前這些感染對治療有抗性。這種方法避免了β-內(nèi)酰胺酶抑制劑遇到的突變抗性問題(Bush，1988)。由于對這些前體藥物的抗性可能是通過失去β-內(nèi)酰胺酶活性而產(chǎn)生的，因此這種方法也是有用的。這將導致細菌再次對青霉素敏感。因此本發(fā)明還要求保護一種使β-內(nèi)酰胺抗生素抗性生物體變得對β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的方法。
一些目前可得到的有效的抗生素的另一個局限在于其缺乏特異性。例子包括絲裂霉素和阿霉素，它們都是從鏈霉菌屬分離的。在尋找和開發(fā)藥物過程中，一個主要的挑戰(zhàn)是將藥物有效地導向疾病機制，而不對未患病的或宿主器官產(chǎn)生作用。由于迄今為止已發(fā)現(xiàn)的許多抗生素都不能很好地區(qū)分細菌與宿主目標，因此它們不能用作抗感染劑。但是這些化合物中有一些已用于治療其它疾病，例如癌癥。本發(fā)明提供了一種將這些毒性化合物(前體藥物的形式)導向感染的生物體、而宿主與毒素接觸最少的方法。
還與本發(fā)明相關的是非常重要的現(xiàn)有技術，其中已經(jīng)設計了這些抗生素的前體藥物構(gòu)建體，其中它們被細菌特異酶如β-內(nèi)酰胺酶激活。在此技術中，稱為抗體定向前體藥物治療(ADEPT)或基因定向前體藥物治療(GDEPT)，通過特異性導向劑如抗體將細茵酶定位于腫瘤(Melton和Sherwood，1996)。然后給患者施用前體藥物，在腫瘤部位(其中通過與抗體共軛結(jié)合使酶定位)優(yōu)先激活前體藥物。這就提供了抗腫瘤抗生素的定域，使得腫瘤部位的活性藥物的濃度較高，較少系統(tǒng)暴露于活性藥物及其較小毒性。已經(jīng)制備了幾種可被β-內(nèi)酰胺酶廣泛激活的前體藥物。這些前體藥物包括阿霉素(Vrudhula，等1995)、紫杉醇(paclitaxil)(Rodrigues，等1995)、氮芥(Kerr，等1995)、長春花生物堿(Meyer，等1992)和絲裂霉素(Vrudhula，等1995)的β-內(nèi)酰胺衍生物。已證實這些化合物可被不同細菌菌種的廣譜β-內(nèi)酰胺酶激活(Vrudhula，等1995)。這些藥物的功效是根據(jù)活化酶的適當定位來決定的，即通過與腫瘤結(jié)合的抗體、或通過腫瘤細胞中的活化酶的優(yōu)先表達來確定。上述出版物的作者沒有公開這些前體藥物作為抗感染劑的效用。由于僅僅是感染生物體表達活化酶，因此本發(fā)明不需要通過抗體或其它方法的這種定位。本發(fā)明著重于革蘭氏陰性菌生物體，其中β-內(nèi)酰胺酶定位于外周質(zhì)間隙中。對于其中分泌β-內(nèi)酰胺酶的革蘭氏陽性生物體來說，很可能不能實現(xiàn)活性毒素的所需定位。
本發(fā)明的目的在于利用這種前體藥物技術來治療感染性疾病，而不是癌癥。類似的前體藥物將用于激活正常宿主-毒性藥物的前體藥物變體、專門用于治療感染，這種類似的前體藥物是由通常參與抵抗抗生素治療的β-內(nèi)酰胺酶或其它微生物酶激活，被感染劑單獨表達和/或被感染劑超量表達。通過僅僅在感染性疾病范圍內(nèi)或其部位產(chǎn)生高濃度的活化形式，這種“生化導向”技術克服了上述藥物作用缺少特異性的缺點。這是一種新方法，能使先前毒性很大的藥物用于抵抗感染性疾病。先前，Mobashery和同事(Mobashery，等1986；Mobashery和Johnson，1986)描述了看來是被β-內(nèi)酰胺酶激活的多肽抗生素。他們的工作沒有提出幾個重要的問題(1)活性不僅僅取決于β-內(nèi)酰胺酶表達，而且有賴于肽通透酶將肽轉(zhuǎn)運到細菌細胞中、和隨后其它細胞酶的細胞內(nèi)激活；(2)在“富集”培養(yǎng)基中所用的肽是無活性的(Boisvert，等1986)。第一個局限是指藥物的進入和其隨后的功效是受其進入細胞的能力的限制。其二，在富集培養(yǎng)基中肽缺少活性，這可能是在任何體內(nèi)應用時遇到的情形。作者沒有期望由于這種“導向”方法而能使用更具毒性的抗生素(例如絲裂霉素或阿霉素)。同樣，致力于ADEPT的工作組，雖然認識到用β-內(nèi)酰胺前體藥物治療癌癥的價值，但沒有認識到它們可用于治療感染性疾病。
在生長于液體或固體培養(yǎng)基中的革蘭氏陰性菌上對抗生素進行試驗，根據(jù)已確立的方法補充候補前體藥物(Miller，1992)。為了測定體內(nèi)功效，用產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的革蘭氏陰性茵感染小鼠，一旦出現(xiàn)感染，用β-內(nèi)酰胺抗生素與β-內(nèi)酰胺前體藥物進行治療。通過對從小鼠取出的樣本中的活菌進行計數(shù)來監(jiān)測疾病的進展。此實驗的目的是為了證實藥物的體內(nèi)安全性、確定其功效和估計用于人的劑量。
整個治療過程中單一劑量、連續(xù)或間隙性體內(nèi)給藥都是有效的。對于本領域技術人員來說，確定最有效的給藥方式和劑量的方法是眾所周知的，可以根據(jù)用于治療的組合物、治療目的、所治療的靶細胞和接受治療的患者的不同來改變上述給藥方式和劑量。用主治醫(yī)生所選擇的劑量水平和類型來進行單一給藥或復合給藥。從下面可以找到合適的劑量劑型和試劑給藥方法。
本發(fā)明藥物組合物可以口服、鼻內(nèi)、非腸道給藥或者通過吸入法給藥，也可采用下列形式片劑、錠劑、粒劑、膠囊、丸劑、安瓿、栓劑或氣霧劑的形式。還可采用以下形式活性成分在含水或不含水稀釋劑中的懸浮液、溶液和乳狀液、糖漿劑、顆粒劑或粉劑。除本發(fā)明的試劑外，藥物組合物還可含有其它藥學上的活性化合物或許多本發(fā)明化合物。
更為特別的是，在此處也稱為活性成分的本發(fā)明試劑，可以通過任何適當?shù)耐緩桨诜?、直腸的、鼻的、局部的(包括經(jīng)皮、氣霧、頰的和舌下的)、陰道的、非腸道的(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))和肺的途徑用于治療給藥。還發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的給藥途徑是隨著接受治療的患者的病情和年齡、以及所治療的疾病的不同而改變的。
理想的應是，給予這種試劑后，活性化合物應在疾病部位達到峰濃度。例如，通過靜脈內(nèi)注射這種試劑(任選在鹽水中)，或者口服給藥如含活性成分的片劑、膠囊或糖漿，來達到上述目的。通過連續(xù)輸注以便在病理組織內(nèi)提供治療量的活性成分，這樣可維持所需的這種試劑的血濃度。采用有效的組合法，意在提供較單獨使用每個治療化合物或藥物時、對每個成分試劑所需的總劑量更少的組合療法，從而減少不利作用。
雖然這種試劑可以單獨給藥，但優(yōu)選作為一種藥學制劑使用，這種藥學制劑包括至少一種如上所述的活性成分、以及一種或多種其藥學上可接受的載體和任選其它治療劑。在與制劑的其它成分相容這一點上，每一載體必須是“可接受的”，并且對患者沒有損害。
這些制劑包括適合于口服的、直腸的、鼻的、局部的(包括經(jīng)皮、頰的和舌下的)、陰道的、非腸道的(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))和肺的途徑給藥的制劑。這些制劑可方便地以單位劑型出現(xiàn)，可以通過藥學領域公知的任何方法來制備。這些方法包括將活性成分與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體相結(jié)合這一步驟?？傊?，這樣制備這些制劑，即，將活性成分與液態(tài)載體或精細粉碎的固體載體或兩者均勻和緊密地結(jié)合，然后如需要，可使產(chǎn)品成形。
適合于口服給藥的本發(fā)明制劑也可以以分散單位的形式出現(xiàn)，如膠囊、扁囊劑或片劑，各自包含預定量的活性成分；可以作為粉劑或顆粒劑；作為含水或不含水液體中的溶液或懸浮液；或作為水包油型液體乳劑或油包水型液體乳劑。活性成分也可以是大藥丸、干藥糖劑或糊劑的形式。
通過任選加入一種或多種輔助成分進行壓縮或模制可以制成片劑。壓縮片劑可按如下方法制備，即在適當?shù)臋C器中壓縮呈自由流動形式如粉末或顆粒的活性成分，上述活性成分任選與粘合劑(如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(如羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧基甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑混合。模制片劑可通過在適當?shù)臋C器中，對被惰性液體稀釋劑濕潤的粉末化合物的混合物進行模制而制成。可以任選對這些片劑進行包衣或刻痕，也可以進行配制以使其活性成分緩慢或控制釋放，例如，使用不同比例的羥丙基甲基纖維素而得到所需的釋放分布。可任選為片劑提供腸溶包衣，以便在腸部分釋放，而不是在胃釋放。
適合于口中局部給藥的制劑包括錠劑，它包含在調(diào)味基質(zhì)(通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)中的活性成分；軟錠劑，它包含在惰性基質(zhì)(如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯膠)中的活性成分；以及漱口藥，它包含在適合的液體載體中的活性成分。
可以將本發(fā)明用于局部給藥的藥物組合物配制成軟膏、乳膏、懸浮液、洗劑、粉劑、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑或油劑?；蛘?，制劑可包含補片和敷料，例如浸漬有活性成分和任選一種或多種賦形劑或稀釋劑的繃帶或橡皮膏。
如需要，乳膏基質(zhì)的含水相可包括例如至少約30％w/w的多元醇，即一種含兩個或多個羥基基團的醇，如丙二醇、丁-1，3-二醇、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇及其混合物。局部制劑根據(jù)需要可包括促進試劑通過皮膚或其它感染部位吸收或滲透的化合物。這種皮膚滲透增強劑的例子包括二甲亞砜和有關類似物。
從已知的成分、按已知方法可以組成本發(fā)明乳劑的油相。盡管此油相可僅僅包括一種乳化劑(emulsifer)(也稱為乳化劑(emulgent))時，但希望它包括至少一種乳化劑與脂肪或油或者與脂肪和油兩者的混合物。優(yōu)選親水乳化劑與作為穩(wěn)定劑的親脂乳化劑包含在一起。還優(yōu)選同時包括油和脂肪。同時，含有或不合穩(wěn)定劑的乳化劑構(gòu)成了所謂的乳化蠟，這種蠟與油和/或脂肪一起構(gòu)成了所謂的乳化軟膏基質(zhì)，它形成乳膏制劑的油分散相。
適用于本發(fā)明制劑的乳化劑和乳劑穩(wěn)定劑包括吐溫60、司盤80、鯨蠟十八烷醇、肉豆蔻醇、單硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸鈉。
由于活性化合物在可能用于藥學乳劑制劑的大多數(shù)油中的溶解性很低，故根據(jù)達到的所需美容特性來選擇適合制劑的油或脂肪。因此乳膏應優(yōu)選非油脂性、非染色性且可洗去的產(chǎn)品，這種產(chǎn)品具有適合的稠度以避免從管子或其它容器泄漏?？梢允褂弥辨溁蛑ф湹囊粌r烷基酯或二價烷基酯，如二-異己二酸酯、硬脂酸異十六烷酯、椰子油脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、棕櫚酸2-乙基己基酯，或稱為Crodamol CAP的支鏈酯的混合物，最后三種是優(yōu)選的酯。根據(jù)所需的特性，這些酯可單獨使用或組合使用?；蛘撸梢允褂酶呷埸c的脂類如柔軟白石蠟和/或液體石蠟或其它礦物油。
適用于眼的局部給藥的制劑也包括滴眼液，其中活性成分溶解或懸浮在適當?shù)妮d體中，尤其是該試劑的含水溶劑中。
用于直腸給藥的制劑可以是含適當基質(zhì)的栓劑形式，該基質(zhì)包括例如可可油或水楊酸酯。
適用于陰道給藥的制劑可以是陰道栓劑、塞劑、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧制劑，該制劑除含試劑外，還含有本領域已知的適當載體。
適用于鼻腔給藥的制劑(其中載體是一種固體)包括顆粒大小例如在約20-約500微米范圍的粗粉，其給藥方式是通過鼻吸，即從離鼻子很近的藥粉容器經(jīng)鼻道快速吸入。適合的制劑(其中載體是一種液體)，例如以鼻噴霧劑、滴鼻劑的形式給藥，或通過噴霧器氣霧給藥，這種制劑包括試劑的含水溶液或油性溶液。
適用于非腸道給藥的制劑包括含水和不含水的等滲無菌注射液，它可包含抗氧化劑、緩沖液、抑茵劑和能使這種制劑與要接受該制劑的接受者血液達到等滲的溶質(zhì)；以及含水和不含水的無菌懸浮液，它可包括懸浮劑和增稠劑，以及脂質(zhì)體或其它被設計成使化合物導向血液成分或者一種或多種器官的微粒系統(tǒng)。這些制劑可保存在單劑量或多劑量的密閉容器中，例如安瓿和小瓶中，并且可在冰凍-干燥(凍干)條件儲藏，僅需在使用前加入無茵液體載體如注射用水。臨時的注射溶液和懸浮液可以從前面所述類型的無菌粉劑、顆粒劑和片劑制得。
優(yōu)選的單位劑量制劑是那些包含試劑的每日劑量或單位、每日亞劑量(如上所述)、或其適當部分的制劑。
應該認識到，除了上面特別提到的成分外，本發(fā)明制劑可包括其它本領域常見的試劑(考慮了該制劑的類型)，例如，用于口服的制劑還可包括諸如甜味劑、增稠劑和調(diào)味劑之類的試劑。另外，本發(fā)明的試劑、組合物和方法還可與其它適合的組合物和療法相結(jié)合。
可以將本發(fā)明的這些試劑和上述的化合物及其衍生物用于制備可適用于本發(fā)明方法中的藥物。
在前體藥物的臨床使用過程中，抗生素可能遵循已確立的原則。劑量可能與已經(jīng)使用的大多數(shù)其它抗生素的劑量相似。據(jù)估計，前體藥物的劑量范圍為100mg-1gm，每8小時給藥一次，或一天一次，用藥1-2周，或者用至患者的感染生物體試驗為陰性。
應當清楚，我們已經(jīng)對本發(fā)明連同上面的實施方式進行了描述，前面的說明書和后面的實施例是為了對本發(fā)明進行舉例說明，而不是限定本發(fā)明的范圍。另外，本發(fā)明的范圍內(nèi)的其它方面、優(yōu)點和改進對本領域所屬技術人員而言是顯而易見的。
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權(quán)利要求
1．一種鑒定用于抑制抗生素抗性革蘭氏陰性微生物的增殖的潛在治療劑的方法，包括(a)在有利于治療劑被酶激活的條件下，將樣本與候補的治療劑接觸，這種試劑是一種酶的選擇性底物，所述酶是被超量表達的并且賦予微生物抗生素抗性；和(b)針對微生物增殖的抑制作用對樣本進行測定。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中微生物對β-內(nèi)酰胺酶抗生素有抗性。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中β-內(nèi)酰胺酶抗生素為青霉素或頭孢菌素。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中微生物的抗生素抗性是由于編碼酶的基因的擴增所致。
5．一種選擇性抑制抗生素抗性革蘭氏陰性微生物的增殖的方法，包括將含微生物的樣本與有效量的前體藥物接觸，這種前體藥物被一種酶選擇性地轉(zhuǎn)化為毒素，這種酶的超量表達賦予微生物抗生素抗性。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中微生物對β-內(nèi)酰胺酶抗生素有抗性。
7．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中β-內(nèi)酰胺酶抗生素為青霉素或頭孢菌素。
8．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中微生物的抗生素抗性是由于編碼酶的基因的擴增所致。
9．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中前體藥物來源于選自絲裂霉素、阿霉素、阿霉素和氮芥的這組細胞毒分子。
10．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中前體藥物具有以下結(jié)構(gòu) 其中R為具有至少一個選自氨基、羧基和羥基的官能團的連接化合物。
11．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中前體藥物具有以下結(jié)構(gòu) 其中Q為氫、常用于頭孢菌素合成的氨基保護基團、或已知的7-?；被^孢菌素抗生素的?；鶊F；L為直接鍵或-S-(CH2)n-；R是一種當從上述頭孢菌素-前體藥物釋放時能對細胞產(chǎn)生細胞毒作用的試劑；n為2、3或4；并且m為0或1，條件是，當L為直接鍵時，m為1；或其藥學上可接受的鹽。
12．一種逆轉(zhuǎn)微生物中的抗生素抗性的方法，此方法包括將這種微生物與有效量的試劑接觸，這種試劑是一種酶的選擇性底物，所述酶是被超量表達的并且賦予這種微生物抗生素抗性。
13．一種抑制受試驗者中抗生素抗性革蘭氏陰性微生物的生長的方法，包括施用有效量的選自下列前體藥物組的化合物，該前體藥物來源于選自絲裂霉素、阿霉素、阿霉素和氮芥的這組細胞毒分子；具有以下結(jié)構(gòu)的化合物 其中R為具有至少一個選自氨基、羧基和羥基的官能團的連接化合物，或者具有下列結(jié)構(gòu)的化合物 其中Q為氫、常用于頭孢菌素合成的氨基保護基團、或已知的7-?；被^孢菌素抗生素的?；鶊F；L為直接鍵或-S-(CH2)n-；R是一種當從上述頭孢菌素-前體藥物釋放時能對細胞產(chǎn)生細胞毒作用的試劑；n為2、3或4；并且m為0或1，條件是，當L為直接鍵時，m為1；或其藥學上可接受的鹽。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中微生物對β-內(nèi)酰胺酶抗生素有抗性。
15．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中β-內(nèi)酰胺酶抗生素為青霉素或頭孢菌素。
16．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中微生物的抗生素抗性是由于編碼酶的基因的擴增所致。
17．一種具有以下結(jié)構(gòu)的化合物 其中Q為氫、常用于頭孢茵素合成的氨基保護基團、或已知的7-?；被^孢菌素抗生素的?；鶊F；L為直接鍵或-S-(CH2)n-；R是一種當從上述頭孢菌素-前體藥物釋放時能對細胞產(chǎn)生細胞毒作用的試劑；n為2、3或4；并且m為0或1，條件是，當L為直接鍵時，m為1；或其藥學上可接受的鹽。
18．一種藥物組合物，它包括權(quán)利要求17的化合物和藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將有毒的抗代謝物導向革蘭氏陰性菌感染的方法。它提供了一種利用主要的疾病抗性機制以局部激活這些藥物和抑制微生物的抗性表型的方法。本發(fā)明還提供了選擇抗生素敏感性的方法,由于生物體可能抵抗前體藥物的可能機制是通過喪失酶活性,這就使細菌對抗生素再次敏感。
文檔編號A61P31/04GK1285745SQ98813132
公開日2001年2月28日 申請日期1998年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月23日
發(fā)明者H·M·施帕德 申請人:新生物生物公司