專利名稱：脂質(zhì)體、含其的藥物組合物和通過用其遞送活性劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及包括彈性蛋白樣多肽(ELP)的脂質(zhì)體、包括該脂質(zhì)體的藥物組合物和通過使用該脂質(zhì)體將活性劑遞送到靶部位的方法。
背景技術(shù)：
脂質(zhì)體由封閉水性(aqueous)內(nèi)部區(qū)室的至少一個脂雙層膜組成。脂質(zhì)體可以膜類型及尺寸為特征。小單層泡囊(small unilamellar vesicle, SUV)具有單層膜,并且直徑典型地在20_50nm范圍內(nèi)。大單層泡囊(large unilamellar vesicle, LUV)典型地大于50nm。寡層大泡囊(oligolamellar large vesicle)和多層泡囊具有多個、通常同心的膜層，并且典型地大于lOOnm。具有若干個非同心膜(即，較大泡囊內(nèi)包含的若干個較小的泡囊)的脂質(zhì)體稱作多泡泡囊。將脂質(zhì)體配制為攜帶包含于水性內(nèi)部空間內(nèi)(水溶性活性劑)或分配到脂雙層中(水不溶性活性劑)的藥物或其它活性劑。在血流中具有短半衰期的活性劑特別適合于經(jīng)由脂質(zhì)體遞送。例如，已知許多抗腫瘤劑在血流中具有短的半衰期，并且因此，它們的胃腸外使用是不可行的。然而，脂質(zhì)體經(jīng)由血流來部位特異性遞送活性劑的用途嚴重地受限于通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的細胞從血液中快速清除脂質(zhì)體。除非脂質(zhì)體膜中形成洞，除非所述膜降解或溶解，或者除非所述膜溫度升高至相變溫度，脂質(zhì)體通常不滲漏。受試者中的靶部位的溫度升高(過熱)可以將脂質(zhì)體的溫度提高到相變溫度或更高，并且因此脂質(zhì)體內(nèi)容物可以被釋放。該方法可用于治療劑的選擇性遞送。然而，在脂質(zhì)體的相變溫度顯著高于正常組織溫度的情況下，此技術(shù)是受限的。因此，設(shè)計能夠有效遞送活性劑的脂質(zhì)體配制劑(formulation)是合乎需要的。

發(fā)明內(nèi)容
提供包括彈性蛋白樣多肽(ELP)的脂質(zhì)體。提供包括脂質(zhì)體的藥物組合物，所述脂質(zhì)體包括ELP和活性劑。提供通過使用脂質(zhì)體將活性劑有效遞送到個體體內(nèi)的靶部位的方法。其它方面將在以下描述中部分地闡明，并且部分地，將從所述描述明晰，或者可通過所提供的實施方式的實踐獲悉。


由結(jié)合附圖考慮的實施方案的以下描述， 這些和/或其它方面將變得明晰和更容易理解，其中:圖1是顯示鈣黃綠素從以約0.55:約55:約2:約20或約0.55:約55:約2:約40 的摩爾比(摩爾比例，molar ratio)使用硬脂酰-VPGVG VPGVG VPGVG VPGVG VPGVGVPGVG-NH2 (SA-V6-NH2)、1，2- 二棕櫚酰-sn_ 甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、[1，2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](銨鹽)](DSPE-PEG-2000)和膽固醇在實施例1中制備的脂質(zhì)體中的溫度釋放譜(profile)的圖，其中使用按全部脂質(zhì)計20%和40%的膽固醇；圖2是顯示鈣黃綠素從根據(jù)實施例2通過以約0.55:約55:約2:約20的摩爾比使用SA-V6-NH2、主要脂質(zhì)(primary lipid)分子(DPPC/1, 2-二硬脂酰_sn_甘油-3-磷酸膽堿(DSPC) =0/100、25/75、50/50、75/25、100/0，按摩爾比計)、DSPE-PEG 和膽固醇制備的脂質(zhì)體中的溫度釋放譜 的圖；圖3是顯不多柔比星(doxorubicin, DX)從以約0.55:約55:約2:約20的摩爾比使用SA-V3-NH2:主要脂質(zhì)(DSPC:DPPC=25:75，按摩爾比計)、DSPE-PEG和膽固醇在實施例3中制備的脂質(zhì)體中的溫度釋放譜的圖；圖4是顯示DX從以約0.55:約55:約2:約20的摩爾比使用SA_V3_NH2、DPPC,DSPE-PEG和膽固醇在實施例4中制備的脂質(zhì)體和溶血脂質(zhì)(Iysolipid)熱敏感性脂質(zhì)體(LTSL)中的溫度釋放譜的圖；圖5是比較以約0.55:約55:約2:約20的摩爾比使用SA_V3-NH2:DPPC:DSPE_PEG和膽固醇在實施例5中制備的脂質(zhì)體與LTSL在37°C的溫度下的穩(wěn)定性的圖；圖6是顯示通過以0.55:55:2:20的摩爾比使用SA-V3-NH2、主要脂質(zhì)(DSPC/DPPC=25/75，按摩爾比計)、DSPE-PEG和膽固醇在實施例6中制備的脂質(zhì)體在37°C、40°C、42 V或45 V的各溫度下的DX釋放動力學(xué)的圖；圖7是顯示在實施例7的方法中在37°C、42°C或45°C的溫度下測量的根據(jù)實施例4中制備的脂質(zhì)體中含有的藥物量的細胞存活力的圖；圖8是顯示根據(jù)溫度的在實施例8的方法中測量的由于實施例4的DX包載脂質(zhì)體(DX量:10ug/mL)所致的DX的細胞攝取的圖；及圖9是顯示在根據(jù)實施例4的DX藥物包載前的脂質(zhì)體和具有根據(jù)實施例4包載的DX藥物的脂質(zhì)體的透射電子顯微術(shù)(TEM)的圖像的圖。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，脂質(zhì)體包括脂雙層；與疏水性部分(moiety)綴合的彈性蛋白樣多肽(ELP);和脂雙層穩(wěn)定劑，其中所述疏水性部分包裝在所述脂雙層中。如本文中所使用的術(shù)語“脂雙層”指由兩層脂質(zhì)分子構(gòu)成的膜。脂質(zhì)層可以具有與天然存在的雙層例如細胞膜、核膜或病毒包膜相似的厚度。脂雙層厚度的例子可以是IOnm或更小，例如約Inm至約9nm、約2nm至約8nm、約2nm至約6nm、約2nm至約4nm、或約2.5nm至約3.5nm。脂雙層是將離子、蛋白質(zhì)和其它分子保持在需要它們的地方并且防止它們擴散到它們不應(yīng)處于的區(qū)域中的屏障。天然雙層通常主要由磷脂構(gòu)成。磷脂具有親水性頭部和兩個疏水性尾部。當(dāng)磷脂暴露于水時，它們自身排列成兩層的片層(雙層)，其中它們所有的尾部指向片層中央。此雙 層的中央幾乎不含水，而且還排除溶解于水中但不溶解于油中的分子，如糖或鹽。具有某些頭基的磷脂可以改變雙層的表面化學(xué)。此外，脂質(zhì)尾部可以影響膜性質(zhì)，例如通過決定雙層的相。雙層可以在較低溫度下采取固體凝膠相態(tài)，但是在較高溫度下經(jīng)歷向流體態(tài)的相變。雙層內(nèi)的脂質(zhì)包裝也影響其機械性質(zhì)，包括其對伸展和彎曲的阻力。生物膜通常包括與磷脂不同的幾類脂質(zhì)。動物細胞中特別重要的例子是膽固醇，其幫助加強雙層并降低其透性(permeability)。用于構(gòu)建脂雙層的“脂質(zhì)分子”可以是具有親水性頭部和疏水性尾部的分子。月旨質(zhì)分子可以具有14至50個碳原子。脂質(zhì)分子可以是磷脂。磷脂可以具有16至24個碳原子。磷脂可以是選自如下 的至少一種:磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺及其組合，其中所述至少一種磷脂具有兩個酰基基團。此外，磷脂可以具有約10°C至約70°C，例如約38至約45°C的相變溫度。磷脂的?；鶊F可以是飽和的或不飽和的。磷脂可以是兩種或更多種磷脂分子的混合物。具有各種相變溫度的脂雙層可以由于兩種或更多種磷脂分子的混合物而生成。磷脂分子可以具有兩個酰基基團，例如選自如下的?；鶊F:C12飽和鏈磷脂(Tc=IO0C )、C14飽和鏈磷脂(Tc=24°C )、C16飽和鏈磷脂(Tc=41°C )、C18飽和鏈磷脂(Tc=55°C )、C20飽和鏈磷脂(Tc=65°C )、C22飽和鏈磷脂(Tc=70°C )、及其組合。類似地，可以使用的其它常見的磷脂包括磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂，它們?nèi)缤字Ｄ憠A一樣具有取決于其?；滈L度以類似的方式變化的相變溫度。C16飽和鏈磷脂的例子可以是二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)。DPPC是具有約41.5°C的雙層轉(zhuǎn)變溫度的飽和鏈(C16)磷脂。C18飽和鏈磷脂的例子可以是1，2_二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)。DSPC是具有約55.10°C的雙層轉(zhuǎn)變溫度的飽和鏈(C18)磷脂?？梢允褂貌皇橇字钠渌ば纬刹牧稀？梢孕纬晒滔嗄さ氖纠圆牧习ú?bola)脂質(zhì)或細菌脂質(zhì)。另外，可以采用包括水溶性聚合物(例如，聚乙二醇)和水不溶性聚合物(例如，聚環(huán)氧丙燒和聚乙基乙烯(polyethylethylene))的嵌段共聚物。如本文中所使用的，脂質(zhì)體雙層中的“主要脂質(zhì)(primary lipid) ”是脂質(zhì)體雙層材料的主要脂質(zhì)組分。因此，例如，在由70摩爾％磷脂和30摩爾％膽固醇構(gòu)成的脂質(zhì)體雙層中，磷脂是主要脂質(zhì)。脂雙層可以隨溫度具有不同的相行為。在給定的溫度下，脂雙層可以液或凝膠(固)相存在。所有脂質(zhì)都具有它們顯示從凝膠相到液相的轉(zhuǎn)變的特征性溫度。在這兩種相中，防止脂質(zhì)分子翻轉(zhuǎn)(flip-flop)雙層，但是在液相雙層中，給定的脂質(zhì)將與其相鄰物交換位置。此隨機步行交換(walk exchange)允許脂質(zhì)擴散，并且因此徘徊通過膜的表面。與液相雙層不同，凝膠相雙層中的脂質(zhì)在適當(dāng)?shù)奈恢面i定。脂雙層的相行為很大程度上由相鄰的脂質(zhì)分子之間的范德華相互作用的引力的強度決定。較長尾部的脂質(zhì)具有更多的相互作用面積，提高該相互作用的強度且因此降低脂質(zhì)移動性。因此，在給定的溫度下，短尾部脂質(zhì)將比其它方面相同的(otherwiseidentical)長尾部脂質(zhì)更具流動性。轉(zhuǎn)變溫度還可受到脂質(zhì)尾部的不飽和程度的影響。不飽和的雙鍵可以在烷鏈中產(chǎn)生結(jié)，破壞脂質(zhì)包裝。這種破壞在雙層內(nèi)產(chǎn)生額外的自由空間，其允許相鄰鏈中的額外柔性。大多數(shù)天然的膜是不同脂質(zhì)分子的復(fù)雜混合物。如果組分中的一些在給定的溫度下是液體，而其它處于凝膠相，則兩個相可以在空間上分開的區(qū)域中共存，很像飄浮于海洋中的冰山。如本文中所使用的，術(shù)語“相變溫度”指材料從固相變化成液相(也稱作熔解溫度)或從液相變化成固相的溫度。材料包括脂質(zhì)分子、不包括與疏水性部分綴合的ELP的脂雙層或脂質(zhì)體、或包括與疏水性部分綴合的ELP的脂雙層或脂質(zhì)體。脂質(zhì)體包括與疏水性部分綴合的ELP，其中疏水性部分包裝在脂雙層中。疏水性部分各自通過被包裝在脂雙層中而構(gòu)成脂雙層。疏水性部分可以是具有將與其綴合的ELP固定于脂雙層的性質(zhì)，例如疏水性質(zhì)的分子。疏水性部分可以是構(gòu)成脂雙層的相同脂質(zhì)分子或其它脂質(zhì)分子。疏水性部分可以包括僅含有疏水區(qū)的分子或含有親水和疏水區(qū)兩者的兩親性分子。在含有親水和疏水區(qū)兩者的兩親性分子中，疏水區(qū)可以向脂雙層內(nèi)部排列，和親水區(qū)可以向脂雙層外部排列，并且與ELP連接。在這里，“向外部”指遠離脂雙層中央，也就是說，向脂質(zhì)體內(nèi)或向脂質(zhì)體外的方向。疏水性部分可以是天然存在于生物膜中的脂質(zhì)分子、或可以構(gòu)成脂雙層，即使不天然存在于生物膜中的脂質(zhì)分子。天然存在于生物膜中的脂質(zhì)分子可以選自磷脂或其衍生物、固醇或其衍生物、鞘脂或其衍生物、及它們的組合。磷脂或其衍生物可以選自磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、及其組合。固醇或其衍生物可以是膽固醇或其衍生物、或鯊烯或其衍生物。鞘脂可以是鞘磷脂或其衍生物、或神經(jīng)節(jié)苷脂或其衍生物。磷脂、固醇、或鞘脂包括在體內(nèi)合成過程期間生成的中間體或前體。例如，疏水性部分包括磷酸甘油酯、鞘氨醇、神經(jīng)酰胺、或腦苷脂。疏水性部分可以是飽和或不飽和的烴、飽和或不飽和的?；肿?、或飽和或不飽和的燒氧基分子。疏水性部分和ELP的綴合可以通過在生理學(xué)和病理學(xué)條件下的不可切割連接或者通過可切割連接進行?？汕懈钸B接的例子可以是由PH可切割接頭(linker)、熱可切割接頭、福射可切割接頭、或在水性溶液(水溶液，aqueous solution)中切割的接頭介導(dǎo)的連接。疏水性部分可以通過與N端的氮原子或C端的羰基(-C(O)-)基團結(jié)合而結(jié)合到ELP。疏水性部分可以通過與ELP側(cè)鏈上選自如下的官能團的相互作用來綴合:氨基基團、羰基基團、羥基基團、硫醇基團、及其組合。疏水性部分可以通過與ELP的氮原子的胺鍵或酰胺鍵與ELP綴合。疏水性部分可以通過與ELP的C端的羰基基團的酰胺或酯鍵與ELP綴合。疏水性部分的疏水區(qū)可以具有4至30個碳原子，例如，14至24個碳原子或16至24個碳原子。例如，疏水性部分可以是肉豆蘧酰基(C14)、棕櫚?；?C16)、硬脂酰基(C18)、花生四烯?；?arachidonyl) (C20)、山箭?；?behenoyl) (C22)或木臘?；?Iignoceroyl) (C24)。疏水性部分可以通過疏水效應(yīng)而包裝在脂雙層中，并且因此，與疏水性部分綴合的ELP可以固定于脂質(zhì)體上。如本文中所使用的，術(shù)語“彈性蛋白樣多肽”指取決于溫度經(jīng)歷構(gòu)象變化的一類氨基酸聚合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，ELP可以是呈現(xiàn)出逆相變行為的聚合物。逆相變行為表明ELP在低于逆轉(zhuǎn)變溫度(Tt)的水性溶液中是可溶的，但是ELP隨著將溫度提高得高于Tt而不可溶。通過提高溫度，ELP從高度可溶性的伸長鏈轉(zhuǎn)變成具有很大降低的溶解度的緊密折疊的聚集體。這樣的逆相變可以隨溫度升高由具有更多β_轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和扭曲的結(jié)構(gòu)的ELP結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)。在一些情況中，ELP可以基于相變溫度限定。例如，在一些情況中，相變可以在約10至約70° C的范圍內(nèi)的溫度發(fā)生。當(dāng)ELP與脂雙層的區(qū)室連接時，由于ELP隨溫度從低于ELP的Tt的溫度升高到更高的溫度而收縮和自組裝(self-assembly)，逆相變行為可以破壞脂雙層。破壞脂雙層可以提高脂雙層的透性。因此，包括脂雙層的脂質(zhì)體中所包含的活性劑可以較高的透性從脂質(zhì)體釋放。然而，本發(fā)明的一個或多個實施方案不限于任何特定的機制。由于ELP的逆 相變行為所致的對脂質(zhì)體中的脂雙層的破壞可以根據(jù)脂雙層的脂質(zhì)分子或脂雙層的相變溫度而不同。脂雙層在相變溫度或之下以凝膠相，和在相變溫度或之上以液(晶)相存在。當(dāng)脂雙層以凝膠相存在時，雖然ELP結(jié)構(gòu)由于逆相變行為而改變?yōu)榫哂笑?轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，但是脂雙層的破壞可以不發(fā)生或者可以是有限的。另一方面，當(dāng)脂雙層以液相存在時，因為ELP結(jié)構(gòu)由于逆相變行為而改變?yōu)榫哂笑?轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，所以可以誘導(dǎo)脂雙層的破壞。換言之，當(dāng)脂雙層以液相而不是以凝膠相存在時，逆相變更有效地誘導(dǎo)脂雙層的破壞。因此，可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的脂雙層的相變溫度或ELP的逆相變溫度來控制包含于脂質(zhì)體中的活性劑的釋放溫度。例如，包括ELP的脂雙層或脂質(zhì)體的相變溫度可以在約10至約70° C，例如約39至約45° C的范圍內(nèi)。與疏水性部分綴合的ELP可以與疏水性部分的末端，而不是在側(cè)鏈上綴合。而且，由于與疏水性部分綴合的ELP與末端，而不是在側(cè)鏈上綴合，因此ELP可以與具有一條鏈的疏水性部分綴合。例如，疏水性部分可以通過與N端的氮原子或C端的羰基(-C(O)-)基團結(jié)合而與ELP綴合。疏水性部分可以通過與ELP的氮原子的胺鍵或酰胺鍵或者通過與ELP的C端的羰基基團的酰胺或酯鍵與ELP綴合。在這里，疏水性部分可以具有4至30個碳原子，例如，14至24個碳原子或16至24個碳原子。與不包括ELP，但僅是脂雙層的脂質(zhì)體相比，可以使用根據(jù)一個或多個實施方案的包括ELP的脂質(zhì)體來有效釋放脂質(zhì)體中包含的活性劑。當(dāng)僅利用脂雙層的脂質(zhì)分子的相變時，通過脂質(zhì)分子的分散誘導(dǎo)脂質(zhì)體中的活性劑的釋放。同時，當(dāng)使用包括ELP的脂質(zhì)體時，可以通過ELP的逆相變行為誘導(dǎo)活性劑的進一步釋放，換言之，可以通過由于ELP的收縮和組裝所致的破壞的脂雙層誘導(dǎo)活性劑的進一步釋放。在這里，活性劑可以包含在脂質(zhì)體的內(nèi)部空間中、脂雙層的內(nèi)部中、脂雙層的表面上、或者它們的組合之中或之上。脂質(zhì)體包括穩(wěn)定劑。在包括ELP的脂質(zhì)體的情況中，當(dāng)用于提高脂雙層的穩(wěn)定性的脂雙層穩(wěn)定劑存在于脂雙層中時，可以有效釋放活性劑。穩(wěn)定劑可以是具有脂雙層的相變溫度或更高、優(yōu)選更高的脂質(zhì)。脂雙層穩(wěn)定劑可以是選自如下的脂雙層穩(wěn)定劑:類固醇或其衍生物、鞘脂或其衍生物、及它們的組合。脂雙層穩(wěn)定劑可以是具有使得實現(xiàn)對脂雙層的摻入(incorporation into a lipid bilayer)的性質(zhì)的類固醇。如本文中所使用的，術(shù)語“類固醇”指包括含有彼此連接的4個環(huán)烷烴環(huán)(換言之，從左到右稱為環(huán)A、B和C的3個環(huán)己烷環(huán)和I個環(huán)戊烷環(huán)(D環(huán)))的特定排列的留烷核心或自其衍生的骨架的一類有機化合物。在這里，“自其衍生的骨架”包括插入留烷骨架中的不飽和鍵。類固醇在附著至4個環(huán)核心的官能團和環(huán)的氧化狀態(tài)方面可以變化。例如，類固醇可以包括在環(huán)上的親水性官能團。例如，類固醇可以具有羥基基團。類固醇可以是固醇。術(shù)語“固醇”是具有在位置C-3處的羥基基團且具有自膽留烷衍生的骨架的一類類固醇。在這里，術(shù)語“衍生的骨架”包括插入膽留烷骨架中的不飽和鍵。類固醇包括在植物、動物和真菌中找到的類固醇。例如，所有類固醇可以在細胞中如在動物和真菌中自羊毛固醇或如在植物中自環(huán)阿屯醇生成。類固醇包括膽固醇或其衍生物。在這里，“衍生物”意指維持待在脂雙層中引入的性質(zhì)的膽固醇衍生物。穩(wěn)定劑可以是選自如下的穩(wěn)定劑:膽固醇、谷固醇、麥角固醇、豆固醇、4，22-豆甾二烯-3-酮、豆固醇乙酸酯、羊毛固醇、環(huán)阿屯醇、及其組合。當(dāng)包括不含ELP的簡單脂雙層的脂質(zhì)體含有穩(wěn)定劑例如膽固醇時，可以顯著降低活性劑的釋放。因此，在包括ELP的脂質(zhì)體的情況中，通過使用脂雙層穩(wěn)定劑，可以在維持脂雙層或脂質(zhì)體的穩(wěn)定性的同時有效地釋放活性劑。特別地，在窄的溫度范圍內(nèi)，例如在約39至約45°C的范圍內(nèi)，藥物可以被有效地釋放。ELP可以通過其 氨基酸序列限定。例如，部分或整個ELP可以包括一種(個)或多種(個)重復(fù)單元，該重復(fù)單元可以選自VPGXG (SEQ NO:1)、PGXGV (SEQ NO: 2)、GXGVP (SEQNO: 3)、XGVPG(SEQ NO:4)、GVPGX(SEQ NO: 5)、及其組合，其中V是纈氨酸，P是脯氨酸，G是甘氨酸，且X是除了脯氨酸外的任何天然的或非天然的氨基酸。在這里，各重復(fù)單元中的X可以是相同或不同的氨基酸。重復(fù)單元可以通過不消除獲得的ELP的相變性質(zhì)的一個或多個氨基酸分開，或者末端部分可以變?yōu)橐粋€或多個氨基酸或其它接頭部分。重復(fù)單元對其它氨基酸或接頭部分的比可以是重復(fù)單元和其它氨基酸兩者中的約0.1至約99.9%的重復(fù)單元。選擇的重復(fù)單元可以重復(fù)兩次或更多次，例如，2至200次。在本發(fā)明的一個實施方案中，ELP可以是嵌段(block)，其中VPGXG、PGXGV、GXGVP、XGVPG, GVPGX或其組合是串聯(lián)地(tandemly)重復(fù)的，或者ELP可以包括嵌段，其中VPGXG、PGXGV, GXGVP, XGVPG, GVPGX或其組合是串聯(lián)地重復(fù)的。只要維持逆相變行為，ELP可以由VPGXG、PGXGV、GXGVP、XGVPG、GVPGX或其組合構(gòu)成，并且可以包括分子中的另一部分，例如接頭和封閉基團(blocking group)。ELP的N端或C端可以與疏水性部分連接。此外,疏水性部分可以通過與ELP中的氨基酸殘基的側(cè)鏈之中的反應(yīng)性基團連接與ELP綴合。反應(yīng)性基團可以是氨基基團、羥基基團、硫醇基團、或羧基基團。不與疏水性部分連接的另一末端可以是封閉的或未封閉的。例如，當(dāng)疏水性部分和ELP經(jīng)由ELP的N端連接時，ELP的C端的羧基基團可以是封閉的或未封閉的?？梢酝ㄟ^與可以是生物相容的、非免疫原性的、有助于特異性遞送、或者可避免生物學(xué)降解系統(tǒng)的材料連接或相互作用來實現(xiàn)封閉。例如，可以通過結(jié)合氨基基團和ELP的C端的羧基基團形成的酰胺鍵實現(xiàn)封閉。氨基基團可以是氨分子、伯胺、仲胺、或叔胺。伯、仲或叔胺可以各自具有I至10個碳原子，例如，I至6個碳原子。X可以是纈氨酸或丙氨酸。重復(fù)單元可以一個或多個整數(shù)重復(fù)數(shù)各自獨立包括在ELP中。重復(fù)數(shù)可以各自獨立是 2 至 200、2 至 100、2 至 80、2 至 60、2 至 40、2 至 10、2 至 12、2 至 8、2 至 6、4 至 100、8至80、10至60、12至40、20至40、4至10、4至8、或4至6的整數(shù)。在脂質(zhì)體中，脂雙層的主要脂質(zhì)分子:與疏水性部分綴合的ELP的摩爾比可以根據(jù)所選擇的脂雙層的性質(zhì)和與疏水性部分綴合的ELP的性質(zhì)適當(dāng)?shù)剡x擇。例如，主要脂質(zhì)分子:與疏水性部分綴合的ELP的摩爾比可以是約50至約99.9:約0.1至約50。例如，主要脂質(zhì)分子(DPPC或DPPC和DSPC的混合物):與疏水性部分(棕櫚酰(VPGXG) η或硬脂酰(VPGXG)η，其中η是2至12)綴合的ELP的摩爾比可以是約50至約99.0:約0.1至約50。
在脂質(zhì)體中，脂雙層可以包括在脂雙層中間的脂雙層穩(wěn)定劑以提高脂雙層的穩(wěn)定性。穩(wěn)定劑可以是具有比脂雙層的相變溫度高的相變溫度的脂質(zhì)。穩(wěn)定劑可以是固醇或糖月旨。固醇可以是膽固醇或其衍生物。穩(wěn)定劑，例如膽固醇可以幫助加強脂雙層，并且降低其透性。因此，穩(wěn)定劑，例如膽固醇使脂質(zhì)體能夠在正常的體溫下穩(wěn)定存在。主要脂質(zhì)分子:穩(wěn)定劑例如膽固醇的摩爾比可以是約50至約99.9:約0.1至約50。主要脂質(zhì)分子:穩(wěn)定劑的比可以是約50至約99.9:約0.1至約50，例如約50至約99.9:約3至約50、約50至約99.9:約5至約50、約50至 約99.9:約7至約50、約50至約99.9:約9至約50、約50至約99.9:約11至約50、約50至約99.9:約15至約50、約50至約99.9:約20至約50、約50至約99.9:約20至約35、約50至約99.9:約20至約30、約50至約99.9:約25至約30、約50至約99.9:約25至約50、約50至約99.9:約30至約50、約50至約99.9:約35至約50、約50至約99.9:約I至約35、約50至約99.9:約3至約30、約50至約99.9:約5至約25、約50至約99.9:約7至約20、或約50至約99.9:約9至約15。脂質(zhì)體由于由其被肝和脾(內(nèi)皮系統(tǒng)或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的器官)的巨噬細胞快速攝取所致的其在血液循環(huán)中相對較短的半衰期而可能不在滲漏的腫瘤組織中積累。脂質(zhì)體制備物(preparation)可以設(shè)計為避免快速的RES攝取,并且因此增加循環(huán)時間。脂雙層可以含有，例如，用親水性聚合物衍生化(derivatize)的脂質(zhì)衍生物，例如磷脂衍生物。親水性聚合物可以選自聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、寡糖、及其混合物。衍生物可以是與PEG綴合的C4-C30，例如C16-C24的磷脂。衍生物可以是DPPC-PEG或DSPE-PEG。PEG可以具有約180至約50，OOODa的分子量。脂質(zhì)體可以是單層泡囊(SUV)或多泡泡囊。脂質(zhì)體的直徑可以是約50nm至約500nm,例如約50nm至約400nm、約50nm至約300nm、約50nm至約200nm、約IOOnm至約500nm、約 IOOnm 至約 400nm、約 IOOnm 至約 300nm、或約 IOOnm 至約 200nm。在本發(fā)明的一個實施方案中，脂雙層可以包括磷脂、與疏水性部分綴合的ELP、用親水性聚合物衍生化的磷脂衍生物、和膽固醇。脂雙層中的磷脂、與疏水性部分綴合的ELP、用親水性聚合物衍生化的磷脂衍生物和膽固醇如上文所提到的。在所述實施方案中，磷脂:具有疏水性部分的ELP:用親水性聚合物衍生化的磷脂衍生物:膽固醇可以具有約50至約99.9:約0.1至約50:約O至約10:約0.1至約50，例如約50至約99.9:約0.1至約50:約O至約10:約20至約50、約50至約99.9:約0.1至約50:約O至約10:約20至約30、約50至約99.9:約0.1至約50:0至約10:約25至約30、約50至約99.9:約0.1至約50:約O至約10:約20至約50、約50至約99.9:約0.1至約50:約O至約10:約20至約30、或約50至約99.9:約0.1至約50:約O至約10:約25至約30的摩爾比。磷脂可以是DPPC。磷脂可以是DPPC和DSPC的混合物。磷脂可以具有約1:約O至約0.5，例如，約1:約0.1至約0.5的DPPC:DSPC摩爾比。與疏水性部分綴合的ELP可以包括:具有?；鶊F的疏水性部分、包括(VPGXG)n或(GVPGX)m的ELP，其中X是除了脯氨酸外的氨基酸，且η或m是I或更大的整數(shù)。X可以是纈氨酸或丙氨酸。η可以是I至12，且m可以是I至12。與疏水性部分綴合的ELP可以是硬脂酰-(GVPGX) 2-6。硬脂酰-(GVPGX) 2-6的羧基端的羧基基團可以是封閉的或不封閉的。封閉可以通過羧基基團和氨基基團(例子:氨)之間形成的酰胺鍵來實現(xiàn)。用親水性聚合物衍生化的磷脂衍生物可以是DPPC-PEG或DSPE-PEG。PEG可以具有約180Da至約50，OOODa的數(shù)均分子量。根據(jù)一個實施方案的脂質(zhì)體可以具有為約10°C至約70°C，例如約10°C至約60°C、約10 °C至約55 V、約10 °C至約45 V、約20 °C至約60 V、約20 °C至約55 V、約25 °C至約45°C、約30°C至約45°C、約35°C至約45°C的相變溫度?？梢酝ㄟ^主要脂質(zhì)分子的碳鏈長度、不飽和鍵的數(shù)目、脂質(zhì)分子的混合物、及它們的組合調(diào)節(jié)相變溫度。例如，當(dāng)將具有比DPPC的相變溫度高的相變溫度 的DSPC與具有較低相變溫度的DPPC混合時，由DPPC和DSPC混合物構(gòu)成的脂質(zhì)體可以具有比僅由DPPC構(gòu)成的脂質(zhì)體的相變溫度高的相變溫度。脂質(zhì)體在室溫下可以處于凝膠相。根據(jù)一個實施方案的脂質(zhì)體可以進一步含有活性劑?；钚詣┛梢园d于脂質(zhì)體內(nèi)部內(nèi)?；钚詣┛梢园d于脂質(zhì)體的脂雙層中?；钚詣┛梢允撬幚韺W(xué)活性劑或診斷劑。藥理學(xué)活性劑可以選自麻醉劑、抗組胺劑、抗腫瘤藥(antineoplastics)、抗?jié)兯?、抗癲癇發(fā)作劑(ant1-seizure agent)、肌肉松弛藥、免疫抑制劑、抗感染劑、非類固醇抗炎劑、成像劑、營養(yǎng)劑、及其組合。活性劑可以選自甲氨蝶呤、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)、艾力替新(ellipticine)、喜樹喊(camptothecin)、帕利他塞(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、順鉬(cisplatin)、潑尼松(prednisone)、甲基潑尼松(methyl-prednisone)、布洛芬(ibuprofen)、及其組合。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，用于對受試者中的靶部位遞送活性劑的藥物組合物包括藥學(xué)可接受載體或稀釋劑、和含有活性劑的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體包括脂雙層；與疏水性部分綴合的ELP ;和穩(wěn)定劑，其中疏水性部分可以包裝在脂雙層中。藥學(xué)可接受載體或稀釋劑可以是本領(lǐng)域中公知的。載體或稀釋劑可以選自水，例如鹽水或無菌水，林格氏(Ringer’ s)溶液、緩沖鹽水、右旋糖溶液、麥芽右旋糖(maltodextose)溶液、甘油、乙醇、及其組合。上文已經(jīng)描述了脂質(zhì)體。脂質(zhì)體可以分散于水性介質(zhì)中。水性介質(zhì)可以包括生理鹽水或PBS?；钚詣┛梢园d于脂質(zhì)體內(nèi)部內(nèi)?；钚詣┛梢园d于脂質(zhì)體的脂雙層中。脂質(zhì)體可以具有約39至約45°C的相變溫度。脂質(zhì)體在室溫下可以處于凝膠相?；钚詣┛梢允撬幚韺W(xué)活性劑或診斷劑。藥理學(xué)活性劑可以選自如下:麻醉劑、抗組胺劑、抗腫瘤藥、抗?jié)兯?、抗癲癇發(fā)作劑、肌肉松弛藥、免疫抑制劑、抗感染劑、非類固醇抗炎劑、成像劑、營養(yǎng)劑及其組合?；钚詣┛梢赃x自如下:甲氨蝶呤、多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、長春新堿、長春堿、依托泊苷、艾力替新、喜樹堿、帕利他塞、多西他賽、順鉬、潑尼松、甲基潑尼松、布洛芬、及其組合。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，對受試者中的靶部位遞送活性劑的方法包括:對受試者施用含有活性劑的脂質(zhì)體，其中各脂質(zhì)體包括脂雙層、與疏水性部分綴合的ELPjP穩(wěn)定劑，其中疏水性部分包裝在脂雙層中；和加熱受試者的靶部位以從靶部位的脂質(zhì)體中釋放活性劑。
所述方法包括對受試者施用含有活性劑的脂質(zhì)體。上文已經(jīng)描述了含有活性劑的脂質(zhì)體。各脂質(zhì)體可以具有約39至約45°C的相變溫度。施用可以是胃腸外施用。例如，胃腸外施用可以是靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腔內(nèi)(腹腔、關(guān)節(jié)或眼)或直接注射。直接注射可以涉及直接注射到患病部位諸如腫瘤部位中?？梢造o脈內(nèi)施用脂質(zhì)體，并且由此通過血流帶到靶部位諸如腫瘤部位。靶部位可以具有滲漏性質(zhì)。所述方法包括加 熱受試者的靶部位以從靶部位的脂質(zhì)體中釋放活性劑。加熱可以是由于誘導(dǎo)過熱的臨床方法所致或者可以涉及發(fā)炎的(inflamed)身體部分與身體的其它部分相比固有地更高的溫度。誘導(dǎo)過熱的臨床方法可以通過直接傳熱，例如，盆中的熱液體介質(zhì)，例如在水中接觸身體，照射超聲，例如聚焦于靶部位的高強度超聲，施加磁場例如放大的磁場，施加微波和/或射頻進行。靶部位可以是病理癥狀存在，例如，腫瘤部位(即，實體瘤)，或炎癥存在的區(qū)域。加熱可以是加熱至約38°C至約45°C的溫度?；钚詣┛梢允撬幚韺W(xué)活性劑或診斷劑。藥理學(xué)活性劑可以選自麻醉劑、抗組胺劑、抗腫瘤藥、抗?jié)兯帯⒖拱d癇發(fā)作劑、肌肉松弛藥、免疫抑制劑、抗感染劑、非類固醇抗炎劑、成像劑、營養(yǎng)劑及其組合?；钚詣┛梢赃x自甲氨蝶呤、多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、長春新堿、長春堿、依托泊苷、艾力替新、喜樹堿、帕利他塞、多西他賽、順鉬、潑尼松、甲基潑尼松、布洛芬及其組合。根據(jù)一個實施方案，脂質(zhì)體的透性可以取決于溫度通過與疏水性部分綴合的ELP的收縮和自組裝來調(diào)節(jié)。因此，可以使用脂質(zhì)體作為媒介物以對受試者的靶部位有效地遞送活性劑。可以通過與疏水性部分綴合的ELP的相變溫度以及脂質(zhì)體自身的相變溫度調(diào)節(jié)含有活性劑的脂質(zhì)體的透性。因此，當(dāng)脂質(zhì)體具有在體溫下更穩(wěn)定的組成時，例如，即使在含有有效量的穩(wěn)定分子諸如膽固醇以在體溫下更穩(wěn)定地維持脂質(zhì)體的狀態(tài)下，可以通過與疏水性部分綴合的ELP的相變溫度有效地調(diào)節(jié)透性。根據(jù)另一個實施方案，根據(jù)用于對受試者投遞含有活性劑的脂質(zhì)體的藥物組合物，可以使用該組合物對受試者有效地遞送活性劑。通過對受試者身體中的靶部位施用活性劑的方法，根據(jù)另一個實施方案，可以對受試者身體中的靶部位有效地遞送活性劑。本發(fā)明現(xiàn)在將對示例性實施方案進行更充分的描述。然而，本發(fā)明可以許多不同的形式體現(xiàn)，并且不應(yīng)解釋為限于本文中所列的實施方案。實施例1:脂質(zhì)體的制備和熱敏感性的測量以0.55:55:2:20 或 0.55:55:2:40 的摩爾比使用硬脂酰-VPGVG VPGVG VPGVGVPGVG VPGVG VPGVG-NH2 (SEQ NO: 6，下文稱為“SA_V6_NH2”)、1，2-二棕櫚酰_sn_甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、[1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](銨鹽)](DSPE-PEG-2000)和膽固醇制備單層泡囊形式的脂質(zhì)體。詳細地，將SA-V6_NH2在甲醇中溶解，并將DPPC、DSPE-PEG和膽固醇在氯仿中溶解。在圓底燒瓶中混合該甲醇和氯仿溶液后，通過使用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器在室溫下蒸發(fā)溶劑而在燒瓶的內(nèi)壁上形成脂質(zhì)薄層。接著，通過在室溫下向燒瓶添加其中溶解200mM鈣黃綠素的生理鹽水而使液體薄層水合。鈣黃綠素是水溶性熒光分子。
通過將水合溶液過濾通過具有擁有IOOnm尺寸的孔的聚碳酸酯膜制備單層泡囊型脂質(zhì)體。用生理鹽水流動將制備的脂質(zhì)體溶液通過ro-10 (GE Healthcare)脫鹽柱以除去未密封的鈣黃綠素。結(jié)果，制得具有包載于水性內(nèi)部中的鈣黃綠素的脂質(zhì)體。制備的脂質(zhì)體具有約IOOnm至約200nm的平均直徑,如通過Zeta粒度儀(Zeta-sizer instrument)(Malvern inst.)測量的。通過測量在生理鹽水的存在下在約25°C至約55°C的溫度溫育5分鐘后鈣黃綠素從脂質(zhì)體的水性內(nèi)部向周圍溶液的百分比釋放評估制備的脂質(zhì)體配制劑的體外穩(wěn)定性和熱敏感性。包載于脂質(zhì)體中的鈣黃綠素的熒光由于其高濃度而自身淬滅，但是在從脂質(zhì)體中釋放并稀釋到周圍溶液中后，鈣黃綠素顯現(xiàn)強烈的熒光。在溫育后，在適當(dāng)?shù)南♂尯笠约ぐl(fā)波長O ex)=485nm和發(fā)射波長Oem)=535nm測量樣品的熒光強度以測定從脂質(zhì)體中釋放的鈣黃綠素的量。通過與在通過添加二甲亞砜(DMSO)破壞脂質(zhì)體樣品后獲得的包載材料的總的釋放相比較來計算由于在特定的溫度下的溫育所導(dǎo)致的相對百分比熒光強度。圖1是顯示鈣黃綠素從以約0.55:約55:約2:約20或約0.55:約55:約2:約40的摩爾比使用SA-V6-NH2、DPPC、DSPE-PEG和膽固醇在實施例1中制備的脂質(zhì)體中的溫度釋放譜(profile)的圖。如圖1中所示，鈣黃綠素的釋放在接近約41°C的DPPC相變溫度的約35至約41°C的溫度下被膽固醇的量控制。如圖1中所示，當(dāng)膽固醇的摩爾比例是41時，根據(jù)溫度的鈣黃綠素釋放是約30%或更小。這是因為促成脂質(zhì)體穩(wěn)定的過量膽固醇在37°C的溫度存在，因此脂質(zhì)體被過度穩(wěn)定，并且因此消除由于根據(jù)ELP取決于溫度的變化例如收縮相變所導(dǎo)致的脂質(zhì)體破壞。實施例2:根據(jù)實施例1中使用的相同方法制備脂質(zhì)體，除了向DPPC添加1，2_ 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)作為主要脂質(zhì)組分，并且以DPPC/DSPC為0/100、25/75、50/50、75/25、100/0的摩爾比混合并使用主要脂質(zhì)分子。然后，評估脂質(zhì)體的熱敏感性。制備的脂質(zhì)體與實施例1中制備的脂質(zhì)體具有相似的平均直徑和分布。圖2是顯示鈣黃綠素從根據(jù)實施例2通過以約0.55:約55 (0/100, 25/75，50/50,75/25，100/0(按摩爾比計)):約2:約20的摩爾比使用SA_V6_NH2、主要脂質(zhì)分子(DPPC/DSPC)、DSPE-PEG和膽固醇制備的脂質(zhì)體中的溫度釋放譜的圖。如圖2中所示，隨著主要脂質(zhì)分子的DSPC的量增加，鈣黃綠素釋放的起始溫度升高。當(dāng)使用DSPC 100作為主要脂質(zhì)分子時，鈣黃綠素的釋放在約40°C開始，并且指數(shù)增加到約55°C。釋放的最大量是在約55°C的80%或更多?？紤]DSPC的相變溫度是55.1V的實情，釋放量的這樣的指數(shù)增加是因為所有脂質(zhì)體的相變溫度被認為是約55.rc。認為釋放的鈣黃綠素的量在約相變溫度時指數(shù)增加。實施例3:使用硫酸銨梯度法的含有多柔比星的脂質(zhì)體的制備和熱敏感性測量以25:75的混合比使用DSPC和DPPC作為主要脂質(zhì)組分，以0.55:55:2:20的摩爾比使用SA-V3-NH2、DSPC+DPPC、DSPE-PEG、和膽固醇，并使用硫酸銨梯度法(J.Control.Release 2009, 139, 73-80)來制備密封多柔比星的單層泡囊型脂質(zhì)體。詳細地，將硬脂酰-VPGVG VPGVG VPGVG-NH2 (SEQ NO: 7，下文為“SA_V3_NH2”)在甲醇中溶解，并將DSPC、DPPC、DSPE-PEG和膽固醇在氯仿中溶解。在圓底燒瓶中混合所述甲醇和氯仿溶液后，通過使用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器在室溫下蒸發(fā)溶劑在燒瓶的內(nèi)壁上形成脂質(zhì)薄層。接著，通過在室溫下向燒瓶添加250mM硫酸銨溶液而使脂質(zhì)薄層水合。通過將水合溶液過濾通過具有擁有IOOnm尺寸的孔的聚碳酸酯膜而制備單層泡囊型脂質(zhì)體。通過將制備的脂質(zhì)體溶液通過充滿(填充有)25mM Tris.HCl的SephadexG-50柱得到脂質(zhì)體溶液，該脂質(zhì)體溶液由內(nèi)部具有250mM硫酸銨和外部具有25mMTris -HCl的脂質(zhì)體形成。將DX以1:0.2的質(zhì)量比添加至主要脂質(zhì)組分，并在37°C的溫度溫育I小時。將制備的脂質(zhì)體溶液通過充滿生理鹽水的Sephadex G_50柱(GE Healthcare)以除去未密封的DX。因此，制備具有包載于水性內(nèi)部中的DX的脂質(zhì)體(密封效率是90%或更高)。制備的脂質(zhì)體具有約170nm的平均直徑,如通過Zeta-粒度儀(Malvern inst.)測量的。通過測量在生 理鹽水的存在下在約25°C至約55°C的溫度溫育5分鐘后DX從脂質(zhì)體的水性內(nèi)部向周圍溶液的百分比釋放評估制備的脂質(zhì)體配制劑的體外穩(wěn)定性和熱敏感性。在溫育后，在適當(dāng)?shù)南♂尯笠约ぐl(fā)波長(λ ex) =485nm和發(fā)射波長(Xem)=635nm測量樣品的熒光強度以測定從脂質(zhì)體中釋放的DX的量。通過與在通過添加l%TritonX-100(乙醇)破壞脂質(zhì)體樣品后獲得的包載材料的總的釋放相比較來計算由于在特定的溫度溫育所導(dǎo)致的相對百分比熒光強度。圖3是顯示DX從以約0.55:約55:約2:約20的摩爾比使用SA_V3_NH2、DSPC+DPPC、DSPE-PEG和膽固醇在實施例3中制備的脂質(zhì)體中的溫度釋放譜的圖。如圖3中所示，DX的釋放在接近約41°C的DPPC相變溫度的約40至約41°C的溫度顯著增加。最大釋放量超過80%。實施例4:使用pH梯度法的含有多柔比星的脂質(zhì)體的制備和熱敏感性測量以0.55:55:2:20 的摩爾比使用 SA_V3_NH2、DPPC、DSPE-PEG 和膽固醇，并使用 pH梯度法(Biochimica et Biophysica Acta 1985, 816, 294-302)制備密封多柔比星的單層
泡囊型脂質(zhì)體。詳細地，將SA-V3-NH2在甲醇中溶解，并將DPPC、DSPE-PEG和膽固醇在氯仿中溶解。在圓底燒瓶中混合該甲醇和氯仿溶液后，通過使用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器在室溫下蒸發(fā)溶劑在燒瓶的內(nèi)壁上形成脂質(zhì)薄層。接著，通過在室溫下向燒瓶添加300mM檸檬酸鹽溶液(pH 4.0)而使脂質(zhì)薄層水合ο通過將水合溶液過濾通過具有擁有IOOnm尺寸的孔的聚碳酸酯膜制備單層泡囊型脂質(zhì)體。通過將制備的脂質(zhì)體溶液通過充滿20mM HEPES(150mM NaCl，pH 7.4)的Sephadex G-50柱制備脂質(zhì)體溶液，該脂質(zhì)體溶液由內(nèi)部具有300mM檸檬酸鹽和外部具有20mM HEPES(150mM NaCl)的脂質(zhì)體形成。將DX以1: 0.2的質(zhì)量比添加至主要脂質(zhì)組分，并在37°C的溫度溫育20小時。將制備的脂質(zhì)體溶液通過充滿生理鹽水的S^hadex G-50柱以除去未密封的DX。結(jié)果，制備具有包載于水性內(nèi)部中的DX的脂質(zhì)體(密封效率是90%或更高)。制備的脂質(zhì)體具有約150nm的平均直徑,如通過Zeta-粒度儀(Malvern inst.)測量的。通過測量在生理鹽水的存在下在約25°C至約55°C的溫度溫育5分鐘后DX從脂質(zhì)體的水性內(nèi)部向周圍溶液的百分比釋放評估制備的脂質(zhì)體配制劑的體外穩(wěn)定性和熱敏感性。在溫育后，在適當(dāng)?shù)南♂尯笠约ぐl(fā)波長Uex)=485nm和發(fā)射波長Uem)=635nm測量樣品的熒光強度以測定從脂質(zhì)體中釋放的DX的量。通過與在通過添加l%TritonX-100(乙醇)破壞脂質(zhì)體樣品后獲得的包載材料的總的釋放相比較來計算由于在特定的溫度溫育所導(dǎo)致的相對百分比熒光強度。圖4是顯示DX從以約0.55:約55:約2:約20的摩爾比使用SA_V3_NH2、DPPC、DSPE-PEG和膽固醇在實施例4中制備的脂質(zhì)體中的溫度釋放譜的圖。如圖4中所示，DX的釋放在接近約41°C的DPPC相變溫度的約40至約41°C的溫度顯著增加。最大釋放量表現(xiàn)為100%。作為比較實驗 的對照組，使用以約90:約10:約4的摩爾比使用DPPC、MPPC和DSPE-PEG通過pH梯度法制備的溶血脂質(zhì)熱敏感性脂質(zhì)體(LTSL)。在LTSL的情況中，藥物釋放在35 V的溫度開始，并且繼續(xù)藥物的逐漸釋放，直至50°C，并且最大DX釋放量表現(xiàn)為約60%。與對照組相比，含有ELP的脂質(zhì)體的藥物釋放譜顯示了在窄的溫度范圍內(nèi)的快速釋放。實施例5:脂質(zhì)體的穩(wěn)定性的評估使用與實施例4中使用的相同方法制備包載DX的熱敏感性脂質(zhì)體。作為比較實驗的對照組，使用以約90:約10:約4的摩爾比使用DPPC、MPPC和DSPE-PEG通過pH梯度法制備的LTS L0 DX包載脂質(zhì)體具有約140± IOnm的平均直徑。圖5是顯示DX包載脂質(zhì)體的穩(wěn)定性的圖。圖5代表在將脂質(zhì)體在37 °C的溫度貯存時隨著時間變化的測量的DX釋放量。如圖5中所示，自包括ELP的脂質(zhì)體釋放的藥物量顯著小于對照組。這表明包括ELP的脂質(zhì)體可以在37°C的溫度穩(wěn)定地維持而不釋放藥物。實施例6:根據(jù)溫度的脂質(zhì)體的藥物釋放動力學(xué)使用與實施例3中使用的相同方法制備DX包載熱敏感性脂質(zhì)體。在37、40、42或45°C的溫度隨著時間的變化測量DX的釋放。圖6是顯示通過以0.55:55:2:20的摩爾比使用SA-V3-NH2、主要脂質(zhì)分子(DSPC/DPPC=25/75)、DSPE-PEG和膽固醇制備的脂質(zhì)體在37、40、42或45°C的各溫度的DX釋放動力學(xué)的圖。如圖6中所示，脂質(zhì)體在37°C的溫度是非常穩(wěn)定的，其中幾乎沒有發(fā)生藥物的滲漏，但是利用在42°C和45°C的溫度的熱刺激，確認快速的藥物釋放。實施例7:脂質(zhì)體的細胞毒性使用與實施例4中使用的相同方法制備DX包載熱敏感性脂質(zhì)體。將5.0X IO4個HeLa細胞在24孔中在含有10%(v/v)胎牛血清(FBS)和1%青霉素/鏈霉素的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)24小時。使用DX包載脂質(zhì)體根據(jù)濃度對培養(yǎng)的HeLa細胞進行處理，并將細胞立即轉(zhuǎn)移到熱搖動器中，并在37、42或45°C的溫度溫育10分鐘。然后，將細胞在37°C的溫度培養(yǎng)2小時，并用新鮮的培養(yǎng)基更換。隨后，將細胞在37°C的溫度培養(yǎng)46小時，并通過使用WST-8 (Dojindo)試劑盒測量細胞增殖。圖7是顯示根據(jù)通過實施例7的方法得到的脂質(zhì)體中包載的藥物量的細胞存活力的圖，其中使用實施例4中相同的方法制備DX包載熱敏感性脂質(zhì)體。使用WST-8測定方法通過從活細胞中釋放的脫氫酶的量測量細胞存活力。由于該實驗，確認在37°C的溫度溫育的細胞沒有顯示毒性，但是在42°C和45°C的溫度溫育的細胞顯示由于脂質(zhì)體中注射的DX所致的根據(jù)濃度的毒性。因此，通過體外細胞毒性實驗確認根據(jù)溫度的藥物釋放和由于釋放的藥物所致的對細胞生長的抑制。實施例8:脂質(zhì)體的細胞攝取使用與實施例4中使用的相同方法制備DX包載熱敏感性脂質(zhì)體。使用DX或DX包載熱敏感性脂質(zhì)體處理HeLa細胞2小時。所使用的DX濃度是10ug/ml。將細胞在37°C和420C的溫度加熱10分鐘，隨后在DMEM中在37°C的溫度溫育2小時。將細胞用PBS漂洗，并用4%甲醛(w/v)在室溫下處 理30分鐘。使用DAPI對細胞核染色。使用共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM 710, Carl Zeiss, USA)觀察細胞攝取。圖8是顯示用實施例8的相同方法得到的DX的細胞攝取的圖，其中使用與實施例4中使用的相同方法制備DX包載熱敏感性脂質(zhì)體。所使用的DX濃度是10ug/ml。圖8顯示通過用實施例4中的注射DX的脂質(zhì)體處理HeLa細胞，在37°C⑶或420C (C)的溫度將經(jīng)處理的樣品處理10分鐘，將經(jīng)處理的樣品在37°C的溫度在DMEM中溫育2小時，并用PBS將細胞漂洗兩次后的熒光確認的DAPI (左)或DX(右)的結(jié)果。對照組(A)顯示通過在10ug/ml DX的存在下在37°C的溫度與HeLa細胞一起在DMEM中溫育2小時后的熒光確認的DAPI或DX的結(jié)果。在圖8中，在左欄圖中灰色區(qū)標示用DAPI染色的細胞核，而在右欄圖中灰色區(qū)標示用DX染色的細胞核。由該結(jié)果，圖8的細胞中存在的DX確認當(dāng)在42°C的溫度處理時從熱敏感性脂質(zhì)體中釋放DX，然后釋放的DX流入細胞中。實施例9:脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)的確認使用透射電子顯微鏡法(低溫TEM)確認通過實施例4中的相同方法制備的脂質(zhì)體和不含DX的熱敏感性脂質(zhì)體的形態(tài)。將脂質(zhì)體在有孔碳膜支持網(wǎng)格(Holey carbonfilm-supported grid)上上樣并觀察。將網(wǎng)格在液氮中包埋，并轉(zhuǎn)移到冷凍轉(zhuǎn)移支架(cryotransfer holder) (Gatan)。通過使用安裝有 CO)照相機(2k, Gatan)的在 2OOkV 下運行的Tecnai F20場發(fā)射槍TEM(FEI)獲得圖像。圖9是顯示在根據(jù)實施例4的DX藥物包載前的脂質(zhì)體和具有根據(jù)實施例4包載的DX藥物的脂質(zhì)體的TEM的圖像的圖。在圖9中，A代表在37 °C的溫度根據(jù)實施例4的DX藥物包載前的脂質(zhì)體，B代表在37°C的溫度具有根據(jù)實施例4包載的DX藥物的脂質(zhì)體，和C代表在42°C的溫度具 有根據(jù)實施例4包載的DX藥物的脂質(zhì)體。如圖9中所示，根據(jù)實施例4的DX藥物包載前的脂質(zhì)體具有球體形狀，并且在37°C的溫度維持其形態(tài)，但是該形態(tài)在42°C的溫度沒有維持，而是被破壞。用于注射藥物的方法是實施例4的pH梯度法。應(yīng)當(dāng)理解，本文中所描述的示例性的實施方案應(yīng)當(dāng)僅在描述的意義上而不是出于限制目的考慮。通常應(yīng)當(dāng)認為每個實施方案內(nèi)的特征或方面的描述可用于其它實施方案中的其它類似特征或方面。
權(quán)利要求
1.脂質(zhì)體，包括: 脂雙層； 與疏水性部分綴合的彈性蛋白樣多肽(ELP);和 脂雙層穩(wěn)定劑， 其中所述疏水性部分包裝在所述脂雙層中。
2.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂雙層穩(wěn)定劑是具有使得實現(xiàn)對脂雙層的摻入的性質(zhì)的類固醇。
3.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述穩(wěn)定劑是選自如下的穩(wěn)定劑:固醇或其衍生物、鞘脂或其衍生物、及它們的組合。
4.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述穩(wěn)定劑是選自如下的穩(wěn)定劑:膽固醇、谷固醇、麥角固醇、豆固醇、4，2 2-豆留二烯-3-酮、豆固醇乙酸酯、羊毛固醇、環(huán)阿屯醇、及其組合。
5.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述ELP包括選自如下的一種或多種重復(fù)單元:VPGXG、PGXGV、GXGVP、XGVPG、GVPGX、及其組合，其中V是纈氨酸，P是脯氨酸，G是甘氨酸，且X是除了脯氨酸外的任何氨基酸。
6.權(quán)利要求5的脂質(zhì)體，其中所述選擇的重復(fù)單元重復(fù)2至200次。
7.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述疏水性部分是能夠通過包裝在脂雙層中而包括在所述脂雙層中且能夠在所述脂雙層中固定與其綴合的所述ELP的分子。
8.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述疏水性部分包括僅含有疏水區(qū)的分子或含有親水和疏水區(qū)兩者的兩親性分子。
9.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述疏水性部分是飽和或不飽和的烴、飽和或不飽和的?；肿?、或飽和或不飽和的烷氧基分子。
10.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂雙層包括磷脂。
11.權(quán)利要求10的脂質(zhì)體，其中所述磷脂是選自如下的磷脂:磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、及其組合。
12.權(quán)利要求11的脂質(zhì)體，其中所述磷脂具有C16到C24?；鶊F。
13.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂雙層包括用親水性聚合物衍生化的磷脂衍生物。
14.權(quán)利要求13的脂質(zhì)體，其中所述親水性聚合物是選自如下的材料:聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、寡糖、及其混合物。
15.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂雙層包括: 憐脂； 與所述疏水性部分綴合的所述ELP ； 用親水性聚合物衍生化的磷脂衍生物；和 膽固醇。
16.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體具有在39°C至45°C范圍內(nèi)的相變溫度。
17.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體具有在50nm至500nm范圍內(nèi)的直徑。
18.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體進一步包括活性劑。
19.權(quán)利要求18的脂質(zhì)體，其中所述活性劑包含在所述脂質(zhì)體的內(nèi)部空間中、所述脂雙層的內(nèi)部中、脂雙層的表面上、或者它們的組合之中或之上。
20.權(quán)利要求18的脂質(zhì)體，其中所述活性劑是藥理學(xué)活性劑或診斷劑。
21.權(quán)利要求19的脂質(zhì)體，其中所述藥理學(xué)活性劑選自麻醉劑、抗組胺劑、抗腫瘤藥、抗?jié)兯?、抗癲癇發(fā)作劑、肌肉松弛藥、免疫抑制劑、抗感染劑、非類固醇抗炎劑、成像劑、營養(yǎng)劑、及其組合。
22.用于將活性劑遞送到受試者中的部位的藥物組合物，包括: 藥學(xué)可接受載體或稀釋劑；和 包括活性劑的根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的脂質(zhì)體。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述活性劑包含在所述脂質(zhì)體的內(nèi)部空間中、所述脂雙層的內(nèi)部中、脂雙層的表面上、或者它們的組合之中或之上。
24.權(quán)利要求22的組合物，其中所述活性劑是藥理學(xué)活性劑或診斷劑。
25.權(quán)利要求22的組合物，其中所述藥理學(xué)活性劑選自麻醉劑、抗組胺劑、抗腫瘤藥、抗?jié)兯?、抗癲癇發(fā)作劑、肌肉松弛藥、免疫抑制劑、抗感染劑、非類固醇抗炎劑、成像劑、營養(yǎng)劑、及其組合。
26.對受試者中的靶部位遞送活性劑的方法，該方法包括: 對受試者施用含有所述活性劑的根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的脂質(zhì)體；和 加熱受試者的所述靶部位以從在所述靶部位處的所述脂質(zhì)體中釋放所述活性劑。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述活性劑包含在所述脂質(zhì)體的內(nèi)部空間中、所述脂雙層的內(nèi)部中、脂雙 層的表面上、或者它們的組合之中或之上。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述活性劑是藥理學(xué)活性劑或診斷劑。
29.權(quán)利要求26的方法，其中所述藥理學(xué)活性劑選自麻醉劑、抗組胺劑、抗腫瘤藥、抗?jié)兯帯⒖拱d癇發(fā)作劑、肌肉松弛藥、免疫抑制劑、抗感染劑、非類固醇抗炎劑、成像劑、營養(yǎng)齊U、及其組合。
30.權(quán)利要求26的方法，其中所述加熱溫度在39°C至45°C的范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明提供脂質(zhì)體、含其的藥物組合物和通過用其遞送活性劑的方法。所述脂質(zhì)體包括彈性蛋白樣多肽。
文檔編號A61K47/42GK103099781SQ201210392230
公開日2013年5月15日 申請日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月19日
發(fā)明者金旻相, 金泫伶, 樸宣玟, 樸在鉆, 蔡洙榮 申請人:三星電子株式會社