專利名稱：哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子樣多肽－10的制作方法
背景技術(shù)：
激素和多肽生長(zhǎng)因子調(diào)控多細(xì)胞生物的細(xì)胞增殖和分化。這些可擴(kuò)散分子使細(xì)胞相互交流并一齊作用以形成細(xì)胞和器官，及修復(fù)和再生損傷組織。激素和生長(zhǎng)因子的例子包括類固醇激素(如雌激素、睪丸素)、甲狀旁腺激素、促卵泡激素、白細(xì)胞介素、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)和降鈣素。
激素和生長(zhǎng)因子通過(guò)結(jié)合蛋白質(zhì)影響細(xì)胞代謝。蛋白質(zhì)可以是與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)的整合膜蛋白，諸如第二信使系統(tǒng)。其它類的蛋白質(zhì)是可溶性分子。
尤其令人感興趣的是細(xì)胞因子，即促進(jìn)細(xì)胞增殖和／或分化的分子。細(xì)胞因子的例子包括促紅細(xì)胞生成素(EPO)，它刺激紅細(xì)胞的發(fā)育；血小板生成素(TPO)，它刺激巨核細(xì)胞譜系細(xì)胞的發(fā)育；及粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，它刺激嗜中性粒細(xì)胞的發(fā)育。這些細(xì)胞因子有助于恢復(fù)貧血癥病人或接受癌癥化療病人體內(nèi)正常的血細(xì)胞水平。這些細(xì)胞因子已經(jīng)證實(shí)的體內(nèi)活性說(shuō)明了其它細(xì)胞因子、細(xì)胞因子興奮劑及細(xì)胞因子拮抗物的巨大臨床潛力和對(duì)它們的需求。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明通過(guò)提供新多肽及相關(guān)組合物和方法來(lái)滿足此需求。一方面，本發(fā)明提供了編碼被稱為Zcyto10之哺乳動(dòng)物四α-螺旋細(xì)胞因子的分離多核苷酸。人Zcyto10多肽包括如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中所示之帶起始甲硫氨酸的176個(gè)氨基酸的序列。現(xiàn)認(rèn)為氨基酸殘基1-24是信號(hào)序列，包含第25位殘基(亮氨酸)至176位氨基酸殘基(谷氨酸)、由SEQ ID NO12所限定的氨基酸序列代表成熟Zcyto10多肽。本發(fā)明的另一實(shí)施方案由SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的序列所限定。SEQ ID NO4的多肽包括151個(gè)氨基酸殘基，其中第1-24位氨基酸含信號(hào)序列，成熟序列包括也由SEQ ID NO13限定的第25位氨基酸殘基(亮氨酸)至第151位氨基酸(谷氨酸)。另一活性變體包括SEQ ID NO2中第33位氨基酸殘基(半胱氨酸)至第176位氨基酸殘基。該變體也由SEQ ID NO26限定。
小鼠Zcyto10也是包括如SEQ ID NO18和19所限定之176個(gè)氨基酸殘基的多肽。小鼠Zcyto10具有從SEQ ID NO19的第1位氨基酸殘基甲硫氨酸延伸至并包括第24位氨基酸殘基甘氨酸的信號(hào)序列。因而，成熟小鼠Zcyto10從SEQ ID NO19的第25位氨基酸殘基亮氨酸延伸至并包括第176位氨基酸殘基亮氨酸，也由SEQ ID NO20所限定。另一活性變體被認(rèn)為自SEQ ID NO19的第33位氨基酸半胱氨酸延伸至第176位氨基酸。該變體也由SEQ ID NO25確定。在另外的實(shí)施方案中，該多肽進(jìn)一步包括親和標(biāo)志。
SEQ ID NO33和34表示小鼠Zcyto10的一種變體。該變體為154個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)，并具有從SEQ ID NO34第1位氨基酸殘基甲硫氨酸延伸至并包括第24位氨基酸殘基甘氨酸的信號(hào)序列。因而，成熟序列從SEQ ID NO34的第25位氨基酸殘基亮氨酸延伸至并包括第154位氨基酸殘基亮氨酸。成熟序列也用SEQ ID NO35表示。
本發(fā)明的第二方面提供了表達(dá)載體，其中含(a)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；(b)編碼Zcyto10多肽的DNA區(qū)段，和(c)轉(zhuǎn)錄終止子，其中啟動(dòng)子、DNA區(qū)段和終止子有效連接。
本發(fā)明的第三方面提供了已引入如上所述表達(dá)載體的人工培養(yǎng)真核或原核細(xì)胞，其中所說(shuō)細(xì)胞表達(dá)該DNA區(qū)段所編碼的多肽。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了基本上由通過(guò)肽鍵連接之第一部分和第二部分組成的嵌合多肽。該嵌合多肽的第一部分基本上由以下組成(a)如SEQ ID NO2中所示的Zcyto10多肽；(b)SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO34或SEQ ID NO35的等位變體；和(c)與(a)或(b)至少90％相同的蛋白質(zhì)多肽。嵌合多肽的第二部分基本上由諸如親和標(biāo)志之類的另一多肽組成。某實(shí)施方案中，親和標(biāo)志是免疫球蛋白Fc多肽。本發(fā)明還提供編碼嵌合多肽的表達(dá)載體及被轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生嵌合多肽的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供了能特異結(jié)合如上所公開(kāi)Zcyto10多肽的抗體，以及能中和抗Zcyto10多肽抗體的抗獨(dú)特型抗體。
本發(fā)明的另一方面提供了含與藥用可接受載體聯(lián)合之純化Zcyto10多肽的藥物組合物。如本文所進(jìn)一步論述的，在特征在于不適當(dāng)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化或細(xì)胞因子產(chǎn)生的紊亂的預(yù)防和治療中，這樣的組合物可有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化或細(xì)胞因子產(chǎn)生。更特異的是，Zcyto10多肽可通過(guò)抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答而有助于自身免疫疾病的預(yù)防和治療?？捎肸cyto10治療的自身免疫疾病包括IDDM、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等等。同樣，本發(fā)明的Zcyto10多肽可有助于抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。
本發(fā)明的Zcyto10多肽還可刺激免疫系統(tǒng)以更好地抵御微生物或病毒感染。尤其是，可系統(tǒng)性服用Zcyto10以提高個(gè)體的血小板產(chǎn)量。此外，本發(fā)明的Zcyto10多肽可用于氣管特異或氣管支氣管特異的應(yīng)用中，諸如用于氣管支氣管上皮或其基底細(xì)胞的維持或傷口修復(fù)中，用于調(diào)節(jié)粘液產(chǎn)生或殘?jiān)恼忱w毛清除中或用于哮喘、支氣管炎或氣管支氣管道其它疾病的治療中。它還可增強(qiáng)傷口愈合及促進(jìn)受影響組織的再生，尤其有助于牙周疾病的治療。此外，Zcyto10多肽可用于治療皮膚病，大體上有諸如牛皮癬、濕疹和干皮病。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及具Zcyto10多肽帶表位部分之氨基酸序列的肽或多肽，該Zcyto10多肽具有上述氨基酸序列。盡管長(zhǎng)達(dá)并包括上述本發(fā)明多肽整個(gè)氨基酸序列的任何長(zhǎng)度帶表位多肽也包括于本發(fā)明中，但具本發(fā)明Zcyto10多肽帶表位部分的氨基酸序列的肽或多肽包括具至少9個(gè)，優(yōu)選至少15個(gè)，更優(yōu)選至少30-50個(gè)氨基酸的多肽部分。還要求保護(hù)的是任何與另一多肽或載體分子融合的這些多肽。這樣的表位變體包括但不局限于SEQ ID NO25-32。自Zcyto10這些帶表位部分產(chǎn)生的抗體可用于從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化Zcyto10。
參照以下詳述和附圖
，本發(fā)明的這些和其它方面將更加明顯。發(fā)明詳述此文所引用的所有參考文獻(xiàn)均全部引用作為參考。
在詳述本發(fā)明之前，定義以下術(shù)語(yǔ)有助于對(duì)其的理解術(shù)語(yǔ)“親和標(biāo)記”在此用于指能附著到第二種多肽上以利于第二種多肽的純化和檢測(cè)或者為第二種多肽與底物的結(jié)合提供位點(diǎn)的多肽片段。原則上，可得到抗體或其它特異結(jié)合劑的任何肽或蛋白質(zhì)都可用作親和標(biāo)記。親和標(biāo)記包括多聚組氨酸片段、蛋白A[Nilsson等人，EMBO J．41075(1985)；Nilsson等人，酶學(xué)方法，1983(1991)]、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶[Smith和Johnson，基因6731(1988)]、谷氨酸-谷氨酸親和標(biāo)記[Grussenmeyer等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)827952-4(1985)]、P物質(zhì)、FlagTM肽[Hopp等人，生物技術(shù)學(xué)61204-1210(1988)]、鏈霉親和素結(jié)合肽、或其它抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通常參閱Ford等人，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化295-107(1991)。編碼親和標(biāo)記的DNA可從商品供應(yīng)商處購(gòu)得(如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。
術(shù)語(yǔ)“等位變體”在此用于指一個(gè)基因占據(jù)相同染色體位點(diǎn)的兩種或多種變換形式中的任一種。等位變異是通過(guò)突變自然發(fā)生的，并可能導(dǎo)致種群內(nèi)的表型多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?所編碼多肽無(wú)變化)或編碼具有改變了的氨基酸序列的多肽。等位變體一詞在本文中也用于指由基因的等位變體編碼的蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“氨基末端”和“羧基末端”在此用于表示多肽中的位置。在內(nèi)容允許之處，這些術(shù)語(yǔ)用于表示參照某一多肽特定序列或部分的接近度或相對(duì)位置。例如，位于多肽中參照序列羧基端的某序列即是在參照序列羧基末端附近，但不必在完整多肽的羧基末端。
術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)物／反互補(bǔ)物對(duì)”表示在適當(dāng)條件下形成非共價(jià)結(jié)合的穩(wěn)定對(duì)的不相同部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或鏈霉親和素)是互補(bǔ)物／反互補(bǔ)物對(duì)的典型成員。其它例子的互補(bǔ)物／反互補(bǔ)物對(duì)包括受體／配體對(duì)、抗體／抗原(或半抗原或表位)對(duì)、有義／反義多核苷酸對(duì)，等等。在需要隨后解離的互補(bǔ)物／反互補(bǔ)物對(duì)中，優(yōu)選互補(bǔ)物／反互補(bǔ)物對(duì)的結(jié)合親和力小于109M-1。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸分子的互補(bǔ)物”是具有與參照序列反向互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG 3′與5′CCCGTGCAT3′是互補(bǔ)的。
術(shù)語(yǔ)“毗連序列”表示具有與另一多核苷酸相同或互補(bǔ)之鄰接序列的多核苷酸。鄰接序列被稱為與所給多核苷酸序列的一段全部或該多核苷酸部分“重疊”。例如，多核苷酸序列5′-ATGGCTTAGCTT-3′的代表性毗連序列是5′-TAGCTTgagtct-3′和3′-gtcgacTACCGA-5′。
術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)并核苷酸序列”表示包括一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)并密碼子(與編碼多肽的參照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。簡(jiǎn)并密碼子包括不同的核苷酸三聯(lián)體，但編碼相同的氨基酸殘基(即，GAU和GAC三聯(lián)體均編碼天冬氨酸)。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”用于表示含與用于轉(zhuǎn)錄的附加片段有效連接的目的多肽編碼片段的線性或環(huán)狀DNA分子。這些附加片段包括啟動(dòng)子和終止子序列，還可包括一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)，等等。表達(dá)載體通常來(lái)源于質(zhì)?；虿《綝NA，或可能兩者的成分都包括。
術(shù)語(yǔ)“分離”當(dāng)用于多核苷酸分子時(shí)，是指多核苷酸分子已從天然遺傳環(huán)境中脫離，并因此去掉了其它多余的或不想要的編碼序列，處于一種適用于基因工程化蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)的形式。這樣的分離分子是那些脫離其天然環(huán)境的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離DNA分子無(wú)通常相關(guān)的其它基因，但可包括天然存在的5′和3′不翻譯區(qū)，諸如啟動(dòng)子和終止子。相關(guān)區(qū)域的鑒定對(duì)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明顯的[例如參閱，Dynan和Tijan，自然316774-78(1985)]。
“分離”的多肽或蛋白質(zhì)是處于其天然環(huán)境之外的條件下的多肽和蛋白質(zhì)，例如從血液和動(dòng)物組織中分離的多肽或蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的形式中，分離多肽基本上無(wú)其它多肽，尤其是動(dòng)物來(lái)源的其它多肽。優(yōu)選提供高純化形式的多肽，即純度超過(guò)95％，更優(yōu)選純度超過(guò)99％。應(yīng)用于本文中時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離的”不排除相同多肽以其它物理形式存在，如二聚體或者糖基化的或衍生的形式。
術(shù)語(yǔ)“有效連接”在指DNA片段時(shí)，表示片段被適當(dāng)排列以使其功能與目的相一致，如轉(zhuǎn)錄起始于啟動(dòng)子并貫穿編碼序列進(jìn)行到終止子。
術(shù)語(yǔ)“正同系物(ortholog)”表示得自一個(gè)物種、為另一物種的多肽或蛋白質(zhì)的功能對(duì)應(yīng)物的多肽或蛋白質(zhì)。正同系物之間的序列差異是物種形成的結(jié)果。
“副同系物(parolog)”是由一種生物體產(chǎn)生的相互區(qū)別但又結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)。副同系物被認(rèn)為是通過(guò)基因重復(fù)產(chǎn)生的。例如α-珠蛋白、β-珠蛋白和肌紅蛋白互為副同系物。
“多核苷酸”為從5′末端讀至3′末端的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈多聚體。多核苷酸包括RNA和DNA，可分離自天然來(lái)源，可體外合成，或結(jié)合天然分子與合成分子而制成。多核苷酸的大小表示為堿基對(duì)(縮寫(xiě)“bp”)、核苷酸(“nt”)或千堿基(“kb”)。只要內(nèi)容允許，后兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可描述單鏈或雙鏈的多核苷酸。當(dāng)該術(shù)語(yǔ)用于指雙鏈分子時(shí)，表示的是全長(zhǎng)，應(yīng)理解為等同于術(shù)語(yǔ)“堿基對(duì)”。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到雙鏈多核苷酸的兩條鏈長(zhǎng)度可能稍有不同，其末端可能因酶切而成交錯(cuò)切口狀；因而雙鏈多核苷酸分子中的所有核苷酸不一定配對(duì)。這些未配對(duì)的末端長(zhǎng)度一般不超過(guò)20nt。
“多肽”是天然產(chǎn)生的或合成的以肽鍵連接的氨基酸殘基多聚體。不足約10個(gè)氨基酸殘基的多肽通常稱為“肽”。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”在此用其本領(lǐng)域公認(rèn)的含義，表示含有可結(jié)合RNA聚合酶并起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列的基因部分。啟動(dòng)子序列常發(fā)現(xiàn)位于基因的5′非編碼區(qū)，但并不總是這樣。
“蛋白質(zhì)”是包含一條或多條多肽鏈的大分子。蛋白質(zhì)也可含非肽成分，如糖基。糖和其它非肽取代基可由產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞加在蛋白質(zhì)上，且在不同細(xì)胞類型中各不相同。蛋白質(zhì)在本文以其氨基酸骨架結(jié)構(gòu)表示；取代基如糖基通常不特別指明，但仍可能存在。
術(shù)語(yǔ)“受體”表示可與生物活性分子(即配體)相結(jié)合并介導(dǎo)配體作用于細(xì)胞上的細(xì)胞相關(guān)蛋白。膜結(jié)合受體特征在于有多結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，包括胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域及一般涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞內(nèi)效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域。配體與受體結(jié)合導(dǎo)致了受體的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而引起效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞中其它分子間的相互作用。這一相互作用依次導(dǎo)致細(xì)胞代謝的改變。與受體-配體相互作用有關(guān)聯(lián)的代謝活動(dòng)包括基因轉(zhuǎn)錄、磷酸化、去磷酸化、環(huán)腺苷酸產(chǎn)量的提高、細(xì)胞鈣的轉(zhuǎn)移、膜脂的移動(dòng)、細(xì)胞粘附、肌醇脂的水解和磷脂的水解。一般說(shuō)來(lái)，受體可以是膜結(jié)合的、胞質(zhì)的或核的；單體的(如促甲狀腺素受體、β-腎上腺素能受體)或多聚體的(如PDGF受體、生長(zhǎng)激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、促紅細(xì)胞生成素受體和IL-6受體)。
術(shù)語(yǔ)“分泌信號(hào)序列”表示編碼多肽(“分泌肽”)的DNA序列，所述多肽作為一個(gè)更大多肽的組分，可指導(dǎo)該更大的多肽穿過(guò)合成它的細(xì)胞的分泌途徑。在通過(guò)分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中該更大的多肽通常被裂解以去除分泌肽。
術(shù)語(yǔ)“剪接變體”在此用于表示由基因轉(zhuǎn)錄出來(lái)的RNA的諸可互換形式。剪接變體一般通過(guò)利用轉(zhuǎn)錄RNA分子內(nèi)(或較少情況下是分別轉(zhuǎn)錄的RNA分子之間)的可互換剪接位點(diǎn)而天然產(chǎn)生，并可導(dǎo)致由同一基因轉(zhuǎn)錄好幾種mRNA。剪接變體可編碼含不同氨基酸序列的多肽。術(shù)語(yǔ)剪接變體用在本文中還表示由基因轉(zhuǎn)錄出來(lái)的mRNA的剪接變體編碼的蛋白質(zhì)。
用不精確的分析方法(如，凝膠電泳)測(cè)定的多聚體分子量和長(zhǎng)度應(yīng)理解為近似值。當(dāng)該值表達(dá)為“大約”X或“近似”X時(shí)，所說(shuō)的X值應(yīng)理解為精確至±10％。
Zcyto10的螺旋D中的保守氨基酸可用作鑒別新家族成員的工具。螺旋D是最高度保守的，與IL-10的螺旋D具有約32％的相同性。例如，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)可用于擴(kuò)增編碼獲自種種組織來(lái)源或細(xì)胞系之RNA保守區(qū)(以上結(jié)構(gòu)域、區(qū)域或基元)的序列。尤其是，設(shè)計(jì)自Zcyto10序列的高度簡(jiǎn)并引物可用于此目的。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，分離的多核苷酸可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO18、SEQ ID NO33或其互補(bǔ)序列的相似大小區(qū)域雜交。一般說(shuō)來(lái)，嚴(yán)謹(jǐn)條件選擇為在確定的離子強(qiáng)度和pH下較該特異序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5℃。Tm是50％靶序列與完全匹配探針雜交的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和pH下)。一般的嚴(yán)謹(jǐn)條件是鹽濃度約0．02M或pH低于7及溫度至少約60℃。如前面所提及，本發(fā)明的分離多核苷酸包括DNA和RNA。用于分離DNA和RNA的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。用鹽酸胍提取隨后以氯化銫梯度離心分離可制備總RNA[Chirgwin等人，生物化學(xué)1852-94，(1979)]。poly(A)+RNA可用Aviv和Leder，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)691408-1412(1972)的方法制備自總RNA?；パa(bǔ)DNA(cDNA)可用已知方法制備自poly(A)+RNA。然后可用例如雜交或PCR鑒別和分離編碼Zcyto10多肽的多核苷酸。
此外，本發(fā)明的多核苷酸可用DNA合成儀合成。通常所選方法是亞磷酰胺方法。如果諸如基因或基因片段合成之類應(yīng)用需要化學(xué)合成的雙鏈DNA，那么分別制備各互補(bǔ)鏈。短基因(60-80bp)的生產(chǎn)在技術(shù)上是簡(jiǎn)單的，可通過(guò)合成互補(bǔ)鏈然后將其退火而完成。然而，對(duì)于較長(zhǎng)基因(＞300bp)的生產(chǎn)，必須實(shí)行特殊的策略，因?yàn)樵贒NA化學(xué)合成中各循環(huán)的偶聯(lián)效率很少能達(dá)到100％。為了克服這一問(wèn)題，合成的基因(雙鏈)由長(zhǎng)度為20-100個(gè)核苷酸的單鏈片段以模塊形式裝配成。參閱Glick，Bernard R．和Jack J．Pasternak，分子生物技術(shù)學(xué)，重組DNA的原理及應(yīng)用(ASM出版社，華盛頓特區(qū)，1994)，Itakura，K等人，合成寡核苷酸的合成和用途，生物化學(xué)年鑒(Annu．Rev．Biochem．)53323-356(1984)，和Climie，S．等人，胸苷酸合成酶基因的化學(xué)合成，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)87633-637(1990)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，公開(kāi)于SEQ ID NO1，2，3和4中的序列代表了人的兩個(gè)等位基因，而SEQ ID NO18，19，33和34代表了小鼠的兩個(gè)等位基因。可按標(biāo)準(zhǔn)步驟探測(cè)來(lái)自不同個(gè)體的cDNA或基因組文庫(kù)而克隆這些序列的其它等位變體?？砂礃?biāo)準(zhǔn)步驟通過(guò)探測(cè)來(lái)自不同個(gè)體的cDNA或基因組文庫(kù)而克隆該序列的等位變體。SEQ IDNO1中所示DNA序列的等位變體，包括那些含沉默突變的變體及其中突變導(dǎo)致氨基酸序列改變的變體，均在本發(fā)明范圍內(nèi)，作為SEQ IDNO2等位變體的蛋白質(zhì)也一樣。產(chǎn)生自其它方式剪接mRNA的保留了Zcyto10多肽特性的cDNA，也包括于本發(fā)明范圍內(nèi)，由這些cDNA和mRNA所編碼的多肽也一樣。按本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)步驟通過(guò)探測(cè)來(lái)自不同個(gè)體或組織的cDNA或基因組文庫(kù)，可克隆這些序列的等位變體和剪接變體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了來(lái)自其它物種的相應(yīng)蛋白質(zhì)和多核苷酸(“物種正同系物”)。目前特別感興趣的是來(lái)自其它哺乳動(dòng)物的Zcyto10多肽，包括鼠的、豬的、綿羊的、牛的、狗的、貓的、馬的及其它靈長(zhǎng)類的Zcyto10多肽?？蓪⒈景l(fā)明提供的信息和組合物與常規(guī)克隆技術(shù)聯(lián)合起來(lái)克隆人Zcyto10蛋白質(zhì)的物種正同系物。例如，可用獲自表達(dá)該蛋白質(zhì)的組織或細(xì)胞類型的mRNA克隆cDNA。可用按本文公開(kāi)序列設(shè)計(jì)的探針，通過(guò)探測(cè)Northern印跡鑒定mRNA的合適來(lái)源。隨后從陽(yáng)性組織或細(xì)胞系的mRNA制備文庫(kù)。然后可用各種方法分離編碼蛋白質(zhì)的cDNA，如用人或小鼠整個(gè)或部分cDNA進(jìn)行探測(cè)，或用基于公開(kāi)序列的一套或多套簡(jiǎn)并探針進(jìn)行探測(cè)。cDNA也可用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或PCR(Mullis等人，美國(guó)專利第4，683，202號(hào))方法，使用按本文公開(kāi)序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行克隆。在另外的方法中，可利用cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，并用該蛋白質(zhì)的抗體檢測(cè)目的cDNA的表達(dá)。相似技術(shù)也可用于基因組克隆的分離上。正如使用和要求專利保護(hù)的，“編碼多肽的分離多核苷酸，所說(shuō)的多核苷酸由SEQ ID NO2、4、12、13、19、20、25、26、34和35表示”這一措詞意指包括這些多肽的所有等位變體和物種正同系物。
本發(fā)明還提供了與SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)多肽和其物種正同系物基本相同的分離蛋白質(zhì)多肽。“分離的”意指存在于其天然環(huán)境之外的條件下的蛋白質(zhì)或多肽，如脫離自血液和動(dòng)物組織。在一優(yōu)選形式中，分離的多肽基本上無(wú)其它多肽，尤其是動(dòng)物來(lái)源的其它多肽。優(yōu)選提供的多肽是高度純化形式的，即純度高于95％，更優(yōu)選純度超過(guò)99％。本文所用的“基本相同”一詞意指多肽與SEQ ID NO2、4、12、13、19、20、25、26、34和35所示序列或其物種正同系物有50％、優(yōu)選60％、更優(yōu)選至少80％相同。這樣的多肽優(yōu)選與SEQ ID NO2或其物種正同系物有至少90％相同，最優(yōu)選95％或更多相同。序列相同性百分率可用常規(guī)方法測(cè)定。參閱，例如，A1tschul等人，Bull．Math．Bio．48603-616(1986)和Henikoff和Henikoff，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)8910915-10919(1992)。簡(jiǎn)短地說(shuō)，就是用缺口開(kāi)放罰分為10、缺口延伸罰分為1及如表1所示(氨基酸用標(biāo)準(zhǔn)單字母符號(hào)表示)Henikoff和Henikoff(同上)的“blossom62”評(píng)分矩陣，將兩個(gè)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，以使比對(duì)評(píng)分最佳。相同性百分率計(jì)算如下 表1A RNDCQEGHILKMFPSTWYVA 4R -1 5N -2 06D -2 -216C 0 -3 -3 -39Q -1 100 -35E -1 002 -425G 0 -20 -1 -3 -2 -26H -2 01 -1 -300 -28I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -34L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -324K -1 20 -1 -311 -2 -1 -3． -25M -1 -1 -2 -3 -10 -2 -3 -212 -15F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -100 -306P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -47S 1 -110 -1000 -1 -2 -20 -1 -2 -14T 0 -10 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -115W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -11 -4 -3 -211Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -32 -1 -1 -2 -13 -3 -2 -2 27V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -331 -21 -1 -2 -20-3 -14利用如上所公開(kāi)的比率通過(guò)相似方法測(cè)定多核苷酸分子間的序列相同性。
變體Zcyto10多肽或基本相同的蛋白質(zhì)和多肽特征是具一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、刪除或添加。這些改變優(yōu)選較小性質(zhì)的改變，即保守氨基酸取代(見(jiàn)表2)和其它不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)或多肽折疊或活性的取代；小的刪除，一般約1-30個(gè)氨基酸的刪除；及小的氨基或羧基端延伸，諸如氨基端甲硫氨酸殘基、高達(dá)約20-25個(gè)殘基長(zhǎng)的小連接肽，或利于純化的小延伸(親和標(biāo)記)，諸如多聚組氨酸片段、蛋白A[Nilsson等人，EMBO J．41075(1985)；Nilsson等人，酶學(xué)方法，1983(1991)]、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶[Smith和Johnson，基因6731(1988)]，或其它抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通常參閱Ford等人，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化295-107(1991)。編碼親和標(biāo)記的DNA可購(gòu)自商品供應(yīng)商處(如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。表2保守氨基酸取代堿性的精氨酸賴氨酸組氨酸酸性的谷氨酸天冬氨酸極性的谷氨酰胺天冬酰胺疏水的亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族的 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的 甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸本發(fā)明進(jìn)一步提供了各種其它多肽融合體(及含一個(gè)或多個(gè)多肽融合體的相關(guān)多聚化蛋白質(zhì))。例如，可按美國(guó)專利第5，155，027和5，567，584號(hào)所公開(kāi)的將Zcyto10多肽制備成與二聚化蛋白質(zhì)的融合體。在該方面的優(yōu)選二聚化蛋白質(zhì)包括免疫球蛋白恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。免疫球蛋白-Zcyto10多肽融合體可于基因工程化細(xì)胞中表達(dá)(以產(chǎn)生各種多聚體Zcyto10類似物)?？蓪⑤o助結(jié)構(gòu)域融合至Zcyto10多肽上，以將它們定向于特異細(xì)胞、組織、或大分子(如膠原)。例如，通過(guò)將多肽與特異結(jié)合靶細(xì)胞表面受體之配體融合，可將Zcyto10多肽或蛋白質(zhì)定向于預(yù)定細(xì)胞類型。以此方式，可將多肽和蛋白質(zhì)定向用于治療或診斷目的?？蓪cyto10多肽與兩個(gè)或多個(gè)部分融合，諸如用于純化的親和標(biāo)記和定向結(jié)構(gòu)域。多肽融合體還可包括一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)，尤其是在結(jié)構(gòu)域之間的切割位點(diǎn)。參閱，Tuan等人，結(jié)締組織研究(Connective Tissue Research)341-9(1996)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以包括非天然存在的氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸包括不局限于反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲撐脯氨酸、順式-4-羥脯氨酸、反式-4-羥脯氨酸、N-甲基甘氨酸、別蘇氨酸、甲基蘇氨酸、羥乙基半胱氨酸、羥乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、六氫吡啶羧酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正纈氨酸、2-氮雜苯丙氨酸(2-azaphenylalanine)、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本領(lǐng)域已知幾種方法可用于將非天然存在氨基酸殘基摻入蛋白質(zhì)。例如，可利用一個(gè)體外系統(tǒng)，其中無(wú)義突變均用化學(xué)氨?；种谱觮RNA進(jìn)行抑制。合成氨基酸和氨酰tRNA的方法為本領(lǐng)域內(nèi)已知。
本發(fā)明多肽中的必需氨基酸可按本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變進(jìn)行鑒定[Cunningham和Wells，科學(xué)2441081-1085(1989)；Bass等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)884498-4502(1991)]。在后一技術(shù)中，于分子中的每個(gè)殘基處導(dǎo)入單個(gè)丙氨酸突變，檢驗(yàn)所得突變分子的生物學(xué)活性(如配基結(jié)合和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))以鑒定對(duì)分子活性比較關(guān)鍵的氨基酸殘基。也可通過(guò)對(duì)諸如核磁共振、晶體學(xué)技術(shù)或光親和標(biāo)記之類的技術(shù)確定的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析而測(cè)定配體-蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)。參閱，例如，de Vos等人，科學(xué)255306-312(1992)；Smith等，分子生物學(xué)雜志224899-904(1992)；Wlodaver等，F(xiàn)EBS Lett．30959-64(1992)。必需氨基酸也可從與相關(guān)蛋白質(zhì)的同源性分析推斷出。
可用已知誘變和篩選方法制備并檢驗(yàn)多重氨基酸取代，如Reidhaar-Olson和Sauer所公開(kāi)的方法(科學(xué)24153-57，1988)或Bowie和Sauer所公開(kāi)的方法(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)862152-2156，1989)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些作者公開(kāi)的方法是同時(shí)使多肽中的兩個(gè)或多個(gè)位置隨機(jī)化，選擇功能性多肽，然后測(cè)序經(jīng)誘變的多肽以確定每個(gè)位置處的容許取代范圍。其它可用的方法包括噬菌體展示(如Lowman等，生物化學(xué)3010832-10837(1991)；Ladner等，美國(guó)專利號(hào)5，223，409；Huse，WIPO公開(kāi)WO92／06204)和區(qū)域定向誘變(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA7127，1988)。
如上所公開(kāi)的誘變方法可結(jié)合高容量篩選方法以檢測(cè)宿主細(xì)胞中克隆的誘變蛋白質(zhì)的活性。在這一點(diǎn)上優(yōu)選的試驗(yàn)包括細(xì)胞增殖試驗(yàn)和基于生物傳感器的配體結(jié)合試驗(yàn)，以下對(duì)這些試驗(yàn)有描述。編碼活性蛋白或其部分(如配體結(jié)合片段)的誘變DNA分子可從宿主細(xì)胞中回收并用現(xiàn)代裝置迅速測(cè)序。這些方法可快速測(cè)定目的多肽中各氨基酸殘基的重要性，并可適用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。
用上述方法，本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員能制備與SEQ ID NO2、4、12、13、19、20、25、26、34和35或其等位變體基本相同并保留野生型蛋白質(zhì)特性的種種多肽。正如本文所表達(dá)和聲稱的，“SEQ ID NO2表示的多肽”包括該多肽的所有等位變體和物種正同系物。
本發(fā)明的蛋白多肽，包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段(如配體結(jié)合片段)及融合多肽均可按常規(guī)技術(shù)在基因工程化宿主細(xì)胞中生產(chǎn)。合適的宿主細(xì)胞是那些能被外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染并能培養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、真菌細(xì)胞及培養(yǎng)的高等真核細(xì)胞。優(yōu)選真核細(xì)胞，尤其是多細(xì)胞生物的培養(yǎng)細(xì)胞。操作克隆DNA分子和將外源DNA引入各種宿主細(xì)胞的技術(shù)公開(kāi)于以下文獻(xiàn)中Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989)，及Ausubel等人，同上。
本發(fā)明的多核苷酸，通常為cDNA序列，編碼上述多肽。編碼本發(fā)明多肽的DNA序列由一系列密碼子組成，多肽的每一氨基酸殘基均由密碼子編碼，每個(gè)密碼子由3個(gè)核苷酸組成。氨基酸殘基由如下相應(yīng)密碼子編碼。
丙氨酸(Ala)由GCA、GCC、GCG或GCT編碼；半胱氨酸(Cys)由TGC或TGT編碼；天冬氨酸(Asp)由GAC或GAT編碼；谷氨酸(Glu)由GAA或GAG編碼；苯丙氨酸(Phe)由TTC或TTT編碼；甘氨酸(Gly)由GGA、GGC、GGG或GGT編碼；組氨酸(His)由CAC或CAT編碼；異亮氨酸由ATA、ATC或ATT編碼；賴氨酸(Lys)由AAA或AAG編碼；亮氨酸(Leu)由TTA、TTG、CTA、CTC、CTG或CTT編碼；甲硫氨酸(Met)由ATG編碼；天冬酰胺(Asn)由AAC或AAT編碼；脯氨酸(Pro)由CCA、CCC、CCG或CCT編碼；谷氨酰胺(Gln)由CAA或CAG編碼；精氨酸(Arg)由AGA、AGG、CGA、CGC、CGG或CGT編碼；絲氨酸(Ser)由AGC、AGT、TCA、TCC、TCG或TCT編碼；蘇氨酸(Thr)由ACA、ACC、ACG或ACT編碼；纈氨酸(Val)由GTA、GTC、GTG或GTT編碼；色氨酸(Trp)由TGG編碼；及酪氨酸(Tyr)由TAC或TAT編碼。
根據(jù)本發(fā)明可以認(rèn)識(shí)到，當(dāng)cDNA如上所述要求專利保護(hù)時(shí)，應(yīng)理解為要求專利保護(hù)的是有義鏈、反義鏈及有義和反義鏈通過(guò)各自氫鍵一起退火形成的雙鏈DNA。要求專利保護(hù)的還有編碼本發(fā)明多肽的信使RNA(mRNA)及由上述cDNA所編碼的mRNA。信使RNA(mRNA)用與上文指示的相同密碼子編碼多肽，只是每個(gè)胸苷(T)均被尿苷(U)所取代。
通常，在表達(dá)載體中，編碼Zcyto7多肽的DNA序列與其表達(dá)所需的其它遺傳元件有效連接，所述元件一般包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子。盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)為在某些系統(tǒng)中選擇標(biāo)記可提供于分離載體上，且外源DNA的復(fù)制可通過(guò)整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組而提供，但載體通常還包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記及一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記、載體及其它元件的選擇是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員水平之內(nèi)的常規(guī)設(shè)計(jì)問(wèn)題。許多這些元件在文獻(xiàn)中都有描述，并可購(gòu)自商品供應(yīng)商處。
為了指導(dǎo)Zcyto10多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可在表達(dá)載體中提供分泌信號(hào)序列(也稱前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。分泌信號(hào)序列可以是該蛋白質(zhì)本身的，或可來(lái)自另一分泌蛋白質(zhì)(如t-PA)或從頭合成。分泌信號(hào)序列以正確閱讀框架與Zcyto10 DNA序列連接。盡管某些信號(hào)序列可位于目的DNA序列中的其它位置(參閱，如Welch等人，美國(guó)專利第5，037，743；Holland等人，美國(guó)專利第5，143，830)，但分泌信號(hào)序列通常位于編碼目的多肽之DNA序列的5′端。
將外源DNA引入哺乳類宿主細(xì)胞的方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染[Wigler等人，細(xì)胞14725(1978)；Corsaro和Pearson，體細(xì)胞遺傳學(xué)7603，1981；Graham和Van der Eb，病毒學(xué)52456(1973)]，電穿孔[Neumann等人，EMBO J．1841-845(1982)]，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染[Ausubel等人編，分子生物學(xué)通用手冊(cè)(John Wiley和Sons，Inc．，NY，1987)]，及脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染[Hawley-Nelson等人，F(xiàn)ocus 1573(1993)；Ciccarone等人，F(xiàn)ocus 1580(1993)]。培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞中重組多肽的生產(chǎn)公開(kāi)于如下文獻(xiàn)中Levinson等人，美國(guó)專利第4，713，339號(hào)；Hagen等人，美國(guó)專利號(hào)4，784，950；Palmiter等人，美國(guó)專利號(hào)4，579，821；及Ringold，美國(guó)專利號(hào)4，656，134。合適的培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞包括COS-1(ATCC NO．CRL1650)、COS-7(ATCC NO．CRL1651)、BHK(ATCC NO．CRL1632)、BHK570(ATCC NO．CRL10314)、293[ATCC NO．CRL1573；Graham等人，普通病毒學(xué)雜志(J．Gen．Virol)3659-72(1977)]和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(如CHO-Kl；ATCC NO．CCL61)細(xì)胞系。另外的合適細(xì)胞系在本領(lǐng)域中是已知的，并可獲自公共保藏單位，如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，洛克菲勒，馬里蘭州。一般說(shuō)來(lái)，優(yōu)選強(qiáng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，如來(lái)自SV-40或巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子。參閱如，美國(guó)專利號(hào)4，956，288。其它合適啟動(dòng)子包括來(lái)自金屬硫蛋白基因的啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)4，579，821和4，601 978)和腺病毒主要晚期啟動(dòng)子。
通常利用藥物選擇來(lái)選出已插入外源DNA的培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞。這些細(xì)胞通常稱為“轉(zhuǎn)染子”。已在有選擇劑存在的條件下培養(yǎng)并能將目的基因傳給子代的細(xì)胞稱為“穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子”。優(yōu)選的選擇標(biāo)記是編碼對(duì)抗生素新霉素的抗性的基因。選擇在新霉素型藥物(如G418等等)存在的條件下進(jìn)行。選擇系統(tǒng)也可用于提高目的基因的表達(dá)水平，此過(guò)程稱為“擴(kuò)增”。擴(kuò)增通過(guò)如下過(guò)程進(jìn)行在低水平選擇劑存在的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染子，然后增加選擇劑的量以選擇出產(chǎn)生高水平引入基因之產(chǎn)物的細(xì)胞。優(yōu)選的可擴(kuò)增選擇標(biāo)記是二氫葉酸還原酶，它賦予對(duì)氨甲蝶呤的抗性。其它的藥物抗性基因(如潮霉素抗性、廣譜抗藥性、嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)也可使用。導(dǎo)入改變表型的其它標(biāo)記，如綠色熒光蛋白，或細(xì)胞表面蛋白(如CD4、CD8、MHC Ⅰ類分子)，胎盤(pán)堿性磷酸酶均可用來(lái)通過(guò)FACS分選術(shù)或磁珠分離技術(shù)之類的方法從未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中選出轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
其它高等真核細(xì)胞也可用作宿主，包括昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞和禽細(xì)胞。昆蟲(chóng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及其中外源多肽的生產(chǎn)已公開(kāi)于Guarino等人的美國(guó)專利第5，162，222、Bang等人的美國(guó)專利第4，775，624和WIPO公開(kāi)WO94／06463中。用發(fā)根農(nóng)桿菌作載體在植物細(xì)胞中表達(dá)基因已由Sinkar等人作了回顧[生物科學(xué)雜志(J．Biosci．)(Bangalore)1147-58(1987)]。昆蟲(chóng)細(xì)胞可用桿狀病毒重組體[通常衍生自苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)]感染。見(jiàn)King，L．A．和Possee，R．D．，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室指南(Chapman＆Hall，倫敦)；O′Reilly，D．R．等人，桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(牛津大學(xué)出版社，紐約，1994)；以及Richardson，C．D．編輯，桿狀病毒表達(dá)方案，分子生物學(xué)方法(Humana出版社，Totowa，NJ，1995)。第二種制備重組Zcyto10桿狀病毒的方法應(yīng)用了基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)，該系統(tǒng)綜述于Luckow，V．A．，等人，病毒學(xué)雜志674566-79，1993中。這一應(yīng)用了轉(zhuǎn)移載體的系統(tǒng)在Bac-to-BacTM試劑盒(LifeTechnologies，Rockville，MD)中有售。此系統(tǒng)利用含Tn7轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移載體pFastBaclTM(Life Technologies)以將編碼Zcyto10多肽的DNA轉(zhuǎn)移入作為被稱為“桿?！钡拇筚|(zhì)粒保持于大腸桿菌中的桿狀病毒基因組中。見(jiàn)Hill-Perkins，M．S．和Possee，R．D．，普通病毒學(xué)雜志71971-6，(1990)；Bonning，B．C．等人，普通病毒學(xué)雜志751551-6(1994)；以及Chazenbalk，G．D．和Rapoport，B．，生物化學(xué)雜志2701543-9(1995)。此外，轉(zhuǎn)移載體可包含在所表達(dá)Zcyto10多肽的C-或N-末端融合了表位標(biāo)記(如Glu-Glu表位標(biāo)記)的編碼DNA的框內(nèi)融合體[Grussenmeyer，T．等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)827952-4(1985)]。用本領(lǐng)域已知技術(shù)可將含Zcyto10的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，并篩選出含有指示為重組桿狀病毒的間斷LacZ基因的桿粒。用常規(guī)技術(shù)分離含重組桿狀病毒基因組的桿粒DNA并用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞)。表達(dá)Zcyto10的重組病毒即可產(chǎn)生。用本領(lǐng)域常用方法制備重組病毒原種。
重組病毒可用于感染宿主細(xì)胞，通常是衍生自秋粘蟲(chóng)(草地夜蛾)的細(xì)胞系?？傄?jiàn)，Glick和Pasternak，分子生物技術(shù)學(xué)重組DNA的原理和應(yīng)用，ASM出版社，華盛頓特區(qū)(1994)。另一合適細(xì)胞系是衍生自粉紋夜蛾的High Five OTM細(xì)胞系(Invitrogen)(美國(guó)專利號(hào)5，300，435)。生產(chǎn)商提供的無(wú)血清培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)和維持細(xì)胞。合適的培養(yǎng)基對(duì)于Sf9細(xì)胞是Sf900 ⅡTM(Life Technologies)或ESF 921TM(Expression Systems)；對(duì)于粉紋夜蛾細(xì)胞是Ex-Cell0405TM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)或Express Five OTM(LifeTechnologies)。細(xì)胞從約為2-5×105個(gè)細(xì)胞的接種密度生長(zhǎng)至1-2×106個(gè)細(xì)胞密度時(shí)，以0．1至10(更通常為近3)的感染復(fù)數(shù)(MOI)加入重組病毒原種。所用程序常描述于實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中(King，L．A．和Possee，R．D．，同上；O′Reilly，D．R．等，同上；Richardson，C．D．，同上)。隨后可用本文所述方法從上清中純化出Zcyto10多肽。
真菌細(xì)胞，包括酵母細(xì)胞，尤其是酵母屬的細(xì)胞也可用于本發(fā)明中，如用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)片段或融合多肽。用外源DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞并從中產(chǎn)生重組多肽的方法公開(kāi)于下述文件，例如，Kawasaki，美國(guó)專利號(hào)4，599，311；Kawasaki等，美國(guó)專利號(hào)4，931，373；Brake，美國(guó)專利號(hào)4，870，008；Welch等，美國(guó)專利號(hào)5，037，743；和Murray等，美國(guó)專利號(hào)4，845，075。通過(guò)由選擇標(biāo)記確定的表型，通常是藥物抗性或在缺乏某種特殊養(yǎng)分(如亮氨酸)的條件下生長(zhǎng)的能力，來(lái)選擇出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。用于酵母中的優(yōu)選載體系統(tǒng)是POT1載體系統(tǒng)，公開(kāi)于Kawasaki等人的美國(guó)專利第4，931，373中，該系統(tǒng)可通過(guò)在含葡萄糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而選擇出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。用于酵母中的合適啟動(dòng)子和終止子包括來(lái)自糖酵解基因(見(jiàn)，如，Kawasaki，美國(guó)專利號(hào)4，599，311；Kingsman等人，美國(guó)專利號(hào)4，615，974；和Bitter，美國(guó)專利號(hào)4，977，092)和乙醇脫氫酶基因的啟動(dòng)子和終止子。也可參閱美國(guó)專利第4，990，446號(hào)；第5，063，154號(hào)；第5，139，936號(hào)和第4，661，454號(hào)。本領(lǐng)域已知用于其它酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，所述酵母包括多形漢遜酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、玉蜀黍黑粉菌、巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)、季也蒙畢赤酵母和麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)。參閱，如Gleeson等，普通微生物學(xué)雜志1323459-3465(1986)和Cregg，美國(guó)專利第4，882，279號(hào)?？筛鶕?jù)McKnight等的美國(guó)專利第4，935，349號(hào)的方法利用曲霉屬細(xì)胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃枝頂孢(Acremonium chrysogenum)的方法公開(kāi)于Sumino等人的美國(guó)專利第5，162，228號(hào)中。轉(zhuǎn)化脈孢菌屬的方法公開(kāi)于Lambowitz的美國(guó)專利第4，486，533號(hào)。
用甲醇畢赤酵母作為宿主生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法描述于WIPO公開(kāi)WO97／17450、WO97／17451、WO98／02536、和WO98／02565中。用于轉(zhuǎn)化甲醇畢赤酵母的DNA分子將通常制成雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒，優(yōu)選在轉(zhuǎn)化之前先線性化。為了在甲醇畢赤酵母中生產(chǎn)多肽，優(yōu)選質(zhì)粒中的啟動(dòng)子和終止子為甲醇畢赤酵母內(nèi)基因，如甲醇半赤酵母醇利用基因(AUG1或AUG2)的啟動(dòng)子和終止子。其它有用的啟動(dòng)子包括二羥基丙酮合成酶(DHAS)基因，甲酸脫氫酶(FMD)基因和過(guò)氧化氫酶(CAT)基因的啟動(dòng)子。為了便于DNA整合入宿主染色體，優(yōu)選質(zhì)粒的整個(gè)表達(dá)片段兩側(cè)均為宿主DNA序列。優(yōu)選用于甲醇畢赤酵母的選擇標(biāo)記為甲醇畢赤酵母ADE2基因，它編碼磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC4．1．1．21)，此酶可使得ade2宿主細(xì)胞在缺乏腺嘌呤時(shí)生長(zhǎng)。為了進(jìn)行希望少用甲醇的大批量工業(yè)化生產(chǎn)，優(yōu)選用其中兩個(gè)甲醇利用基因(AUG1和AUG2)均缺失的宿主細(xì)胞。為了生產(chǎn)分泌型蛋白質(zhì)，優(yōu)選液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)有缺陷的宿主細(xì)胞?？衫秒姶┛状龠M(jìn)含目的多肽編碼DNA的質(zhì)粒引入甲醇畢赤酵母細(xì)胞。優(yōu)選用電穿孔方法轉(zhuǎn)化甲醇畢赤酵母細(xì)胞，所用電場(chǎng)為指數(shù)級(jí)衰減的脈沖電場(chǎng)，電場(chǎng)強(qiáng)度為2．5-4．5kV／cm，優(yōu)選約為3．75kV／cm，時(shí)間常數(shù)(τ)為1-40毫秒，最優(yōu)選約20毫秒。
原核宿主細(xì)胞，包括大腸桿菌、芽孢桿菌屬及其它屬的菌株也可用作本發(fā)明的宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化這些宿主并表達(dá)克隆其中的外源DNA的技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知(見(jiàn)，如，Sambrook等，同上)。當(dāng)在諸如大腸桿菌之類的細(xì)菌中表達(dá)Zcyto10多肽時(shí)，該多肽可保留在細(xì)胞質(zhì)中(通常為不溶顆粒)，或可由細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)至周質(zhì)空間中。在前一種情況中，將細(xì)胞裂解，回收顆粒并用如異硫氰酸胍或尿素變性。然后可通過(guò)稀釋變性劑，如對(duì)尿素溶液透析，和結(jié)合使用還原型和氧化型谷胱甘肽，再對(duì)緩沖鹽溶液透析，使變性多肽重新折迭和二聚化。在后一種情況中，多肽可從周質(zhì)間隙中以可溶性有功能形式回收，即通過(guò)破碎細(xì)胞(如通過(guò)超聲處理或滲透休克)以釋放周質(zhì)間隙的內(nèi)容物并回收蛋白質(zhì)而完成，這樣可不必變性和再折疊。
轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞根據(jù)常規(guī)程序培養(yǎng)于含有所選宿主細(xì)胞生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物和其它成分的培養(yǎng)基中。各種合適的培養(yǎng)基，包括已知成分培養(yǎng)基和復(fù)合培養(yǎng)基，在本領(lǐng)域中都是已知的，并通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)。如果需要，培養(yǎng)基中也可包含諸如生長(zhǎng)因子或血清之類的組分。培養(yǎng)基通常將通過(guò)例如藥物選擇或缺少某種必需養(yǎng)分來(lái)選擇含外源導(dǎo)入DNA的細(xì)胞，這種缺少的必需養(yǎng)分可通過(guò)表達(dá)載體上攜帶的或共轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記得到補(bǔ)充。在約25℃-35℃將甲醇畢赤酵母細(xì)胞培養(yǎng)于含足夠碳源、氮源和微量養(yǎng)分的培養(yǎng)基中。用常規(guī)方法向液體培養(yǎng)物中提供足夠通氣量，諸如小搖瓶或發(fā)酵罐噴霧。甲醇畢赤酵母的優(yōu)選培養(yǎng)基是YEPD(2％D-葡萄糖、2％BactoTMPeptone(Difco實(shí)驗(yàn)室，底特律，MI)、1％BactoTM酵母提取物(Difco實(shí)驗(yàn)室)、0．004％腺嘌呤和0．006％L-亮氨酸)。
在本發(fā)明的一方面，通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)，該細(xì)胞被用于篩選此蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)受體，包括天然受體，以及天然配基的激動(dòng)劑和拮抗劑。
蛋白質(zhì)分離優(yōu)選純化本發(fā)明多肽至不低于80％純度，更優(yōu)選不低于90％的純度，甚至更優(yōu)選不小于95％的純度，尤其優(yōu)選藥學(xué)上的純度，即相對(duì)于雜質(zhì)大分子，特別是其它蛋白質(zhì)和核酸，純度超過(guò)99．9％，且不合傳染因子和致熱因子。優(yōu)選地，純化多肽基本不含其它多肽，特別是其它動(dòng)物源多肽。
表達(dá)的重組多肽(或嵌合多肽)可用分級(jí)分離和／或常規(guī)純化方法和介質(zhì)進(jìn)行純化。硫酸銨沉淀及酸或離液劑提取可用于樣品的分級(jí)分離中。典型的純化步驟可包括羥基磷灰石層析、尺寸排阻層析、FPLC和反相高效液相層析。合適的陰離子交換介質(zhì)包括葡聚糖衍生物、瓊脂糖、纖維素、聚丙烯酰胺、特殊性能二氧化硅，等等。PEI、DEAE、QAE和Q衍生物是優(yōu)選的，特別優(yōu)選DEAE Fast-Flow Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)。典型的層析介質(zhì)包括那些苯基、丁基或辛基衍生的介質(zhì)，如Phenyl-SepharoseFF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、Octyl-Sepharose(Pharmacia)，等等；或聚丙烯樹(shù)脂，如AmberchromCG71(Toso Haas)等。合適的固相支持體包括玻璃珠、硅基樹(shù)脂、纖維素樹(shù)脂、瓊脂糖珠、交聯(lián)瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、交聯(lián)聚丙烯酰胺樹(shù)脂等等，它們?cè)谒褂玫臈l件下是不溶的。這些支持物可用反應(yīng)基團(tuán)修飾，使得蛋白質(zhì)可通過(guò)氨基、羧基、巰基、羥基和／或碳水化合物部分附著于支持物上。偶聯(lián)化學(xué)法的例子包括溴化氰活化、N-羥基琥珀酰亞胺活化、環(huán)氧化物活化、巰基活化、酰肼活化及用于碳二亞胺偶聯(lián)化學(xué)法的羧基和氨基衍生物。這些及其它固相介質(zhì)在本領(lǐng)域中是眾所周知并廣泛應(yīng)用的，且可購(gòu)自產(chǎn)品供應(yīng)商處。將受體多肽結(jié)合到支持介質(zhì)上的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。特定方法的選擇是一個(gè)常規(guī)設(shè)計(jì)的問(wèn)題，它部分是由所選支持物的特性決定的。參閱例如《親和層析原理和方法》(Pharmacia LKBiotechnology，Uppsala，Sweden，1988)。
可利用它們的特性分離本發(fā)明的多肽。例如，固定化金屬離子吸附(IMAC)層析可用于純化富含組氨酸的蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)單說(shuō)，凝膠先帶上二價(jià)金屬離子，形成螯合物(E．Sulkowski，生化動(dòng)態(tài)31-7，1985)。富含組氨酸的蛋白質(zhì)將以不同的親和力吸附于該基質(zhì)上(這取決于所用的金屬離子)，并可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性洗脫作用，降低pH，或用強(qiáng)螯合劑而洗脫。其它的純化方法包括用凝集素親和層析和離子交換層析純化糖基化的蛋白質(zhì)(酶學(xué)方法，182卷，“蛋白質(zhì)純化指南”，M．Deutscher，(編)，529-539頁(yè)，Acad出版社，San Diego，1990)?；蛘?，可構(gòu)建目的多肽與親和標(biāo)記(如多聚組氨酸、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)的融合體以有助于純化。
用途本發(fā)明多肽具有四螺旋束細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)特性。如果一種蛋白質(zhì)可溶并具有通過(guò)細(xì)胞表面受體作用而傳導(dǎo)信號(hào)和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的能力，通常將它描述為細(xì)胞因子。細(xì)胞因子有數(shù)種三級(jí)結(jié)構(gòu)折疊分類，包括富半胱氨酸的二聚體(如胰島素、PDGF)、β-三葉形折迭(如FGF、IL-1)、及全α四螺旋束。后者的特征在于具有獨(dú)特上-上-下-下拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的4個(gè)螺旋，標(biāo)記為A、B、C和D，其中兩個(gè)自上而下環(huán)連接螺旋A和B以及螺旋C和D。參閱，例如，Manavalan等，蛋白質(zhì)化學(xué)雜志11(3)321-31(1992)。有時(shí)將四螺旋束細(xì)胞因子進(jìn)一步再分成短鏈(如IL-4、IL-2、GM-CSF)和長(zhǎng)鏈(如TPO、生長(zhǎng)激素、leptin、IL-10)，其中后者通常具有較長(zhǎng)的A和D螺旋和自上而下的環(huán)。今后我們可同義地使用術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”和“四螺旋束細(xì)胞因子”。Zcyto10的螺旋A包括氨基酸殘基35(異亮氨酸)至氨基酸殘基49(異亮氨酸)，也由SEQ ID NO14表示；螺旋B包括第91位氨基酸亮氨酸至第105位氨基酸蘇氨酸，也由SEQ ID NO15表示；螺旋C包括第112位氨基酸殘基亮氨酸至第126位氨基酸殘基半胱氨酸，也由SEQ ID NO16表示；螺旋D包括第158位氨基酸殘基纈氨酸至第172位氨基酸殘基甲硫氨酸，也由SEQ ID NO17表示。
人Zcyto10在Cys33和Cys126之間有分子內(nèi)二硫鍵。預(yù)期其它4個(gè)半胱氨酸Cys80、Cys132、Cys81和Cys134形成Cys80-Cys132和Cys81-Cys134形式的兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。預(yù)計(jì)對(duì)Zcyto10的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性比較重要的殘基包括Cys33、Cys126、Cys80、Cys132、Cys81和Cys134。預(yù)期這些殘基中任何一個(gè)突變成其它殘基均會(huì)使Zcyto10功能失活。
Zcyto10的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性還取決于維持四個(gè)α-螺旋上的埋藏的疏水面。預(yù)計(jì)殘基Ile42、Phe46、Ile49、Leu91、Val94、Phe95、Tyr98、Leu112、Phe116、Ile119、Leu123、Val158、Leu162、Leu165、Leu168、Leu169和Met172埋藏于蛋白質(zhì)核心中，如果它們改變，則取代氨基酸殘基必須是疏水氨基酸。
預(yù)期涉及Zcyto10與細(xì)胞表面受體結(jié)合的殘基包括螺旋A和B間自上而下的環(huán)中的Asp57，和預(yù)計(jì)暴露于螺旋D表面的帶電殘基Lys160和Glu164。在蛋白質(zhì)表面上，環(huán)AB和螺旋D區(qū)域上是含殘基Ile62、Leu71、Ile167和Trp171的疏水表面塊。這些殘基可能與細(xì)胞表面受體上的疏水表面塊相互作用。
本發(fā)明的人Zcyto10多肽與白介素-10(IL-10)有約28％的相同性。小鼠Zcyto10多肽與人IL-10具有約24％的相同性，與小鼠IL-10有約27％的相同性。人Zcyto10多肽與小鼠Zcyto10多肽有約76％的相同性。
小鼠Zcyto10的螺旋A包括SEQ ID NO19的第35位氨基酸殘基異亮氨酸至第49位氨基酸殘基精氨酸，也用SEQ ID NO21表示。小鼠Zcyto10的螺旋B包括SEQ ID NO19的第91位氨基酸殘基亮氨酸至第105位氨基酸殘基蘇氨酸，也用SEQ ID NO22表示。小鼠Zcyto10的螺旋C包括SEQ ID NO19的第112位氨基酸殘基亮氨酸至第126位氨基酸殘基半胱氨酸，也用SEQ ID NO23表示。小鼠Zcyto10的螺旋D包括SEQ ID NO19的第158位氨基酸殘基纈氨酸至第172位氨基酸殘基甲硫氨酸，也用SEQ ID NO24表示。
IL-10是一種細(xì)胞因子，它可抑制其它細(xì)胞因子的產(chǎn)生、誘導(dǎo)活化B淋巴細(xì)胞增殖和分化、抑制HIV-1復(fù)制并對(duì)γ干擾素呈現(xiàn)拮抗效應(yīng)。IL-10似乎以由180°旋轉(zhuǎn)相關(guān)的兩α-螺旋多肽區(qū)形成的二聚體形式存在。參閱，例如，Zdanov等，結(jié)構(gòu)3(6)591-601(1996)。已報(bào)道IL-10是活化Th2T-細(xì)胞、B-細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞的產(chǎn)物，能調(diào)節(jié)Th1T-細(xì)胞應(yīng)答。可通過(guò)抑制Th1 T-細(xì)胞的細(xì)胞因子合成來(lái)完成這樣的調(diào)節(jié)。參閱，例如，Hus等，Int．Immunol．4563(1992)和D’Andrea等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J．Exp．Med．)1781042(1992)。也已報(bào)道IL-10可抑制天然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子合成。參閱，例如，Hus等(上文所引用)和Fiorentino等，免疫學(xué)雜志，1463444(1991)。此外，已發(fā)現(xiàn)IL-10對(duì)胰島素依賴型糖尿病具保護(hù)作用。
在相應(yīng)于該新DNA之mRNA的組織分布分析中，觀察到有單個(gè)轉(zhuǎn)錄物，大約為1．2Kb。利用Clontech多組織Northern，觀察到在氣管、胎盤(pán)、睪丸、皮膚、唾液腺、前列腺、甲狀腺中明顯有人轉(zhuǎn)錄物，而在胃和胰中表達(dá)較低。Zcyto10表達(dá)于以下小鼠組織中腎、骨骼肌、唾液腺、肝和皮膚。
Zcyto10表達(dá)的組織特異性顯示，在氣管和唾液腺、胃、胰和肌肉中Zcyto10可能是生長(zhǎng)和／或維持因子；且在局部免疫應(yīng)答中可能是重要的。而且，Zcyto10基因定位在染色體lq32．2上，這表明Zcyto10是生長(zhǎng)／分化因子或如同IL-10一樣在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中是重要的。
本發(fā)明還提供了可用于診斷應(yīng)用中的試劑。含Zcyto 10 DNA或RNA或其亞序列的探針可用于測(cè)定Zcyto 10基因是否存在于染色體1上或是否發(fā)生了突變。
本發(fā)明還提供具顯著治療價(jià)值的試劑。Zcyto 10多肽(天然或重組形式)、其片段、它們的抗體和抗獨(dú)特型抗體以及鑒定為與Zcyto 10多肽具結(jié)合親和力的化合物，在異常生理或發(fā)育相關(guān)性疾病(包括異常增殖，如患癌或變性疾病或免疫性改變)的治療中是有用的。
可純化抗Zcyto 10多肽抗體并隨后施用于病人。為了治療的作用，這些試劑可與另外的活性或惰性成分相結(jié)合，如藥學(xué)上可接受的載體或稀釋液以及生理學(xué)上無(wú)害的穩(wěn)定劑和賦形劑。這些混合物可經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾，并通過(guò)冷凍干燥置于試劑瓶中或保存于穩(wěn)定的水制劑中以劑量形式放置。本發(fā)明還涉及抗體及其結(jié)合片段、或包括非補(bǔ)體結(jié)合形式在內(nèi)的單鏈抗體的用途。
有效治療所必需試劑的份量取決于許多不同的因素，包括施藥方法、靶位點(diǎn)、病人的生理學(xué)狀態(tài)及施用的其它藥物。因此，應(yīng)確定治療劑量以使安全性和有效性達(dá)到最佳。一般說(shuō)來(lái)，這些試劑的體外使用劑量能為其體內(nèi)施用的有效量提供有用的指導(dǎo)。治療特殊失調(diào)的有效劑量的動(dòng)物試驗(yàn)將為人所用劑量提供進(jìn)一步預(yù)兆性指示。施藥方式包括口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉、經(jīng)皮用藥或通過(guò)噴霧器或霧化器以噴霧形式施用入肺或氣管。藥學(xué)上可接受載體將包括水、鹽水、一些緩沖液等。通常預(yù)期的劑量范圍是1-1000μg／Kg體重／天。然而，劑量可以更高或更低，這可由本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)的內(nèi)科醫(yī)生確定。藥物配方和劑量范圍的完整討論可參閱Remington′s PharmaceuticalScience，第18版(Mack Publishing Co．，Easton，Penn．，1996)，及Goodman和Gilman的治療的藥物學(xué)基礎(chǔ)，第9版(Pergamon Press1996)。
基于核酸的治療如果哺乳動(dòng)物的Zcyto 10基因突變或缺失，可將Zcyto 10基因引入該哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，將編碼Zcyto 10多肽的基因在一病毒載體上引入體內(nèi)。這樣的載體包括減毒或缺陷型DNA病毒，諸如(但不局限于)單純瘡疹病毒(HSV)、乳頭瘤病毒、非洲淋巴瘤病毒(EBV)、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)等等。優(yōu)選完全或幾乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒在引入細(xì)胞后無(wú)感染性。使用缺陷型病毒載體能夠在特定的局部區(qū)域給與細(xì)胞，而不用擔(dān)心此載體會(huì)感染其它細(xì)胞。特殊的載體例子包括，但不局限于，缺陷型皰疹病毒1(HSV1)載體[Kaplitt等，Molec．Cell．Neurosci．，2320-330(1991)]、減毒的腺病毒載體，如由Stratford-Perricaudet等，臨床研究雜志(J．Clin．Invest．)，90626-630(1992)所述的載體，及缺陷型腺伴隨病毒載體[Samulski等，病毒學(xué)雜志，613096-3101(1987)；Samulski等，病毒學(xué)雜志，633822-3828(1989)]。
在另一實(shí)施方案中，基因可在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中引入，如以下文獻(xiàn)所述Anderson等的美國(guó)專利第5，399，346號(hào)；Mann等，細(xì)胞，33153(1983)；Temin等的美國(guó)專利第4，650，764號(hào)；Temin等的美國(guó)專利第4，980，289號(hào)；Markowitz等，病毒學(xué)雜志，621120(1988)；Temin等的美國(guó)專利第5，124，263號(hào)；國(guó)際專利公開(kāi)號(hào)WO95／07358，由Dougherty等人于1995年3月16日公開(kāi)；血液學(xué)，82845(1993)?；蛘撸d體可利用脂質(zhì)體通過(guò)體內(nèi)脂轉(zhuǎn)染法而引入。合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)可用來(lái)制備脂質(zhì)體以用于標(biāo)記編碼基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)染[Felgner等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，847413-7417(1987)；參閱Mackey等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，858027-8031(1988)]。使用脂轉(zhuǎn)染法將外源基因引入體內(nèi)特殊器官具有某些實(shí)用的好處。脂質(zhì)體對(duì)特定細(xì)胞的分子靶向性代表了優(yōu)點(diǎn)的一方面。很顯然，指導(dǎo)向特殊細(xì)胞的轉(zhuǎn)染代表了優(yōu)點(diǎn)的又一方面。也很清楚的是，在細(xì)胞異質(zhì)性組織，如胰、肝、腎和腦中，向特殊細(xì)胞類型的定向轉(zhuǎn)染尤其有利。為了靶向的目的可將脂類化學(xué)偶聯(lián)上其它分子。靶向肽，如激素或神經(jīng)遞質(zhì)，及如抗體之類的蛋白質(zhì)，或非肽分子均可與脂質(zhì)體化學(xué)偶聯(lián)。這些脂質(zhì)體也可以用噴霧器或霧化器的方法以噴霧形式施用于肺或氣管。
將細(xì)胞從體內(nèi)取出，然后將作為裸露DNA質(zhì)粒的載體引入該細(xì)胞中，并隨后將此轉(zhuǎn)化細(xì)胞再植入體內(nèi)，這樣的操作是可能的?？砂幢绢I(lǐng)域已知技術(shù)將用于基因治療的裸DNA載體引入目的宿主細(xì)胞中，如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、基因槍的使用或DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的使用[參閱，如Wu等，生物化學(xué)雜志267963-967(1992)；Wu等，生物化學(xué)雜志，26314621-14624(1988)]。
Zcyto 10多肽也可用于制備可特異結(jié)合Zcyto 10多肽的抗體。這些抗體隨后可用于制備抗獨(dú)特型抗體。本文所用的“抗體”一詞包括多克隆抗體、單克隆抗體、及其諸如F(ab)2和Fab片段之類的抗原結(jié)合片段，等等，其中包括基因工程抗體。若抗體與Zcyto 10多肽結(jié)合的Ka≥107／M，則此抗體被定義為可特異結(jié)合。本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員可輕易測(cè)定單克隆抗體的親和力(參閱，例如，Scatchard，同上)。
制備多克隆和單克隆抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的(參閱例如，Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版)(冷泉港，紐約，1989)；和Hurrell，J．G．R．，編輯，單克隆雜交瘤抗體技術(shù)及應(yīng)用(CRC Press，Inc．，Boca Raton，F(xiàn)L，1982)，均在此引入作為參考)。本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員可明顯看到，多克隆抗體可自各種溫血?jiǎng)游铮珩R、牛、山羊、綿羊、狗、小雞、兔子、小鼠和大鼠中制備。通過(guò)使用諸如弗氏完全或不完全佐劑之類的佐劑可提高Zcyto 10多肽的免疫原性。本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員已知的各種試驗(yàn)均可用于檢測(cè)能與Zcyto 10多肽特異結(jié)合的抗體。實(shí)例性試驗(yàn)詳述于《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Harlow和Lane(編)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1988)。這些試驗(yàn)的代表性例子包括合并免疫電泳、放射免疫分析、放射免疫沉淀法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)、抑制或競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)及三明治試驗(yàn)。
抗Zcyto 10抗體可用于標(biāo)記表達(dá)此蛋白質(zhì)的細(xì)胞，用于親和純化，在診斷分析中用于測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)多肽的循環(huán)水平，并可作為拮抗劑以阻斷體外和體內(nèi)的配體結(jié)合和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明的另一方面提供了含純化Zcyto 10多肽與藥用可接受載體結(jié)合的藥物組合物。如本文將進(jìn)一步論述的，這些組合物可用于在預(yù)防和治療其特征為非正常細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化或細(xì)胞因子產(chǎn)生的疾病中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化或細(xì)胞因子產(chǎn)生。此外，本發(fā)明的Zcyto 10多肽可用于氣管特異或氣管支氣管特異的應(yīng)用中，如氣管支氣管上皮或其基底細(xì)胞的維持或傷口修復(fù)、調(diào)節(jié)粘液產(chǎn)生或殘?jiān)恼骋盒郧宄蛑委熛?、支氣管炎或氣管支氣管道的其它疾病。預(yù)計(jì)Zcyto 10多肽的施用劑量范圍在與Zcyto 10-FC構(gòu)建體所用相同的劑量至比其高100倍劑量之間，這取決于Zcyto 10多肽的穩(wěn)定性。Zcyto 10的治療劑量為5-5000μg／Kg／天。
本發(fā)明的Zcyto 10多肽高表達(dá)于唾液腺和氣管中，通過(guò)Western印跡分析發(fā)現(xiàn)存在于唾液中。唾液腺合成和分泌具有不同生物學(xué)功能的許多蛋白質(zhì)。這樣的蛋白質(zhì)有助于口腔的潤(rùn)滑(如粘蛋白和富脯氨酸蛋白質(zhì))、補(bǔ)充礦質(zhì)(如statherin和離子性的富脯氨酸蛋白質(zhì))和消化(如淀粉酶、脂酶和蛋白酶)及指供抗微生物(如富脯氨酸蛋白質(zhì)、溶菌酶、histatin和乳過(guò)氧化物酶)和粘膜成分維持(如粘蛋白)能力。此外，唾液是唾液腺所合成之生長(zhǎng)因子的豐富來(lái)源。例如，已知唾液含表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、胰島素、胰島素類生長(zhǎng)因子Ⅰ和Ⅱ(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)。參閱，例如，Zelles等，J．Dental．Res．74(12)1826-32，1995。唾液腺合成生長(zhǎng)因子的過(guò)程被認(rèn)為是雄激素依賴型的，對(duì)于口腔及胃腸道的健康是必需的。
因而，Zcyto 10多肽、其興奮劑或拮抗物在胃腸道或口腔再生中可能有治療效用。為了證實(shí)本發(fā)明Zcyto多肽、興奮劑或拮抗物有這樣的能力，按本領(lǐng)域已知方法評(píng)估這些Zcyto 10多肽、興奮劑或拮抗物降解淀粉的能力。通過(guò)干預(yù)Th1和Th2淋巴細(xì)胞的交叉調(diào)節(jié)及對(duì)諸如嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之類其它炎性細(xì)胞介質(zhì)的生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)，Zcyto 10多肽、其興奮劑或拮抗物可用于治療哮喘及其它氣管支氣管道疾病。Zcyto 10多肽及其興奮劑或拮抗物還可調(diào)節(jié)氣管支氣管道中肌肉的緊張性。
當(dāng)摻入油膏或霜中時(shí)，Zcyto 10多肽還可用于治療許多系統(tǒng)性或局部的皮膚病，例如通常為濕疹、牛皮癬或干皮病，或用于相關(guān)的皮膚保養(yǎng)。此外Zcyto 10多肽還可直接注射入肌肉以治療老人、病人或長(zhǎng)期臥床者的肌萎縮。
放射雜交繪圖是用于構(gòu)建哺乳動(dòng)物染色體的高分辨率連續(xù)圖譜的體細(xì)胞遺傳技術(shù)[Cox等，科學(xué)250245-250(1990)]。部分或完全清楚基因序列就可設(shè)計(jì)適于染色體放射雜交繪圖板使用的PCR引物。覆蓋整個(gè)人基因組的放射雜交繪圖板，如Stanford G3 RH Panel和GeneBridge 4 RH Panel(Research Genetics，Inc．，Huntsville，AL)可購(gòu)買(mǎi)得到。這些板可基于PCR而快速地進(jìn)行染色體定位及基因、序列標(biāo)記位點(diǎn)(STS)和其它非多態(tài)性或多態(tài)性標(biāo)志在目的區(qū)域內(nèi)的排列。這包括直接建立新發(fā)現(xiàn)目的基因與原先圖標(biāo)標(biāo)志間的成比例物理距離。確知基因位置在許多方面都是有用的，包括1)確定一段序列是否為一已有毗連序列群的一部分，并得到諸如YAC-、BAC-或cDNA克隆之類多種形式的其它周圍遺傳序列，2)為顯示與相同染色體區(qū)域連鎖的遺傳疾病提供可能的候選基因，及3)交叉參照模型生物，諸如小鼠，以協(xié)助確定特殊基因所具有的功能。
結(jié)果顯示Zcyto 10基因繪圖在WICGR放射雜交圖譜上自人染色體1連鎖群頂部的889．26cR-3000。近側(cè)或遠(yuǎn)側(cè)構(gòu)架標(biāo)記分別是DIS504和WI-9641(DIS2427)。利用周圍標(biāo)記將Zcyto 10基因定位于完整LDB染色體1圖譜上的lq32．2區(qū)域(遺傳定位數(shù)據(jù)庫(kù)，南安普敦大學(xué)，WWW服務(wù)器http／／cedar．genetics．soton．a(chǎn)c．uk／public-html／)。許多基因已繪圖于染色體1的lq32．2區(qū)域。尤其是，該區(qū)域內(nèi)的突變已發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致van der Woude綜合癥，和有時(shí)與腭裂相關(guān)的下唇畸形有關(guān)。因而，表達(dá)于唾液腺中的Zcyto 10基因可用于該綜合癥的基因治療。若哺乳動(dòng)物Zcyto 10基因突變或缺失，可將Zcyto10基因引入該哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中。
本發(fā)明的另一方面涉及與SEQ ID NO1，3，18和33所列多核苷酸的區(qū)段互補(bǔ)的反義多核苷酸組合物?？稍O(shè)計(jì)這樣的合成反義寡核苷酸以結(jié)合編碼Zcyto 10多肽的mRNA并抑制該mRNA的翻譯。這樣的反義寡核苷酸可用于抑制細(xì)胞培養(yǎng)物或被試者中Zcyto 10多肽編碼基因的表達(dá)。
本發(fā)明還提供了在診斷應(yīng)用中有用的試劑。例如，Zcyto 10基因、含Zcyto 10 DNA或RNA或其亞序列的探針可用于檢測(cè)Zcyto 10基因是否存在于染色體1上或是否發(fā)生了突變。在Zcyto 10基因位置上的可檢測(cè)染色體畸變包括但不局限于非整倍體、基因拷貝數(shù)改變、插入、刪除、限制酶切位點(diǎn)改變和重排。通過(guò)分子遺傳學(xué)技術(shù)，諸如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析、應(yīng)用PCR技術(shù)的短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分析及本領(lǐng)域已知的其它遺傳連鎖分析技術(shù)[Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；Marian，A．J．，Chest，108255-265，(1995)]，用本發(fā)明的多核苷酸可檢測(cè)這樣的畸變。
本領(lǐng)域的那些技術(shù)熟練人員將認(rèn)識(shí)到公開(kāi)于SEQ ID NO2、4、12、13、19、20、25、26、34和35中的序列代表了人和小鼠Zcyto 10基因和多肽的單個(gè)等位基因，并認(rèn)識(shí)到會(huì)存在等位變異和其它剪接方式。按標(biāo)準(zhǔn)步驟通過(guò)對(duì)來(lái)自不同個(gè)體的cDNA或基因組文庫(kù)進(jìn)行探測(cè)可克隆等位變體。SEQ ID NO1、3、18和33中所示DNA序列的等位變體，包括含沉默突變的變體和突變導(dǎo)致氨基酸序列改變的變體，均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
Zcyto 10序列在SEQ ID NO1之3’非翻譯區(qū)內(nèi)位置706、813、855和906處具有7個(gè)信使不穩(wěn)定性基元。用放線菌酮處理表達(dá)Zcyto10的細(xì)胞可削弱這種信使不穩(wěn)定性。參閱Shaw，G．等，細(xì)胞46659-667(1986)。此外，可在基因上改變或除去富AT的3’非翻譯區(qū)以進(jìn)一步提高信使穩(wěn)定性。
使用Zcyto 10促進(jìn)傷口愈合實(shí)施例4的數(shù)據(jù)顯示Zcyto 10在傷口愈合中起作用。因此，Zcyto10可應(yīng)用于傷口或燒傷中促進(jìn)傷口愈合。Zcyto 10可以1-100μg／Kg體重的劑量系統(tǒng)性地施用。Zcyto 10還可通過(guò)含1ng-1mg Zcyto 10／g藥膏或軟膏的藥膏或軟膏方式應(yīng)用于傷口上。參閱Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版(Mark Publishing Co．，Easton，Penn．，1996)。應(yīng)每天將Zcyto 10用于清潔傷口上直到傷口愈合。
利用Zcyto 10增加血小板數(shù)正如在以下實(shí)施例7中可見(jiàn)的，我們已發(fā)現(xiàn)Zcyto 10可用于增加血小板數(shù)。這對(duì)于由于化療或放療而血小板減少的癌癥病人尤其重要。Zcyto 10可與藥用可接受載體一起在治療上施用。
本發(fā)明進(jìn)一步由以下非限制實(shí)施例進(jìn)行描述。
實(shí)施例1Zcyto 10的克隆Zcyto10x1(較長(zhǎng)形式)和Zcyto10x2(較短形式)的全長(zhǎng)序列通過(guò)以下步驟闡明進(jìn)行3’RACE，并將產(chǎn)生的兩片段測(cè)序(SEQ ID NO10和SEQ ID NO11)，然后用計(jì)算機(jī)將SEQ ID NO5中所示的est序列與來(lái)自兩個(gè)3’race的片段的重疊序列人工拼接在一起。
將寡核苷酸zc15907(SEQ ID NO6)設(shè)計(jì)成恰位于Zcyto 10推定甲硫氨酸上游區(qū)域(5’)。將另一寡核苷酸zc15906(SEQ IN NO7)設(shè)計(jì)在更遠(yuǎn)的下游，恰位于信號(hào)序列切割位點(diǎn)的上游區(qū)域。將這些寡核苷酸用于人氣管marathon cDNA的3’RACE反應(yīng)中。ZC15907用于第一3’race反應(yīng)中，zc15906用于嵌套式3’race反應(yīng)中。以購(gòu)自Clontech的人氣管mRNA開(kāi)始，用Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)按制造商說(shuō)明書(shū)制備MARATHON cDNA。
按Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒中制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng)，在熱循環(huán)參數(shù)上有一些修改。用于第一PCR反應(yīng)中的循環(huán)參數(shù)是94℃1分鐘30秒，1次94℃15秒、68℃1分鐘，30次72℃7分鐘，1次用于嵌套式PCR反應(yīng)中的循環(huán)參數(shù)是94℃1分鐘30秒1次，94℃15秒68℃1分鐘20秒，30次，72℃7分鐘1次。
將產(chǎn)生的產(chǎn)物進(jìn)行1．2％瓊脂糖凝膠(Gibco瓊脂糖)電泳，可見(jiàn)兩主帶，大約相距80bp。將這些帶切出并按制造商說(shuō)明書(shū)用QIAEXTM樹(shù)脂(Qiagen)進(jìn)行凝膠純化。然后將這些片段測(cè)序，可識(shí)別Zcyto 10的全長(zhǎng)序列。
實(shí)施例2RNA印跡分析對(duì)人的多組織印跡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和RNA主點(diǎn)印跡(Master DotBlot)(Clontech)進(jìn)行探測(cè)，以確定Zcyto 10的組織分布。用est序列(SEQ ID NO5 bp 100-145)設(shè)計(jì)45-mer反義寡核苷酸(SEQ IDNO9)并用于探測(cè)。
用T4多核苷酸激酶(Gibco-BRL)將15pm的SEQ ID NO9進(jìn)行32P末端標(biāo)記。標(biāo)記反應(yīng)液含2μl5X激酶反應(yīng)緩沖液(Gibco-BRL)、1μl T4激酶、15pm SEQ ID NO9、1μL 6000Ci／mmol32P γ-ATP(Amersham)和水至10μl。反應(yīng)液37℃溫育30分鐘。用NucTrapProbe Purification Column(Stratagene)除去未摻入的放射性。多組織RNA印跡和人RNA主印跡(Clontech)在10ml ExpressHyb中50℃預(yù)雜交3小時(shí)，其中含1mg鮭精DNA和0．3mg人cotl DNA(Gibco-BRL)，二者均煮沸3分鐘，冰置2分鐘然后加入ExpressHyb中。在50℃雜交過(guò)夜。起始洗滌條件如下2XSSC、0．1％SDS室溫40分鐘，其中多次換洗滌液，然后1XSSC、0．1％SDS在64℃(Tm-10)30分鐘。印跡隨后對(duì)膠片曝光兩天。
RNA印跡中Zcyto 10的表達(dá)顯示在氣管中約有1．2kb的帶，在胃中有弱的1．5kb帶，在胰中有這兩種大小的較弱帶。斑點(diǎn)印跡顯示在氣管、唾液腺、胎盤(pán)、睪丸、皮膚、前列腺、腎上腺和甲狀腺中存在Zcyto 10。
在小鼠中，Zcyto 10發(fā)現(xiàn)存在于腎、骨骼肌、唾液腺、肝和皮膚內(nèi)。
實(shí)施例3
Zcyto 10的染色體分布和定位用可購(gòu)買(mǎi)到的“Stanford G3放射雜交繪圖板”(Reseach Genetics，Inc．，Hantsville，AL)將Zcyto 10繪圖于第1號(hào)染色體上。該“Stanford G3 RH板”包含來(lái)自整個(gè)人基因組之83個(gè)放射雜交克隆中每一個(gè)的可PCR DNA，加上兩個(gè)對(duì)照DNA(RM供體和A3受體)。一個(gè)公眾可使用的WWW服務(wù)器(http／／shgc-www．stanford．edu)可用于標(biāo)記的染色體定位。
為了用“Stanford G3 RH板”給Zcyto10繪圖，在可PCR的96孔微滴定板(Stratagene，La Jolla，CA)上建立20μl的反應(yīng)體系，將其用于“RoboCycler Gradient96”熱循環(huán)儀(Stratagene)上。85個(gè)PCR反應(yīng)中的每一個(gè)組成如下2μl 10x KlenTaq PCR反應(yīng)緩沖液(CLONTECH Laboratories，Inc．，Palo Alto，CA)、1．6μl dNTP混合液(每種2．5mM，PERKIN-ELMER，F(xiàn)oster City，CA)、1μl有義引物(SEO ID NO6，5’ATT CCT AGC TCC TGT GGT CTC CAG 3’)、1μl反義引物(SEQ ID No8，5’TCC CAA ATT GAG TGT CTT CAG T3’)、2μl“Redi Load”(Research Genetics，Inc．，-Huntsville，AL)、0．4μ1 50x Advantage KlenTaq Polymerase Mix(ClontechLaborabories，Inc．)、來(lái)自單個(gè)雜交克隆或?qū)φ盏?5ng DNA，用ddH2O補(bǔ)充至總體積20μl。用等量礦物油覆蓋和密封反應(yīng)液。PCR循環(huán)條件如下開(kāi)始的第一個(gè)循環(huán)為95℃變性5分鐘，然后35個(gè)循環(huán)是95℃變性1分鐘、66℃退火1分鐘再72℃延伸1分鐘，最后一個(gè)循環(huán)是72℃延伸7分鐘。在2％瓊脂糖凝膠(Life Technologies，Gaithersburg，MD)上電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物。
結(jié)果顯示，Zcyto 10與構(gòu)架標(biāo)記SHGC-36215連鎖，具大于10的LOD值，且距離標(biāo)記為14．67CR-10000。借助于周圍標(biāo)記，將Zcyto10定位于完整LDB 1號(hào)染色體圖譜的lq32．2區(qū)域(The GeneticLocation Database，南安普敦大學(xué)，WWW服務(wù)器http／／cedar．genetics．soton．a(chǎn)c．uk／public_html／)。
實(shí)施例4
利用Zcyto 10促進(jìn)傷口愈合本研究中使用了正常成熟雌性Balb／C小鼠。將它們以12小時(shí)光亮-黑暗的循環(huán)置于動(dòng)物護(hù)理室中，在研究期間給水并以實(shí)驗(yàn)室嚙齒類隨意食水方式喂養(yǎng)。它們從外科手術(shù)的那天起被分別關(guān)入籠中。
在外科手術(shù)當(dāng)日，用在無(wú)菌(0．2 μ-過(guò)濾)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的104mg／kg氯胺酮(Vetalar，Aveco Inc．，F(xiàn)t．Dodge，IA)加7mg／kg甲苯噻嗪(Rompun，Mobey Corp．，Shawnee，KS)通過(guò)腹膜內(nèi)注射麻醉動(dòng)物。剪掉背部毛發(fā)并用NAIR(Carter-Wallace，NewYork，NY)使皮膚脫毛，然后以水清洗。將100％aloe vera凝膠用于對(duì)抗由于NAIR處理所致的堿性灼傷，然后將動(dòng)物置于循環(huán)水加熱臺(tái)上直到皮膚及周圍毛皮干燥。
然后用metofane(Pittman Moore，Mundelein，NJ)麻醉動(dòng)物并用70％酒精擦拭脫毛的背部。在胸腰椎水平穿過(guò)脊柱旁區(qū)域上方的皮膚和肉膜作4個(gè)切口，每個(gè)0．5平方厘米。用粘性的半透性封閉敷料BIOCLUSIVE(Johnson＆Johnson，Arlington，TX)覆蓋傷口和周圍脫毛皮膚。為了稍后評(píng)估閉合參數(shù)，通過(guò)BIOCLUSIVE將切口邊緣描到醋酸透明紙上。
用Qiagen RNeasy Midi Kit在不同時(shí)間點(diǎn)(7小時(shí)、15小時(shí)和24小時(shí))處理對(duì)照皮膚和受傷皮膚。簡(jiǎn)短地說(shuō)，將皮膚(對(duì)照和受傷區(qū)域)稱重并于恰當(dāng)體積裂解緩沖液(RLT)中勻漿。旋轉(zhuǎn)裂解物以去除組織殘?jiān)⒌润w積70％乙醇加入；混勻后上柱。樣品旋轉(zhuǎn)5分鐘并用3．8mlRW1緩沖液洗1次，然后用RPE洗兩次(各2．5ml)。用無(wú)RNase水洗脫總RNA。用實(shí)時(shí)PCR(Perkin Elmer ABI Prisn 7700 SequenceDetector)檢測(cè)皮膚樣品的表達(dá)水平。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為一無(wú)模板對(duì)照、一套標(biāo)準(zhǔn)和皮膚樣品。用小鼠腎總RNA作標(biāo)準(zhǔn)曲線。三套皮膚總RNA(25ng)用于此實(shí)驗(yàn)中7小時(shí)(對(duì)照和受傷的)；15小時(shí)(對(duì)照和受傷的)、24小時(shí)(對(duì)照和受傷的)。每一樣品在7700序列檢測(cè)儀上通過(guò)一步逆轉(zhuǎn)錄PCR重復(fù)三次進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)中使用了內(nèi)置式(in-house)正向引物SEQ ID NO36、反向引物SEQ IDNO37和Perkin Elmer’s Taq Man probe(ZG-7-FAM)。一步逆轉(zhuǎn)錄PCR的條件如下(逆轉(zhuǎn)錄步驟)48℃30分鐘，(40個(gè)循環(huán)的PCR步驟)95℃10分鐘，95℃15秒，60℃1分鐘。
對(duì)照皮膚樣品中在7小時(shí)和15小時(shí)時(shí)Zcyto10的表達(dá)水平類似，分別為2．46ng／ml和2．61ng／ml。24小時(shí)的對(duì)照皮膚樣品中Zcyto10的表達(dá)水平是0。7小時(shí)時(shí)受傷皮膚的Zcyto10表達(dá)水平是5．17ng／ml(與對(duì)照樣品的相比提高了2倍以上)。15小時(shí)時(shí)受傷皮膚的Zcyto 10表達(dá)水平是14．45ng／ml(與對(duì)照樣品相比增加了5．5倍)。24小時(shí)時(shí)受傷皮膚的Zcyto 10表達(dá)水平是5．89ng／ml。重復(fù)實(shí)驗(yàn)還包括陰性對(duì)照(酵母tRNA)，顯示有相似傾向，酵母tRNA的結(jié)果接近0。結(jié)果顯示擴(kuò)增確實(shí)存在且為小鼠特異性。
這些數(shù)據(jù)表明Zcyto10在傷口修復(fù)中起作用，因?yàn)槭軅M織的Zcyto10表達(dá)水平較對(duì)照樣品的高且其隨時(shí)間增加和減少。因此，Zcyto10可應(yīng)用于受傷處以促進(jìn)傷口愈合。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)在清蛋白或金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下表達(dá)Zcyto10的轉(zhuǎn)基因小鼠。出生時(shí)，數(shù)只小鼠具有發(fā)亮的外觀，運(yùn)動(dòng)有限。這些小鼠的皮膚緊繃并有皺紋，其中數(shù)個(gè)還在下唇上有細(xì)絲類毛發(fā)。鼻孔和嘴區(qū)域、四肢和尾部有些腫。
使用清蛋白啟動(dòng)子的一只轉(zhuǎn)基因小鼠存活3天，它嚴(yán)重地生長(zhǎng)延遲。無(wú)耳朵發(fā)育，而足趾的發(fā)育延緩。當(dāng)其在第1、2或3天瀕死時(shí)處死所有動(dòng)物。收集尾和肝樣品并將其原位固定于10％中性福爾馬林中并包埋在石蠟中，切成3μm的切片并用H&E染色。具此表型的所有小鼠均為轉(zhuǎn)基因小鼠且有從低到高的Zcyto10表達(dá)。
在除皮膚外的大部分組織中觀察不到顯著的改變。表達(dá)Zcyto10的幼鼠，尤其是具高Zcyto10表達(dá)水平的那些小鼠的皮膚傾向于較無(wú)表達(dá)幼鼠的皮膚厚。這些幼鼠的顆粒層與無(wú)表達(dá)幼鼠相比厚度減少，棘層由于細(xì)胞層增加和／或細(xì)胞直徑增加而較厚。
除了表皮中的改變外，具中等Zcyto10表達(dá)的一只小鼠的真皮被粘性物質(zhì)病灶性地適度擴(kuò)張。
實(shí)施例6從細(xì)胞培養(yǎng)基純化Zcyto10用陽(yáng)離子交換層析和大小排阻層析兩步方法自細(xì)胞培養(yǎng)基中分離CHO細(xì)胞產(chǎn)生的Zcyto10。A．陽(yáng)離子交換層析步驟所用材料用具共價(jià)鍵合磺丙基(SP)的一種TOYOPEARL離子交換樹(shù)脂，SP-650M陽(yáng)離子交換樹(shù)脂填充的2．2cm直徑(D)x6cm高(H)柱(AMICON)。
收集來(lái)自已被含Zcyto質(zhì)粒轉(zhuǎn)染之幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞的15升培養(yǎng)基。用2N HCl將培養(yǎng)基pH調(diào)至pH5。用50mM乙酸鈉(NaAc，pH5．0)平衡上述填充柱。以約8ml／分鐘20個(gè)柱體積(CV)／小時(shí)的速率將培養(yǎng)基裝入柱子。上柱完成后用10個(gè)柱體積的50mM NaAc，pH5．0洗柱。然后用50mM NaAc，pH5．0中的20柱體積NaCl梯度洗脫柱中的物質(zhì)。NaCl梯度為0→0．5M NaCl。這將培養(yǎng)基中的物質(zhì)從15升濃縮至170ml。
用截流5000的旋轉(zhuǎn)離心濃縮器(Millipore，Inc．Bedford，MA)將產(chǎn)生的170ml收獲物進(jìn)一步濃縮至約5ml。B．大小排阻(S-100)凝膠過(guò)濾步驟所用材料1．6cm(直徑)X93cm(高)柱S-100凝膠(Pharmacia，Piscataway，NJ)隨后將5ml收獲液加到上述含S-100凝膠的柱子上。該柱子已用5X磷酸緩沖鹽溶液平衡至柱pH約為7．0。用1XPBS以1．5ml／分鐘的流速將Zcyto10與污染物分離。以2ml量收集各組分。通過(guò)以考馬斯蘭染色的十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳確定，在洗脫開(kāi)始約90分鐘時(shí)Zcyto10多肽洗下到組分52-64中。凝膠顯示在約14KDa的預(yù)期分子量處有一條帶。
實(shí)施例7小鼠Zcyto10的克隆5’MARATHON RACETM(Clontech，Palo Alto，CA)的PCR引物為附著于MARATHONTMAP1銜接物的SEQ ID NO38，它與附著于AP2MARATHONTM銜接物的SEQ ID NO39嵌套，3’MARATHON RACETM的引物為附著于MARATHON RACETMAP1銜接物的SEQ ID NO40，它與附著于MARATHON RACETMAP2銜接物的SEQ ID NO41嵌套，對(duì)小鼠皮膚MARATHON RACETMcDNA進(jìn)行5’和3’PCR。將來(lái)自這些反應(yīng)的數(shù)個(gè)片段進(jìn)行凝膠純化和測(cè)序，可闡明小鼠Zcyto10的全長(zhǎng)編碼序列及一些5’和3’UTR序列。發(fā)現(xiàn)兩小鼠Zcyto10變體，稱為SEQ ID NO18以及19和SEQ ID NO33和34。物引物SEQ ID NO42和43 PCR擴(kuò)增這些克隆。
實(shí)施例8通過(guò)腺病毒將Zcyto10施用于正常小鼠通過(guò)含Zcyto10基因的腺病毒施用Zcyto10。如下所述有三組小鼠。將腺病毒從靜脈內(nèi)注射入C57B1／6雄性和雌性小鼠。在處死前3天所有小鼠接受含有溴脫氧尿苷(Brdu)的飲用水。這樣可通過(guò)組織學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞增殖。檢測(cè)參數(shù)包括體重改變、全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清化學(xué)、組織學(xué)、器官重量及通過(guò)BrdU檢測(cè)的細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)第一組 Zcyto 10x1(SEQ ID NO18)／pAC-CMV／AdV1X1011顆粒／劑(在第21天處死9只雌性、9只雄性小鼠)(在第11天處死2只雌性、2只雄性小鼠)總數(shù)=22只小鼠第二組 空CMV／AdV對(duì)照1X1011粒／劑(在第21天處死10只雌性、10只雄性小鼠)
(在第11天處死2只雌性、2只雄性小鼠)總數(shù)=24只小鼠第三組 不經(jīng)處理(5只雌性、5只雄性小鼠)總數(shù)=10結(jié)果最引人注目的結(jié)果是，與空腺病毒對(duì)照相比，在用Zcyto10-腺病毒處理的雄性和雌性小鼠中觀察到血小板計(jì)數(shù)顯著增加。在雄性小鼠中這伴隨著血細(xì)胞比容降低及脾和肝重增加。在雄性中胸腺重量也減少。與此形成對(duì)照的是，與空病毒對(duì)照相比，Zcyto10腺病毒處理的雌性小鼠顯示白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增加，主要是淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加。
這些結(jié)果表明Zcyto10處理影響血細(xì)胞生成，但除了血小板計(jì)數(shù)增加這一效果在兩性都有之外，其它影響是性別特異性的。
其它影響包括以下結(jié)果在被處理組中雌性的葡萄糖水平降低，而雄性葡萄糖水平顯示無(wú)顯著變化。
在被處理組的雄性和雌性中血尿氮(BUN)均提高。
在被處理組中雌性的堿性磷酸酶較高，而雄性顯示無(wú)顯著變化。
被處理組的雄性和雌性中血小板計(jì)數(shù)均較高。
在被處理組中雌性的總白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)較高而雄性顯示無(wú)顯著變化。序列表&#60110&#62ZymoGenetics，Inc．&#60120&#62哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子樣多肽10&#60130&#6297-72PC&#60160&#6243&#60170&#62FastSEQ for Window Version 3．0&#60210&#621&#60211&#62926&#60212&#62DNA&#60213&#62人&#60220&#62&#60221&#62CDS&#60222&#62(45)…(572)&#60400&#621ctttgaattc ctagctcctg tggtctccag atttcaggcc taag atg aaa gcc tct 56Met Lys Ala Ser1agt ctt gcc ttc agc ctt ctc tct gct gcg ttt tat ctc cta tgg act 104Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr Leu Leu Trp Thr5 10 15 20cct tcc act gga ctg aag aca ctc aat ttg gga agc tgt gtg atc gcc 152Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser Cys Val Ile Ala25 30 35aca aac ctt cag gaa ata cga aat gga ttt tct gac ata cgg ggc agt 200Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Asp Ile Arg Gly Ser40 45 50gtg caa gcc aaa gat gga aac att gac atc aga atc tta agg agg act 248Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile Leu Arg Arg Thr55 60 65gag tct ttg caa gac aca aag cct gcg aat cga tgc tgc ctc ctg cgc 296Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys Cys Leu Leu Arg70 75 80cat ttg cta aga ctc tat ctg gac agg gta ttt aaa aac tac cag acc 344His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Ash Tyr Gln Thr85 90 95 100cct gac cat tat act ctc cgg aag atc agc agc ctc gcc aat tcc ttt 392Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe105 110 115ctt acc atc aag aag gac ctc cgg ctc tgt cat gcc cac atg aca tgc 440Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala His Met Thr Cys120 125 130cat tgt ggg gag gaa gca atg aag aaa tac agc cag att ctg agt cac 488His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln Ile Leu Ser His135 140 145ttt gaa aag ctg gaa cct cag gca gca gtt gtg aag gct ttg ggg gaa 536Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu150 155 160cta gac att ctt ctg caa tgg atg gag gag aca gaa taggaggaaa 582Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu165 170 175gtgatgctgc tgctaagaat attcgaggtc aagagctcca gtcttcaata cctgcagagg 642aggcatgacc ccaaaccacc atctctttac tgtactagtc ttgtgctggt cacagtgtat 702cttatttatg cattacttgc ttccttgcat gattgtcttt atgcatcccc aatcttaatt 762gagaccatac ttgtataaga tttttgtaat atctttctgc tattggatat atttattagt 822taatatattt atttattttt tgctattaat gtatttaatt ttttacttgg gcatgaaact 882ttaaaaaaaa ttcacaagat tatatttata acctgactag agca926&#60210&#62 2&#60211&#62 176&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 2Met Lys Ala Ser Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr1 5 10 15Leu Leu Trp Thr Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser20 25 30Cys Val Ile Ala Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Asp35 40 45Ile Arg Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile
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&#60210&#62 22&#60211&#62 15&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Mus musculus&#60400&#62 22Leu Asp Arg Val Phe Lys Val Tyr Gln Thr Pro Asp His His Thr1 5 10 15&#60210&#62 23&#60211&#62 15&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Mus musculus&#60400&#62 23Leu Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys1 5 10 15&#60210&#62 24&#60211&#62 15&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Mus muculus&#60400&#62 24Val Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met1 5 10 15&#60210&#62 25&#60211&#62 144&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Mus muculus&#60400&#62 25Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu1 5 10 15Ile Arg Asp Ser Val Gln Ala Glu Asp Thr Asn Ile Asp Ile Arg Ile20 25 30Leu Arg Thr Thr Glu Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ser Leu Asp Arg Cys35 40 45Cys Phe Leu Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys50 55 60Val Tyr Gln Thr Pro Asp His His Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu65 70 75 80Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys His Ser85 90 95His Met Ala Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gln100 105 110Ile Leu Ser His Phe Ile Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val Val Lys115 120 125Ala Leu Gly Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu130 135 140&#60210&#62 26&#60211&#62 144&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 26Cys Val Ile Ala Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Asp1 5 10 15Ile Arg Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile20 25 30Leu Arg Arg Thr Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys35 40 45Cys Leu Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys50 55 60Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu65 70 75 80Ala Ash Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala85 90 95His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln100 105 110Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys115 120 125Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu130 135 140&#60210&#62 27&#60211&#62 38&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 27Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln Ile Leu Ser His PheI 5 10 15Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu20 25 30Asp Ile Leu Leu Gln Trp35
&#60210&#62 28&#60211&#62 71&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 28Ile Ala Thr Ash Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Asp Ile Arg1 5 10 15Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Ash Ile Asp Ile Arg Ile Leu Arg20 25 30Arg Thr Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Ash Arg Cys Cys Leu35 40 45Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr50 55 60Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr65 70&#60210&#62 29&#60211&#62 92&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 29Ile Ala Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Asp Ile Arg1 5 10 15Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile Leu Arg20 25 30Arg Thr Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys Cys Leu35 40 45Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr50 55 60Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn65 70 75 80Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys85 90&#60210&#62 30&#60211&#62 82&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 30Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu1 5 10 15Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp20 25 30Leu Arg Leu Cys His Ala His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala35 40 45Met Lys Lys Tyr Ser Gln Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu Glu Pro50 55 60Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln65 70 75 80Trp Met&#60210&#62 31&#60211&#62 36&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 31Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu1 5 10 15Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp20 25 30Leu Arg Leu Cys35&#60210&#62 32&#60211&#62 61&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 32Leu Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His1 5 10 15Ala His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser20 25 30Gln Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val35 40 45Lys Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met50 55 60&#60210&#62 33&#60211&#62 756&#60212&#62 DNA&#60213&#62 Mus musculus&#60220&#62
&#60221&#62 CDS&#60222&#62 (71)...(532)&#60400&#62 33tgggagacat cgatagccct gattgatctc tttgaatttt cgcttctggt ctccaggatc60taggtgtaag atg aaa ggc ttt ggt ctt gcc ttt gga ctg ttc tcc gct 109Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu Phe Ser Ala1 5 10gtg ggt ttt ctt ctc tgg act cct tta act ggg ctc aag acc ctc cat 157Val Gly Phe Leu Leu Trp Thr Pro Leu Thr Gly Leu Lys Thr Leu His15 20 25ttg gga agc tgt gtg att act gca aac cta cag gca ata caa aag gaa 205Leu Gly Ser Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu30 25 40 45ttt tct gag att cgg gat agt gtg tct ttg gat agg tgc tgc ttc ctt 253Phe Ser Glu Ile Arg Asp Ser Val Ser Leu Asp Arg Cys Cys Phe Leu50 55 60cgt cat cta gtg aga ttc tat ctg gac agg gta ttc aaa gtc tac cag 301Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Val Tyr Gln65 70 75acc cct gac cac cat acc ctg aga aag atc agc agc ctc gcc aac tcc 349Thr Pro Asp His His Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser80 85 90ttt ctt atc atc aagaag gac ctc tca gtc tgt cat tct cac atg gca 397Phe Leu Ile Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys His Ser His Met Ala95 100 105tgt cat tgt ggg gaa gaa gca atg gag aaa tac aac caa att ctg agt 445Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gln Ile Leu Ser110 115 120 125cac ttc ata gag ttg gaa ctt cag gca gcg gtg gta aag gct ttg gga 493His Phe Ile Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly130 135 140gaa cta ggc att ctt ctg aga tgg atg gag gag atg cta tagatgaaag 542Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu145 150tggataggct gctgagaaca ctcctgtcca agaatctcag acctcagcac catgaagaca 602tggccccagg tgctggcatt tctactcaag agttccagtc ctcagcacca cgaagatggc 662ctcaaaccac cacccctttg tgatataact tagtgctagc tatgtgtata ttatttctac 722attattggct cccttatgtg aatgccttca tgtg 756&#60210&#62 34&#60211&#62 154&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Mus musculus&#60400&#62 34Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu Phe Ser Ala Val Gly Phe1 5 10 15Leu Leu Trp Thr Pro Leu Thr Gly Leu Lys Thr Leu His Leu Gly Ser20 25 30Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu35 40 45Ile Arg Asp Ser Val Ser Leu Asp Arg Cys Cys Phe Leu Arg His Leu50 55 60Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Val Tyr Gln Thr Pro Asp65 70 75 80His His Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Ile85 90 95Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys His Ser His Met Ala Cys His Cys100 105 110Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gln Ile Leu Ser His Phe Ile115 120 125Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Gly130 135 140Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu145 150&#60210&#62 35&#60211&#62 120&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Mus musculus&#60400&#62 35Leu Lys Thr Leu His Leu Gly Ser Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln1 5 10 15Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu Ile Arg Asp Ser Val Ser Leu Asp20 25 30Arg Cys Cys Phe Leu Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val35 40 45Phe Lys Val Tyr Gln Thr Pro Asp His His Thr Leu Arg Lys Ile Ser50 55 60Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys65 70 75 80His Ser His Met Ala Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr85 90 95Asn Gln Ile Leu Ser His Phe Ile Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val100 105 110Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu115 120 125Met Leu130&#60210&#62 36&#60211&#62 27&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人&#60400&#62 36agattctatc tggacagggt attcaaa 27&#60210&#62 37&#60211&#62 17&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人&#60400 &#62 37gcgaggctga tctttct 17&#60210&#62 38&#60211&#62 25&#60212&#62 DNA&#60213&#62 Mus musculis&#60400&#62 38tggcgaggct gctgatcttt ctcag 25&#60210&#62 39&#60211&#62 25&#60212&#62 DNA&#60213&#62 Mus musculis&#60400&#62 39ctttatgtct ttcaaagact cagtc 25
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1．編碼多肽的分離多核苷酸，所說(shuō)的多肽與選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No19、SEQ IDNo20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQ ID No35的一種或多種多肽有至少90％相同。
2．權(quán)利要求1的分離多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼含有選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ IDNo19、SEQ ID No20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQ ID No35之氨基酸序列的多肽。
3．權(quán)利要求1的分離多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸選自SEQ IDNo1、SEQ ID No3、SEQ ID No18和SEQ ID No33。
4．編碼多肽的多核苷酸，所述多肽具有其氨基酸序列選自SEQ IDNo2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No19、SEQ ID No20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQID No35之多肽的帶表位部分的氨基酸序列。
5．權(quán)利要求4的分離多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸編碼選自SEQ ID No14、SEQ ID No15、SEQ ID No16、SEQ ID No17、SEQ IDNo21、SEQ ID No22、SEQ ID No23、SEQ ID No24、SEQ ID No27、SEQ ID No28、SEQ ID NO28、SEQ ID No29、SEQ ID No30、SEQ IDNo31和SEQ ID No32的多肽。
6．權(quán)利要求4的分離多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸編碼與選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ IDNo19、SEQ ID No20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQ ID No35的一種或多種多肽至少80％同的多肽。
7．與選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No19、SEQ ID No20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ IDNo34和SEQ ID No35的一種或多種多肽至少90％相同的分離多肽。
8．權(quán)利要求7的分離多肽，其中所說(shuō)的多肽選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No19、SEQ IDNo20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQ ID No35。
9．含有具選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQID No13、SEQ ID No19、SEQ ID No20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQ ID No35之氨基酸序列的多肽中攜表位部分的氨基酸序列的多肽。
10．權(quán)利要求9的多肽，其中所說(shuō)多肽選自SEQ ID No14、SEQ IDNo15、SEQ ID No16、SEQ ID No17、SEQ ID No21、SEQ ID No22、SEQ ID No23、SEQ ID No24、SEQ ID No27、SEQ ID No28、SEQ IDNO28、SEQ ID No29、SEQ ID No30、SEQ ID No31和SEQ ID No32。
11．權(quán)利要求9的多肽，其中所述的多肽與選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No19、SEQ IDNo20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQ ID No35的多肽至少80％相同。
12．可選擇性地結(jié)合選自下組的多肽的抗體SEQ ID No2、SEQ IDNo4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No19、SEQ ID No20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34、SEQ ID No35、SEQ IDNo14、SEQ ID No15、SEQ ID No16、SEQ ID No17、SEQ ID No21、SEQ ID No22、SEQ ID No23、SEQ ID No24、SEQ ID No27、SEQ IDNo28、SEQ ID NO28、SEQ ID No29、SEQ ID No30、SEQ ID No31和SEQ ID No32。
13．可與權(quán)利要求12之抗體結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體。
全文摘要
稱為Zcyto10的哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子樣多肽,編碼它的多核苷酸,可特異結(jié)合該多肽的抗體,及可結(jié)合該抗體的抗獨(dú)特型抗體。Zcyto10有助于促進(jìn)傷口的愈合并利于刺激血小板的增殖。
文檔編號(hào)A61K38/19GK1282372SQ98812428
公開(kāi)日2001年1月31日 申請(qǐng)日期1998年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月26日
發(fā)明者D·C·肯克林, B·A·哈爾德曼, A·格羅斯曼 申請(qǐng)人:津莫吉尼蒂克斯公司